JP5184144B2 - 高生理活性マンネンタケの製造方法 - Google Patents
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Description
マンネンタケは、縁起の良いものとして贈り物ののしに代えて使用されるなど、馴染み深いものであるが、近年マンネンタケの効能、効果についても確認が進んでおり、肝機能改善作用、抗炎症作用、抗高血圧作用、抗腫瘍作用、抗高脂血症作用、抗HIV作用などが知られている。
これらの薬理作用の解明とともに、活性成分も明らかとなりつつあるが、一方でマンネンタケの培養に関しては、その収穫量の増大を図る試みは多々行われているものの、薬理活性と培養方法に関しては十分な検討が進んでいない。
すなわち、本発明にかかる高生理活性マンネンタケの製造方法は、梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養することを特徴とする。
また、前記方法において、生理活性は血小板凝集抑制機能、ケモカイン遺伝子発現抑制機能ないしアンギオテンシン転換酵素阻害活性機能であることが好適である。
まず、本発明者等は、各種キノコと生育条件について検討する過程で、キノコの種が同じであっても、菌株の違いはもとより、光、温度、湿度、樹種などの生育条件の違いにより、子実体の形状、色合い、肉質、苦味などが微妙に変化し、さらに品質や内容成分にも差が見られることを見出した。
そこで、本発明者等は、まずマンネンタケを各地より収集し、その薬理作用について検討を行った。すなわち、供試菌株として、8都道府県から採取したマンネンタケ18菌株を用いた。5系統は梅に生育していたもの、10系統は梅以外の広葉樹に生育していたもの、3系統は人工栽培によって得られたものである。乾燥市販品はそのまま、また天然物のマンネンタケは、棚段式キノコ子実体乾燥機を用いて40〜60℃可変式により24時間通風乾燥させ、ワーリングミキサーを用いて粉砕した。このようにして得られた乾燥粉末5gを100mlの30%メタノール(室温)中で12時間抽出した。濾液を減圧濃縮し、メタノール抽出物を得た。
これらの抽出物について、以下の機能性試験を行った。
種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患や肌荒れの発症には、アラキドン酸やその代謝物であるロイコトリエンやトロンボキサン、プロスタグランジンが関与していることが明らかにされつつある。例えば炎症性異常角化性疾患である乾癬では、その患部表皮において高いアラキドン酸代謝物の存在が認められており、アレルギー性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎、湿疹にもアラキドン酸代謝物の関与が示唆されている。また、プロスタグランジン類やトロンボキサン類は血小板を凝集させることから、アラキドン酸からプロスタグランジン類やトロンボキサン類への合成を抑制する化合物は、抗血栓効果、すなわち血流改善効果を有するものと考えられる。
試験方法は以下の通りである。
ヒト血液を室温にて1100rpmで20分間遠心し、多血小板血漿(PRP)を分取した後、さらに3000rpmで5分間遠心して乏血小板血漿(PPP)を分取した。PRP 223μLを37℃にて予備加温した後、上記被検抽出物の2%DMSO溶液、又は対照例としてイオン交換水をそれぞれ2μL添加し、さらに3分間37℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるPAF水溶液(500nM)を25μL添加した。
惹起された凝集はアグリゴメーター(MCMヘマトレーサー MCMメディカル株式会社製)を用いて測定し、被験試料の最大凝集率(PPPの値を100として被験試料の凝集曲線より求められた最大値)を対照例の最大凝集率と比較することにより、被験物質のPAF惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した(表中PAF)。
また、炎症やアレルギー等の発生の原因物質であるアラキドン酸による血小板凝集に対する抑制作用(表中A−Na)及びADPによる血小板凝集に対する抑制作用(表中ADP)も、上記のPAF水溶液のかわりにアラキドン酸ナトリウム水溶液(500μM)、ADPを用いることにより、同様に評価した。
近年、種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患の発症に炎症性細胞の遊走・活性化を支配するケモカイン(Chemotactic Cytokine,Chemokine)が強く関与することが明らかにされつつある。ケモカインは分子量8〜10kDaのヘパリン結合性を有する塩基性蛋白の総称であり、生体において炎症に関わる様々な細胞の炎症部位への遊走・活性化に中心的に作用し、炎症の惹起に重要な役割を果たしているものと考えられている。
従って、IL−8等のケモカインの発現を抑制することは、これらの炎症性あるいはアレルギー性の疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
そこで、マンネンタケ子実体抽出物におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用を調べた(表中K−M)。
ケモカイン遺伝子発現抑制作用の測定方法は次のとおりである。
ヒト皮膚線維芽細胞を直径6cmの培養皿で、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地に被験試料として、マンネンタケ抽出液、あるいはハイドロコルチゾン(陽性対照)を添加した。マンネンタケ抽出物及びハイドロコルチゾンの終濃度はそれぞれ0.0025〜0.04%(乾燥質量)及び10−7Mとした。
次に常法に従って、細胞からRNAを単離し、cDNAを合成したのち、定量的PCR法(TaqMan PCR法)により、IL−8遺伝子の発現量を測定した。内部標準遺伝子としてGAPDH(グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素)遺伝子を用い、得られたデータを補正した。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として入手可能であり、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよい。
アンギオテンシンI転換酵素(ACE)は、アンギオテンシンIを昇圧性物質のアンギオテンシンIIに転換して、血圧の調整に関与する膜酵素であり、その阻害により高血圧予防、治療効果が期待される。
そこで本発明者らは、各マンネンタケ抽出物についてACE阻害活性を測定した(表中ACE)。
測定方法は以下の通りである。
被検試料について、合成基質(Hippuryl-His-Leu)及びACEをもちいてCheung.H.Sらの方法に準じて測定し、水を対象とした場合の試料の阻害率を算出した。
以上のように、採取したマンネンタケ子実体を用いた機能性評価試験の結果から、梅木から採取したマンネンタケが、他樹種から採取したもの或いは人工栽培のものに比較し、高い生理活性を有することが明らかとなった。この原因についてはいまのところ不明であるが、梅木成分が高蓄積されたか、或いはマンネンタケの生理活性成分が梅木成分により高濃度化されたことによると思われる。
すなわち、梅木(1年)、梅木(10年以上)、ブナ、コナラ、サクラ、スギよりそれぞれ木粉を作成し、木粉:フスマ=5:1、含水率60%に調製し被検培地とした。そして、シャーレで1週間、菌糸体を成長させた後、40〜60℃で乾燥し、乾燥粉末を得た。乾燥粉末5gを100ml−30%メタノール抽出(25℃/12時間)し、前記各生理活性試験に供した。
結果を図2に示す。同図より明らかなように、子実体を検体とした場合よりも、樹種間の差異は小さくなってはいるが、特に血小板凝集抑制効果において顕著な差異が認められた。
なお、6種のマンネンタケ(E−8401,M−0601,M−0602,M−0603,M−0604,M−0605)について、SMY培地(ショ糖−麦芽抽出エキス−酵母抽出エキス)と、コナラ木粉、梅木粉をそれぞれ用いた平板培地における菌糸成長速度を検討した結果、同一菌であればおおよそ同程度の成長を示した(図3)。
このように、菌糸の成長と機能性評価の結果は一致せず、菌糸の成長に依存した培養方法の決定は、少なくとも機能性素材としてマンネンタケを見た場合には、妥当ではないことが理解される。
同図に示すように、梅木粉と栄養剤(フスマ)の混合比率の変化は、平板培地における菌糸成長速度にはほとんど変化を与えない。
このように、キノコの生長或いは収穫量が多い培養条件と、収穫されたキノコの生理活性とは相関性が低く、成長に好ましい条件で優れた生理活性が必ずしも得られるものではない。
そして、培地という観点からマンネンタケの生理活性向上を企図した場合には、梅木ないし梅木粉を用いて培養を行うことにより、優れた生理活性が得られることが示された。
Claims (2)
- 梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養されたマンネンタケの菌糸を抽出する工程を含むことを特徴とする血小板凝集抑制剤の製造方法。
- 梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養されたマンネンタケを抽出する工程を含むことを特徴とするIL−8遺伝子発現抑制剤の製造方法。
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