JP5260303B2 - 筋肉損失の治療のための方法 - Google Patents

Description

発明の背景

１．技術分野
本発明は、概して、哺乳類における筋肉損失の治療に関する。より詳細には、そのような筋肉損失の治療における、１つ又は２つ以上の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、ＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、又はそれらの任意の組合せ、の投与に関する。本発明は更に、そのような投与に適した栄養製剤に関する。

２．背景技術
アミノ酸は、タンパク質の単量体構成単位であり、タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、イオン若しくは小分子の輸送分子、コラーゲン及び筋組織を始めとする広範な生体化合物を構成する。アミノ酸は、水への溶解性、特に側鎖の極性に基づいて、疎水性又は親水性と見なされる。極性側鎖を有するアミノ酸は親水性であり、非極性側鎖を有するアミノ酸は疎水性である。アミノ酸の溶解性は、タンパク質の構造をある程度決定する。親水性アミノ酸は、タンパク質の表面を構成する傾向があり、疎水性アミノ酸は、タンパク質の、水に不溶性の内部を構成する傾向がある。

通常の２０種のアミノ酸のうち、９種は、人体が合成することができないことから、ヒトにおいて不可欠（必須）と考えられている。むしろ、これらの９種のアミノ酸は、個体が食事から得なければならない。１種又は複数のアミノ酸の欠乏は、負の窒素バランスをもたらす場合がある。負の窒素バランスとは、例えば、摂取されるよりも多くの窒素が排出されることである。このような状態は、酵素活性の喪失及び筋肉量の低下をもたらす可能性がある。

多くの筋消耗状態について、アミノ酸サプリメントによる治療の有効性が判明している。例えば、悪液質は、著明な体重減少、食欲不振、無力症及び貧血を特徴とする重度の身体消耗状態である。悪液質は、癌、敗血症、慢性心不全、関節リウマチ及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を始めとする多くの病気の共通の特徴である。他の筋消耗疾患及び障害としては、例えば、筋肉減少症、加齢に伴う筋肉量低下が知られている。

タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）：
特定の腫瘍が、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）と呼ばれる２４ｋＤａの糖タンパク質の産生を介して悪液質を誘導する可能性があることが判明している。提唱されているＰＩＦの作用機序の１つは、タンパク質合成を低下させることであり、提唱されているＰＩＦの作用機序のもう１つは、タンパク質分解の活性化であり、提唱されている第３の機序は、上述のタンパク質合成の低下及びタンパク質分解の活性化の組合せである。ＰＩＦに関連するタンパク質合成の低下は、タンパク質合成の翻訳プロセスを阻害するＰＩＦの能力によるものとの仮説が立てられている。もう１つの因子であるアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）は同様の作用を示すが、悪液質の一部の症例で観察される筋消耗に関与している可能性がある。

ユビキチン−プロテアソーム経路におけるＰＩＦの元々の役割は知られている。ＰＩＦは、アラキドン酸放出の増大を引き起こし、アラキドン酸は、プロスタグランジン及び１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１５−ＨＥＴＥ）に代謝される。１５−ＨＥＴＥは、タンパク質分解及び転写因子ＮＦ−κＢ（Ｂ細胞においてκ免疫グロブリン軽鎖遺伝子エンハンサーに結合する核因子）の核結合、の顕著な増大を引き起こすことが判明している。

翻訳開始を介したタンパク質合成の制御：
タンパク質合成の阻害におけるＰＩＦの役割は、下流因子のＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）活性化を介して翻訳を阻害するという、ＰＩＦの理論的に裏付けられた能力によるものとの仮説が立てられている。ＰＩＦによるタンパク質合成の阻害は、生理学的濃度又はそれ以下の濃度のインスリンによって減弱される。インスリンは、翻訳開始におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）結合ステップの活性化を介してタンパク質合成を制御するので、上述のことは、ＰＩＦが翻訳開始段階でタンパク質合成を阻害する可能性があることを示唆する。

翻訳の開始には、制御されるステップが２つある。それは、（１）開始メチオニン転移ＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ）の、４０ｓリボソームサブユニットへの結合、及び（２）ｍＲＮＡの、４３ｓ前開始複合体への結合、である。

第１のステップでは、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡが、真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）及びグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）との三重複合体として４０ｓリボソームサブユニットに結合する。次いで、ｅＩＦ２に結合しているＧＴＰが加水分解されてグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）となり、ｅＩＦ２が、ＧＤＰ−ｅＩＦ２複合体としてリボソームサブユニットから放出される。ｅＩＦ２は、新ラウンドの翻訳開始に参加するために、ＧＤＰをＧＴＰと交換しなくてはならない。これは、ｅＩＦ２でのグアニンヌクレオチド交換を媒介する別の真核生物翻訳開始因子、ｅＩＦ２Ｂの作用を介して起こる。ｅＩＦ２Ｂは、ｅＩＦ２のαサブユニットでのリン酸化によって制御され、これにより、ｅＩＦ２はｅＩＦ２Ｂの基質から競合阻害物質へと変換される。

第２のステップでは、ｍＲＮＡの４３ｓ前開始複合体への結合に、ｅＩＦ４Ｆと総称されるタンパク質群、すなわち、ｅＩＦ４Ａ（ＲＮＡヘリカーゼ）、ｅＩＦ４Ｂ（ｅＩＦ４Ａとともに機能して、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域の二次構造を巻き戻す）、ｅＩＦ４Ｅ（ｍＲＮＡの５’末端に存在するｍ７ＧＴＰキャップに結合する）、及びｅＩＦ４Ｇ（ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ及びｍＲＮＡの足場として機能する）、からなるマルチサブユニット複合体が必要となる。ｅＩＦ４Ｆ複合体は共働して、ｍＲＮＡを認識し、その折り畳みを解き、それを４３ｓ前開始複合体に導く。ｅＩＦ４Ｆ複合体形成におけるｅＩＦ４Ｅの利用可能性は、翻訳抑制因子であるｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４Ｅ−ＢＰ１）によって制御されるようである。４Ｅ−ＢＰ１は、ｅＩＦ４Ｇと競合してｅＩＦ４Ｅに結合し、ｅＩＦ４Ｅを不活性複合体中に隔離することができる。４Ｅ−ＢＰ１の結合は、キナーゼである哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）によるリン酸化を介して制御され、リン酸化の増大は、４Ｅ−ＢＰ１のｅＩＦ４Ｅに対する親和性の低下を引き起こす。

ｍＴＯＲは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／セリン／スレオニンキナーゼ経路（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路）のシグナル伝達を介した、結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）１−ＴＳＣ２複合体のリン酸化及び阻害によって活性化されると考えられている。ｍＴＯＲはまた、ｐ７０Ｓ６キナーゼをリン酸化し、ｐ７０Ｓ６キナーゼはリボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化し、リボソームタンパク質Ｓ６は、５’キャップ構造に隣接する一続きのピリミジン残基を有するｍＲＮＡの翻訳を促進する。このようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質としては、リボソームタンパク質、翻訳伸長因子及びポリＡ結合タンパク質が挙げられる。

翻訳開始に関与するタンパク質同化因子：
多数の研究により、タンパク質同化因子（例えば、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、アミノ酸）は、タンパク質合成を増大させ、筋肥大を引き起こすことが示されている。分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、特にロイシンは、翻訳開始を調節するシグナル伝達経路を開始できる。このような経路は、しばしばｍＴＯＲを含む。他の研究では、分裂促進物質（例えば、インスリン及びＢＣＡＡ）は、ｅＩＦ２を通じてシグナルを伝達することが示されている。アミノ酸欠乏は、ｅＩＦ２−αのリン酸化の増大及びタンパク質合成の減少をもたらす。

タンパク質合成及び分解に関与するシグナル伝達経路：
上述のように、ＰＩＦは、ＮＦ−κＢ経路を通じてタンパク質分解を誘導することが知られている。それ故、ＰＩＦによるタンパク質合成の阻害は、共通のシグナル伝達開始点を通じて起こり、次いで、２つの別々の経路に分岐し、一方は、ＮＦ−κＢを通じてタンパク質分解を促進し、他方は、ｍＴＯＲ及び／又はｅＩＦ２を通じてタンパク質合成を阻害する、と考えるのが妥当である。

ＡＫＴはセリン／スレオニンキナーゼであり、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られている。ＡＫＴの活性化は、ＰＩ３Ｋのイノシトール脂質産物の、プレクストリン相同ドメインへの直接結合を介して起こる。ＡＫＴのＰＩ３Ｋ依存性活性化はまた、スレオニン３０８の、ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ１）によるリン酸化を介して起こり、これは、セリン４７３の自己リン酸化をもたらす。最初は別々のシグナル伝達経路のコンポーネントとして作動すると考えられていたが、いくつかの研究により、ＮＦ−κＢ及びＡＫＴシグナル伝達経路は合流することが示された。研究の結果、ＡＫＴシグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、種々の細胞型においてアポトーシスを阻害し、これは、ＮＦ−κＢ活性化に関与するキナーゼであるＩκＫを含むアポトーシス制御コンポーネントをリン酸化する能力によって媒介されることが明らかとなった。したがって、ＡＫＴの活性化は、ＮＦ−κＢの活性化を促進する。これは一連のシグナル伝達事象において、ＡＫＴをＮＦ−κＢ活性化の上流に位置づけるものであるが、ある研究では、ＡＫＴがＮＦ−κＢの下流標的である可能性が報告されている。全体的にみれば、このことは、ＡＫＴが異化経路に関与していることを示唆する。しかし、ＡＫＴが、ｍＴＯＲの活性化と、その結果起こるｐ７０Ｓ６キナーゼ及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化と、を介して同化プロセスにも関与して、タンパク質合成の増大をもたらすことを示唆するデータもある。

ＰＫＲは、抗ウイルス防御経路の制御を担うインターフェロン誘導性、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＰＫＲは、インターフェロン以外の形態の細胞ストレスによって誘導される可能性がある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αもＰＫＲを通じて作用することを示唆する証拠がいくつか存在する。興味深いことに、インターフェロン及びＴＮＦ−αはいずれも、悪液質状態の原因因子とされている。ＰＫＲは、活性化物質（例えば、インスリン、ＩＧＦ、ＢＣＡＡ）との相互作用後に、ホモ二量体を形成して自己リン酸化することが報告されている。結果的に、ＰＫＲは、標的基質のリン酸化を触媒することができるが、ここで最も特徴的なのは、ｅＩＦ２−αサブユニットでのセリン５１のリン酸化である。そして、ｅＩＦ２は、翻訳の律速コンポーネントであるｅＩＦ２Ｂを隔離して、タンパク質合成の阻害をもたらす。最近の研究では、ＰＫＲは、ＩκＫ複合体と物理的に結合しており、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）を刺激し、他方、ＩκＫをリン酸化してその後の分解をもたらすことが示唆される。ＮＦ−κＢが、ｅＩＦ２キナーゼ活性とは独立の機序に基づいてＰＫＲにより活性化されることを示唆する研究があり、他方、ｅＩＦ２−αのリン酸化がＮＦ−κＢの活性化に必要であることを示す研究もある。

ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）は、ｅＩＦ２−αをリン酸化し、ＮＦ−κＢを活性化するもう１つのキナーゼである。しかし、ＰＥＲＫは、ＮＦ−κＢからのＩκＫの放出をもたらすが、その分解は引き起こさないので、ＰＩＦがこの経路を通じて作用するとは考えにくい。更に、ＰＩＦは、ＮＦ−κＢの活性化の際のＩκＫの分解を引き起こすことが判明している。

筋肉損失のための公知の治療法：
悪液質のような状態の治療は、多くの場合、タンパク質合成の増大を目的とした栄養補充、特にアミノ酸補充を含む。３種のＢＣＡＡは、バリン、ロイシン及びイソロイシンである。これまでに、ロイシンは、タンパク質構成単位としてだけではなく、翻訳開始を調節するシグナル伝達経路の誘導因子としても機能することが判明している。本発明者らの最新の研究では、３種のＢＣＡＡのすべてが、同程度に、タンパク質分解を低下させ、タンパク質翻訳を増大させる能力を有することが示唆される。

悪液質は、アミノ酸補充が有効であることが判明している状態、障害及び疾患の１つにすぎない。アミノ酸補充はまた、糖尿病、高血圧症、血清コレステロール高値及びトリグリセリド高値、パーキンソン病、不眠、薬物及びアルコール嗜癖、疼痛、不眠、並びに低血糖を治療するためにも用いられている。ＢＣＡＡの補充は、肝機能障害（肝硬変等）を含む肝臓障害；胆嚢疾患；舞踏病及びジスキネジア；並びに尿毒症を含む腎臓障害、の治療に特に使用されている。ＢＣＡＡ補充はまた、血液透析を受けている患者の治療においても奏功し、健康及び気分全般の改善をもたらすことが判明している。

今日まで、アミノ酸による栄養補充を伴う治療を含めて、筋肉損失の治療は、筋肉同化の促進に重点を置いてきた。例えば、Ｖｅｒｌａａｎらの米国特許出願公開第２００４／０１２２０９７号には、筋肉組織の生成を促進するための、ロイシン及びタンパク質の両方を含有する栄養補助食品が記載されている。ロイシンの前駆体（例えば、ピルベート）及び代謝物（例えば、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート、α−ケトイソカプロエート）は、ロイシンと同様の特性を示す。注目すべきは、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートが、ヒトによって臨床的に十分な量は産生されず、そのため、補充しなくてはならない点である。

タンパク質同化ホルモンであるインスリンは、大量投与された場合に、タンパク質合成を促進することができることが明らかとされている。したがって、公知の治療法は、筋肉損失に罹患した個体に筋肉組織の生成の増大を介して利益を提供するが、筋肉損失自体には影響を及ぼさない。すなわち、筋肉損失を治療する公知の方法は、筋肉異化の減少よりむしろ筋肉同化の増大のために行われている。

骨格筋を構成するアミノ酸は、新参のアミノ酸（経腸ルート又は非経口ルートにより投与されたか、再循環されたもの）がタンパク質として貯蔵され、現存のタンパク質が分解される定常的な流動状態にある。筋肉量の低下は、タンパク質合成速度の低下（分解は正常）、分解増大（合成は正常）、又は合成減少及び分解増大の両方の進行、を始めとする多数の因子の結果生じたものである可能性がある。結果的に、合成増大を目的とする治療は、筋消耗疾患における問題の１／２に対処するにすぎない。

そのため、当技術分野では、筋肉異化を減少させ、場合により、筋肉同化を増大させる、筋肉損失の治療方法への要求が存在する。

発明の概要

本発明は、個体において筋肉損失を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、ＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、又はそれらの任意の組合せ、の有効量を個体に投与することを含む。本発明は、そのような投与のための栄養製品（例えば、経口投与可能な栄養製品）を更に提供する。

第１の態様において、本発明は、個体における筋肉損失を治療する方法であって、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、又はＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、の少なくとも１種の有効量を個体に投与するステップを含み、ＢＣＡＡ、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、及びＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、の少なくとも１種がタンパク質異化に拮抗する方法、を提供する。

第２の態様において、本発明は、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、又はＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、の少なくとも１種を含み、ＢＣＡＡ、ＢＣＡＡ前駆体、ＢＣＡＡ代謝物、ＢＣＡＡリッチタンパク質、及びＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、の少なくとも１種がタンパク質異化に拮抗する、経口投与可能な栄養製品を提供する。

本発明の具体的な態様は、本明細書に記載されている問題、及び論じられてはいないが、当業者によって発見可能なその他の問題を解決することを目的としている。

本発明のこのような特徴は、本発明の種々の実施形態を示す添付の図面と併用される、本発明の種々の態様に関する以下の詳細な説明からより容易に理解される。

本発明の図面は正確な縮尺で表したものでないことに留意されたい。図面は、本発明の典型的な態様のみを表すものであり、それ故、本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない。

詳細な説明

上述のように、本発明は、個体における筋肉損失の治療のための方法及び関連製品を提供する。より具体的には、本発明の方法及び製品は、筋肉異化、特に、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）媒介性筋肉異化を減少させる。

本明細書において、「治療」及び「治療する」という語は、疾病を患う危険性があるか、疾病を患っていると疑われる患者、並びに病気の患者、又は疾病若しくは医学的症状を患っていると診断された患者、の治療を含む、予防的又は防止的治療及び治癒的又は疾患修飾的治療の両方を指す。「治療」及び「治療する」という語はまた、疾病を患っていないが、窒素不均衡、筋肉損失等の非健康的な状態を発現しやすい個体における健康の維持及び／又は促進を指す。それ故、「有効量」とは、個体において疾病又は医学的症状を治療する量であり、より一般的には、個体に栄養的、生理的又は医学的な利益を提供する量である。治療は、患者又は医師に関連したものであり得る。更に、「個体」及び「患者」という語は、本明細書において、多くの場合、ヒトを指すのに用いられるが、本発明はそれに限定されない。つまり、「個体」及び「患者」という語は、筋肉損失等の医学的症状を患っているか、その危険性のある任意の哺乳類を指す。

実験データ：
筋肉異化の減少における、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）及びその他の物質の効力を調べるために、マウスＣ_２Ｃ_１２筋管を、アミノ酸（ＢＣＡＡを含む）、インスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びＰＫＲ阻害剤と組み合わせた、ＰＩＦ又はアンジオテンシンＩＩに曝露した。ＰＩＦは、Ｓｍｉｔｈら，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｃｈｅｃｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃ２Ｃ１２ Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９：５５０７〜１３頁（１９９９）（参照されることにより本明細書に組み込まれる。）に記載の方法で、ＭＡＣ１６腫瘍から抽出し、精製した。タンパク質分解は、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅら，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＰＩＦ） ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＮＦ−κＢ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，８９：１１１６〜２２頁（２００３）（参照されることにより本明細書に組み込まれる。）に記載の方法を用いて測定した。

図１は、濃度を増大させた場合の、ＰＩＦによる、タンパク質合成の抑制を示すグラフである。タンパク質合成の抑制は、１分当たりカウント（ＣＰＭ）（ＰＩＦを含まない対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対するパーセントで示す。）で測定されている。タンパク質合成の有意な低下が認められ、タンパク質合成の最大抑制は４．２ｎＭのＰＩＦ濃度で生じている。測定されたＰＩＦのタンパク質分解活性は、より具体的には、ユビキチン様分解活性と呼ぶことができる。

図２は、ＰＩＦ、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びアルギニン（これらは、単独で、又はＰＩＦと組み合わせて用いる。）とともにインキュベートされたＣ_２Ｃ_１２筋管におけるリン酸化ｅＩＦ２−αのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析の結果を示すグラフである。対照サンプルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのみインキュベートした。図２に示されるように、ＰＩＦは、対照と比較して、ｅＩＦ２−αのリン酸化を有意に増大させる。各アミノ酸は、ＰＩＦ単独の場合と比較して、ＰＩＦの存在下でｅＩＦ２−αリン酸化を低下させた。しかし、ＢＣＡＡ（すなわち、ロイシン、イソロイシン及びバリン）は、このようなリン酸化を、ほぼ対照のレベル又はそれより低いレベルまで低下させ、他方、メチオニン誘導性リン酸化及びアルギニン誘導性リン酸化のレベルは対照より高かった。驚くべきことに、タンパク質合成を高めることを目的とする公知の治療法（ロイシンはその他のＢＣＡＡより高い効力を示す。）とは異なり、ｅＩＦ２−αのＰＩＦ誘導性リン酸化の低下においては、すべてのＢＣＡＡがほぼ同等に有効であることを、これらのデータは示している。実際、イソロイシン及びバリンとのインキュベーションにより生じたリン酸化レベルは、ロイシンとのインキュベーションについて観察されたものと異ならなかった。

図３は、インスリン及びＩＧＦ−１（これらは、単独で、又はＰＩＦと組み合わせて用いる。）のインキュベーションを含む同様の実験の結果を示す図である。インスリン及びＩＧＦ−１はいずれも、ＰＩＦ単独の場合と比較して、ＰＩＦの存在下でｅＩＦ２−αリン酸化を有意に低下させた。したがって、ＢＣＡＡの、ＰＩＦ媒介性タンパク質分解を低下させる能力は、インスリン及び／又はＩＧＦ−１の添加によって、又はインスリン及び／又はＩＧＦ−１のレベルを増大させる処置によって補完又は増強することができる。

図４は、ＰＩＦ誘導性タンパク質分解の低下及びタンパク質合成の増大のいずれにも有用なＰＫＲ阻害剤（ＰＫＲ阻害の陽性対照として用いた。）の構造を示す。図５〜８は、ＰＩＦ又はアンジオテンシンＩＩのいずれかと組み合わせたＰＫＲ阻害剤のインキュベーションを含む実験の結果を示す。図５には、ＰＩＦが、単独でインキュベートされた場合にタンパク質分解を最大８７％増大させ、ＰＫＲ阻害剤の添加がタンパク質分解レベルをほぼ対照のレベルにまで戻したことが示されている。同様に、図６には、ＰＩＦが、単独でインキュベートされた場合にタンパク質合成を最大約２５％低下させ、ＰＫＲ阻害剤の添加がタンパク質合成レベルをほぼ対照のレベルにまで戻したことが示されている。

図７及び８は、アンジオテンシンＩＩとともにＰＫＲ阻害剤をインキュベーションした際の同様の結果を示す。図７では、アンジオテンシンは、対照と比較して、タンパク質分解を最大約５１％増大させた。ＰＫＲ阻害剤の添加はこの傾向を逆転させ、タンパク質分解レベルをほぼ対照のレベルに維持させた。同様に、図８では、アンジオテンシンＩＩは、対照と比較して、タンパク質合成を約４０％低下させたが、ＰＫＲ阻害剤の添加は、タンパク質合成レベルをほぼ対照のレベルで維持された。

ＰＫＲ阻害剤は、タンパク質分解及びタンパク質合成のいずれにおいても、ＰＩＦ及びアンジオテンシンＩＩの作用を減弱した。このことは、ＰＩＦ及びアンジオテンシンＩＩは、同様の機序を介して、また、恐らくはＰＫＲを含む共通のメディエーターを通じてその作用を発現することを示唆する。より具体的には、これらの結果は、ＰＩＦがＰＫＲを活性化し、次いで、これが、ｅＩＦ２−αのリン酸化を引き起こし、開始メチオニンｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ）の４０ｓリボソームサブユニットへの結合を阻害することを示唆する。ＢＣＡＡ、インスリン及びＩＧＦ−１は、ＰＩＦに起因するｅＩＦ２−αのリン酸化を減弱するが、このことは、ＰＩＦがｅＩＦ２−αのリン酸化をアップレギュレートしてタンパク質合成を阻害するという仮説を更に支持する。ＰＫＲはタンパク質合成を阻害し、ＮＦ−κＢを活性化することができ、これがタンパク質分解をもたらすので、ＰＫＲは恐らく、ＰＩＦのシグナル伝達経路における初期コンポーネントである。

また、ＰＫＲが４Ｅ−ＢＰ１リン酸化の制御に関与しているという証拠がある。したがって、ＰＩＦがＰＫＲを通じてシグナルを伝達するとすれば、ＰＩＦが、セリン／スレオニンホスファターゼＰＰ２ＡのＰＫＲによる活性化を介してタンパク質合成を低下させ、これが、４Ｅ−ＢＰ１の脱リン酸化を引き起こし、これが今度は、ｅＩＦ４Ｅを不活性複合体中に隔離して、４３ｓ前開始複合体の形成を妨げるということもあり得る。

図９は、別の機序を示す図である。タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）及びアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）は、タンパク質合成を４０％低下させ、タンパク質合成の抑制において最も効果的な両物質の濃度は、タンパク質分解の誘導において最も効果的な濃度と同じである。この結果は、インスリン及びＩＧＦ１がいずれも、少なくとも部分的に、ＰＫＲ及び／又はｅＩＦ２αリン酸化の阻害を介してＰＩＦによって誘導されるタンパク質分解を減弱することを示唆する。ＰＩＦ及びＡｎｇ ＩＩによる活性化の機序は、ＰＫＲの細胞性タンパク質アクチベーターであるＰＡＣＴ（インターフェロン誘導性タンパク質キナーゼのタンパク質アクチベーター）を介したものである可能性がある（もっとも、ＰＩＦはポリアニオン性分子であり、そのため、直接的な活性化を行うこともできる）。そうではあるが、ＰＫＲ阻害剤がタンパク質合成に対する両物質の阻害作用を減弱したことから、ＰＩＦ及びＡｎｇ ＩＩによるｅＩＦ２αのリン酸化は、ＰＫＲを通じて起こるものと考えられる。タンパク質翻訳に対するＰＩＦ及びＡｎｇ ＩＩの作用は、ｅＩＦ２αのリン酸化の増大に起因するものと思われる。

腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）によるアポトーシスにおけるタンパク質合成の阻害もまた、ｅＩＦ２αのリン酸化の増大と関連する。ＰＩＦ及びＡｎｇ ＩＩによるタンパク質合成の阻害におけるｅＩＦ２αリン酸化の役割に関する更なる根拠が、インスリン及びＩＧＦ１（これらは、タンパク質合成の阻害の抑制において有効であった。）がいずれも、ｅＩＦ２αリン酸化の誘導を完全に減弱したという知見によって提供される。集められたデータは、ＢＣＡＡがまた、ＰＩＦによって開始される分解経路を阻害するように、同様の機序を介して働くことを示唆する。この研究は、ＰＫＲの活性化及びｅＩＦ２αリン酸化を介した、ＰＩＦ（及びＡｎｇ ＩＩ）による骨格筋におけるタンパク質合成の抑制と、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路の発現及び活性の増大をもたらすＮＦ−κＢの活性化を介した、筋原線維タンパク質ミオシンの分解の増大と、の関係についての第１の証拠を提供するものである。これは、ＰＫＲを標的とする物質（例えば、ＢＣＡＡ）が、癌悪液質における筋萎縮の治療において有効である可能性があることを示唆する。

図１０は、更に別の機序を示す図である。前述のように、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）及びアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）は、ＰＫＲ及び／又はｅＩＦ２αのリン酸化を介してタンパク質分解を増大させる。ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢの放出を介して生じる、ＰＩＦ又はＰＩＦの下流メディエーター（ＰＫＲ及び／又はｅＩＦ２α）によって活性化される可能性がある。この更に別の機序において、ＮＦ−κＢは、同様のリン酸化カスケードの一部をなすものではない（もっとも、同様の標的を有し、分解されるタンパク質へのユビキチンタグの付加を促進する）。

まとめると、上述のデータは、本発明の多くの新規態様を支持する。第１に、ＢＣＡＡは、ＰＩＦ及び／又はアンジオテンシンＩＩにより媒介されるタンパク質異化に、ＰＫＲ及び／又はｅＩＦ２αの活性化の阻害を介して拮抗することによって、個体における筋肉損失の治療に使用することができる。第２に、各ＢＣＡＡは、そのような拮抗作用において同等に有効である。第３に、インスリン、ＩＧＦ−１及び／又はＰＫＲ阻害剤の同時投与、或いはインスリン及びＩＧＦ−１のいずれか又は両方のレベルを高める処置の使用は、タンパク質異化への更なる拮抗、タンパク質合成の増大、又はその両方、によってＢＣＡＡ治療の効果を増大させる。

それ故、本発明の栄養製品は、ＢＣＡＡを単独で含有してもよいし、また、インスリン、ＩＧＦ−１及び／又はＰＫＲ阻害剤とともに含有してもよい。ＢＣＡＡは、遊離形、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、ＢＣＡＡリッチタンパク質、及び／又はＢＣＡＡ含量が増加するように操作されたタンパク質、として投与することができる。ジペプチド、トリペプチド及びポリペプチドは、２つ以上のＢＣＡＡを含んでもよい。ジペプチド、トリペプチド又はポリペプチドに非ＢＣＡＡが含まれる場合は、好ましいアミノ酸として、例えばアラニン及びグリシンが挙げられるが、非ＢＣＡＡは、可欠又は不可欠（必須又は非必須）アミノ酸のいずれであってもよい。好ましいジペプチドとしては、これらに限定されないが、例えば、アラニル−ロイシン、アラニル−イソロイシン、アラニル−バリン、グリシル−ロイシン、グリシル−イソロイシン、及びグリシル−バリンが挙げられる。

本発明の栄養製品は、ＢＣＡＡに加えて、又はＢＣＡＡの代わりに、ＢＣＡＡの前駆体及び／又は代謝物、特にロイシンの前駆体及び／又は代謝物、を含んでもよい。このような製品は、種々の追加成分（例えば、タンパク質、繊維、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、糖、炭水化物、香味料、薬物及び治療薬）を更に含んでもよい。

本発明の栄養製品は、経口的に、又は栄養チューブを通じて、又は非経口的に投与することができる。このような製剤は、種々の筋消耗疾患、障害若しくは状態、又は筋肉損失と関連する任意の疾患、障害若しくは状態、例えば、悪液質；癌；腫瘍に起因する体重減少；敗血症；慢性心不全；関節リウマチ；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）；筋肉減少症；糖尿病；高血圧症；血清コレステロール高値；トリグリセリド高値；パーキンソン病；不眠；薬物嗜癖；アルコール嗜癖；疼痛；不眠；低血糖；肝硬変を含む肝機能障害；胆嚢疾患；舞踏病；ジスキネジア；及び尿毒症を含む腎障害、を患っている個体の治療に使用可能である。

本発明の様々な態様に関する以上の説明は、例示及び説明目的で提示されたものである。これは、網羅的であること、又は本発明を、開示された正確な形に限定すること、を意図したものではない。多くの修飾及び変形が可能であるのは明らかである。当業者には明らかと思われるこのような修飾及び変形は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に包含されるものとする。

種々の濃度のタンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）による、タンパク質合成の抑制を示すグラフである。 ｅＩＦ２−αのリン酸化に対するアミノ酸の作用を示すグラフである。 ｅＩＦ２−αのリン酸化に対するインスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ）の作用を示すグラフである。 本発明で使用するのに適したＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）阻害剤の構造を示す図である。 ＰＩＦのタンパク質分解活性に対する、図４のＰＫＲ阻害剤の作用を示すグラフである。 ＰＩＦにより媒介されるタンパク質合成低下を無効にする、図４のＰＫＲ阻害剤の作用を示すグラフである。 アンジオテンシンＩＩのタンパク質分解活性に対する、図４のＰＫＲ阻害剤の作用を示すグラフである。 アンジオテンシンＩＩにより媒介されるタンパク質合成低下を無効にする、図４のＰＫＲ阻害剤の作用を示すグラフである。 タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）により引き起こされ、分岐鎖アミノ酸、インスリン及びＩＧＦ−１により阻害されるタンパク質分解の別の機序を示す図である。 ＰＫＲ及びｅＩＦ２αの活性化を介してタンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）により引き起こされ、分岐鎖アミノ酸、インスリン及びＩＧＦ−１により阻害されるタンパク質分解の更に別の機序を示す図である。

Claims (28)

1. 個体における筋肉損失を治療するための薬剤であって、
   分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体又はＢＣＡＡ代謝物の少なくとも１種を含み、
   ＢＣＡＡ、ＢＣＡＡ前駆体又はＢＣＡＡ代謝物の少なくとも１種が、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）阻害剤と組み合わせて投与されるように用いられ、
   筋肉損失の治療は、タンパク質異化に拮抗することによって達成され、
   ＢＣＡＡ前駆体はピルベートであり、
   ＢＣＡＡ代謝物は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート及びβ−ケトイソカプロエートからなる群より選択される、薬剤。
2. 複数のＢＣＡＡが投与されるように用いられる、請求項１に記載の薬剤。
3. ＢＣＡＡは、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群より選択される、請求項１に記載の薬剤。
4. 筋肉損失の治療は、タンパク質異化に拮抗すること及びタンパク質合成を促進することによって達成される、請求項１に記載の薬剤。
5. ＢＣＡＡが、ジペプチド、トリペプチド又はポリペプチドの少なくとも１種として投与されるように用いられる、請求項１に記載の薬剤。
6. ジペプチドは２つのＢＣＡＡを含む、請求項５に記載の薬剤。
7. ジペプチドはアラニン及びグリシンの一方を含む、請求項５に記載の薬剤。
8. ジペプチドは、アラニル−ロイシン、アラニル−イソロイシン、アラニル−バリン、グリシル−ロイシン、グリシル−イソロイシン及びグリシル−バリンからなる群より選択される、請求項５に記載の薬剤。
9. トリペプチド又はポリペプチドは少なくとも２つのＢＣＡＡを含む、請求項５に記載の薬剤。
10. ＢＣＡＡ、ＢＣＡＡ前駆体又はＢＣＡＡ代謝物の少なくとも１種が、インスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の少なくとも一方と更に組み合わせて投与されるように用いられる、請求項１に記載の薬剤。
11. ＰＫＲ阻害剤は下記構造を有する、請求項１に記載の薬剤。
    

    
12. タンパク質異化は、
    （ａ）タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、
    （ｂ）アンジオテンシンＩＩ、
    （ｃ）ＰＫＲ、
    （ｄ）ｅＩＦ２α、又は
    （ｅ）それらの組合せ
    によって直接的又は間接的に媒介される、請求項１に記載の薬剤。
13. 個体は、悪液質；癌；腫瘍に起因する体重減少；敗血症；慢性心不全；関節リウマチ；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）；筋肉減少症；糖尿病；高血圧症；血清コレステロール高値；トリグリセリド高値；パーキンソン病；不眠；薬物嗜癖；アルコール嗜癖；疼痛；不眠；低血糖；肝硬変を含む肝機能障害；胆嚢疾患；舞踏病；ジスキネジア；及び尿毒症を含む腎障害、の少なくとも１種を有する、請求項１に記載の薬剤。
14. 個体における筋肉損失を治療するための栄養製品であって、
    分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、ＢＣＡＡ前駆体又はＢＣＡＡ代謝物の少なくとも１種を含み、
    ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）阻害剤を更に含み、
    筋肉損失の治療は、タンパク質異化に拮抗することによって達成され、
    ＢＣＡＡ前駆体はピルベートであり、
    ＢＣＡＡ代謝物は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート及びβ−ケトイソカプロエートからなる群より選択される、製品。
15. 複数のＢＣＡＡを含む、請求項１４に記載の製品。
16. ＢＣＡＡは、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群より選択される、請求項１４に記載の製品。
17. 筋肉損失の治療は、タンパク質異化に拮抗すること及びタンパク質合成を促進することによって達成される、請求項１４に記載の製品。
18. ＢＣＡＡが、ジペプチド、トリペプチド又はポリペプチドの少なくとも１種として投与されるように用いられる、請求項１４に記載の製品。
19. ジペプチドは２つのＢＣＡＡを含む、請求項１８に記載の製品。
20. ジペプチドはアラニン及びグリシンの一方を含む、請求項１８に記載の製品。
21. ジペプチドは、アラニル−ロイシン、アラニル−イソロイシン、アラニル−バリン、グリシル−ロイシン、グリシル−イソロイシン及びグリシル−バリンからなる群より選択される、請求項１８に記載の製品。
22. トリペプチド又はポリペプチドは少なくとも２つのＢＣＡＡを含む、請求項１８に記載の製品。
23. インスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の少なくとも一方を更に含む、請求項１４に記載の製品。
24. ＰＫＲ阻害剤は下記構造を有する、請求項１４に記載の製品。
    

    
25. タンパク質、繊維、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、糖、炭水化物、香味料、薬物及び治療薬の少なくとも１種を更に含む、請求項１４に記載の製品。
26. タンパク質異化は、
    （ａ）タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、
    （ｂ）アンジオテンシンＩＩ、
    （ｃ）ＰＫＲ、
    （ｄ）ｅＩＦ２α、又は
    （ｅ）それらの組合せ
    によって直接的又は間接的に媒介される、請求項１４に記載の製品。
27. 経口的に又は栄養チューブを通じて投与することが可能な、請求項１４に記載の製品。
28. 非経口的に投与することが可能な、請求項１４に記載の製品。

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