JP5184826B2 - 細胞シートの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞シートの製造方法に関するものである。

従来、温度応答性処理された培養容器内において接着性の細胞を培養することによりシート状に製造された細胞を培養容器から剥離させる細胞シートの製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１においては、培地中にビタミンＣを添加することにより、細胞によるコラーゲンの産生を促進して、取り扱い容易で接着性の高い細胞シートを製造することとしている。

特開２００５−１１７９３９号公報

しかしながら、十分な厚さを有する細胞シートを構成するには、細胞によりコラーゲンが産生されるのに長い培養期間が必要であり、また、多くの細胞数が必要とされる。このため、細胞の増殖に要する時間が長くなり、全体として細胞シートを製造するために長時間を要するという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易かつ短期間で十分な厚さを有する細胞シートを製造することができる細胞シートの製造方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、コラーゲンに非ゲル化対策を施して培地に添加するステップと、培養容器内の前記非ゲル化対策が施されたコラーゲンを含有する培地内において間葉系幹細胞を培養するステップと、培養により製造された細胞シートを培養容器から剥離させるステップとを備える細胞シートの製造方法を提供する。

本発明によれば、非ゲル化対策が施されたコラーゲンが培地に添加されることにより、培地をゲル化させてしまうことなく、添加されたコラーゲンを細胞の上に沈殿させ、蓄積させることができる。コラーゲンが蓄積されると、間葉系幹細胞はコラーゲンによって刺激され、細胞外基質の産生量を向上させるようになる。したがって、大量の細胞を使用しなくても、また、細胞の活性が低い場合においても、時間をかけることなく細胞シートを製造することができる。

また、このようにして製造された細胞シートは、添加されたコラーゲンによってコラーゲン量が補われ、間葉系幹細胞から産生される細胞外基質が比較的少ないので、接着性が低く、例えば、水流のような簡易な方法で培養容器から剥離させることができる。すなわち、トリプシン等のタンパク質分解酵素を使用しないで剥離でき、間葉系幹細胞の健全性を維持することができる。また、温度応答性処理された培養容器のような特殊な培養容器を使用せずに済む。

上記発明においては、前記非ゲル化対策が、培地中のコラーゲン濃度を０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬにすることであってもよい。
このようにすることで、培地中において０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のコラーゲンは、培地をゲル化させることなく細胞上に沈殿することができる。

また、上記発明においては、前記非ゲル化対策が、コラーゲンを酵素処理することであってもよい。
このようにすることで、酵素処理されたコラーゲンは、培地中においてゲル化し難く、細胞上に沈殿して、簡易に細胞シートを製造することができる。酵素処理としては、例えば、ペプシン、コラゲナーゼあるいはプロナーゼＥ等のペプチダーゼを少なくとも１種類含有する酵素溶液にコラーゲンを接触させることが挙げられる。

また、上記発明においては、前記非ゲル化対策が、コラーゲンを加熱処理することであってもよい。
このようにすることで、加熱処理されたコラーゲンは、培地中においてゲル化し難く、細胞上に沈殿して、簡易に細胞シートを製造することができる。例えば、４０℃以上に加熱することで、コラーゲンをゲル化し難くすることができる。

また、上記発明においては、前記コラーゲンを酸性またはアルカリ性溶液内において加熱処理することとしてもよい。
このようにすることで、酸性またはアルカリ性溶液の作用により、コラーゲンの加水分解を開始させ、さらにゲル化し難くすることができる。

また、本発明は参考例として、グリシン−Ｘ−Ｙを含むペプチドを培地に添加するステップと、培養容器内の前記ペプチドを含有する培地内において細胞を培養するステップと、培養により製造された細胞シートを培養容器から剥離させるステップとを備える細胞シートの製造方法を提供する。
本発明によれば、グリシン−Ｘ−Ｙを含むペプチドは培地中においてゲル化せず、コラーゲンと同様に機能するので、細胞上に蓄積されることで、細胞による細胞外基質の産生を向上し、少ない細胞あるいは活性の低い細胞によっても、短時間で細胞シートを製造することができる。
上記発明においては、前記細胞が間葉系幹細胞であることが好ましい。

本発明によれば、簡易かつ短期間で十分な厚さを有する細胞シートを製造することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞シートの製造方法について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞シートの製造方法は、図１に示されるように、コラーゲンに非ゲル化対策を施すステップＳ１と、非ゲル化対策が施されたコラーゲンを培地に添加するステップＳ２と、非ゲル化対策が施されたコラーゲンを含有する培地を貯留した培養容器内において細胞を培養するステップＳ３と、培養により製造された細胞シートを培養容器から剥離させるステップＳ４とを備えている。

コラーゲンに非ゲル化対策を施すステップＳ１としては、例えば、培地内においてコラーゲンが０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように添加するコラーゲン量を計量することが挙げられる。
このようにして計量されたコラーゲンをステップＳ２において培地に添加することにより、添加されたコラーゲンによって培地がゲル化することなく、培地の流動状態を維持したまま、細胞を培養することができる。

そして、ステップＳ３において、上記培地内において細胞を培養することにより、培地内に添加された低濃度のコラーゲンがゲル化することなく沈殿して細胞上に蓄積する。また、蓄積したコラーゲンが細胞に作用することにより、細胞による細胞外基質の産生が向上し、細胞の成長が促進される。

したがって、細胞数が大量ではなく、また、細胞の活性がさほど高くない場合においても、短時間の内に、細胞シートを構成するために十分なコラーゲン量を細胞上に蓄積させることができ、培養容器の底面に細胞シートが製造される。
そして、ステップＳ４においては、例えば、水流等の簡易な方法によって、製造された細胞シートを培養容器の底面から剥離させることができる。

この場合において、本実施形態によれば、添加されたコラーゲンによって細胞シートの構成に必要なコラーゲン量が補われ、細胞によって産生されるコラーゲンを始めとする細胞外基質の産生量は少なくて済むので、細胞シートの製造にかかる時間を短縮することができる。また、短時間で製造されるので、細胞が産生した細胞外基質によって培養容器の底面に強固に接着することがない。したがって、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いることなく、水流のような簡易な方法で培養容器の底面から剥離させることができ、細胞の健全性を損なわないで済むという利点がある。
また、このようにして構成された細胞シートは、コラーゲンを添加することなく製造された細胞シートと比較して、剥離後の収縮を低減することができるという利点もある。

ここで、本実施形態に係る細胞シートの製造方法の実施例について説明する。
骨髄由来間葉系幹細胞を１２穴培養プレートに１．２×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種した。
培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％人血清、５０μｇ／ｍＬのビタミンＣを添加したものを使用した。
コラーゲンとしては、ブタ皮膚製コラーゲン溶液ｐＨ３．０（日本ハム社製）を再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）、濃縮培地ＭＥＭ／Ｆ１２（新田ゼラチン社製）を８：１：１の割合で混合し、中性に調製したものを使用した。

調製されたコラーゲンは、０、０．０６３、０．１２５，０．２５，０．５，１．０、１．５，２ｍｇ／ｍＬの濃度で培地に添加した。この状態で、１週間培養した後に、ピペットなどで水流をかけ、培養プレートから剥がし、細胞シートの長径と培養プレートの培養面の直径との比率による細胞シートの収縮率の計測と、含有されるタンパク量の計測とを行った。タンパク量の定量には、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を使用した。
その結果を表１、表２および図２、図３に示す。

表１および図２は、添加するコラーゲン濃度と、製造された細胞シートの収縮率との関係を示している。
図２の写真は、コラーゲン濃度が、Ａ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｂ：１．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃ：１ｍｇ／ｍＬ、Ｄ：０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｅ：０．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｆ：０．１２５ｍｇ／ｍＬ、Ｇ：０．０６３ｍｇ／ｍＬ、Ｈ：無添加の場合である。

表１および図２によれば、添加するコラーゲンの濃度が１．５ｍｇ／ｍＬ以上の場合、培地のゲル化が進行して、細胞シートが形成されず、水流によって剥離することができない。また、０．２５ｍｇ／ｍＬ以下の場合、無添加の場合と同様であり、コラーゲンを添加した効果が見られなかった。
これに対して、コラーゲン濃度０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの場合には、製造される細胞シートが無添加の場合と比較しても十分に大きく、剥離後の収縮も少ないことがわかった。

また、表２および図３は、コラーゲン濃度０〜１．０ｍｇ／ｍＬと培養後のタンパク量との関係を示している。
これによれば、コラーゲン濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ以下の場合には、無添加の場合と比較してタンパク量が増えておらず、コラーゲン添加の効果が見られなかった。
これに対して、コラーゲン濃度０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの場合には、無添加の場合と比較して十分にタンパク量が増えており、細胞の増殖が認められた。

なお、本実施形態においては、コラーゲンをゲル化させることなく培地に添加する方法として、コラーゲン濃度を低濃度に抑えることとしたが、これに代えて、予め酵素処理して可溶化されたコラーゲンＴｙｐｅ ＩまたはＴｙｐｅ ＩＩＩを含むコラーゲンまたはゼラチンを培地に添加することにしてもよい。
このようにすることで、酵素処理されたコラーゲンは、培地中においてゲル化し難く、細胞上に沈殿して、簡易に細胞シートを製造することができる。酵素処理としては、例えば、ペプシン、コラゲナーゼあるいはプロナーゼＥ等のペプチダーゼを少なくとも１種類含有する酵素溶液にコラーゲンを接触させることが挙げられる。

また、加熱処理したコラーゲンを培地に添加することにしてもよい。
このようにすることで、加熱処理されたコラーゲンは、培地中においてゲル化し難く、細胞上に沈殿して、簡易に細胞シートを製造することができる。例えば、４０℃以上に加熱することで、コラーゲンをゲル化し難くすることができる。

また、酸性またはアルカリ性溶液内において加熱処理したコラーゲンを培地に添加することにしてもよい。
このようにすることで、酸性またはアルカリ性溶液の作用により、コラーゲンの加水分解を開始させ、さらにゲル化し難くすることができる。

また、本実施形態においては、コラーゲンを添加することとしたが、これに代えて、グリシン−Ｘ−Ｙを含むペプチドを培地に添加することとしてもよい。
グリシン−Ｘ−Ｙを含むペプチドも培地中においてゲル化せず、コラーゲンと同様に機能するので、細胞上に蓄積されることで、細胞による細胞外基質の産生を向上し、少ない細胞あるいは活性の低い細胞によっても、短時間で細胞シートを製造することができる。

本発明の一実施形態に係る細胞シートの製造方法を示すフローチャートである。 図１の細胞シートの製造方法により製造された細胞シートの添加コラーゲン濃度に対する収縮率の変化を示す写真である。 図１の細胞シートの製造方法により製造された細胞シートの添加コラーゲン濃度に対するタンパク量の変化を示すグラフである。

符号の説明

Ｓ１ 非ゲル化対策ステップ
Ｓ２ コラーゲン添加ステップ
Ｓ３ 培養ステップ
Ｓ４ 剥離ステップ

Claims (6)

1. コラーゲンに非ゲル化対策を施して培地に添加するステップと、
   培養容器内の前記非ゲル化対策が施されたコラーゲンを含有する培地内において細胞を培養するステップと、
   培養により製造された細胞シートを培養容器から剥離させるステップとを備える細胞シートの製造方法。
2. 前記非ゲル化対策が、培地中のコラーゲン濃度を０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬにすることである請求項１に記載の細胞シートの製造方法。
3. 前記非ゲル化対策が、コラーゲンを酵素処理することである請求項１に記載の細胞シートの製造方法。
4. 前記非ゲル化対策が、コラーゲンを加熱処理することである請求項１に記載の細胞シートの製造方法。
5. 前記コラーゲンを酸性またはアルカリ性溶液内において加熱処理する請求項４に記載の細胞シートの製造方法。
6. 前記細胞が間葉系幹細胞である請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。