JP5183042B2 - 粉末厚膜胞子及びその製造方法 - Google Patents

Description

この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３４６）の厚膜胞子を製造し、これを乾燥して粉末化することを目的とした粉末厚膜胞子の製造方法に関する。

この発明の対象物たるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５は出願人により、平成４年１２月２５日に特許出願され、平成１２年３月１７日に特許登録された（特許第３０４６１６７号）。

またトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５の菌糸体を培養して厚膜胞子を製造する技術も発明されている（特開２０００−９３１６７、特開２００１−１７２１１２）。なお、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（あて名：茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター 中央第６）（旧工業技術院生命工学工業技術研究所）に１９９２年１２月９日付で寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３４６が付与されている。

次に、凍結乾燥された微生物の製造方法についての提案（特公平４−１２９５０）、ビフィズス乾燥菌体の安定化方法の発明（特公平４−６３４９）及び活性ビフィズス菌含有粉末の製造方法の発明（特公昭６３−１２５９４）が知られている。
特公平４−１２９５０ 特公平４−６３４９ 特公昭６３−１２５９４

前記従来知られているビフィズス菌は、菌体自体を凍結乾燥するものであるが、このような処理ができるのは、凍結乾燥し、これを使用する際再び生菌に戻る菌に限られるので、他の菌にそのまま使用できない問題点があった。この発明の対象物たるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５の分生子は、これを乾燥すると、大部分死滅することが判明していた。

そこで温度等に耐性のある厚膜胞子を製造し、この厚膜胞子を凍結乾燥することについて実験を繰り返したが、水分を少なくする（例えば水分３０％以下、特に１０％以下）にすると、処理前に１０^８ ＣＦＵ／ｇあった厚膜胞子が、１０^４ ＣＦＵ／ｇ以下に激減し、残留厚膜胞子の活性も小さいという問題点があってので、平成１４年以来の実験研究において低水分（１０％以下）の厚膜胞子の乾燥粉末化は極めて困難とされていた。

またトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５（以下、「ＳＫ−５５」とする）の分生子から厚膜胞子を製造した場合に、培養液中には厚膜胞子と、菌糸とが絡み合って共存しているので、菌糸と厚膜胞子を分離する必要があったが、厚膜胞子を傷つけることなく、効率よく分離する手段が不明であった。

また厚膜胞子と、菌糸が分離したとしても、厚膜胞子と培養液とを分離する手段が必要であったが、これまた不明であった。

次に厚膜胞子を分離しても、これを乾燥する手段がなく、例えば２０℃〜３０℃の低温乾燥では、長時間を要し、ＳＫ−５５数が激減することが判明し、その上乾燥された物の活性が著しく低下することが判明した。例えば処理前に１０^８ ＣＦＵ／ｇあった厚膜胞子が１０^４ ＣＦＵ／ｇ程度になると共に、その活性が弱くなり、発芽率が５０％以下となるような、実用性のないものであった。

前記厚膜胞子と、菌糸との分離については、ホモジナイズの技術によって解決したが、その条件（吹き込み空気量、速度、吹き込み状態）については試行錯誤があって多大の時間、労力を費やした。前記ホモジナイズについて実験の結果、図１の現象が明らかになった。そこでホモジナイズ開始後５０分〜２００分を実施時間とすることにより、ＳＫ−５５の数を高く保つことができることが判った。

次に厚膜胞子と、培養液との分離についても、遠心力分離が適当であることが判明してから、各種条件について最良条件が見つからず、多大の時間を費やした。単なる分離だけはすぐできたけれども、遠心力が強いと効率のよい反面、有効なＳＫ−５５の数が半減し、遠心力が弱いと分離効率が低下することが判明してから、効率よく、しかも残留ＳＫ−５５の数を多くすることについて試行錯誤を繰り返した。前記遠心分離は、例えば直径３０ｃｍの分離器を３０００ｒｐｍ以上で使用した（重力の加速度はほぼ１５００×ｇ）。

次に低温乾燥で、例えば２０℃〜３０℃の乾燥空気利用だと、数時間以上掛かるのみならず、水分１０％以下というような低水分に乾燥することが難しくなった。そこで温度を４０℃〜５０℃にすると乾燥できるけれども、活性を有する残留ＳＫ−５５の数が激減し（例えば処理前のＳＫ−５５が１．０×１０^８ ＣＦＵ／ｇのものが、減圧常温乾燥すると８．７×１０^５ ＣＦＵ／ｇ程度となった）、実用性が乏しくなった。

そこで−３０℃〜−８０℃の凍結乾燥について試験したが、水分５％以下まで乾燥することが可能となったけれども、依然として活性を有する残留ＳＫ−５５の数が少ない問題点があった。

前記改善方法として保護剤を使用することとし、保護剤として、例えばグルコース又はスクロースを試した際、表１のような良好な結果を得て、凍結したＳＫ−５５にも３．７〜８．０１×１０^７ ＣＦＵ／ｇの残留が認められ、しかも活性が失われていないことが確認された。また前記保護剤の使用量については、表２の結果を得た。そこで濃度２０％前後が実用範囲とし、これを採用した。

前記保護剤としては、グルコース、スクロース、フルクトース、ソルビトール等の単糖類の１５％〜２５％を用いるとほぼ安定することが判明した。この場合にグルタミン酸ナトリウム等をさらに０．１〜３％添加する場合もある。

そこで前記凍結物を２５℃程度の温度で乾燥すれば、活性を有するＳＫ−５５が残存することを認めたが、乾燥時間が著しく長くなる（例えば５０時間〜１００時間）ことが判明したので、これを短縮すべく減圧乾燥を採用し、この発明を完成したのである。

即ちこの発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５の厚膜胞子であって、その数を１．０×１０^５ＣＦＵ／ｇ以上を含み、水分１０％以下の粉末としたことを特徴とする粉末厚膜胞子であり、厚膜胞子の数を１．０×１０^６ＣＦＵ／ｇ以上を含み、水分５％以下の粉末とした粉末厚膜胞子の製造方法である。

また方法の発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５の菌糸体に、下記各工程を順次加えることを特徴とした粉末厚膜胞子の製造方法である。
（１）菌糸体を培養して厚膜胞子を多量に含む厚膜胞子入り培養液とする。
（２）厚膜胞子入り培養液内の厚膜胞子と、菌糸とを分離する。
（３）前記処理を経た培養液を、厚膜胞子と培養上澄み液とに分離する。
（４）厚膜胞子に保護剤を添加した後、急速凍結処理する。
（５）急速凍結処理した凍結厚膜胞子を減圧乾燥する。
（６）乾燥した厚膜胞子を粉砕して粉末厚膜胞子とする。

次に、菌糸体をグルコース、酵母エキス及びポリペプトンを含む培養培地に接種して培養し、厚膜胞子を多量に含む培養液を得るものである。また、厚膜胞子と菌糸との分離は、ホモジナイズ処理により行うものであり、厚膜胞子と菌糸体とを分離した培養液を遠心分離機にかけて、厚膜胞子と、培養液とに分離するものである。更に、保護剤はグルコース、スクロース、フルクトース、ソルビトール等の単糖体を１５％〜２５％添加して行うものとするものであり、急速凍結処理は、６０〜１８０秒間以内に−３０℃〜−８０℃とするものであり、減圧乾燥は、０〜１０Ｐａの減圧下で、０〜２５℃の温度下で、２４〜４８時間かけ、水分１０％以下とするものである。

前記のように、この発明は、厚膜胞子を採用し、これを乾燥したこと、厚膜胞子は、各種加工に対応できることは判明していたが、これを発芽させた場合に、処理方法によって、残留ＳＫ−５５の数に大差があることが判明した。そこで活性のあるＳＫ−５５が多数生存させることを目標とし、各種処理を経てこの発明を完成したのである。

前記におけるホモジナイズ処理は、培養液に超音波振動を与え溶液中にキャビテーションを引き起こす。溶液中でキャビテーションが起こると溶液中の物質に衝撃を与え、菌糸、胞子を分離する。従って同一効果を生じる処理は何れもホモジナイズ処理として取り扱うものにする。

前記において、粉末厚膜胞子中の厚膜胞子の数を１．０×１０^５ ＣＦＵ／ｇとしたのは、この厚膜胞子を植物に施用した結果、厚膜胞子による本来の効果が認められたからである。また厚膜胞子粉末製品を提供する場合には、１．０×１０^６ ＣＦＵ／ｇ以上を含み、水分５％以下がより好ましい。

この発明によれば、従来知られているＳＫ−５５の厚膜胞子を含む培養液から、厚膜胞子を分離、抽出して水分１０％〜５％以下であって、活性ＳＫ−５５を多量に含む粉末厚膜胞子とすることであるから、保存性が抜群であり、特別の手段（例えば恒温容器による保存）によることなく、寒冷地又は熱帯地等へ輸送し使用できると共に、使用に際して、必要量を容易に分取し、かつ取り扱いが容易であるなどの諸効果がある。

またこの発明の製造方法によれば、厚膜胞子を含む培養液からＳＫ−５５の減少を極力少なくして容易に厚膜胞子の粉末を製造し得ると共に、活性を保有し得る効果がある。

また乾燥効率もよいので、粉末製造についての費用を低減し得る効果もある。

この発明の厚膜胞子の乾燥粉末は、温度に影響されないので、取り扱いが容易であり、保存性、分取性、再生発芽性など何れにおいても優れているなどの諸効果がある。

この発明は、菌糸体を、グルコース、酵母エキス及びポリペプトンを含む培養培地に接種して培養し、厚膜胞子を多量に含む培養液とする。ついでこの培養液をホモジナイズ処理して、厚膜胞子と菌糸とを分離し、ついで遠心分離機にかけて厚膜胞子と、上澄液とに分離する。前記のようにして得た厚膜胞子に保護剤を添加してから−３０℃〜−８０℃に急速凍結する。この急速凍結には、従来知られている手段として、液体窒素を噴射する（例えば１００ｇの厚膜胞子に０．１リットルの液体窒素を噴射する）と、６０秒間に−３０℃の凍結物となる。

そこで乾燥室へ移し、５Ｐａの減圧下で１０℃の温度下で２４時間乾燥し、水分５％の厚膜胞子を得た。ついでこの厚膜胞子を粉砕機にかけて粒度０．０１ｍｍ以下の粉末とすれば、この発明の粉末乾燥物を得たのである。

この発明の実施例について説明すれば、次のとおりである。

トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５を下記培地に接種し、振盪培養機（２６℃、１００ｒｐｍ）で５０〜７０時間好気的に培養した後、前記培地から菌糸体（５μｍ以上）を分離し、菌糸体の５〜１００倍の生理食塩水を用いて菌糸体の表面に付着している栄養分を除去する。

種培養（栄養培地）
グルコース ６．２５ ｇ
麦芽エキス ６．２５ ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４ １．２５ ｇ
酵母エキス １．０ ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．６２５ ｇ
ペプトン ０．６２５ ｇ
蒸留水 １０００ ｍｌ
前記のように栄養分を除去した菌糸体を下記飢餓培地に接種し、振盪培養機（２６℃、１００ｒｐｍ）で１７０〜２００時間好気的に培養した。

主培養（飢餓培地）
ショ糖 ２０ ｇ
ＫＮＯ_３ １．０ ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４ １．０ ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ ｇ
ＣａＣｌ_２ ０．１ ｇ
ＺｎＳＯ_４ ２．０ ｍｇ
ＣｕＣｌ_２ ０．１ ｍｇ
ＦｅＳＯ_４ ０．２ ｍｇ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．２ ｍｇ
Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０１ ｍｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
前記培養液を３０分間ホモジナイズし、厚膜胞子と菌糸を分離し次いでこの培養液を遠心分離機（直径３２ｃｍ、回転数は３０００ｒｐｍ）を用い、１５００×ｇの重力加速度で５分間かけて、胞子と液分を分離し、厚膜胞子を取り出す。

この厚膜胞子に、グルコース濃度２０％に混合した後、−３０℃に急速凍結する。この凍結処理物を乾燥器に収容して５Ｐａ、２０℃以下の温度で３０時間乾燥し、水分５％の厚膜胞子を得た。前記厚膜胞子を乳鉢に入れて粉砕し、この発明の粉末厚膜胞子を得た。この場合のＳＫ−５５の数は７．５×１０^７であった。また、−８０℃で凍結し、以下同様に処理した所、ＳＫ−５５の数は９．０×１０^７であった。

前記凍結温度差による性質は表３のとおりである。

前記粉末厚膜胞子の保存による経時的変化について判定した所、表４の結果を得た。従って、室温保存でもよいが、長期に亘る場合は冷蔵（０℃〜５℃）が望ましい。

前記実施例１の成分を用いて、振盪培養機を用いシード培養３日、本培養８日を行い、ホモジナイズ処理後、遠心分離し、分離して得た厚膜胞子に、２０％グルコースを添加して、−３０℃で急速凍結して実施例１と同様に乾燥した所、表５の結果を得た。この場合のＳＫ−５５の数は２．３×１０^８ ＣＦＵ／ｇから８．７×１０^７ ＣＦＵ／ｇに変わった。

前記のように、凍結処理によりＳＫ−５５の数に若干の減少がみられた。

前記実施例１において、凍結温度を−８０℃とした所、表６のように処理前と、処理後のＳＫ−５５の数の変化は殆どなかった。従って凍結温度が低い程減少するということもできるが、その限界（例えば−４０℃以上は同一とか、−５０℃以上は同一とかの限界）は不明である。

ジャーファーメンターを用い、シード培養２日、本培養６日を行った以外は実施例３と同様に行った所、厚膜胞子の菌数は表７のようになった。要するに−８０℃凍結の方がＳＫ−５５の数の減少度が少ない。

この発明において、培地組成を変えた場合の実施例を説明する。

（１）ジャー培養（培地組成）
グルコース ３．３％
ポリペプトン ０．３％
ｍｇＳｏ_４ ０．０５％
ＣａＣｌ_２ ０．０５％
ｐＨ 無調整
シード量 ０．７％
（２）条件
温度 ２８℃
撹拌 ２００ｒｐｍ
通気量 ０．３ｖｖｍ
前記培地で液体通気（撹拌）状態で３日間通気培養し、３日経過後１リットルサンプリングして、容量５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌ添加し、下記条件で７日間培養（全部で１０日間培養）し、前記ジャーで継続培養したものと比較した所、表８の結果を得た。

前記実験より次のことが考えられる。
（イ）胞子化の温度条件は、培養温度（２８℃）が最適と思われる。
（ロ）最近の胞子形成と異なり、カルシウムの添加効果はない。
（ハ）厚膜胞子の形成は、菌体の自己消化酵素との関係が推定され、アルカリ側で若干の増加傾向が見られた。
（ニ）培養液のｐＨを５に調整した区で極端に胞子化が悪く、自己消化酵素との関係を裏付けられている。
（ホ）ジャー培養の胞子数５×１０^７ ＣＦＵ／ｍｌで再現性あがり、糖切れ後のｐＨ調整で胞子率は促進される。

前記培養液をホモジナイズして、菌糸と厚膜胞子を分離した後、遠心力をかけて厚膜胞子を分離採取し、これにグルコースをまぶして、−８０℃で凍結し、ついで減圧１０Ｐａすると共に、温度１０℃で乾燥した後粉砕すれば、この発明の粉末厚膜胞子を得た。この場合のＳＫ−５５の数は、１．３×１０^８ ＣＦＵ／ｍｌであった。

実施例１と同様の培地を用い、主培養を２、３日、本培養日数を７〜１１日とした時の凍結乾燥前のＳＫ−５５を上段に、凍結乾燥後のＳＫ−５５を下段にまとめて表９に示す。

ジャーファーメンター（２６℃、３００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分）を用い、種培養を２日、本培養６日行った以外は実施例１と同様に行った厚膜胞子の菌数は１．３×１０^８ ＣＦＵ／ｇであった。

ジャーファーメンター（２６℃、３００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分）を用い、本培養５日行った以外は実施例７と同様に行った厚膜胞子の菌数は１．０×１０^８ ＣＦＵ／ｇであった。

前記各実施例をまとめると、水分６％以下で、ＳＫ−５５は初期に５×１０^７以上あり、一年後に１×１０^７ ＣＦＵ／ｇ以上あることを目標として研究開発している。

ホモジナイズ時間と、ＳＫ−５５の数との関係を示す図。

Claims (1)

1. トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３４６）の菌糸体に、下記各工程を順次加えることを特徴とした粉末厚膜胞子の製造方法。
   （１）菌糸体をグルコース、酵母エキス及びポリペプトンを含む培養培地に接種して培養して厚膜胞子を多量に含む厚膜胞子入り培養液とする。
   （２）厚膜胞子入り培養液内の厚膜胞子と、菌糸とをホモジナイズ処理により分離する。
   （３）前記処理を経た培養液を、厚膜胞子と培養上澄み液とに分離する。
   （４）厚膜胞子にグルコース、スクロース又はフルクトースなどの単糖類よりなる菌数保護剤を１５％〜２５％添加した後、−３０℃〜−８０℃の冷凍庫で６０〜１８０秒以内に共晶点以下に急速凍結処理する。
   （５）前記急速凍結処理した凍結厚膜胞子を０〜１０Ｐａの減圧下で、０〜２５℃の温度下で、２４〜４８時間かけ、水分１０％以下に減圧乾燥する。
   （６）乾燥した厚膜胞子を粉砕して粉末厚膜胞子とする。

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