JP5203950B2 - ベツリン酸の改良された抽出方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、グランドスズカケノキバーク(ground plane bark)から高度に純粋なベツリン酸を得るための工業的スケールの方法に関する。ベツリン酸は、以下の式の３β−ヒドロキシ−ラップ−２０（２９）−エン−２８−酸である：

ベツリン酸は、メラノーマ細胞の成長に対して(例えば、Pisha et al. Nature Medicine 1, 1995, 1046 ff)及び他の癌細胞に対して(例えば、Sunder et al. US Patent US 6,048,847)効果を有することが知られている。また、その誘導体は、ＨＩＶに対抗するために使用可能であるとされる(例えば、Evers et al., J. Med. Chem. 39, 1996, 1056 ff; Soler et al., J. Med. Chem. 39, 1996 1069ff又はButler, Nat. Prod. Rep., 2005, 22, 162 ff)。従って、ベツリン酸の需要が高い。
合成方法(例えば、L. Ruzicka et al., Helv. Chim. Acta 21, 1938, 1076 ff)は別として、ベツリン酸は、また、種々の植物、特には木、例えば、Picramnia pentandraのバークから(例えば、Herz et al., Phytochemistry 11, 1972, 3061 ff)、Arbutus menziesii(マドロナ)のバークから(Robinson et al., Phytochemistry 9, 1970, 907 ff)及びZiziphus mauritianaから(例えば、Pisha et al., Nature Medicine 1, 1995, 1046 ff)得ることができる。
しかしながら、これらの出発材料からベツリン酸を単離するのは困難である。より有望なのは、スズカケノキのバーク及び／又は皮層からのその回収である。DE 197 13 768は、ベツリン酸を回収する方法を提案しており、その中においては、スズカケノキ皮層から得られた粉末を、中程度の極性溶剤、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム又はジエチルエーテルを用いて抽出する。
この方法は、しかしながら、多量のベツリン酸を工業的に回収するのに不適切であり、なぜなら、非常に多量の中程度の極性溶剤を、ベツリン酸の抽出のために使用しなければならないからである(１５０ｇの粉末スズカケノキバークに対して７リットルのジクロロメタン)。更に、静水圧下でガラス柱において行われる抽出は、多量の場合には不適切であり及び安全性の観点で問題がある。
Bruckner et al., J. Chem. Soc. 1948, 948-951には、スズカケノキバークからベツリン酸を得る方法が記載されており、その中においては、グランドアップバーク(ground-up bark)がメタノールを用いて抽出され、得られた抽出物は蒸発除去(evaporate down)され及び濃縮物は、木炭の存在下でメタノールから繰り返して結晶化される。しかしながら、そのようにして得られたベツリン酸は、依然として、種々の汚染物質を含む。
WO 03/066659には、グランドスズカケノキバークのメタノール抽出によりベツリン酸を得る方法が開示されている。収率は、使用されるスズカケノキバークをベースとして、粗い形態で２．３％であるが、所望の純度ではなく、ｎ−ヘキサンでの抽出物を攪拌することを含む更なる精製工程を行ったとしてもである。
本発明の目的は、従って、スズカケノキバークからベツリン酸を得る改良された方法を提供することであり、それは、また、工業的スケールで使用することができる。

驚くべきことに、転換レベルが、本発明の方法を用いて有意に増加し得ることを見い出した。更に、廃棄物の量は、クロマトグラフィ材料の使用を避けることにより低く維持され得る。
従って、本発明は、グラウンドスズカケノキバーク及び／又は皮層(cortex)の抽出により高度に純粋なベツリン酸を得るための改良された方法であって、抽出を、トルエン、キシレン又はトルエン／キシレン、好ましくは、トルエン又はキシレン及び１又はそれより多くのＣ_1-6アルコール、又は酢酸エステル、又はＣ_3-6ケトンからなる溶剤混合物を用いて行う方法をベースとする。
特に好ましくは、トルエン又はキシレン及びメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、（＋−）−２−ペンタノール又は３−ペンタノール、又は酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸２−プロピル、又はアセトン、メチルエチルケトン又はメチル−２−ブチルケトンの溶剤混合物を使用する。
好ましい溶剤混合物は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、（＋−）−２−ペンタノール又は３−ペンタノールより選択される２種のアルコール及びトルエンからなる。特に好ましくは、溶剤混合物は、トルエン、メタノール及び第二アルコール（エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、（＋−）−２−ペンタノール又は３−ペンタノール）から、特に好ましくは、トルエン、メタノール及び（＋−）−２−ペンタノールからなる。その方法の特に好ましい変形においては、使用される溶剤混合物は、非常に容易に回収することができ、従って、リサイクリング工程において溶剤の損失を最小限にし；トルエンの上記アルコールに対する比が８０：２０〜９５：５で、この目的に特に適切であることが証明された。

特に好ましくは、上記方法において、スズカケノキバークを抽出前に水で湿らせる。一方では、これは、スズカケノキバークの加工性を改良し及び他方では、引き起こされる環境粉塵汚染を低減し得る。
上記方法は、連続的に又はバッチ処理で行うことができるが、抽出を連続的に行う上記方法が好ましい。
好ましくは、その方法は、２〜４８時間、好ましくは、５〜３５時間、特には、１５〜２５時間内で０．２〜６ｍ³／ｈの溶剤混合物の流量で連続的に行う。種々のサイズ及び構成のバッテリー(battery)抽出装置を使用することができる。抽出のための粉末スズカケノキバークの１日の平均量は、５００ｋｇ〜８トンであってもよい。
抽出を２０〜１１０℃で、好ましくは、４０〜９０℃で、特に好ましくは、５０〜７０℃で行う上記方法が特に好ましい。
粗抽出物からベツリン酸を得るために、その方法の後にいくつかの追加工程を行う。ベツリン酸を単離するための連続的な以下の工程を行う上記方法が好ましい：
ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶剤混合物におけるスズカケノキバークの抽出；
ｂ）抽出物からの溶剤混合物の除去；
ｃ）適切な溶剤における残留物の溶解；
ｄ）ろ液からのベツリン酸の沈殿。
工程ｃ）で適切な溶剤は、Ｃ_1-4クロロアルカン又は酢酸エステル及びＣ_1-4アルコールの混合物であってもよい。好ましいクロロアルカンは、ジクロロメタン及びクロロホルムであり、好ましい酢酸エステルは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸２−プロピルであり、好ましいアルコールは、メタノール、エタノール及び２−プロパノールである。特に好ましくは、５：１〜１：２、好ましくは、３：１〜１：１、特に好ましくは、２：１〜１．５：１の比でのジクロロメタンとメタノールとの混合物である。適切な量の溶剤又は溶剤混合物が、固形残留物をベースとして使用される。好ましい比は、固形物１ｋｇあたり、５〜３０リットル、特に好ましくは、１６〜２０リットルである。ベツリン酸の沈殿は、好ましくは、５〜５０時間、好ましくは、５〜２０時間、特に好ましくは、１０〜１５時間内で、−１５〜１０℃、好ましくは、
−１０〜１０℃、特に好ましくは、０〜１０℃にろ液をゆっくりと冷却することにより行う。次いで、精製されたベツリン酸は、固形物として母液から分離することができ、当該技術分野において知られる方法を用いて乾燥する（吸込みフィルター、遠心分離、デカンター、加圧フィルター、フィルタードライヤーなど）。そのようにして精製されたベツリン酸は、依然として、１０％までの溶剤を含んでいるかもしれない。

他の中間工程は、実質的には、ベツリン酸の純度を高め及び更なる処理を容易にし得る。好ましい方法においては、工程ｂ）及びｃ）の間に、以下の工程ｂ１）〜ｂ４）を行う：
ｂ１）プロパノール、ブタノール又はそれらの混合物において残留物を懸濁し及び溶解する工程；
ｂ２）ろ過又は吸引組成物と混合物する工程；
ｂ３）懸濁液をろ過する工程；
ｂ４）ろ過した抽出物から粗ベツリン酸を沈殿する工程。
工程ｂ１）〜ｂ４）は、場合により、１回又は複数回行ってもよい。好ましくは、工程ｂ１）における懸濁は、プロパノール、特には、２−プロパノールにおいて行う。１０〜５０リットル、好ましくは、１５〜２５リットル、特に好ましくは、１７〜１９リットルの容量の溶剤を、溶剤を含まない抽出物１ｋｇあたりに使用することができる。好ましくは、工程ｂ３）からのろ液を、工程ｂ４）における沈殿前に蒸発により濃縮して、特に好ましくは、形成されている又は期待される固形物に対して１：１２〜１：３６に希釈する。沈殿は、好ましくは、５〜５０時間、好ましくは、５〜２０時間、特に好ましくは、１０〜１５時間内に、−１５〜１５℃、好ましくは、−５〜１５℃、特に好ましくは、５〜１５℃にろ液をゆっくりと冷却することにより行う。次いで、粗ベツリン酸は、固形物として母液から分離し及び当該技術分野において知られる方法（吸込みフィルター、遠心分離、デカンター、加圧フィルター、フィルタードライヤーなど）を用いて乾燥することができる。そのようにして得られた粗ベツリン酸は、依然として、１５％までの溶剤を含んでいるかもしれない。
好ましくは、上記ろ過又は吸引組成物は、活性炭及び／又は珪藻土からなる。
変動可能な量のろ過又は吸引組成物を使用することができる。当業者は、精製工程におけるろ過又は吸引組成物としての使用のための十分な量に精通しているであろう。

用語及び定義
先で又は後に使用する用語“ベツリン酸”は、ベツリン酸それ自体及びそれらの水和物及び溶媒和物の双方、好ましくは、０．５〜２当量の溶剤で溶媒和されたベツリン酸を含む。
本発明の範囲内において、全ての種類のプラタナス属が適切である。特に適切であると証明されたスズカケノキ(plane)は、アメリカシカモアー (プラタナス オシデンタリス)、東洋スズカケノキ(プラタナスオリエンタリス)、ケールズスズカケノキ(プラタナスケリー)、メキシコスズカケノキ(プラタナスメキシカナ)、カリフォルニアシカモアー(プラタナスラセモサ)及びアリゾナシカモアー(プラタナスライティー)である。スズカケノキの亜族及び属及び亜族から誘導されるハイブリッド、例えば、カエデの葉、一般又はロンドンスズカケノキ（プラタナス×ヒスパニカ/アセリフォリア）（P. オシデンタリス及びP. オリエンタリスのハイブリッド）が、また、ベツリン酸を得るための出発材料として適切である。
用語“Ｃ_1-4アルコール”は、１〜４個の炭素原子及び１又は２個のヒドロキシ基を有する分枝及び非分枝アルコールを意味する。例としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール又はｔ−ブタノールが挙げられる。いくつかのケースにおいては、上記分子は、また、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ｎ−ＰｒＯＨ、２−ＰｒＯＨ、ｎ−ＢｕＯＨ、ｉ−ＢｕＯＨ、ｔ−ＢｕＯＨなどと称される。別に記載のない限り、プロパノール及びブタノールの定義は、問題となっている基の、可能性のある異性体の全てを含む。従って、例えば、プロパノールとしては、ｎ−プロパノール及び２−プロパノールが挙げられ及びブタノールとしては、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール及びｔ−ブタノールなどが挙げられる。
用語“Ｃ_1-4クロロアルカン”は、１又はそれより多くの塩素原子により置換されている、１〜４個の炭素原子を有する分枝及び非分枝アルカンを意味する。これらの例としては、ジクロロメタン及びクロロホルムが挙げられる。
用語“Ｃ_3-6ケトン”は、非末端炭素原子においてオキソ基により置換されている、３〜６個の炭素原子を有する分枝及び非分枝アルカンを意味する。これらの例としては、アセトン、メチルエチルケトン及びメチル−２−ブチルケトンが挙げられる。
本発明の目的のために、用語キシレンは、ｏ−、ｍ−及びｐ−キシレンの混合物、及び、場合によりエチルベンゼンであってもよい。しかしながら、理論的には、異性体的に純粋な溶剤をまた使用することができる。

実施例
１Ａ スズカケノキバーク抽出物の調製
工業的スケールにおいて粉末スズカケノキバークを抽出するために、３つのエクストラクター、純粋な蒸留液レシーバー及び蒸発器からなるバッテリー抽出装置を使用した。装置を十分に充填するために、各エクストラクターのために６５０ｋｇの粉末スズカケノキバークを、ミキサーにおいて２６０リットルの水と混合し及びベルトコンベヤーを用いて個々のエクストラクターに導入した。各々のエクストラクターに、次いで、２．５ｍ³の温かいトルエン／（＋−）−２−ペンタノール／メタノール混合物（８８：７：５）を充填した。純粋な蒸留液レシーバーから出発して、６０℃まで加熱されたトルエン／（＋−）−２−ペンタノール／メタノール混合物（８８：７：５）を、２ｍ³／ｈの流量で、連続して接続された３つのエクストラクターにより排水した。１時間あたり２ｍ³の抽出物を、また、システムからの蒸発器に供給し及びその中において溶剤混合物を留去することにより濃縮した。
得られた蒸留物は、相分離器によりそれとともに蒸留された水から開放され及び有機相を、次いで、ガスクロマトグラフィーにより分析した。必要ならば、有機相の組成の再調整を、新鮮なメタノール又は（＋−）−２−ペンタノールの添加により、トルエン／（＋−）−２−ペンタノール／メタノールの比を８８：７：５とした。このようにリサイクルされたトルエン／（＋−）−２−ペンタノール／メタノール混合物を、純粋な蒸留液レシーバーに供給し及びその温度を６０℃に調節した。２０時間後、抽出工程を終了した。エクストラクターに含まれる残留抽出物を排水し及びまた蒸発器において蒸発させた。得られた抽出物の全量を、１３００リットルの容量まで濃縮した。残留物を測定することにより得られた全抽出物の含量は、６１ｇ／ｌであった。

１Ｂ 粗形態のベツリン酸の獲得
実施例１Ａで得られた１３００リットルの抽出物を、蒸発器から蒸留装置にポンプし、次いで、蒸発して乾燥物にし及び残留物を５６０リットルの２−プロパノールにおいて懸濁した。それを蒸発して再び乾燥物とし及び次いで、蒸留残留物を、１４３０リットルの２−プロパノールを用いて、標準圧下で、３０分間還流させた。懸濁液を１１ｋｇの珪藻土及び２４ｋｇの活性炭と組み合わせ及び加圧フィルターを通して晶析装置に温かくろ過(filter hot)し及び蒸留装置及び加圧フィルターを２０リットルの２−プロパノールで濯いだ。２４０リットルの２−プロパノールを２−プロパン(propanoic)溶液から留去し及び次いで、晶析装置の含有物を１０℃で一晩冷却した。得られた懸濁液を吸引ろ過し、固形物を４８リットルの２−プロパノールで洗浄し及び次いで、５５℃で、真空乾燥カップボード(vacuum drying cupboard)において乾燥した。２−プロパノールは、蒸留により回収することができる。
４３．４ｋｇのベツリン酸を、粗形態で得た。
Ｍ．ｐ．３０９〜３１０℃；ベツリン酸含量（ＨＰＬＣ−ＵＶ）：８３．９％；２−プロパノール含量（¹Ｈ ＮＭＲ）：１０．５％

１Ｃ 純粋形態のベツリン酸の獲得
実施例１Ｂで得られた４３．４ｋｇの粗ベツリン酸を還流させ及び蒸留装置において９３０リットルのジクロロメタン及び３２５リットルのメタノールを用いて溶解した。混合物を放置して、３０℃まで冷却し及び６５リットルのメタノール中に２２ｋｇの活性炭及び１１ｋｇの珪藻土を有する懸濁液を添加した。装置の含有物を再び加熱して沸騰させ、加圧フィルターを通して晶析装置に温かくろ過し及び蒸留装置及び加圧フィルターを５０リットルのジクロロメタンでリンスした。６３０リットルのろ液を標準圧下で留去し及び装置の含有物を次いで５℃で一晩冷却した。沈殿した固形物を遠心分離を用いて分離除去し、４４リットルのメタノールを５℃でスプレーし及び次いで、５０℃で、真空乾燥カップボードにおいて乾燥した。２８．９ｋｇの純粋なベツリン酸を得た。
Ｍ．ｐ．３０８〜３１０℃；ベツリン酸含量（ＨＰＬＣ−ＵＶ）：９３．８％；ジクロロメタン含量（¹Ｈ ＮＭＲ）：２．１％；メタノール含量（¹Ｈ ＮＭＲ）：２．３％

Claims (7)

1. グラウンドスズカケノキバーク及び／又は皮層の抽出によりベツリン酸を得るための改良された方法であって、前記抽出を、トルエン及び１又はそれより多くのＣ _1-6 アルコールからなる溶剤混合物であって、前記トルエンと前記アルコールの比が８０：２０〜９５：５である溶剤混合物を用いて行う方法。
2. 前記スズカケノキバークを抽出前に水で湿らす請求項１に記載の方法。
3. 前記抽出を連続して行う請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記抽出を２０〜１１０℃で行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 以下の工程：
   ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶剤混合物におけるスズカケノキバークの抽出；
   ｂ）抽出物からの溶剤混合物の除去；
   ｃ）適切な溶剤における残留物の溶解；
   ｄ）ろ液からのベツリン酸の沈殿；
   を連続して行って、ベツリン酸を単離する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程ｂ）及びｃ）の間に、以下の工程：
   ｂ１）プロパノール、ブタノール又はそれらの混合物において残留物を懸濁し及び溶解する工程；
   ｂ２）ろ過又は吸引組成物と混合する工程；
   ｂ３）懸濁液をろ過する工程；
   ｂ４）ろ過した抽出物から粗ベツリン酸を沈殿する工程；
   を行う請求項５に記載の方法。
7. ろ過又は吸引組成物が、活性炭及び／又は珪藻土からなる請求項６に記載の方法。