JP5224443B2 - 核酸ポリマーの分析システムおよび方法および関連構成要素 - Google Patents
核酸ポリマーの分析システムおよび方法および関連構成要素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5224443B2 JP5224443B2 JP2007521633A JP2007521633A JP5224443B2 JP 5224443 B2 JP5224443 B2 JP 5224443B2 JP 2007521633 A JP2007521633 A JP 2007521633A JP 2007521633 A JP2007521633 A JP 2007521633A JP 5224443 B2 JP5224443 B2 JP 5224443B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid polymer
- complementary strand
- particle beam
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/22—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
- C12Q2523/30—Characterised by physical treatment
- C12Q2523/313—Irradiation, e.g. UV irradiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/137—Metal/ion, e.g. metal label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
- C12Q2565/518—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the immobilisation of the nucleic acid sample or target
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/601—Detection means characterised by use of a special device being a microscope, e.g. atomic force microscopy [AFM]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本出願は、合衆国法典第35巻(35 U.S.C.)第119条(e)の規定に基づき、2004年7月14日に出願された米国仮特許出願第60/587,997号を基礎として優先権を主張し、また参照として本明細書中に組み込まれる。
本発明は、概して核酸ポリマーの同定、配列決定および/または検出に関し、より具体的に、粒子(例えば、電子)線を使って核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび/または検出するシステムおよび方法、ならびに関連構成要素に関する。
核酸分子を配列決定する様々な方法がある。歴史的に、一般的な方法は、後に電気泳動法により分離する特異的切断核酸分子を作る化学的(例えば、マキサム・ギルバート(Maxam and Gilbert)配列決定)または酵素的(例えば、サンガー(Sanger)ジデオキシ配列決定およびエクソヌクレアーゼベースの配列決定)反応を基にしたものであり、それらの相対的な長さを決定するためのものである。より最近では、潜在的により高性能な手法が、ピロシーケンスおよびハイブリダイゼーションベースの配列決定方法を含め、開発されている。しかしながら、かかる方法における改善でさえも、核酸配列決定の費用および速度を、(例えば分子医学および薬理ゲノム学において有用な)幅広いゲノム配列決定および核酸配列の他の使用を容易にするために改善すべきである。
したがって、現在利用できる方法およびシステムよりも核酸配列および量をより迅速におよび効果的に決定することができる改善された方法およびシステムの必要性がある。
本発明は、核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび/または検出するシステムおよび方法、ならびに関連構成要素(例えば、基質、ソフトウェアなど)を提供する。
本発明の一面により、核酸ポリマーの配列を決定する方法を提供する。該方法は、核酸ポリマーの相補鎖を形成することおよび粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖におけるヌクレオチドの配列を同定することを含む。
好ましい態様において、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾する。好ましくは、標識は各種のヌクレオチドに対して特異的である。標識は1または2以上の原子、好ましくは3または2以下の原子、好ましくは単一原子を含むことができる。いくつかの好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で55より大きい原子番号を有し、一方他の好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で55以下の原子番号を有する。いくつかの態様において、原子はハロゲン原子である。
また他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によってヌクレオチドを同定することを含む。好ましくは、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾し、より好ましくは、ヌクレオチドを同定するステップは、粒子線への特徴的変化を検出することを含む。ある態様において、粒子線は軽粒子線であり、より好ましくは、軽粒子線は電子線である。
ある態様において、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を、配列を同定する前に実質的に真っ直ぐにする。好ましくは、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を流体により真っ直ぐにし、より好ましくは、流体は分子コーミングを含む。流動体は1または2以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする。
他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖の複数の走査を行うことを含む。好ましくは、少なくとも100のヌクレオチドが、各走査において同定される。
ある態様において、核酸ポリマーおよび/または相補鎖はDNAまたはRNAである。他の態様において、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使って核酸ポリメラーゼ酵素により合成する。
好ましくは、標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖の合成に使われるリボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸に取り込む。他の態様において、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖へのリボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸の取り込み後、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドに結合させる。
他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖の複数の走査を行うことを含む。好ましくは、少なくとも100のヌクレオチドが、各走査において同定される。
いくつかの態様において、同定するステップは、長さを測定することまたは少なくとも相補鎖および/または核酸ポリマーの部分配列を決定することを含む。
好ましくは、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび/または相補鎖中に取り込む。他の態様において、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドに結合させる。
いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾する。好ましくは、ヌクレオチドを検出するステップは、粒子線への特徴的変化を検出することを含む。ある態様において、粒子線は軽粒子線であり、より好ましくは、軽粒子線は電子線である。
他の態様において、方法はまた、相補鎖および/または核酸ポリマーの量を定量化することを含む。
いくつかの態様において、基質は、実質的に電子線に透明である。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。
他の態様において、デバイスはまた、実質的に粒子線に透明である支持体を含む。
好ましくは、基質は5nm厚未満であり、より好ましくは2nm厚未満であり、さらにより好ましくは1.5nm厚未満、なおより好ましくは1.1nm厚未満である。
さらなる態様において、デバイスはまた、1または2以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることを含む。好ましくは、1または2以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する。
いくつかの態様において、基質は、実質的に電子線に透明である。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。いくつかの態様において、核酸ポリマー結合部位を、基質表面の所定の位置で、好ましくは格子パターンに形成する。
好ましくは、基質は5nm厚未満であり、より好ましくは2nm厚未満であり、さらにより好ましくは1.5nm厚未満であり、なおより好ましくは1.1nm厚未満である。
ある態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的であり、好ましくはオリゴヌクレオチドである。他の態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的ではない。
また他の態様において、該方法はまた、1または2以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることを含む。好ましくは、1または2以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する。
さらなる態様において、システムはまた、データ解析モジュールにより受信されたおよび/または生み出された情報の表示を制御するのに作動可能なユーザーインターフェースを含む。
好ましい態様において、粒子線発生装置は電子線発生装置である。
他の態様において、システムはまた、核酸ポリマーデータを基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュールを含む。
ある態様において、フィードバックモジュールは、核酸ポリマーの塩基−塩基間距離を基にシステムを較正するよう設計されている。他の態様において、フィードバックモジュールは、核酸ポリマーの既知の形状を基にシステムを較正するよう設計されている。
他の態様において、データ解析モジュールは、データ解析モジュールにより受信されたおよび/または生み出された情報をユーザーに表示するためのユーザーインターフェースを含む。
いくつかの態様において、粒子線種は1または2以上の以下の特性:吸収、反射、偏向、エネルギーおよび方向を有し、検出、配列決定および/または同定する行為が、1または2以上の特性の値を決定するために1または2以上の信号を分析することを含む。
さらなる態様において、プロセスはさらに、1または2以上の受信された信号から決定した情報をユーザーに表示することを含む。
他の態様において、プロセスはさらに、コンピュータ可読の媒体において1または2以上の信号から決定した情報を記憶させることを含む。
DNAなどの核酸ポリマーを配列決定する、同定するおよび/または検出するシステムおよび方法を提供する。該方法は、電子線などの粒子線を使って、核酸ポリマーに関する情報を得ることを伴い得る。例えば、DNAのサンプルを粒子線に曝露することができ、サンプルとの相互作用によるビームにおける変化は、情報を提供すると解釈することができるパターンを形成し得る。いくつかの態様において、粒子線機器(例えば、電子顕微鏡)を、DNAのサンプルを直接見るのに使うことができる。サンプルに、サンプルのヌクレオチドの検出および同定を容易にするために(例えば、DNA鎖に付着した原子または分子を使って)標識してもよい。さらに以下に説明するように、該方法により、利点の中でとりわけ、高速で、安価で、および高精度で核酸の配列決定する、同定するおよび/または検出することが可能になる。
一般的に、サンプル14は、核酸ポリマーの配列および/または存在を決定するために分析してもよい好適な形状である。ある態様において、サンプルを、核酸ポリマーの1または2以上の相補鎖で形成することが好ましい。他の態様において、サンプルを、相補鎖に沿ってまたは離れて核酸ポリマーの1または2以上の鎖で形成してもよい。
ある態様において、相補鎖を第1の鎖から分離するとき、相補鎖を、標識してもよい別の鎖を作るためにテンプレートとして使用する。これは、図6に示すように、2本の標識鎖(すなわち、相補鎖および相補鎖から作られた新しい鎖)を含む二重鎖構造を作ることができる。ある方法において、この二重鎖構造を、検出および/または同定ステップにおいてサンプルとして使う。
核酸鎖の基質への付着プロセスを、既に含まれた、部分的に含まれた、またはまだ含まれていない標識のいずれかと行うことができる。後者2つの場合、続いて1または2以上の型の標識を基質上の鎖に標識するのに加える。
いくつかの方法において、核酸材料をサンプルから除去してもよく、一方標識を基質に結合させたままにしてもよい。例えば、核酸材料を、溶解、酵素消化、蒸発(例えば、減圧および/または加温により)またはエッチング(例えば、化学物質または粒子線により)により除去してもよい。核酸をエッチングするとき、標識を保護するために、マスクを任意に使ってもよい。
典型的に、ビームをサンプルにわたって走査し、それはサンプルに相対的なビームの動きによって、ビームに相対的なサンプルの動きによって、あるいは両方によって生じる。ある方法は、複数回サンプルにわたってビームを走査することを伴う。
データ解析モジュール71を、例えば、Cognex Corporation(Natick, Massachusetts)より入手可能なシステムなどの既知のマシン視覚システム(例えば、「見ること」ができる機械)に用いられる手法と同様の、または同じ手法を用いてもよい。
システム60は、以下のいずれも含んでもよい:粒子線機器64;検出器68;ソフトウェア解析モジュール71;ネットワーク69;ネットワーク85;データ資源86;他の構成要素;または前述のあらゆる好適な組合せ。粒子線機器64および検出器68は、本明細書中に記載のあらゆる型であってもよい。
核酸ポリマー情報88を、複数のエントリーを含むデータ構造として配置してもおよび/または含んでもよく、ここで各エントリーは、それぞれの核酸ポリマーについての情報を特定する。例えば、各エントリーは、GenBankデータベースからのエントリーおよび/または記録であってもよい。
本発明のいくつかの態様において、粒子線機器に曝露するサンプルは、複数の同じ型の核酸ポリマーを含んでもよい。したがって、サンプルの曝露による粒子線種は、1または2以上の分子を示す情報を含有してもよい。その結果、1または2以上の信号70は、複数の分子についての情報を表してもよい。かかる態様において、データ解析モジュールを、1または2以上の信号70から複数の分子についての情報を決定するよう、およびサンプル内に含有される核酸ポリマーを検出する、および/または配列決定するおよび/または同定するためにこの情報を使うよう構成してもよい。例えば、データ解析モジュールは、2または3以上の複数の分子を部分的に配列決定することにより、複数の部分配列を作り出してもよい。結合モジュール76を、分子を検出する、および/または配列決定するおよび/または同定するために部分配列を組み合わせるよう構成してもよい。
本発明のシステムおよび方法はまた、将来の参照および照合のための遺伝子データの保存を可能にする、大量の可読の核酸配列データを物理的に保管してもよい。
本発明のシステムおよび方法はまた、非常に少量のサンプルを有利に使ってもよく、例えば、単一分子から配列データを決定することが可能である。
以下の例は、説明目的のために示したものであり、限定することを意図しているものではない。
この例は、標識DNAを作るためのステップおよび試薬を説明する。
規則正しいDNAにより標識DNAを並べる模範的手順:
試薬:
Taq DNAポリメラーゼ(New England Biolabs (NEB), Beverly, MA、カタログ番号 MO267)
dNTP:5mMの各dNTP、20mMの総NTP濃度(NEB、カタログ番号N0447)
NEB供給の緩衝液、超純水。
PCRプライマー、ZSDp200F (TTATCAATTCACGAAACTGC;配列番号:1)およびZSDp200R(AATGCACCTTCTAATAATAC;配列番号:2)、50μM貯蔵濃度。プライマーは、Operon Biotechnologies, Huntsville ALにより生産された[ZSDp200F(52-336-000)およびZSDp200R(52-336-000)]。
注意:異なる実験において、別の組のPCRプライマーを使った。ZSDp200FおよびZSDp200Rの組合せから、アルドラーゼ遺伝子配列から増幅させた200bp以下の生成物(配列番号:3)を得た。別のプライマー対から、約1000bpの生成物を得た。
1x − 5分/95℃
30x − [40秒/95℃、40秒/55℃、1分/72℃]
1x − 7分/72℃
試薬:
以下の2つの方法を使った。
A:手製のスピンカラムを、Sephadex G75-50 Superfine (GE Healthcare、旧Amersham Biosciences/Pharmacia Biotech)を使って作った。PCR混合物を樹脂に5秒間吸収させ、そして5,000rpmの微小遠心で、室温で60秒間回転させた。流れを収集した。おそらく、塩、プライマーおよび核酸以外種が樹脂に残った。
B:Qiagenカラムを、キット付属品(QIAquick Gel Extraction Kit #28704)と共に含まれるプロトコルの後にPCR生成物からヌクレオチドおよび緩衝剤を除去するのに使った。
貯蔵dCTP+dUTPミックスを、ストックdCTPは20mM濃度であるため、それぞれ5mMに設定した。代替のミックスは、スタンダードdATPおよびdGTPの組合せを、dTTPを交換した5−Iodo dUTPおよびスタンダードdCTPを交換した5−Iodo dCTPと一緒にしたものである。これらのヌクレオシド三リン酸類似体は市販されている。
5−Iodo−dCTP
生産者:Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
製品番号:I-8361
5−Iodo−dUTP
生産者:Trilink BioTechnologies, San Diego, CA
製品名:DUTP Iodinated
この例は、基質の調製および核酸サンプルの調製した基質への付着を示す。
非晶質炭素で被覆した銅格子(製品番号01822または01822-F、供給元:Ted Pella, Inc.(Redding, CA))を最初に、「無水」アセトン溶液に浸して2Åの分子ふるいに24時間放置すことにより洗浄し、水の大部分を除去する。同じアセトン溶液を、全洗浄ステップにおいて使う。
そして格子を空気乾燥し、3分間プラズマ処理する。プラズマを、高出力RFパルスを空気に真空下1〜4torrで適用することにより発生させ、出力および時間を、その下の格子を破壊することなく親水性の表面を作るのに最適化した。プラズマ処理した格子は、著しい親水性の特徴を示した。
格子を、無水アセトンに10〜15間浸すことにより再び洗浄し、そして2%のビニルトリエトキシシラン(VTS)のアセトン溶液に浮かばせた。おそらく、VTSは−OH末端と反応し、Si−O−C結合を介して格子の表面にビニルシランを付着させたままにした。
サンプル調製および電子線機器を使っての核酸分子の解析
1.原子的に標識したDNAを、以下のように合成する:
・原子的に標識したdNTPを最後のサイクルのみで使って、一本鎖のみが原子的標識を有する二本鎖DNAを作る;
・原子的に標識したdNTPを全サイクルで使って、両方の鎖が標識原子を含有する二本鎖DNAを作る;および
・原子的に標識したdNTPを最後の2サイクルで使って、分子の半分が両方の鎖で標識され、半分が一本鎖で標識された二本鎖DNA混合物を作る。
・両方の鎖が標識されている分子から;および
・一本鎖のみが標識されている分子から。
原子的に標識したDNA分子の代表的な画像を図14に示す。画像において、原子的に標識したDNA分子は一般的に円形である。
機器:
製造者:JEOL
本社所在地:日本国、196-8558 東京都昭島市武蔵野3丁目1−2
モデル:100S
設定:
加速電圧:80kV
直接倍率:40,000倍
総倍率(スコープおよびカメラ):482,000倍
カメラシステムおよびソフトウェア:AMTカメラシステム
Lab Manualからの標準アライメントプロトコルを使った。2のコンデンサ絞りを選択した;2の対物絞りを選択した;H.V. Wobblerを使わずむしろ手動で焦点を合わせた。
最終的な非点補正(stigmation)をAMTカメラシステムで捉えたある画像に示された画像のFFT(高速フーリエ変換)を用いて手動で行った。
方法ステップ:
サンプルを、201bpのPCR増幅生成物の原液から調製した。
サンプルは、およそ50ng/μLの標識DNAであった。PCR合成を5−iodo−dCTPおよび5−iodo−dUTP両方により行い、上に説明したように、塩基対あたり単一標識原子を提供した(すべてのピリミジンが標識されている)。
基質を、既述のように親水性を誘導するために、低圧プラズマに曝露した。0.8〜1.0μLの液滴を処理した基質に落とし、上に説明したように室温でおよび室内圧力で蒸発させた。
Claims (28)
- 核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
核酸ポリマーの相補鎖を形成することおよび
粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖におけるヌクレオチドの配列を同定することを含み、
ここで、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾し、
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび/または相補鎖中に取り込むか、またはヌクレオチド特異的標識が、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドに共有結合する、前記方法。 - 標識がヌクレオチド各種に特異的である、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの配列を同定するステップが、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によってヌクレオチドを同定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 粒子線が電子線である、請求項1に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/または相補鎖を基質に固着させる、請求項1に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップが、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する、請求項1に記載の方法。
- さらに相補鎖および/または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの配列を同定するステップが、粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖の複数の走査を行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を合成すること、および
粒子線を使って核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドを同定すること
を含み、
標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドが、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖に取り込まれたとき、粒子線を使って同定可能である、前記方法。 - 粒子線が電子線である、請求項9に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/または相補鎖を基質に固着させる、請求項9に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を同定するステップが、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する、請求項9に記載の方法。
- さらに相補鎖および/または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項9に記載の方法。
- 標識リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を同定するステップが、粒子線を使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖の複数の走査を行うことを含む、請求項9に記載の方法。
- 核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
標識リボヌクレオチド三リン酸および/またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーの相補鎖を合成すること、
核酸ポリマーおよび/または相補鎖を基質に付着させること、
分子コーミングを使って核酸ポリマーおよび/または相補鎖を実質的に真っ直ぐにすること、
粒子線を発生させること、
基質上の核酸ポリマーおよび相補鎖を粒子線に曝露すること、および
相補鎖における標識ヌクレオチドを検出するための、ヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈し、それにより核酸ポリマーの配列を決定すること
を含む、前記方法。 - 核酸ポリマーの存在を検出するおよび/または同定する方法であり、
核酸ポリマーの相補鎖を形成すること、
相補鎖、または、相補鎖および核酸ポリマーを基質に付着させること、および
粒子線を使って相補鎖および/または核酸ポリマーの存在を検出するおよび/または同定すること
を含み;
ここで、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾し、
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび/または相補鎖中に取り込むか、またはヌクレオチド特異的標識が、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドに共有結合する、前記方法。 - 粒子線を使って相補鎖および/または核酸ポリマーの存在を検出するおよび/または同定するステップが、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび/または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によって相補鎖および/または核酸ポリマーのヌクレオチドを同定することを含む、請求項16に記載の方法。
- 粒子線が電子線である、請求項16に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/または相補鎖を、配列を検出する前に実質的に真っ直ぐにする、請求項16に記載の方法。
- 核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップが、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの存在、長さおよび/または配列を決定する、請求項16に記載の方法。
- さらに相補鎖、または、相補鎖および核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項16に記載の方法。
- 実質的に粒子線に透明である基質、および基質表面の核酸ポリマー結合部位を含むデバイスであって;
核酸ポリマー結合部位に固着させた1または2以上の核酸ポリマーをさらに含み、1または2以上の核酸ポリマーを、共有結合の標識を含むように修飾する、前記デバイス。 - 実質的に粒子線に透明である基質を得ること、および
基質表面に核酸ポリマー結合部位を形成すること
を含む、デバイスを作る方法であって、
1または2以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることをさらに含み、1または2以上の核酸ポリマーを共有結合の標識を含むよう修飾する、前記方法。 - 核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび/またはそれを同定するために設計されたシステムであり:
サンプルチャンバー;
チャンバーを伴う粒子線発生装置;
核酸ポリマーの共有結合の標識相補鎖を含むサンプル、ここで該サンプルは、チャンバー内に置かれたとき、粒子線発生装置により発生した粒子線に曝露され、粒子線および相補鎖の間で相互作用をもたらす;および
相互作用後、粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器
を含む、前記システム。 - 核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび/またはそれを同定するために設計されたシステムであり:
核酸ポリマーおよび/または核酸ポリマーの相補鎖を含むサンプル;
サンプルチャンバー;
チャンバーを伴う粒子線発生装置;
粒子線および核酸ポリマーおよび/または核酸ポリマーの相補鎖を含むサンプルの間の相互作用後、粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器;
核酸ポリマーに関する情報を決定するために粒子線種に関する信号を分析するよう設計されたデータ解析モジュール;および
情報を基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュール
を含み;
サンプルが、核酸ポリマーの共有結合の標識相補鎖を含む、前記システム。 - 粒子線機器を較正する方法であり、
共有結合の標識核酸ポリマーに関するデータを入手すること;および
データを基に機器を較正すること
を含む、前記方法。 - 核酸ポリマーを検出器により検出される粒子線種を基に検出する、配列決定するおよび/または同定するシステムであり、粒子線種は核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線への曝露によるものであり:
検出器からの1または2以上の信号を受信し、1または2以上の信号は粒子線種を表し、および少なくとも一部は受信した1または2以上の信号に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を検出、配列決定および/または同定するのに作動可能なデータ解析モジュールを含み、
核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖が共有結合により標識されている、前記システム。 - コンピュータを以下の手段:
核酸ポリマーを検出器により検出された粒子線種を基に検出する手段、
核酸ポリマーを検出器により検出された粒子線種を基に配列を決定する手段、
および/または
核酸ポリマーを検出器により検出された粒子線種を基に同定する手段
として機能させるアプリケーションプログラムであって、
ここで粒子線種が、核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を含むサンプルの、粒子線への曝露によりもたらされ、
前記検出する手段は、検出器からの1または2以上の、粒子線種を表す信号を受信し、受信した1または2以上の信号の少なくとも一部に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を検出し、
前記配列を決定する手段は、受信した1または2以上の信号の少なくとも一部に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖の配列を決定し、
前記同定する手段は、受信した1または2以上の信号の少なくとも一部に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび/またはその相補鎖を同定し、
ここで、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドは、標識を含むように修飾され、
ヌクレオチド特異的標識は、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび/または相補鎖中に取り込まれるか、またはヌクレオチド特異的標識は、核酸ポリマーおよび/または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび/または相補鎖のヌクレオチドに共有結合する、前記アプリケーションプログラム。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US58799704P | 2004-07-14 | 2004-07-14 | |
US60/587,997 | 2004-07-14 | ||
PCT/US2005/024979 WO2006019903A1 (en) | 2004-07-14 | 2005-07-14 | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008508865A JP2008508865A (ja) | 2008-03-27 |
JP2008508865A5 JP2008508865A5 (ja) | 2008-09-04 |
JP5224443B2 true JP5224443B2 (ja) | 2013-07-03 |
Family
ID=35058066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007521633A Expired - Fee Related JP5224443B2 (ja) | 2004-07-14 | 2005-07-14 | 核酸ポリマーの分析システムおよび方法および関連構成要素 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US7288379B2 (ja) |
EP (1) | EP1766081B1 (ja) |
JP (1) | JP5224443B2 (ja) |
KR (1) | KR101229318B1 (ja) |
CN (1) | CN101010436B (ja) |
AU (1) | AU2005275061B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0513308A (ja) |
CA (1) | CA2573302C (ja) |
IL (1) | IL180581A (ja) |
WO (1) | WO2006019903A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006019903A1 (en) | 2004-07-14 | 2006-02-23 | Zs Genetics, Inc. | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components |
TW200736401A (en) * | 2005-11-09 | 2007-10-01 | Zs Genetics Inc | Nano-scale ligand arrays on substrates for particle beam instruments and related methods |
US20070190557A1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-16 | Zs Genetics, Inc. | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components |
US20090136932A1 (en) * | 2007-03-16 | 2009-05-28 | Craighead Harold G | Fibers with isolated biomolecules and uses thereof |
EA201000427A1 (ru) * | 2007-10-04 | 2010-10-29 | Хэлсион Молекулар | Секвенирование нуклеиново-кислотных полимеров с использованием электронной микроскопии |
JP5173386B2 (ja) | 2007-12-10 | 2013-04-03 | キヤノン株式会社 | 3次元フォトニック結晶及び機能素子 |
EP2534667A2 (en) * | 2010-02-10 | 2012-12-19 | Mochii, Inc. (d/b/a Voxa) | Aberration-correcting dark-field electron microscopy |
TW201216318A (en) * | 2010-06-07 | 2012-04-16 | Halcyon Molecular Inc | Incoherent transmission electron microscopy |
US8598527B2 (en) | 2011-11-22 | 2013-12-03 | Mochii, Inc. | Scanning transmission electron microscopy |
WO2014078652A1 (en) | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Zs Genetics, Inc. | Heavy atom labeled nucleosides, nucleotides, and nucleic acid polymers, and uses thereof |
US20160032281A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Fei Company | Functionalized grids for locating and imaging biological specimens and methods of using the same |
WO2017075179A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Zs Genetics, Inc. | Sequencing by deconvolution |
US10508305B2 (en) * | 2016-02-28 | 2019-12-17 | Damoun Nashtaali | DNA sequencing and processing |
WO2018081113A1 (en) | 2016-10-24 | 2018-05-03 | Sawaya Sterling | Concealing information present within nucleic acids |
WO2018174903A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-27 | Zs Genetics, Inc. | Methods and devices for analysis of biological analytes |
WO2019217939A1 (en) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Complete Genomics, Inc. | Polysubstrates and methods of use thereof |
CN109337807A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-15 | 苏州百源基因技术有限公司 | Pcr流水线 |
WO2021072079A1 (en) | 2019-10-08 | 2021-04-15 | Yale University | A gene associated with human reading performance |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5275261A (en) * | 1975-12-19 | 1977-06-24 | Jeol Ltd | Test piece image dispaly unit |
US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
NL8902843A (nl) | 1989-11-17 | 1991-06-17 | Philips Nv | Contaminatiemonitor voor het meten van een verontreinigingsgraad in een evacueerbaar geladen deeltjesbundelsysteem. |
EP0517930B1 (en) | 1991-06-08 | 1995-05-24 | Hewlett-Packard GmbH | Method and apparatus for detecting the presence and/or concentration of biomolecules |
DE59405534D1 (de) | 1993-07-02 | 1998-04-30 | Inst Molekulare Biolog E V | Probenträger und seine verwendung |
FR2716263B1 (fr) * | 1994-02-11 | 1997-01-17 | Pasteur Institut | Procédé d'alignement de macromolécules par passage d'un ménisque et applications dans un procédé de mise en évidence, séparation et/ou dosage d'une macromolécule dans un échantillon. |
US6337479B1 (en) * | 1994-07-28 | 2002-01-08 | Victor B. Kley | Object inspection and/or modification system and method |
US5866913A (en) * | 1995-12-19 | 1999-02-02 | International Business Machines Corporation | Proximity correction dose modulation for E-beam projection lithography |
GB9809918D0 (en) * | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Isis Innovation | Microelectrode biosensor and method therefor |
FR2797053B1 (fr) | 1999-07-13 | 2001-08-31 | Commissariat Energie Atomique | Support d'analyse a transmission de lumiere de fluorescence |
US20050244821A1 (en) * | 2000-08-17 | 2005-11-03 | Ory Zik | Method of identification and quantification of biological molecules and apparatus therefore |
US7419833B2 (en) | 2000-11-17 | 2008-09-02 | Nagayama Ip Holdings Llc | Method for nucleic acid sequencing |
JP2002153271A (ja) * | 2000-11-17 | 2002-05-28 | Jeol Ltd | Dnaあるいはrnaの塩基配列決定方法およびdnaシーケンサー |
DE10123443A1 (de) | 2001-05-14 | 2002-11-28 | Sauter Richard | Analyseverfahren zur Sequenzierung von Atomen/Molekülen und Vorrichtung hierfür |
US6767731B2 (en) * | 2001-08-27 | 2004-07-27 | Intel Corporation | Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing |
JP2003346321A (ja) * | 2002-05-23 | 2003-12-05 | Sony Corp | 磁気記録媒体とその製造方法 |
CN100392097C (zh) | 2002-08-12 | 2008-06-04 | 株式会社日立高新技术 | 使用dna微阵列的核酸检测方法以及核酸检测装置 |
EP1694702B1 (en) * | 2003-12-12 | 2009-10-14 | IQ Corporation | Methods of inducing il-10 production |
WO2006019903A1 (en) * | 2004-07-14 | 2006-02-23 | Zs Genetics, Inc. | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components |
WO2006127736A2 (en) | 2005-05-23 | 2006-11-30 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Silicon substrates with thermal oxide windows for transmission electron microscopy |
TW200736401A (en) * | 2005-11-09 | 2007-10-01 | Zs Genetics Inc | Nano-scale ligand arrays on substrates for particle beam instruments and related methods |
US20070190557A1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-16 | Zs Genetics, Inc. | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components |
US20090136932A1 (en) * | 2007-03-16 | 2009-05-28 | Craighead Harold G | Fibers with isolated biomolecules and uses thereof |
-
2005
- 2005-07-14 WO PCT/US2005/024979 patent/WO2006019903A1/en active Application Filing
- 2005-07-14 US US11/181,688 patent/US7288379B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-14 US US11/181,392 patent/US8697432B2/en active Active
- 2005-07-14 BR BRPI0513308-4A patent/BRPI0513308A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-07-14 JP JP2007521633A patent/JP5224443B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-14 EP EP05772998.0A patent/EP1766081B1/en not_active Not-in-force
- 2005-07-14 KR KR1020077003600A patent/KR101229318B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-07-14 CA CA2573302A patent/CA2573302C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-14 AU AU2005275061A patent/AU2005275061B2/en not_active Ceased
- 2005-07-14 US US11/181,389 patent/US7291467B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-14 US US11/181,695 patent/US7291468B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-14 CN CN2005800298217A patent/CN101010436B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-07 IL IL180581A patent/IL180581A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-11-06 US US11/983,046 patent/US7604942B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-06 US US11/983,055 patent/US7604943B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-20 US US12/582,028 patent/US7910311B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005275061A1 (en) | 2006-02-23 |
US8697432B2 (en) | 2014-04-15 |
IL180581A (en) | 2013-07-31 |
AU2005275061B2 (en) | 2012-05-24 |
WO2006019903A9 (en) | 2006-04-20 |
US20080199871A1 (en) | 2008-08-21 |
CA2573302C (en) | 2015-06-02 |
US20080227095A1 (en) | 2008-09-18 |
EP1766081B1 (en) | 2013-04-10 |
US7604943B2 (en) | 2009-10-20 |
US7291468B2 (en) | 2007-11-06 |
JP2008508865A (ja) | 2008-03-27 |
US7291467B2 (en) | 2007-11-06 |
US7910311B2 (en) | 2011-03-22 |
US20060024717A1 (en) | 2006-02-02 |
US20100105055A1 (en) | 2010-04-29 |
US7288379B2 (en) | 2007-10-30 |
WO2006019903A1 (en) | 2006-02-23 |
IL180581A0 (en) | 2007-06-03 |
CA2573302A1 (en) | 2006-02-23 |
US20060024718A1 (en) | 2006-02-02 |
US20060029957A1 (en) | 2006-02-09 |
BRPI0513308A (pt) | 2008-05-06 |
CN101010436B (zh) | 2012-12-05 |
KR101229318B1 (ko) | 2013-02-05 |
US20060024716A1 (en) | 2006-02-02 |
EP1766081A1 (en) | 2007-03-28 |
KR20070044015A (ko) | 2007-04-26 |
CN101010436A (zh) | 2007-08-01 |
US7604942B2 (en) | 2009-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5224443B2 (ja) | 核酸ポリマーの分析システムおよび方法および関連構成要素 | |
JP5818683B2 (ja) | 核酸配列決定のための方法およびキット | |
JP7067896B2 (ja) | 品質評価方法、品質評価装置、プログラム、および記録媒体 | |
JP2002272463A (ja) | 一塩基多型の型を判定する方法 | |
JP2004531274A (ja) | 切断可能タグを用いたdna配列決定 | |
JP2008508865A5 (ja) | ||
KR102493424B1 (ko) | Rna 검출 방법 | |
US20070190557A1 (en) | Systems and methods of analyzing nucleic acid polymers and related components | |
JP7242081B2 (ja) | 低分子rnaを検出する方法 | |
JP4589480B2 (ja) | 反復配列の多型を分析する方法 | |
WO2017075179A1 (en) | Sequencing by deconvolution |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080711 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080711 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110315 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110614 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110621 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110708 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110715 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110915 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120410 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120709 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120717 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120810 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130307 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160322 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |