JP5358688B2 - 標識独立検出システムのためのナノ粒子捕捉 - Google Patents
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Description
関連した同時係属出願に対する相互参照
2008年11月26日に出願された標識独立検出システムのためのナノ粒子捕捉と称するヨーロッパ特許出願第08305846.1号の利点を本出願では請求する。
「アッセイ」、「分析する」又は同様の用語は、例えば、リガンド候補化合物又はウイルス粒子又は病原体、表面又は培養条件又は実体のような外因性刺激による刺激時の生物学的の又は細胞の光学的応答又はバイオインピーダンス応答のタイプ、存在、非存在、量、範囲、速度、動態力学を確定するための分析をいう。この種の語は、また、刺激に対する反応又は刺激に対する非生物学的もしくは非細胞応答を含むことができる。
基質表面上にナノ粒子(NP)を有し、ナノ粒子が、金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のうちの少なくとも1つを有する下記化学式(I)
Rは、水素又は置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から6の炭素原子を有する一価のヒドロカルビル部分であり、
R’は、2から18の炭素原子を有する不飽和モノマーと無水マレイン酸との共重合から生じた、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の二価のヒドロカルビル部分であり、
R”は、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から10の炭素原子を有する二価のヒドロカルビル部であり、
Sは、基質に付着する少なくとも一つの付着点を含み、例えば、X置換基を介し重合体に共有結合して接着することができる基質表面基又は表面修飾基であり、
Wは、少なくとも一つの金属イオンキレート基から成り、少なくとも一つのタグを有する生体分子のための初期結合部位であり、例えば、金属イオンの非存在下での金属イオンキレート化基のような少なくとも一つの二座基であり、例えば、キレート化された金属イオンの存在下で少なくとも一つのタグを有する生体分子のための活性結合部位であることができ、
Xは、−NH−基、−NR−基又は−O−基及びそれら同類の二価基であり、
ここで、金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のモル比x:(y+z)は、約2:8から約8:2であり、
ナノ粒子は約10nmから約100nmの直径を有する}で示される重合体から成ることを特徴とするバイオセンサ物品を提供する。
(1)接触工程では、例えばアミノ官能基ケイ素などの変換表面外被を有する基質を、ナノ粒子(NP)に接触させ、ナノ粒子装飾基質を形成する。ここで、ナノ粒子は少なくともマレイン酸無水物モノマーから成る前記化学式(I)の共重合体から成り、そして、かかる共重合体は少なくとも一つの二座基などの基類の金属イオンキレータを有する。
(2)接触工程では、前記ナノ粒子装飾基質を遮断剤に接触させ、イオン化可能基(y)を有する少なくとも一つの共重合体を形成する。ここで、遮断剤はたとえば、エタノールアミンなどの遮断剤化合物である。
(3)接触工程では、結果として生じる遮断された共重合体を、選択された金属イオン溶液に接触させ、少なくとも一つの金属イオン被キレート基(Wでの基(x’))を形成する。
(4)接触工程では、結果として生じる少なくとも一つの金属イオン被キレート基(x’)を有する前記遮断された共重合体とHisタグされた実体とを接触させ、少なくとも一つの金属イオン被キレート基(x’)にて、少なくとも一つの固定されたHisタグされた実体を有する少なくとも一つの共重合体を形成する。
0.96gのエチレン−alt−無水マレイン酸共重合体(EMA)は約1時間の撹拌の下で100mLの無水DMSOに溶かされた。予め調製されたEMAの水溶液に、0.92gのビス−(CML)(すなわちN,N’−ビス[カルボキシメチル]−Lリジン(ニトリロ酢酸)(NTA)(オールドリッチChemicalから入手可能))が添加された。使用するNTAの量は、無水物基の約50mol%をNTA基へ転換することに必要とする量と一致する。結果として生じる水溶液は、室温で、48時間かき混ぜられた。それから、この水溶液はDMSOで約500mLまで希釈され、そして、500mLの無水IPA(50/50v/v)は、撹拌を伴って約1時間で添加され、動的光散乱(DLS)(約30nm)及びSEM(図2B及び2C)によって特徴づけられる重合体ナノ粒子(EMA050NTA)を形成した。
無水エタノールの20mMでの(3−ルカプトプロピル)トリメトキシシラン(3−MPT(Aldrich Chemicals))は、室温で、2時間の間、清浄された金チップに添加される。洗浄した後に、5%のアミノプロピルシルセスキオキサンオリゴマ(APS(Gelest))の水溶液は、室温で、15分間、チップに加えられる。それから、予め被覆されたチップは、100%のNMP(2Dストラテジ)のEMA重合体に、室温で10分間、接触されて、そして、他のチップはEMA重合体散在NMP/IPA(90/10)(3Dストラテジ)のコロイド溶液に、室温で、10分間、接触された。それから、CML(10mLの水の0.5g)の水溶液は、室温で、1時間の両方のチップ上へ添加された。ニッケル水溶液の添加は、BiacoreX設備装置でなされた。Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、20mM(図3)、トリス(HCl)の100μg/mLで、これらの2つの表面(2D及び3D)に固定された。
実施例2の手順が繰り返されて、EMA重合体のコロイド溶液から作られるコーティングを有する金チップを調製された。ニッケル水溶液の添加は、BIACORE X設備において実験チップ上と市販のBIACORE NTAチップ上になされた。Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、トリス(HCl)の125μg/mLで、20mM(図4)これらの2つの表面に固定された。
実施例1の手順が繰り返され、EMA050NTAで被覆された384−ウェルマイクロプレートを調製した。異なるアプローチは、このポリマー層(4エリアに分割されたマイクロプレート)で実行された。部分1及び部分4は、ニッケル水溶液と接触させた。それから、Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、酢酸緩衝液内で、一晩の50μg/mL、両部分の上で固定された。第2のステップにおいて、洗浄した後に、EDC/NHS(200mM/50mM)処理は、部分4だけに適用された。部分2に関して、EDC/NHS処理は、ニッケル添加の前にEMA050NTA上で実行された。部分3に関して、ニッケル添加はEDC/NHS処理の前になされた。それから、Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、酢酸緩衝液内で、部分2及び部分3上で50μg/mL、固定された(Epic(登録商標)応答(図5))。緩衝液PBS+0.1%DMSOの添加はマイクロプレートの第1の部分の固定されたタンパク質上で実行され、そして、タンパク質浸出はEpic(登録商標)設備(図6)で測定された。マイクロプレートの他の部分にて、フロセミドリガンドはPBS及び0.1%のDMSOで固定されたタンパク質上に10μM添加され、そして、結合値はEpic(登録商標)設備装置(図7)によって測定された。HisタグCA2の固定化は、2つの緩衝液(酢酸塩pH5.5又はHEPESpH7.4)において達成された。結果は、約5,000pm(図5)を超える固定化レベルと、結合している25pm(図7)を超える値を示した。タンパク質の損失は、両方の場合で約3pmであり、固定されたタンパク質の約0.1パーセント未満が推定された。
実施例1の手順は繰り返され、EMA050NTAナノ粒子で被覆された384−ウェルマイクロプレートを調製した。ニッケル水溶液の添加の後、Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、酢酸緩衝液又はHEPES及び塩(すなわち150mMのNaCl)緩衝液内で、一晩で挿入物上に50μg/mL、固定された。洗浄の後、EDC/NHS処理(200mM/50mM)が水で30分実行され、タンパク質固定化レベルは、Epic(登録商標)設備(図8)を使用して得られた。緩衝液(PBS及び0.1%のDMSO)の添加はマイクロプレートの一部の固定されたタンパク質上で実行され、そして、タンパク質浸出はEpic(登録商標)設備装置(図9)で測定された。マイクロプレートの他の部分上にて、フロセミドリガンドはPBS及び0.1%のDMSOで固定されたタンパク質上に10μM添加され、そして、結合値はEpic(登録商標)設備装置(図10)によって測定された。
実施例1の手順が繰り返され、EMA−NTAナノ粒子で被覆された384−ウェルマイクロプレートを調製した。ニッケル水溶液の添加の後、Hisタグカルボニックアンヒドラーゼ及び非タグのカルボニックアンヒドラーゼは、酢酸緩衝液又はHEPES及び150mMのNaCl緩衝液内で、一晩で挿入物上に50μg/mL、固定された。洗浄後、EDC/NHS処理(200mM/50mM)が水で30分実行され、タンパク質固定化レベルは、Epic(登録商標)設備(図11)を使用して得られた。
実施例1の手順が繰り返され、EMANTAナノ粒子で被覆された384−ウェルマイクロプレートを調製した。ニッケル水溶液の添加は、マイクロプレートの半分だけに実行された。Hisタグカルボニックアンヒドラーゼは、酢酸緩衝液単独又はHEPES及び150mMのNaCl緩衝液内で、一晩で挿入物各部上に50μg/mL、固定された。洗浄後、EDC/NHS処理(200mM/50mM)が水で30分実行され、タンパク質固定化レベルは、Epic(登録商標)設備(図12)を使用して得られた。
Claims (5)
- 表面上にナノ粒子(NP)を有する基質を含み、前記ナノ粒子が金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のうちの少なくとも1つを有する下記化学式(I)
Rは、水素又は置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から6の炭素原子を有する一価のヒドロカルビル部分であり、
R’は、2から18の炭素原子を有する不飽和モノマーと無水マレイン酸との共重合から生じた、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の二価のヒドロカルビル部分であり、
R”は、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から20の炭素原子を有する二価のヒドロカルビル部であり、
Sは、基質に付着する少なくとも一点を含み、
Wは、少なくとも一つの二座基を含み、
Xは、−NH−基、−NR−基又は−O−基であり、
金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のモル比x:(y+z)は、約2:8から約8:2であり、
ナノ粒子は約10nmから約100nmの直径を有する}で示される重合体を含むことを特徴とするバイオセンサ物品。 - (1)前記ナノ粒子が金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のうちの少なくとも1つを有する下記化学式(I)
Rは、水素又は置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から6の炭素原子を有する一価のヒドロカルビル部分であり、
R’は、2から18の炭素原子を有する不飽和モノマーと無水マレイン酸との共重合から生じた、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の二価のヒドロカルビル部分であり、
R”は、置換若しくは非置換の直鎖若しくは分枝鎖の1から20の炭素原子を有する二価のヒドロカルビル部であり、
Sは、基質に付着する少なくとも一点を含み、
Wは、少なくとも一つの二座基を含み、
Xは、−NH−基、−NR−基又は−O−基であり、
金属イオンキレート化基(x)、イオン化可能基(y)及び表面実質的基(z)のモル比x:(y+z)は、約2:8から約8:2であり、
ナノ粒子は約10nmから約100nmの直径を有する}で示される重合体を含む前記ナノ粒子に、
変換表面外被を有する基質を、接触させ、ナノ粒子装飾基質を形成する接触工程と、
(2)前記ナノ粒子装飾基質を遮断剤に接触させ、イオン化可能基(y’)を有する少なくとも一つの共重合体を形成する接触工程と、
(3)結果として生じる遮断された共重合体を、金属イオン溶液に接触させ、少なくとも一つの金属イオン被キレート基(W)を形成する接触工程と、
(4)接触工程では、結果として生じる少なくとも一つの金属イオン被キレート基(x’)を有する前記遮断された共重合体とHisタグされた実体とを接触させ、少なくとも一つの金属イオン被キレート基にて、少なくとも一つの固定されたHisタグされた実体を有する少なくとも一つの共重合体を形成する接触工程と、
を含むことを特徴とする請求項1に記載のバイオセンサ物品を作成する方法。 - 前記固定されたHisタグされた実体と安定化剤とを接触させ、安定化したHisタグされた実体を有するナノ粒子装飾基質を形成する接触工程を更に含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記Hisタグされた実体と安定化剤とを有するナノ粒子装飾基質とリガンドとを接触させ、安定化したHisタグされた実体を有するナノ粒子装飾基質を形成する接触工程を含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記安定化したHisタグされた実体を有するナノ粒子装飾基質とリガンドとを接触させ、結合リガンドを有するHisタグされた実体を有するナノ粒子装飾基質を形成する接触工程を更に含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
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