JP5366222B2 - 殺藻活性タンパク質分解酵素、それをコーディングする遺伝子及びそれを含む殺藻製剤 - Google Patents
殺藻活性タンパク質分解酵素、それをコーディングする遺伝子及びそれを含む殺藻製剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は、赤潮生物の成長を抑制するタンパク質分解酵素及びそれをコーディングする遺伝子に関する。
海で赤潮を誘発する原因種は、珪藻類（Bacillariophyceae）、ラフィド藻類（Raphidophyceae）及び渦鞭毛藻類（Dinophyceae）などの鞭毛藻類から構成されており、特に、鞭毛藻類が大部分を占めている。珪藻類は、寒天の含まれた培地で成長可能であるのに対し、鞭毛藻類は成長不可であり、ソフト寒天重層（soft-agar overlay）法を利用した殺藻細菌の研究は制限されてきた。
海及び沿岸環境から分離された殺藻細菌は、アルテロモナス（Alteromonas）、バチルス（Bacillus）、カウロバクター（Caulobacter）、サイトファーガ（Cytophaga）、フラボバクテリュウム（Flavobacterium）、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）、シュードモナス（Pseudomonas）、サポロスピラ（Saporospira）、ビブリオ（Vibrio）属が主である。海から分離された殺藻細菌は、分類学上、フラボバクテリュウム−サイトファーガ複合体とプロテオバクテリア類（Proteobacteria branch）、例えば、アルテロモナス、シュードモナス、シュードアルテロモナス 、サポロスピラ及びビブリオに区分することができる。一般的に、さまざまな生体巨大分子（biomacromolecules）の分解能力を有するフラボバクテリュウム−サイトファーガ複合体の種は、藻類の細胞壁と、これらから放出される排泄物を栄養原として利用することができるため、植物プランクトンと密接な関係を有することと思われる。
これまで研究された結果によれば、殺藻細菌の殺藻メカニズムは二つに大別して定義することができる。第一のメカニズムは、殺藻細菌が赤潮生物の表面に付着して赤潮生物を溶解する接触によるメカニズムであって、サイトファーガ種及びアルテロモナス種がその代表的な例として知られている。第二のメカニズムは、殺藻細菌が殺藻物質を細胞外に分泌して、赤潮生物の成長を抑制または溶解するメカニズムであって、大部分の殺藻細菌がこれに属する。海から分離された大部分の殺藻細菌は、細胞外の物質を生成するメカニズムを有するが、このような物質の分離、同定及びメカニズムについての報告はほとんどない。
本発明者らは、赤潮生物であるスケレトネマ・コスタータム（Skeletonema costatum）を殺す殺藻細菌であるコルディア・アルジシダ（Kordia algicida）ＯＴ−１菌株を分離し、これを２００８年４月２４日付で韓国生命工学研究院内の生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures：KCTC）に寄託したことがある（寄託番号：KCTC11320BP；寄託日：2008. 4. 8）。
また、ＮＣＢＩ（national center for biotechnology information）に登録された菌株との１６Ｓ ｒＲＮＡの類似性を調査し、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を分析した結果、前記菌株は、フラボバクテリア（Flavobacteria）に属する新規な菌株であることが確認された（Sohnら, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54:675-680, 2004）。
Sohnら, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54:675-680, 2004
Oppenheimer, C. H., et al., J. Mar. Res., 11:10-18, 1952
Stein, Handbook of phycological methods, Cambridge Univ. Press, 1973
Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970
Park, H. I., J. Biol. Chem., 275:20540-20544, 2000
本発明の目的は、赤潮生物の成長を抑制することができる新規なタンパク質及びそれをコーディングする遺伝子を提供することである。
本発明の他の目的は、前記タンパク質を活性成分として含む殺藻製剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記製剤を利用して赤潮発生地域を処理する方法を提供することである。
本発明は、配列番号：１、４乃至７、２６及び２７のうち何れか一つのアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素及び前記タンパク質分解酵素をコーディングする遺伝子を提供する。
また、本発明は、前記タンパク質分解酵素を活性成分として含む殺藻製剤を提供する。
また、本発明は、前記殺藻製剤を赤潮現象が発生した地域に処理するステップを含む赤潮防除方法を提供する。さらに詳細には、コルディア・アルジシダＯＴ１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）を利用して、配列番号１、７及び２７からなる群から選択された何れか一つ以上のタンパク質分解酵素を生産するステップと、前記生産されたタンパク質分解酵素を活性成分として含む殺藻製剤を海に投入するステップとを含むことを特徴とする赤潮防除方法を提供する。前記殺藻製剤は、前記タンパク質分解酵素を生産するコルディア・アルジシダＯＴ１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）と同時に投入するか、または前記コルディア・アルジシダＯＴ１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）の培養物から純粋または部分的に分離したタンパク質分解酵素を有効成分にして投入することができる。前記培養時に、海水の状態に相応するように、ＮａＣｌ ０．５〜６％、Ｍｇ２＋ ０．０５ｇ−１．２ｇ／ｌ及びＣａ２＋ ０．０５−１．０ｇ／ｌを含む培地を使用することができる。
本発明は、殺藻細菌であるコルディア・アルジシダＯＴ−１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）から分離した配列番号：１のアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素を提供する。
配列番号：１のアミノ酸配列で、１乃至２７番目のアミノ酸は信号ペプチドに該当し、２８乃至９８番目のアミノ酸はプロセッシング・ペプチドに該当し、９９乃至２７８番目のアミノ酸は成熟タンパク質に該当し、前記成熟タンパク質は金属結合部位（２００乃至２１７番目のアミノ酸）を含む（図３）。
前記タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質分解酵素の機能に影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸の置換、付加または欠損が行われ、目的によってタンパク質の一部のみが使用されることもでき、このように変形したアミノ酸配列も本発明の範囲に属する。したがって、本発明は、前記タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びその断片を含む。
したがって、本発明は、前記タンパク質で信号ペプチドを含んでいない、配列番号：２６のアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素、及び信号ペプチド及びプロセッシング・ペプチドを含んでいない、配列番号：２７のアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素も含む。
前記タンパク質をコーディングする遺伝子は、コドンの縮退性（degeneracy）によって、または前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、前記タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われることができ、コーディング領域を除いた部分においても、タンパク質の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形が行われることができ、そのような変形遺伝子も本発明の範囲に属する。したがって、本発明は、前記配列番号：１のアミノ酸配列をコーディングする塩基配列と実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド及びその断片を含み、好ましくは、配列番号：２の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む。
また、前記配列番号：２６及び２７のアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素をコーディングする、配列番号：２８及び２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドも含む。
前記配列番号：１のタンパク質分解酵素は、成熟タンパク質の部分の外にプロセッシング・ペプチドをさらに含む場合に、タンパク質の分解活性がさらに優れており、プロセッシング・ペプチド及び成熟タンパク質を含むタンパク質は経時的に自己切断（autocleavage）されて、成熟タンパク質に変換し（図７及び図８）、成熟タンパク質のＣ−末端がタンパク質のプロセッシングに非常に重要な役割を行うということが分かる。
また、本発明のタンパク質分解酵素は、ｐＨ６．５乃至ｐＨ８、好ましくは、ｐＨ７乃至ｐＨ８、及び温度１８乃至２８℃、好ましくは、２０乃至２３℃、最も好ましくは、２０℃で、８０乃至１００ｍＭのカルシウムイオンの存在下で最適の活性を示し（図９、図１０及び図１２）、亜鉛イオンは、タンパク質分解酵素の活性を阻害するということが確認された（図１１）。
また、配列番号：１のアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質分解酵素は、コックロディニウム・ポリクリコイデス（Cochlodinium polykrikoides）、タラシオシラ種（Thalassiosira sp.）、ヘテロシグマ・アカシオ（Heterosigma akashiwo）、スケレトネマ・コスタータム（Skeletonema costatum）、アレキサンドリウム（Alexandrium sp）、キートセロス（Chaetoceros cuvisetus）、ギムノディニウム属（Gymnodium sp）などの藻類に対して優れた殺藻活性を示す。
配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質分解酵素は、フラボバクテリュウム・ジョンソニエＵＷ１０１（ＺＰ＿０１２４７０９５、配列番号：４）、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９（ＺＰ＿００９５１３４４、配列番号：５）及びリューエンホキエラ・ブランデンシスＭＥＤ２１７（ＺＰ＿０１０５９７８０、配列番号：６）と８０％以上の遺伝子被覆率（gene coverage）で４０％以上の同一性を示し、特に、プロセッシング・ペプチド以後の成熟したプロテアーゼ部分は、５０％以上の高い相同性を示す（図１３）。また、コルディア・アルジシダのＫＡＯＴ１＿１１５６２遺伝子（配列番号：７）とも高い相同性を示す（図１４）。
また、このようなタンパク質の発現形態及び活性は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質とほぼ類似している（図１６）。
前述のように、各タンパク質をコーディングする遺伝子は、前記タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内で多様な変形が行われることができるため、本発明は、前記配列番号：４乃至７のアミノ酸配列をコーディングする各塩基配列と実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド及びその断片を含み、これらは、好ましくは、配列番号：８乃至１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明の殺藻活性タンパク質分解酵素は、優れた殺藻活性を示すため、前記タンパク質及びそれをコーディングする遺伝子は、赤潮の防除に有用に使用されることができる。
したがって、本発明は、前記配列番号：１及び４乃至７のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質を活性成分として含む殺藻製剤を提供する。前記活性成分は、組成物の総重量を基準に約１乃至９９重量％含まれることができる。
また、本発明は、赤潮が発生した海水に前記殺藻製剤を処理して赤潮を防除する方法を提供する。
本発明の方法において、前記殺藻製剤の使用量は、有機物の蓄積程度、赤潮発生程度などによって可変的である。
前記製剤の使用方法は、海水面上に撒布するか、またはパイプで海の干潟などに撒布するなど、多様な方法が適用されることができるが、これらに限定されるものではなく、このとき、前記方法は、殺藻製剤の状態及び殺藻製剤が適用される海水または湖の状態を考慮して適切に使用することができる。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１）殺藻細菌の培養
殺藻細菌であるコルディア・アルジシダＯＴ−１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）をゾベル（ZoBell）２２１６ｅ固形培地（文献［Oppenheimer, C. H., et al., J. Mar. Res., 11:10-18, 1952］参照）で成長させた後、１００ｍｌのゾベル２２１６ｅ液体培地（前記文献［Oppenheimer, C. H., et al., 1952］参照）に３％（ｖ／ｖ）の量を接種して、２５℃で１５０ｒｐｍで１日間振とう培養して前培養液を準備した。３ｌのゾベル２２１６ｅ液体培地の含まれた５ｌのジャー・ファーメンター（韓国の発酵器社）に前記培養液を３％（ｖ／ｖ）添加した後、２５℃、３００ｒｐｍ及び０．５ｖｖｍの条件下で培養した。
殺藻細菌であるコルディア・アルジシダＯＴ−１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）をゾベル（ZoBell）２２１６ｅ固形培地（文献［Oppenheimer, C. H., et al., J. Mar. Res., 11:10-18, 1952］参照）で成長させた後、１００ｍｌのゾベル２２１６ｅ液体培地（前記文献［Oppenheimer, C. H., et al., 1952］参照）に３％（ｖ／ｖ）の量を接種して、２５℃で１５０ｒｐｍで１日間振とう培養して前培養液を準備した。３ｌのゾベル２２１６ｅ液体培地の含まれた５ｌのジャー・ファーメンター（韓国の発酵器社）に前記培養液を３％（ｖ／ｖ）添加した後、２５℃、３００ｒｐｍ及び０．５ｖｖｍの条件下で培養した。
（実施例２）赤潮生物の準備
殺藻細菌の探索のための宿主生物は、コックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属を利用し、各藻類をＦ／２液体培地（ＮａＮＯ３ ０．０７５ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ０．００５ｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ ０．０３０ｇ、Ｆ／２微量金属溶液１ｍｌ、Ｆ／２ビタミン溶液１ｍｌ及び熟成海水１, ０００ｍｌ； Stein, Handbook of phycological methods, Cambridge Univ. Press, 1973）を利用して対数増殖期に培養した後、探索のために次のように準備した。
殺藻細菌の探索のための宿主生物は、コックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属を利用し、各藻類をＦ／２液体培地（ＮａＮＯ３ ０．０７５ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ０．００５ｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ ０．０３０ｇ、Ｆ／２微量金属溶液１ｍｌ、Ｆ／２ビタミン溶液１ｍｌ及び熟成海水１, ０００ｍｌ； Stein, Handbook of phycological methods, Cambridge Univ. Press, 1973）を利用して対数増殖期に培養した後、探索のために次のように準備した。
赤潮生物は、蛍光光度計（Hitachi、日本）を利用して、最終の密度が０．０５の蛍光強度（励起波長；４３４ｎｍ、放出波長；６７０ｎｍ）になるようにＦ／２液体培地で希釈した後、試験管（１１０mm×１０mm）に２. ７ｍｌずつ分注して、ＭＰＮ（most probable number）法のための試験管を準備した。
（実施例３）殺藻活性タンパク質の選別
＜３−１＞殺藻細菌タンパク質の精製及び分離
前記実施例１で培養された殺藻細菌の殺藻活性タンパク質を分離するために、前記実施例１で培養された殺藻細菌を、５ｌのジャー・ファーメンターを利用して３０時間培養した後、限外ろ過膜濃縮装置（Ultrafiltration kit）を利用して１０ｋＤａ以上の物質を濃縮した後、非変性（native）−ＰＡＧＥ（１２％）を行ってタンパク質を分離し、その結果を図１に示した。図１で、レーン１はサイズマーカーであり、レーン２は殺藻細菌タンパク質である。
前記実施例１で培養された殺藻細菌の殺藻活性タンパク質を分離するために、前記実施例１で培養された殺藻細菌を、５ｌのジャー・ファーメンターを利用して３０時間培養した後、限外ろ過膜濃縮装置（Ultrafiltration kit）を利用して１０ｋＤａ以上の物質を濃縮した後、非変性（native）−ＰＡＧＥ（１２％）を行ってタンパク質を分離し、その結果を図１に示した。図１で、レーン１はサイズマーカーであり、レーン２は殺藻細菌タンパク質である。
＜３−２＞分離されたタンパク質の殺藻活性の測定
前記＜３−１＞のように分離されたタンパク質を、１０％のポリアクリルアミド・ゲルで２０ｍＡの定電流で１００分間非変性電気泳動させた後、ゲルの一部をクマシーブリリアントブルー（Coomassive brilliant blue）Ｒ−２５０で染色してバンドの位置を確認した。残りのゲルから、バンドのパターンによって１３個のバンドに区分して小さいサイズに切片した後、１．５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）を入れ、４℃の冷蔵庫中で２時間放置した。前記溶液を遠心分離してゲルを沈澱させた後、上澄み液はウルトラコン（Ultracon, cut-off size, 10kDa）を利用して濃縮し、濃縮した試料は、スケレトネマ・コスタータムを利用したローン（lawn）分析法によって殺藻活性を測定した。このとき、陽性対照群としては、殺藻細菌の培養液を使用し、陰性対照群としては、試料の条件によってゾベル２２１６ｅ液体培地、Ｆ／２培地及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液を使用した。
前記＜３−１＞のように分離されたタンパク質を、１０％のポリアクリルアミド・ゲルで２０ｍＡの定電流で１００分間非変性電気泳動させた後、ゲルの一部をクマシーブリリアントブルー（Coomassive brilliant blue）Ｒ−２５０で染色してバンドの位置を確認した。残りのゲルから、バンドのパターンによって１３個のバンドに区分して小さいサイズに切片した後、１．５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）を入れ、４℃の冷蔵庫中で２時間放置した。前記溶液を遠心分離してゲルを沈澱させた後、上澄み液はウルトラコン（Ultracon, cut-off size, 10kDa）を利用して濃縮し、濃縮した試料は、スケレトネマ・コスタータムを利用したローン（lawn）分析法によって殺藻活性を測定した。このとき、陽性対照群としては、殺藻細菌の培養液を使用し、陰性対照群としては、試料の条件によってゾベル２２１６ｅ液体培地、Ｆ／２培地及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液を使用した。
具体的に、スケレトネマ・コスタータムを２０℃、光周期１４Ｌ（５０００ルクス（lux））／１０Ｄの条件下で１乃至２週間培養した。活性能は、スケレトネマ・コスタータムのローンに発生した透明領域の直径（mm）を測定して活性程度を比較し、透明領域がなければ“−”、透明領域のサイズが１mmであれば“＋”、２mmであれば“＋＋”、３mmであれば“＋＋＋”、５mmであれば“＋＋＋＋”として、その結果を下記表１に示した。
前記表１に示すように、バンド番号３及び１０のタンパク質の殺藻活性が優れているということが分かる。
また、前記で選別されたバンド番号３及び１０のタンパク質を変性条件（文献［ Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970］参照）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってバンド番号１０のタンパク質の発現を確認した後（図２；レーン１：サイズマーカー、レーン２：殺藻細菌タンパク質、レーン３：バンド番号３のタンパク質及びレーン４：バンド番号１０のタンパク質）、前記タンパク質のＮ−末端のアミノ酸配列を分析した結果、２０個のアミノ酸を有する配列番号：３のアミノ酸配列を得た。
その後、前記アミノ酸配列をＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ、ＰＤＦ及びＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどのタンパク質配列データベースを利用して類似性を検索した結果、既存に報告されたタンパク質配列とは類似性がないということが分かった。
（実施例４）殺藻活性タンパク質のＯＲＦ（open reading frame）の識別
殺藻細菌であるコルディア・アルジシダＯＴ−１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）の誘電体配列を分析した後、配列番号：３のＮ−末端アミノ酸配列を利用してデータマイニング（data mining）を行った結果、配列番号：３の２０個アミノ酸のうち１８個が一致するＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質（配列番号：１）を確認した。
殺藻細菌であるコルディア・アルジシダＯＴ−１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）の誘電体配列を分析した後、配列番号：３のＮ−末端アミノ酸配列を利用してデータマイニング（data mining）を行った結果、配列番号：３の２０個アミノ酸のうち１８個が一致するＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質（配列番号：１）を確認した。
（実施例５）殺藻活性タンパク質発現ベクターの構築
前記配列番号：１のＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質は、図３に示すように、信号ペプチド（１乃至２７番目のアミノ酸）、プロセッシング・ペプチド（２８乃至９８番目のアミノ酸）及び成熟領域（９９乃至２７８番目のアミノ酸）から構成されたメタロプロテアーゼ（metallo protease）であると予測され、野生型菌株から分離されたＮ−末端配列は細胞外に分泌されて、プロセッシング・ペプチドの除去された成熟したタンパク質分解酵素であると予想された。
したがって、前記タンパク質の殺藻活性を確認するために、図４に示すような多様なタンパク質が発現されるように、下記のようにそれぞれの発現ベクターを構築した。
まず、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を有するようにデザインされた下記表２のプライマー組合せ、鋳型として配列番号：２の遺伝子及びＴＬＡ１ポリメラーゼ（Bioneer社、韓国）を使用して配列番号：１のＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質またはその断片をコーディングする多様なＤＮＡをＰＣＲで増幅した。前記ＰＣＲは、９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０回繰り返した。
前記配列番号：１のＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質は、図３に示すように、信号ペプチド（１乃至２７番目のアミノ酸）、プロセッシング・ペプチド（２８乃至９８番目のアミノ酸）及び成熟領域（９９乃至２７８番目のアミノ酸）から構成されたメタロプロテアーゼ（metallo protease）であると予測され、野生型菌株から分離されたＮ−末端配列は細胞外に分泌されて、プロセッシング・ペプチドの除去された成熟したタンパク質分解酵素であると予想された。
したがって、前記タンパク質の殺藻活性を確認するために、図４に示すような多様なタンパク質が発現されるように、下記のようにそれぞれの発現ベクターを構築した。
まず、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を有するようにデザインされた下記表２のプライマー組合せ、鋳型として配列番号：２の遺伝子及びＴＬＡ１ポリメラーゼ（Bioneer社、韓国）を使用して配列番号：１のＫＡＯＴ１＿１０４７６タンパク質またはその断片をコーディングする多様なＤＮＡをＰＣＲで増幅した。前記ＰＣＲは、９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０回繰り返した。
その後、ｐＥＴ２４ａ発現ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで処理して切断した後、プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を利用して精製し、前記で得た各ＰＣＲ産物とライゲーションさせた後、大膓菌ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド精製キットを利用して前記で得た形質転換体からＤＮＡを精製した後、これを配列分析して突然変異やフレーム移動が起こっていない完全なＤＮＡがクローニングされたことを確認した後、前記ＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換した。
（実施例６）殺藻活性タンパク質分解酵素の発現及びリフォールディング
前記実施例５で得た形質転換体をカナマイシン（kanamycin, 50ug/ml）の添加されたＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社）に接種して、３７℃で１２時間培養した後、前記培養物を前記と同一の培地に１％（ｖ／ｖ）で接種して３時間培養した後、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社）を１ｍＭの最終の濃度で添加してタンパク質分解酵素を過発現させた。各タンパク質分解酵素の発現程度及び時期を分析するために、１時間周期でサンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、培養３時間後のタンパク質分解酵素の発現程度を図５に示した。
前記実施例５で得た形質転換体をカナマイシン（kanamycin, 50ug/ml）の添加されたＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社）に接種して、３７℃で１２時間培養した後、前記培養物を前記と同一の培地に１％（ｖ／ｖ）で接種して３時間培養した後、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社）を１ｍＭの最終の濃度で添加してタンパク質分解酵素を過発現させた。各タンパク質分解酵素の発現程度及び時期を分析するために、１時間周期でサンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、培養３時間後のタンパク質分解酵素の発現程度を図５に示した。
図５に示すように、ＰＣＲ産物１０４７６＿３の挿入されたプラスミドを除き、全てタンパク質分解酵素が発現されるということが確認された。
また、ｐＥＴシステムのプロトコルによって発現されたタンパク質分解酵素が溶解性分画、不溶解性分画及び周辺細胞質領域のうちどこで生産されるかを確認した結果、大部分のタンパク質分解酵素が不溶性タンパク質であるということが確認された。
また、前記で得た１０４７６＿１、１０４７６＿６、１０４７６＿７（配列番号：２７）、１０４７６＿８（配列番号：２６）及び１０４７６＿９タンパク質分解酵素の不溶解性分画に８Ｍウレアを処理してタンパク質分解酵素を可溶化させた後、これを再び緩衝溶液（50mM Tris（ｐＨ8.0）, 1mM CaCl2）で置換させてリフォールディングを行うことによってタンパク質分解酵素を得た（図６を参照）。
その結果、すべてのタンパク質分解酵素がリフォールディングされるということが確認された。
（実施例７）殺藻活性タンパク質分解酵素の分解活性の測定
前記実施例６で得たタンパク質分解酵素をそれぞれゼラチン基質ゲル（gelatin substrate gel）に展開させてタンパク質分解活性を測定（文献［Park, H. I., J. Biol. Chem., 275:20540-20544, 2000］参照）し、その結果を図７に示した。
前記実施例６で得たタンパク質分解酵素をそれぞれゼラチン基質ゲル（gelatin substrate gel）に展開させてタンパク質分解活性を測定（文献［Park, H. I., J. Biol. Chem., 275:20540-20544, 2000］参照）し、その結果を図７に示した。
図７に示すように、１０４７６＿９タンパク質を除いた１０４７６＿１及び１０４７６＿６乃至１０４７６＿８タンパク質はタンパク質分解活性を示す。
また、プロセッシング・ペプチドを含む１０４７６＿８タンパク質（配列番号：２６）の活性を示すバンドは、経時的に徐々に下がりつつ、成熟した領域を発現させた１０４７６＿７タンパク質（配列番号：２７）と類似したサイズを示した。
したがって、１０４７６＿８タンパク質のプロセッシング・ペプチドが経時的に自己切断されて、成熟タンパク質に変換されることを予想することができる。
また、１０４７６＿１タンパク質の結果から、Ｎ−末端のＨｉｓタグの存在がタンパク質分解活性を妨害し、１０４７６＿９タンパク質の結果から、Ｃ−末端の欠損突然変異はプロセッシングされないため、活性を示さないということを予想することができる。
（実施例８）殺藻活性タンパク質分解酵素のプロセッシング現象の観察
本発明の殺藻活性タンパク質分解酵素のプロセッシング現象を観察するために、１０４７６＿８タンパク質（配列番号：２６）を４℃で１週間反応させたことを除き、前記実施例７と同様の方法でタンパク質分解活性分析を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、その結果を図８に示した。
本発明の殺藻活性タンパク質分解酵素のプロセッシング現象を観察するために、１０４７６＿８タンパク質（配列番号：２６）を４℃で１週間反応させたことを除き、前記実施例７と同様の方法でタンパク質分解活性分析を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、その結果を図８に示した。
図８に示すように、１０４７６＿８タンパク質は、反応後３日目にプロセッシング・ペプチドが分解されて、成熟したタンパク質分解酵素に変換される現象が確認され、７日目には２個の主要なバンドが示された。また、主要なタンパク質の量及び時間によって増加した低分子性ペプチドの量を考慮するとき、成熟過程中に自己切断が伴われるということが確認された。
また、前記と同様の方法で１０４７６＿９タンパク質を分析した結果、プロセッシング・ペプチドを含み、Ｃ−末端に５個のアミノ酸が欠損された突然変異である１０４７６＿９タンパク質はよく分離されたが、１０４７６＿８タンパク質のように、バンドのサイズが縮小する現象は観察されなかった。したがって、１０４７６＿９タンパク質はプロセッシングされないことによって活性を示さないため、Ｃ−末端アミノ酸がプロセッシングに重要な役割を行うということが分かる。
（試験例１）殺藻活性タンパク質分解酵素の生化学的な特性の識別
成熟したタンパク質のみを含む１０４７６＿７タンパク質（配列番号：２７）をプロテアーゼの界面活性剤に対する抵抗性とＥＤＴＡを利用した安定性とを組み合わせることにより、ＳＤＳを利用してタンパク質を溶解させた後、これをＳＤＳを含んでいない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００を含む緩衝溶液に希釈してリフォールディングさせた後、温度及びｐＨによるタンパク質分解活性を前記文献［Park, H. I., 2000］に記載した方法によって測定し、その結果をそれぞれ図９及び図１０に示した。
成熟したタンパク質のみを含む１０４７６＿７タンパク質（配列番号：２７）をプロテアーゼの界面活性剤に対する抵抗性とＥＤＴＡを利用した安定性とを組み合わせることにより、ＳＤＳを利用してタンパク質を溶解させた後、これをＳＤＳを含んでいない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００を含む緩衝溶液に希釈してリフォールディングさせた後、温度及びｐＨによるタンパク質分解活性を前記文献［Park, H. I., 2000］に記載した方法によって測定し、その結果をそれぞれ図９及び図１０に示した。
図９及び図１０に示すように、１０４７６＿７タンパク質は、ｐＨ７乃至ｐＨ８及び約２０℃で最適の活性を示した。
また、リフォールディングされたタンパク質５μｇを０．１％のゼラチン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌに１ｍＭの亜鉛またはカルシウムイオンの含まれた緩衝溶液に入れ、２０℃で２時間反応させた後、５％のＴＣＡ溶液（ｗ／ｖ）を入れた後、１０分間氷中で放置し、１０, ０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を利用してタンパク質を定量した。これを、金属の含まれていない対照群と比較して、金属イオンによる活性阻害を測定し、その結果を図１１及び図１２に示した。
図１１に示すように、１０４７６＿７タンパク質に対する亜鉛イオンの阻害活性を確認した。
また、図１２に示すように、タンパク質分解酵素の活性にカルシウムイオンが必須であり、８０乃至１００ｍＭのカルシウムイオンによってタンパク質分解酵素の最大活性が示された。
（試験例２）殺藻活性タンパク質分解酵素の殺藻活性の分析
１０４７６＿７タンパク質分解酵素（配列番号：２７）の殺藻活性を確認するために、実施例２で準備したコックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属（Gymnodniium sp）培養液に前記タンパク質（１００μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。２４時間後に一括的にルゴールヨード溶液（Lugol’s iodine solution、１％）を利用して前記培養液を染色した後、細胞の数を測定して、タンパク質分解酵素の添加されていない対照群とタンパク質分解酵素の添加された実験群（実験群１及び 実験群２）との細胞数及び抑制程度を比較し、その結果を下記表３に示した。
１０４７６＿７タンパク質分解酵素（配列番号：２７）の殺藻活性を確認するために、実施例２で準備したコックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属（Gymnodniium sp）培養液に前記タンパク質（１００μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。２４時間後に一括的にルゴールヨード溶液（Lugol’s iodine solution、１％）を利用して前記培養液を染色した後、細胞の数を測定して、タンパク質分解酵素の添加されていない対照群とタンパク質分解酵素の添加された実験群（実験群１及び 実験群２）との細胞数及び抑制程度を比較し、その結果を下記表３に示した。
前記表３に示すように、コックロディニウム・ポリクリコイデス菌株に配列番号：１のタンパク質分解酵素を処理すれば、菌株の成長が効果的に抑制されるということが確認された。また、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属に対しても効果があるということが確認された。
（実施例９）相同性を有する遺伝子の検索
殺藻効果が確認された本発明のタンパク質分解酵素のアミノ酸配列（配列番号：１）に基づいて、多様な海洋微生物のアミノ酸配列をＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔを利用して分析した結果、図１３に示すように、フラボバクテリュウム・ジョンソニエＵＷ１０１（ＺＰ＿０１２４７０９５、配列番号：４）、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９（ＺＰ＿００９５１３４４、配列番号：５）及びリューエンホキエラ・ブランデンシスＭＥＤ２１７（ＺＰ＿０１０５９７８０、配列番号：６）と８０％以上の遺伝子被覆率で４０％以上の同一性を示し、特に、プロセッシング・ペプチド以後の成熟したプロテアーゼ部分は５０％以上の高い相同性を示した。また、図１４に示すように、コルディア・アルジシダのＫＡＯＴ１＿１１５６２遺伝子（配列番号：７）とも高い相同性を示した。
殺藻効果が確認された本発明のタンパク質分解酵素のアミノ酸配列（配列番号：１）に基づいて、多様な海洋微生物のアミノ酸配列をＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔを利用して分析した結果、図１３に示すように、フラボバクテリュウム・ジョンソニエＵＷ１０１（ＺＰ＿０１２４７０９５、配列番号：４）、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９（ＺＰ＿００９５１３４４、配列番号：５）及びリューエンホキエラ・ブランデンシスＭＥＤ２１７（ＺＰ＿０１０５９７８０、配列番号：６）と８０％以上の遺伝子被覆率で４０％以上の同一性を示し、特に、プロセッシング・ペプチド以後の成熟したプロテアーゼ部分は５０％以上の高い相同性を示した。また、図１４に示すように、コルディア・アルジシダのＫＡＯＴ１＿１１５６２遺伝子（配列番号：７）とも高い相同性を示した。
（実施例１０）相同性を有する殺藻活性タンパク質の発現
配列番号：１の殺藻活性タンパク質分解酵素と相同性を示す殺藻活性タンパク質を発現させるために、下記表４のプライマーの組合せ、及び鋳型としてそれぞれ配列番号：４乃至７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコーディングする遺伝子（配列番号：８乃至１１）を使用したことを除き、前記実施例５と同様の方法でＰＣＲを行い、その結果を図１５に示した。
配列番号：１の殺藻活性タンパク質分解酵素と相同性を示す殺藻活性タンパク質を発現させるために、下記表４のプライマーの組合せ、及び鋳型としてそれぞれ配列番号：４乃至７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコーディングする遺伝子（配列番号：８乃至１１）を使用したことを除き、前記実施例５と同様の方法でＰＣＲを行い、その結果を図１５に示した。
その後、前記各ＰＣＲ産物を使用したことを除き、前記実施例５と同様の方法でｐＥＴ２４発現ベクターにクローニングし、前記実施例６と同様の方法でタンパク質を過剰発現させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、４種のタンパク質が何れも良好に発現されたが、何れも不溶性分画で検出された。したがって、活性を測定しようと前記試験例１と同様の方法でタンパク質を溶解させた後（前）、これを、ＳＤＳを含んでいない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％のトライトンＸ−１００を含む緩衝溶液に希釈してリフォールディング（後）を試み、その結果を図１６に示した。
図１６に示すように、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９のタンパク質（配列番号：５）を除いた他のタンパク質の場合、多量の成熟したタンパク質を得ることができた。
（試験例１１）相同性を有する殺藻活性タンパク質の殺藻活性の分析
フラボバクテリュウム・ジョンソニエＵＷ１０１（ＺＰ＿０１２４７０９５、配列番号：４）、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９（ＺＰ＿００９５１３４４、配列番号：５）、リューエンホキエラ・ブランデンシスＭＥＤ２１７（ＺＰ＿０１０５９７８０、配列番号：６）、コルディア・アルジシダのＫＡＯＴ１＿１１５６２遺伝子（配列番号：７）で製造されたタンパク質の殺藻活性を確認するために、実施例２で準備したコックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属の培養液に前記タンパク質（100μg/ml）５０μｌを添加した。２４時間後に一括的にルゴールヨード溶液（１％）を利用して前記培養液を染色した後、細胞数を測定し、タンパク質分解酵素の添加されていない対照群とタンパク質分解酵素の添加された実験群（実験群１及び実験群２）との細胞数及び抑制程度を比較し、その結果、コックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属に対しても効果があるということが確認された。
フラボバクテリュウム・ジョンソニエＵＷ１０１（ＺＰ＿０１２４７０９５、配列番号：４）、クロセイバクター・アトランチカスＨＴＣＣ２５５９（ＺＰ＿００９５１３４４、配列番号：５）、リューエンホキエラ・ブランデンシスＭＥＤ２１７（ＺＰ＿０１０５９７８０、配列番号：６）、コルディア・アルジシダのＫＡＯＴ１＿１１５６２遺伝子（配列番号：７）で製造されたタンパク質の殺藻活性を確認するために、実施例２で準備したコックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属の培養液に前記タンパク質（100μg/ml）５０μｌを添加した。２４時間後に一括的にルゴールヨード溶液（１％）を利用して前記培養液を染色した後、細胞数を測定し、タンパク質分解酵素の添加されていない対照群とタンパク質分解酵素の添加された実験群（実験群１及び実験群２）との細胞数及び抑制程度を比較し、その結果、コックロディニウム・ポリクリコイデス、タラシオシラ種、ヘテロシグマ・アカシオ、スケレトネマ・コスタータム、アレキサンドリウム種、キートセロス、ギムノディニウム属に対しても効果があるということが確認された。
このように、本発明の殺藻活性タンパク質は、赤潮生物の成長を効果的に抑制するため、赤潮発生地域で赤潮の防除に有用に使用されることができる。
Claims (11)
- 配列番号：１、４、７、２６及び２７のうち何れか一つのアミノ酸配列を有する殺藻活性タンパク質分解酵素。
- 前記殺藻活性タンパク質分解酵素が配列番号：２６のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の殺藻活性タンパク質分解酵素。
- 前記殺藻活性タンパク質分解酵素が配列番号：２７のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の殺藻活性タンパク質分解酵素。
- 請求項１に記載のタンパク質分解酵素をコーディングするヌクレオチド。
- 配列番号：２、８、１１、２８及び２９のうち何れか一つの塩基配列を有することを特徴とする請求項４に記載のヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチドが配列番号：２８の塩基配列を有することを特徴とする請求項５に記載のヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号：２９の塩基配列を有することを特徴とする請求項５に記載のヌクレオチド。
- 配列番号：１、４乃至７、２６及び２７のうち何れか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質分解酵素を活性成分として含む殺藻製剤。
- 請求項８に記載の製剤を、赤潮現象の発生した地域に処理するステップを含むことを特徴とする赤潮防除方法。
- コルディア・アルジシダ（Kordia algicida）ＯＴ１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）を利用して、配列番号１、７及び２７からなる群から選択されるタンパク質分解酵素を生産するステップと、
前記生産されたタンパク質分解酵素を活性成分として含む殺藻製剤を海に投入するステップと、を含むことを特徴とする赤潮防除方法。 - 前記殺藻製剤を前記生産菌株コルディア・アルジシダＯＴ１菌株（ＫＣＴＣ １１３２０ＢＰ）と同時に投入することを特徴とする請求項１０に記載の赤潮防除方法。
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