CN104131002A

CN104131002A - 一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法

Info

Publication number: CN104131002A
Application number: CN201410293899.0A
Authority: CN
Inventors: 孙朋飞; 赵宇华; 王冠; 卢丽玲
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开了一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法，通过Tail-PCR以及常规PCR技术克隆出了柠檬酸杆菌中的溶藻关键基因。本发明通过转座子以基因重组方式整合到细菌基因组上，从而制备出其突变株，进而使用Tail-PCR克隆出插入位点，克隆出上游基因，再根据上游基因与CitrobacterfreundiiCFNIH1基因组中glucose-1-phosphateadenylyltransferase基因设计一对引物，通过PCR扩增后得到溶藻基因下游基因，将上游基因和下游基因拼接，得到完整的柠檬酸杆菌溶藻基因。

Description

一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法。

背景技术

目前，水污染问题日益加重，尤其是水华的爆发每年都会对人类的生活活动造成不同程度的影响，已严重威胁到人类及其他生物的安全。为了避免传统物理治藻、化学治藻方法在水华治理过程中造成的二次污染，近几年使用生物治藻的研究越来越多，但是这些研究多数集中在表层溶藻现象的研究，很少在基因层面上对溶藻菌的溶藻机制进行研究。

目前，转座突变技术是一种常用的未知基因获取方法，而常用的用于柠檬酸杆菌突变株构建的转座子如载体pAG408上的Tn5转座子、载体pFAG1820上的Tn5转座子均以卡那霉素抗性基因作为筛选基因，而本发明中的柠檬酸杆菌具有很高的卡那霉素抗性，因此用此类转座子很难进行突变株的构建，寻找合适的适用于该柠檬酸杆菌突变株的构建方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：以柠檬酸杆菌突变株基因组为模板进行tail-PCR，扩增出柠檬酸杆菌中转座子插入位点，得到长度为559bp的上游基因，该上游基因序列如SEQ ID NO.5所示，进一步通过PCR扩增技术克隆出其完整下游基因，该下游基因序列如SEQ ID NO.20所示，将上游基因和下游基因拼接，得到完整的柠檬酸杆菌溶藻基因，该基因序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的有益效果是，通过验证可知含有Tc1/himar1 mariner transposon vector pFAC的质粒pFAC能够成功用于具有高卡纳抗性的柠檬酸杆菌突变株的构建，可以为柠檬酸杆菌基因功能的研究提供技术借鉴，也是首次证明该转座子能够成功应用于柠檬酸杆菌属突变株的构建。同时，柠檬酸杆菌溶藻基因的获得，对于柠檬酸杆菌属细菌溶藻机理的研究具有一定的指导作用。

所述柠檬酸杆菌突变株(TR1)保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.9199，分类命名：柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，保藏日期为2014年5月23日。

附图说明

图1是质粒pFAC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围，若未特殊指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段。

实例1一种柠檬酸杆菌溶藻突变株(TR1)的制备方法，包括以下步骤：

(1)培养基的配制

LB培养基的配置：以水为溶剂，每升中含有5g酵母粉、10g蛋白胨和10g NaCl。

固体培养基的配置：在上述LB培养基中加入2％琼脂粉。必要时，在培养基中加入50μg/mL的庆大霉素(Gm)以增加培养基的选择性。

MM培养基的配置：以水为溶剂，每升中含有2gK₂HPO₄·3H₂O，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.2g(NH₄)₂SO₄、0.03g CaCl₂，0.9gNaCl，微量元素溶液0.5mL，20g葡萄糖；其中，微量元素溶液配方为：MnSO₄1.2311g/L，ZnSO₄0.356g/L，FeSO₄0.256g/L，CuSO₄·5H₂O0.3127g/L。

(2)柠檬酸杆菌突变株的制备

(2.1)使用5mL LB(含有50μL浓度为30mM的DAP，7.5μL浓度为10mg/mL的庆大霉素)培养基培养E.coli WM3064，5mLLB培养基培养的柠檬酸杆菌(R1)，培养条件均为37℃，200rpm，12h。

柠檬酸杆菌R1保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.9198，分类命名：柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，保藏日期为2014年5月23日。

(2.2)将2mLE.coli WM3064的LB培养液与1mL柠檬酸杆菌(R1)的LB培养液混匀，使用注射器注射到滤膜上，取下滤膜，将滤膜含菌面朝上贴在LB平板上(含DAP和庆大霉素)，37℃培养12h；

(2.3)使用无菌水洗脱滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布在含有庆大霉素(浓度为15μg)的LB平板上，37℃倒置培养24h；

(2.4)挑取单菌落到MM培养基中，培养48h后，使用24板挑选出溶藻活性丧失的菌株，即柠檬酸杆菌突变株(TR1)；

(3)突变株(TR1)的验证

根据质粒pFAC上庆大霉素抗性基因，质粒pFAC的序列如SEQ ID NO.1所示，庆大霉素抗性基因的序列如SEQ ID NO.21所示，设计一对引物(Gm-S/Gm-A)，Gm-S的序列如SEQ ID NO.7所示，Gm-A的序列如SEQ ID NO.8所示，

以突变株基因组作为模板进行PCR验证，将大小在331bp的突变株基因条带割胶回收，送至上海生工测序，将测序结果(序列如SEQ ID NO.2所示)与质粒pFAC上携带的庆大霉素基因序列比较相似度；同时对筛选到的突变株进行16SrDNA测序(序列如SEQ ID NO.3所示)，测序结果与原始菌株16SrDNA(序列如SEQ ID NO.4所示)序列比对，比较突变株是否由原始菌株突变而来。

从测序(序列如SEQ ID NO.2)可以看出，该序列大小为331bp，经过blast比对结果可知，该序列一段庆大霉素抗性基因序列，由于原始菌株中并没有庆大霉素基因，因此可以说明，该突变株中的庆大霉素基因是转座子所携带的，即成功的发生了专做突变。同时将突变株16SrDNA测序结果(序列如SEQ ID NO.3所示)与原始菌株16SrDNA测序结果(序列如SEQ ID NO.4所示)blast比对后发现，其相似度为100％，均为柠檬酸杆菌属，即证明该突变株是由原始柠檬酸杆菌突变而来的。

实例2：一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法，包括以下步骤：

(1)获取上游基因

以实施例1得到的柠檬酸杆菌突变株的基因组为模板，根据质粒pFAC序列设计两对引物(Round1-S/Round1-A，Round2-S/Round2-A)进行tail-PCR，Round1-S的序列如SEQIDNO.11所示，Round1-A的序列如SEQ ID NO.12所示，Round2-S的序列如SEQ ID NO.13所示，Round2-A的序列如SEQ ID NO.14所示，将第二轮PCR结果中条带大小在750bp大小的条带割胶回收，回收产物TA克隆后，转化到大肠杆菌DH5a中，挑取单菌落提质粒并且PCR验证后送测，得到长度为559bp的上游基因，序列如SEQ ID NO.5所示。

(2)获取下游基因

根据上游基因，设计一条特异引物glaA(序列如SEQ ID NO.17所示)，根据Citrobacter freundii CFNIH1基因组中glucose-1-phosphate adenylyltransferase基因(序列如SEQ ID NO.18所示)设计一条引物glaS，glaS序列如SEQ ID NO.19所示，进一步使用PCR扩增技术克隆出其完整的下游基因，下游基因的序列如SEQ ID NO.20所示。

(3)获取完整的溶藻基因

将步骤(1)得到的上游基因和步骤(2)得到的下游基因拼接，得到完整的柠檬酸杆菌的溶藻基因，该基因序列如SEQ ID NO.6所示。

所述PCR体系及扩增条件

(1)庆大霉素抗性验证PCR(总体积为20μl)

(2)柠檬酸杆菌突变株16SrDNA PCR(总体积为20μl)

(3)Tail-PCR

第一轮：(总体积为20μl)

第二轮：(总体积为50μl,以第一轮PCR产物为模板)

(4)转化质粒PCR验证(总体积为20μl)

(5)A克隆体系(总体积为10μl)

SolutionI	5μl
		pMD19-T	0.5μl
胶回收产物	2μl
		水	2.5μl

培养条件：金属浴中16℃，2-3h。

所述引物27F的序列如SEQ ID NO.9所示，引物1492R的序列如SEQ ID NO.10所示，引物M13-47的序列如SEQ ID NO.15所示，引物RV-M的序列如SEQ ID NO.16所示，

(6)下游基因PCR体系(总体积为50μl)

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

accacaccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ctcaaccaag 60

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 120

aataccgcgc cacataacag gttggctgat aagtccccgg tctaacaaag aaaaacacat 180

ttttttgtga aaattcgttt ttattattca acatagttcc cttcaagagc gatacccctc 240

gaattgacgc gtcaattctc gaattgacat aagcctgttc ggttcgtaaa ctgtaatgca 300

agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca gaaccttgac cgaacgcagc ggtggtaacg 360

gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg actgtttttt tgtacagtct atgcctcggg 420

catccaagca gcaagcgcgt tacgccgtgg gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg 480

atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt 540

ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg 600

cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat 660

cagccggact ccgattacct cgggaacttg ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct 720

gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag 780

cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag 840

ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat 900

gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg 960

ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgccac ctaacaattc 1020

gttcaagccg agatcggctt cccggccgac gcgtcctcgg taccgggccc cccctcgagg 1080

tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggaatcat ttgaaggttg 1140

gtactatata aaaataatat gcatttaata ctagcgacgc catctatgtg tcagaccggg 1200

gacttatcag ccaacctgtt agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaaaggctgc 1260

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 1320

ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 1380

gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat acactcacta tagggcgaat tggaggatcc 1440

ggtctaacaa agaaaacaca ttttttgtga aa 1472

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg 120

cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat 180

cagccggact ccgattacct cgggaacttg ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct 240

gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag 300

cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag 360

ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat 420

gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg 480

ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgccac ctaa 534

<210> 3

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcgccctcc cgaaggttaa gctacctact tcttttgcaa cccactccca tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgtggca ttctgatcca cgattactag 120

cgattccgac ttcatggagt cgagttgcag actccaatcc ggactacgac atactttatg 180

aggtccgctt gctctcgcga ggtcgcttct ctttgtatat gccattgtag cacgtgtgta 240

gccctactcg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc agtttatcac 300

tggcagtctc ctttgagttc ccgaccgaat cgctggcaac aaaggataag ggttgcgctc 360

gttgcgggac ttaacccaac atttcacaac acgagctgac gacagccatg cagcacctgt 420

ctcagagttc ccgaaggcac caaagcatct ctgctaagtt ctctggatgt caagagtagg 480

taaggttctt cgcgttgcat cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcatt tgagttttaa ccttgcggcc gtactcccca ggcggtcgac ttaacgcgtt 600

agctccggaa gccacgcctc aagggcacaa cctccaagtc gacatcgttt acggcgtgga 660

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cctggaattc tacccccctc tacaagactc tagcctgcca gtttcggatg cagttcccag 840

gttgagcccg gggatttcac atccgacttg acagaccgcc tgcgtgcgct ttacgcccag 900

taattccgat taacgcttgc accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg 960

gtgcttcttc tgcgagtaac gtcaattgct gcggttatta accacaacac cttcctcctc 1020

gctgaaagta ctttacaacc cgaaggcctt cttcatacac gcggcatggc tgcatcaggc 1080

ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg accgtgtctc 1140

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ttaccccacc tactagctaa tcccatctgg gcacatccga tggcaagagg cccgaaggtc 1260

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<210> 4

<211> 1442

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat 1320

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gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg gcgctaccac ttggatcagg 1440

gc 1442

<210> 5

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta gaccggggac ttaccaatcg tgaacatcag 60

cttataggca atagaatgct taagtgcctc tacgctgagt gtgggcgatg cataagtaaa 120

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atgacttcgc cgcgacttgc cagttaaaat ccatggtcat ggcctgacgt tgtacaaacc 240

gccaaagcga aggccgggac cacaatacga aagcacgccg gatcgcgcgt aacagcgacc 300

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aactgtcaga gactgtatca gccagcccac cggtgcgccg caccagcggc agcgtgccgt 420

actccagtcc atacaactgc gttaagccac acggctcaaa acggctggga accaatatca 480

catcagcccc acccatgatg cggtgcgaga aggcttcgtg atagccgatc tgcaccccca 540

cctgtcctgg atgttccgcc gctgcggcga ggaatccttc ctgtaatacc ggatcgcccg 600

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ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 840

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<210> 6

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

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cggctcaaaa cggctgggaa ccaatatcac atcagcccca cccatgatgc ggtgcgagaa 360

ggcttcgtga tagccgatct gcacccccac ctgtcctgga tgttccgccg ctgcggcgag 420

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acatccggcc cagccgagca acgcaaaacg caggacgtta tcggtataag cgaacaggtt 1140

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<213> 人工合成

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<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

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<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

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<212> DNA

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<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(33)

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<212> DNA

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<400> 13

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

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<210> 15

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<212> DNA

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<400> 15

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<210> 16

<211> 24

<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 18

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

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ttcagggata acgcaggcgc ggtcaatgat acaacgacgt aaccggcatg aacgtcctac 180

ccatacttca ggcaacaaca ctgccgaatc aatgttacag aatgaattca cccgcactcg 240

cgggaacaga acggactgca ccaccaccga accagaaata atacagccgc cggagaccag 300

cgagttcagc gtcattccgt ggctaccgga acggtcctgc acaaatttcg ccggcggcag 360

agattccata tgcgtacgga ttggccagtc ctggtcgtac atatccagtt caggcgttac 420

cgaggccaga tcgaggttgg ccttccagta agcttccagc gttcccacat cgcgccagta 480

cggctcggat tccgggtcag actgtacgca ggacaacggg aagggatgtg catacgccat 540

gccagcttcg gttatttttg ggatgatgtc tttaccgaaa tcgtgactgg agttttcatc 600

gaggtcatct tccgccagta attcatacag gtaatcggcg ttaaaaacgt agatccccat 660

gctggcaaga gatttggtcg ggtcgcccgg catggctggc gggttggcag gtttttcaac 720

gaactcgata attttgtcgc tgtcgtccac gtccatcaca ccaaacgcgc tggcctcttc 780

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catacgcgag tagtcctgct tataaatatg atcgcctgcg aggatcacca catattccgc 900

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

<400> 20

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ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgccac ctaa 534

Claims

1.一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法，其特征在于，该方法具体为：以柠檬酸杆菌突变株基因组为模板进行tail-PCR，扩增出柠檬酸杆菌中转座子插入位点，得到长度为559bp的上游基因，该上游基因序列如SEQ ID NO.5所示，进一步通过PCR扩增技术克隆出其完整下游基因，该下游基因序列如SEQ ID NO.20所示，将上游基因和下游基因拼接，得到完整的柠檬酸杆菌溶藻基因，该基因序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法，其特征在于，所述柠檬酸杆菌突变株保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9199，分类命名：柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.）。