JP5178254B2 - 標的物質検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、検体中の標的物質を検出するための標的物質検出方法に関する。

金属微粒子を基板表面に固定化し、そこに誘起される局在プラズモン共鳴を利用して金属微粒子近傍の物質を検出する測定法が知られている。金や銀などの金属微粒子に光を入射すると、局在プラズモン共鳴により特徴的な共鳴スペクトルが現れる。その共鳴波長は金属微粒子近傍の媒質の誘電率に依存することが知られている。その誘電率が大きくなるに従い、共鳴ピークの吸光度は大きくなり、長波長側へシフトするようになる。例えば、岡本らは、直径約２０ｎｍの金コロイドを用いた系を提案している（特許文献１）。これは、基板に固定した金属微粒子の直径程度の距離までにある媒質の屈折率を検出するようにしたものであり、その結果、金属微粒子表面への物質（抗原抗体反応における抗原など）の吸着や堆積を検出することができる。

また、渡辺らは、物質に係わる相互作用を高精度に測定できるセンサ技術を提案している（特許文献２）。ここでは、誘電体クリスタルでDNAを標識し、プラズモン共鳴に利用する例が開示されている。ここでは、あらかじめ、標的物質が結合すると一本鎖DNAになるように改変されたDNAと誘電体クリスタルで標識された相補的なDNAからなる二本鎖DNAが、プラズモン共鳴が生じる検出表面に固定化されている。検出表面上のＤＮＡに標的物質が結合すると、誘電体と基板の距離が変化し、この変化を利用して標的物質の検出が行われている。
特許第３４５２８３７号明細書 特開２００５−２５７６６７号公報

しかしながら、これまでに発明されている局在プラズモン共鳴を利用した検出方法は、抗原抗体反応の特異性を利用したイムノ・アッセイなどのアフィニティ・アッセイにおいて、その検出感度が十分ではない場合があり、更なる感度の向上が望まれていた。

本発明は、上記の背景技術における課題を解決するものであり、その目的は、局在プラズモン共鳴を利用した標的物質の検出における検出感度を向上させることができる標的物質検出方法を提供することにある。

本発明は、検体中の標的物質を検出するための標的物質検出方法であって、
基板と該基板の表面に存在する金属構造体と該金属構造体の表面に存在する第一の標的物質捕捉体とを少なくとも有する標的物質検出素子に、検体を接触させる第一の工程と、
前記第一の工程の後にもしくは前記第一の工程と同時に行われる工程であって、前記標的物質検出素子に標識物質と第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料を接触させる第二の工程と、
前記検体および前記標識材料と接触させた前記標的物質検出素子の吸収スペクトル（Ａ）を取得する第三の工程と、
を有する標的物質の検出方法において、
前記標識物質として、
前記検体および前記第二の標的物質捕捉体と接触させた標的物質検出素子の液体中での吸収スペクトル（Ｂ）の最大吸収波長（λ_z）における前記液体中での前記標識物質の吸収スペクトル（Ｃ）の接線の傾きが０より大きい標識物質を用いる
ことを特徴とする標的物質検出方法である。

ここで、前記標識物質は、無機酸化物あるいは有機物であることが好ましい。

本発明によれば、標識物質の吸収スペクトル特性を利用した感度増幅効果により、標的物質の検出を高感度に行うことが可能となる。

以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明は、以下の形態及び実施例に限定解釈されるものではない。たとえば、以下の形態及び実施例の材料、組成条件、反応条件等は、当業者が理解可能な範囲で自由に変更して本発明を実現することができる。

（標的物質検出方法）
本発明にかかる検体中の標的物質を検出するための標的物質検出方法は、以下の工程（１）〜（３）を有する。
（１）基板と該基板の表面に存在する金属構造体と該金属構造体の表面に存在する第一の標的物質捕捉体とを少なくとも有する標的物質検出素子に、検体を接触させる第一の工程（２）第一の工程の後にもしくは第一の工程と同時に行われる工程であって、標的物質検出素子に標識物質と第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料を接触させる第二の工程
（３）第二の工程の後に標的物質検出素子の吸収スペクトル（Ａ）を取得する第三の工程
そして、標識物質として、検体および第二の標的物質捕捉体と接触させた後の標的物質検出素子の液体中での吸収スペクトル（Ｂ）における最大吸収波長（λ_Z）での前記液体（吸収スペクトル（Ｂ）を取得した液体と同一の液体）中での標識物質の吸収スペクトル（Ｃ）の接線の傾きが０より大きい標識物質を用いる。

以下、各工程について説明する。

（１）の工程について
（１）の工程では、基板と該基板の表面に存在する金属構造体と該金属構造体の表面に存在する第一の標的物質捕捉体とを少なくとも有する標的物質検出素子に、検体を接触させる。標的物質検出素子と検体とを接触させる際は、標的物質検出素子に検体を接触させても良いし、検体に標的物質検出素子を浸しても良い。

以下、標的物質検出素子について説明する。

図１（ａ）に標的物質検出素子の例を示す。標的物質検出素子は、基板１と、基板１の表面に存在する金属構造体２と、該金属構造体２の表面に存在する第一の標的物質捕捉体３と、を少なくとも有している。なお、図示してはいないが、検出素子には検体や緩衝溶液が供給されるようになっている。例えば、検体などを保持するための容器や、流路が検体に接続されていても良い。

次に、標的物質検出素子を構成する各部分（基板、金属構造体及び標的物質捕捉体）について説明する。

（基板）
基板１は、金属構造体２を担持する機能を有すれば、任意の材料で構成することができる。基板の材料としては、例えば、一般的に基板の材料として用いられている樹脂、ガラス、シリコン等の無機材料を用いることができる。また、透過光を用いて検出する場合、基板は、検出を行う光の透過度が大きい材料であることが好ましい。その場合、好ましい透過率の範囲は８０％以上１００％以下である。なお、透過率を測定する光としては、例えば４００〜６００ｎｍの波長の光などを用いることができる。透過率の観点で好ましい基板の例としては、ガラス基板、石英基板、ポリカーボネートやポリスチレンなどの樹脂基板やＩＴＯ（インジウム錫酸化物）付き基板などが挙げられる。また、基板は、一つの層で構成されていても良く、複数の層で構成されていても良い。複数の層で構成される場合は、最表面の金属構造体を固定する部分がアミノ基やチオール基などの金属と親和性の高い官能基を有していても良いし、クロム、チタンなどからなる膜などの基板と金属構造体との間の接着力を高める膜としても良い。また、金属構造体を構成する部分以外の部分が非特異的吸着防止膜であっても良い。

また、基板１の表面は平滑である場合に限られないが、局在表面プラズモン共鳴を生じる金属構造体が基板の表面に存在する状態としては、略平滑な基板表面に金属構造体が存在するのが一般的である。ここで、略平滑とは表面粗さが５ｎｍ以下のこととする。

（金属構造体）
金属構造体は、基板１の表面に存在し、局在表面プラズモン共鳴を生じるものである。金属構造体の材料としては、金、銀、銅、白金およびアルミニウムのいずれかの金属、もしくはそれらの元素の少なくとも一種を含む合金を好適に用いることができる。金属構造体の形状の例としては、球形（粒子形状）、略球形といった多面でない形状、球形状あるいは略球形状の一部を切り取った形状、円柱、多角柱、円錐、角錐、厚さを持ったリング形状、厚さを持った井型や田型形状などの種々の多面体形状などが挙げられる。また、製法に着目して述べれば、本発明の金属構造体のうちいくつかの例は金属パターンとも呼びうる。なお、金属構造体を基板上に種々の成膜法を用いて作成する場合、その大きさは粒径測定装置で測定することは困難である。このような場合の金属構造体の好ましい大きさは以下のとおりである。まず、好ましい厚さ（基板面と垂直な方向の平均の厚さ）は、１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。また、大きさ（基材の金属構造体被形成面と平行な平面での金属構造体における任意の２点間の距離の最大値）は、１０ｎｍ以上１４５０ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上４５０ｎｍ以下であることがより好ましい。

金属構造体２同士の間隔（隣り合う金属構造体間の最短距離）は、好ましくは５０ｎｍ以上２μｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以上１μｍである。間隔が狭すぎると、各金属構造体が有するプラズモン同士が相互作用し、空間的な電場の分布・強度に影響を及ぼして、センサ感度が低下してしまう可能性がある。また、間隔が広すぎると、金属構造体の密度が低いことにより信号強度が弱くなる場合があり、信号強度が弱くなった場合には感度を高くするためには特殊な光学系が必要となってしまう場合がある。

（標的物質および標的物質捕捉体）
標的物質捕捉体は、標的物質を認識して捕捉するものであり、標的物質捕捉体および標的物質は複合体を形成する。なお、ここでの標的物質捕捉体は、（１）の工程における第一の標的物質捕捉体と（２）の工程における第二の標的物質捕捉体の両方を含むことは言うまでもない。

このような標的物質捕捉体としては、例えば、以下のものを代表的なものとして挙げることができる。
（i）高分子化合物の三次元構造を利用して標的物質の形状、大きさなどを認識するもの。
（ii）水素結合、配位結合、静電的相互作用、疎水場などを利用して標的物質を認識するもの。
（iii）上記の（i）及び（ii）の構造、結合、作用などのうちのいくつかを複合的に利用して標的物質を認識するもの。

このように本発明及び本明細書中でいう「捕捉」は種々の相互作用を用いた物質認識一般を広く包含する概念である。捕捉される標的物質は、生体物質に限られるものではなく、そのサイズも限定されない。また、分子やイオンといった比較的小さいものだけではなく、分子の集合体や細胞などであってもよい。

このような標的物質と標的物質捕捉体の組み合わせとしては、抗原−抗体、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、アミノ酸−抗体、糖−レクチン、ビタミン−抗体、擬似抗体−抗原などが挙げられる。ここで、標的物質と標的物質捕捉体として、「Ａ−Ｂ」と記載する場合は、ＡとＢとの組み合わせを示しているものである。したがって、標的物質がＡであり標的物質捕捉体がＢである場合と、標的物質がＢであり標的物質捕捉体がＡである場合の両方を示していることとする。なお、標的物質捕捉体は標的物質に応じて適宜選択されるものであり、その選択にあたっては、生化学、錯体化学などに関する種々の教科書や文献を参考にすることができる。また、マウス、ラット、ウサギなどを用いて特定の抗原（標的物質）に対応する抗体を生産することによって標的物質捕捉体を得ることも可能である。なお、本発明の標的物質検出素子の測定対象は、直接標的物質捕捉体が反応する標的物質である必要は無く、間接的に測定できるものでもよい。

また、（１）の工程を行うことによる標的物質検出素子の吸収スペクトルの変化を図４に示す。（１）の工程を行う前の液体と接触させた標的物質検出素子（図４（Ａ））の吸収スペクトルを図４（Ｄ）のａに、（１）の工程を行った後に前記液体と接触させた標的物質検出素子（図４（Ｂ））の吸収スペクトルを図４（Ｄ）ｂに示す。標的物質検出素子７が標的物質６を捕捉することにより、金属構造体２近傍の誘電率（屈折率）が変化し、吸収スペクトルが図４（Ｄ）ａから図４（Ｄ）ｂへと変化する。

ここで、吸収スペクトルは、対象物に光を照射し、前記対象物からの透過光を取得することで得られる。したがって、標的物質検出素子の吸収スペクトルは、標的物質検出素子に光を照射して、前記標的物質検出素子を透過した透過スペクトルのことである。また、照射する光は、金属構造体の材料や形状や大きさによって異なるが２００〜１５００nmの範囲であることが好ましい。

（２）の工程について
（２）の工程では、（１）の工程で、検体と接触させた標的物質検出素子にさらに第二の標的物質捕捉体を接触させる。なお、上記では（１）の工程の後に（２）の工程が行われる場合を想定して記載しているが、（１）の工程と（２）の工程が同時に行われても良い。同時に行われる場合は、第一の標的物質捕捉体が捕捉した標的物質を第二の標的物質捕捉体が捕捉する場合と、第二の標的物質捕捉体に捕捉された標的物質を更に第一の標的物質捕捉体が捕捉する場合とが同時に起きる。

ここで、標的物質検出素子が有する第一の標的物質捕捉体と標識材料が有する第二の標的物質捕捉体とは標的物質を捕捉する領域が異なることが好ましい。すなわち、標的物質において、第一の標的物質捕捉体が認識して捕捉する領域と、第二の標的物質捕捉体が認識して捕捉する領域とは異なることが好ましい。したがって、標的物質を捕捉した場合、標的物質を第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体とで挟んで捕捉した状態となる。なお、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体とは標的物質を認識する領域が異なっていれば、同一の種類であっても良いし、異なる種類であっても良い。

次に標識物質について説明する。

標識材料の構成例を図１（ｂ）に示す。

図１（ｂ）に示す標識材料は、標識物質４と第二の標的物質捕捉体５とからなる。

標識材料としては、前記検体および前記第二の標的物質捕捉体と接触させた標的物質検出素子の液体中での吸収スペクトル（Ｂ）の最大吸収波長（λ_Z）における前記液体中での前記標識物質の吸収スペクトル（Ｃ）の接線の傾きが０より大きい標識物質を用いる。

具体的には、以下のような光学的性質を有する標識物質である。

（１）の工程と同時もしくは（１）の工程の後に（２）の工程を行うことによって、図４（Ｃ）に示すように、第二の標的物質捕捉体５および第一の標的物質捕捉体３がサンドイッチ構造で標的物質６を捕捉する。図４（Ｃ）に示す状態の標的物質検出素子の前記液体中での吸収スペクトルは図４（Ｄ）の吸収スペクトルｃとなる。吸収スペクトルｃの最大吸収波長はλ_zであり、第二の標的物質捕捉体が金属構造体の近傍に固定されることにより、屈折率が変化してλ_y＜λ_zとなる。

標識物質は、図４（Ｅ）に示す前記液体中に存在する場合の吸収スペクトル（図４のｄ）における前記液体中での図４（Ｃ）の標的物質検出素子の吸収スペクトルｃの最大吸収波長（λ_z）での接線ｔの傾きが０より大きい。また、好ましくは、図４（Ｃ）の標的物質検出素子の吸収スペクトルｃの最大吸収波長（λ_z）よりも長波長である標識物質である。

標識物質が上記光学的性質を有することにより、標識材料８および検体と接触させた後に吸収スペクトル検出用の液体（以下、単に「液体」と呼ぶ場合がある）と接触させた状態（図４（Ｆ）に示す状態）での標的物質検出素子（（２）の工程で得られる標的物質検出素子）の吸収スペクトルｅは長波長側により大きくシフトする。すなわち、（２）の工程で得られる標的物質検出素子の吸収スペクトル検出用の液体での吸収スペクトルｅの最大吸収波長λβは、より長波長となる。これは、標識材料で標的物質を捕捉した場合に、標識物質由来のスペクトルと標的物質検出素子が有する金属構造体の局在プラズモン共鳴によるスペクトルの足し合わせとなるからである。

標識物質由来のスペクトルと標的物質検出素子が有する金属構造体の局在プラズモン共鳴によるスペクトルが足し合わせになるという現象については、模擬実験を行うことで簡単に証明することが可能である。例えば、８００nm付近に吸収を有する物質を標識物質とし、リン酸緩衝液に溶解させた場合について説明する。６００nm付近に吸収を有する標的物質検出素子上に標識物質溶液を加えた場合の吸収スペクトルは、標識物質由来の８００nm付近の吸収ピークと標的物質検出素子由来の６００ nm付近の吸収ピークを有する。つまり、標識物質のリン酸緩衝液中の吸収スペクトルと標的物質検出素子のリン酸緩衝液中の吸収スペクトルの足し合わせとなる。また、標識物質由来の吸収スペクトルの形状が変化していないことも確認することができる。以上から、溶液中の標識物質が有する吸収スペクトルを測定することで、スペクトルの足し合わせの効果を予測することが可能となる。

ここで、図３に示すように、標識物質の吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｄ）は、標的物質を捕捉した状態での標的物質検出素子が有する吸収スペクトルにおいて最大吸光度を示す波長を基準として、以下の直線近似が可能な場合が多い。そこで、かかる近似が可能な標識物質を利用することができる。
（Ａ）（吸収スペクトル測定用の液体中で吸収スペクトルの測定を行う場合）
標的物質を捕捉している標的物質検出素子（図４（Ｂ））での吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｂ）において最大吸光度を示す波長（λ_y）から＋５０ｎｍの範囲内で、標識物質の吸収スペクトルを線形近似すると傾きが０より大きい直線で近似できる。
（Ｂ）（吸収スペクトル測定用の気体中で吸収スペクトルの測定を行う場合）
標的物質を捕捉した状態での標的物質検出素子での吸収スペクトルにおいて最大吸光度を示す波長から＋２００ｎｍの範囲内において標識物質の吸収スペクトルを線形近似すると傾きが０より大きい直線で近似できる。

なお、吸収スペクトル測定用の液体としては、通常、検体の溶媒として用いられている液体（緩衝液）と同じものを使用することができる。例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＭＥＳ溶液、ＨＥＰＥＳ溶液などを使用することが可能である。また、「気体中」とは、通常、大気中を意味するが、それ以外の気体中、例えば窒素中などであっても構わない。

なお、得られる近似直線の傾きは１×１０⁶以上であることが好ましい。線形近似の範囲については、実験値を参考に設定したものである。吸収スペクトルの変化は標的物質の量や金属構造体の種類に依存するが、ある条件で標的物質検出素子に標的物質と第二の標的物質捕捉体を接触させた場合、大気中のスペクトルの変化は、液体中の約４倍であった。また、溶液中のスペクトルの変化は、標的物質の量や金属構造体の種類によって依存するが、０nmから５０ nmの範囲内である。以上の実験値を参考にし、線形近似の範囲を溶液中では＋５０ nm、大気中では＋２００ nmの範囲内と定義する。ここで、線形近似の方法としては、最小２乗法を用いることが可能である。

なお、（２）の工程において上述した光学的性質を有する標識物質を用いれば良いため、標識物質の光学特性が前記条件を満たすことがわかっていれば、図４（Ｃ）の状態の標的物質検出素子の吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｃ）および図４（Ｅ）の状態の標識物質の吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｄ）のスペクトルは（１）〜（３）のいずれの工程においても取得しなくて良い。

標識物質の材料としては、前述したような光学特性を有するものであればいかなるものでも良い。標識物質を構成する材料としては、例えば、無機酸化物、有機物を用いることが可能である。より具体的には、ポリスチレンやポルスチレン誘導体からなるポリマー粒子や、ソーダライムガラスなどを用いることが可能である。また、ポリマー粒子に色素を含有させた色素含有ポリマー粒子であっても良い。ただし、標識物質は前記金属構造体と反応しない材料であることが好ましい。

（３）の工程について
（３）の工程では、前記（２）の工程の後に（２）の工程で得られた標的物質検出素子（図４（Ｆ））の吸収スペクトル（Ａ）を取得する。ここで、吸収スペクトル（Ａ）は図４（Ｄ）における吸収スペクトルｅである。

（２）の工程で標識材料が標的物質に結合するほど、標識物質由来のピークの影響が大きくなるため、シフト量が大きくなり、標的物質を検出する検出感度が向上する。

なお、あらかじめ既知の濃度の標的物質を含む溶液と標識材料とに接触させた標的物質検出素子の吸収スペクトルを取得し、標的物質の濃度と標的物質検出素子の最大吸収波長のシフト量の関係を取得しておくことで、検体中の標的物質の濃度を決定することができる。また、標的物質の検出に際しては、リファレンスをとることも可能である。そのような場合、標的物質に接触させる前の標的物質検出素子の吸収スペクトル（図４（Ｄ）のａ）を取得し、該吸収スペクトルをリファレンスとすることができる。

次に、本発明の検出方法に用いることのできる標的物質検出キットについて説明する。検体中の標的物質を検出するための標的物質検出キットは、少なくとも、以下の構成要素を有して構成される。

（標的物質検出素子）
・基板。
・該基板の表面に存在する金属構造体。
・該金属構造体の表面に存在する第一の標的物質捕捉体。

また、以下に、標的物質検出素子および標識材料の作製方法について説明する。
（標的物質検出素子の作製方法）
本発明にかかる標的物質検出素子の製造方法の一例を図２に示す。図２に示す例では、基板１上に金属構造体２を形成し、金属構造体２上に第一の標的物質捕捉体３を結合させている。金属構造体２を形成するにあたっては、基板１上の所定の位置に金属粒子を配置させても良いし、基板１上に金属膜バターンを形成しても良い。基板１上に金属膜パターンを形成するにあたっては、基板１上に金属膜を形成した後にパターニングを行っても良いし、インクジェット法、ディスペンス法、マイクロコンタクトプリンティング法などを用いて金属膜パターンを直接形成しても良い。

なお、金属構造体２上に標的物質捕捉体３を結合させるにあたっては種々の公知の化学反応を用いることができる。例えば、共有結合、イオン結合、吸着などが挙げられる。

結合による方式では、金属構造体上に直接作用できる反応基を持った標的物質捕捉体を直接反応させて結合させてもよいし、金属構造体上に直接作用出来る架橋材料を反応させて、さらに前記架橋材料に標的物質捕捉体を反応させることで結合させても構わない。金属構造体が金、もしくは、銀、もしくは銅を含む場合は、チオール基やアミノ基等を有する標的物質捕捉体を直接固定することができる。また、金属構造体にチオール基やアミノ基等を有するシランカップリング剤等の架橋材料を反応させて、さらにこの架橋材料に標的物質捕捉体を結合させることで固定することもできる。

吸着による方式では標的物質捕捉体と、金属構造体の材質との組み合わせにおいて、適当な親和性を有する組み合わせを選択すればよい。また、金属構造体の表面を表面修飾することで、適当な親和性を有する表面を形成し、標的物質捕捉体を固定することも可能である。

（標識材料の作製方法）
次に、標識材料の作製方法について記述する。第二の標的物質捕捉体と標識物質を結合させるにあたっては種々の公知の化学反応を用いることができる。例えば、共有結合、イオン結合、吸着などである。

結合による方式では、標的物質捕捉体に直接作用できる反応基を持った標識物質を直接反応させて結合させてもよいし、標識物質に直接作用できる架橋剤を反応させて、さらに前記架橋材料に標的物質捕捉体を反応させて結合させても構わない。例えば、アミノ基を有する標的物質捕捉体とカルボキシル基を有する標識物質をアミノカップリング法により結合させることもできる。吸着による方式では、標識物質と標的物質捕捉体の材質との組み合わせにおいて、適当な親和性を有する組み合わせを選択すればよい。また、標識物質の表面を表面修飾することで、適当な親和性を有する表面を形成し、標的物質捕捉体を固定することも可能である。

以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
（実施例１）
本実施例は、基板上に電子線描画装置を用いて金の構造体をパターンニングし、金の構造体にウシ血清アルブミンを結合させて、標的物質検出素子を作製し、これを用いて抗ウシ血清アルブミン抗体の検出を行う例である。標識材料としては、抗ラビットＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をポリスチレン製ビーズで標識したものを用いる。

（標的物質検出素子の作製）
・石英基板上への金属構造体のパターンニング
まず、膜厚２５ｎｍの金薄膜を６２５μｍ厚の石英基板上に形成し、これを所定のパターンに電子線描画装置を用いてパターンニングすることで金属構造体を作製する。金属構造体（３００ｎｍ×１００ｎｍ）の平面形状は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像によって確認する（その例を図５に示す）。このようにして得られた金属構造体付き基板を、以下では基板Ａと表現する。
・第一の標的物質捕捉体の導入
ウシ血清アルブミンをリン酸緩衝液に溶解させ、溶解液に基板Ａを浸漬し、振とう条件下、室温にて放置することにより、金属構造体表面にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（第一の標的物質捕捉体）を物理的に固定させる。以上の工程によって標的物質検出素子を製造する。

（標的物質検出素子の吸収スペクトル測定）
上記得られた標的物質検出素子に、１×１０^-5g/mLの濃度の抗ウシ血清アルブミン抗体（標的物質）および前記リン酸緩衝液を含む溶液を接触させて、前記標的物質を標的物質検出素子に結合させる。

（標識材料の作製）
次に、標識材料を構成する標識物質の選定方法について説明する。まず、図４（Ａ）の状態の標的物質検出素子に検体を接触させて図４（Ｂ）の状態の標的物質検出素子とする。そして、後ほど標識材料の第二の標的物質捕捉体として用いる量と同じ量の第二の標的物質捕捉体である抗ラビットＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、検体と接触させた標的物質検出素子に接触させて、図４（Ｃ）に示す状態の標的物質検出素子を得る。そして、図４（Ｃ）に示す状態の検体の溶媒としての緩衝液であるリン酸溶液中での標的物質検出素子における吸収スペクトル（Ｂ）（図４（Ｄ）のｃ）の最大吸収波長（λ_z）を取得する。

また、標識物質である粒子表面にカルボキシル基が付いたポリスチレン粒子の前記リン酸溶液に接触させた状態（図４（Ｅ）の状態）での吸収スペクトル（Ｃ）（図４（Ｄ）のｄ）を得る。そして、得られた標識物質の吸収スペクトル（Ｃ）における前記λ_Zでの接線を取得し、得られる接線の傾きが０より大きいことを確認する。

次に、抗ラビットＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（第二の標的物質捕捉体）をリン酸緩衝液に溶解させ、溶解液にカルボキシル基付ポリスチレン粒子を加え、振とう条件下、室温にて混合し、抗体とカルボキシル基付ポリスチレン粒子を共有結合もしくは物理吸着させる。反応後、得られた標識材料をリン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液中での吸収スペクトルを測定しても良い。

また、多くの場合は、前記標識物質は以下のような光学的特性を有する標識物質であるため、標識物質は以下のような方法で選定しても良い。すなわち、標識物質は、前述の標的物質が結合した標的物質検出素子（図４（Ｂ））のリン酸緩衝液中の吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｂ）における最大吸光度を示す波長（λ_y）から＋５０ｎｍの範囲内において、線形近似した時に0より大きい傾きを持つ直線で近似できる吸収スペクトルを有する。

さらに、リン酸緩衝液の代わりに大気を用いる場合は、前記標識物質は、前述の標的物質が結合した標的物質検出素子の大気中の吸収スペクトルにおける最大吸光度を示す波長から＋２００ｎｍの範囲内において、線形近似した時に0より大きい傾きを持つ直線で近似できる吸収スペクトルを有する。

具体的な標識物質の選定方法を以下に説明する。

前述した標識材料の選定方法において、標的物質と結合させた図４（Ｂ）の状態の標的物質検出素子の前記リン酸溶液中での吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｂ）を得て、最大吸収スペクトルλ_yを決定する。次に、標識物質である粒子表面にカルボキシル基が付いたポリスチレン粒子の前記リン酸溶液に接触させた状態（図４（Ｅ）の状態）での吸収スペクトル（図４（Ｄ）のｄ）を得る。そして、図３に示すように、λ_yから＋５０ｎｍの範囲内における前記標識物質の吸収スペクトルを線形近似すると傾きが０より大きい直線で近似できることを確認して標識物質を選定する。

また、標的物質と結合させた図４（Ｂ）の状態の標的物質検出素子の大気中での吸収スペクトルの最大吸光度を示す波長λγを算出し、λγから＋２００ｎｍの範囲内における前記標識物質の吸収スペクトルを線形近似すると傾きが０より大きい直線で近似できることを確認して標識物質を選定しても良い。なお、吸収スペクトルを線形近似する方法としては、最小２乗法を用いることができる。

以上の工程によって作製された標的物質検出素子および標識材料を製造する。得られた標識材料は所定溶液中にて保存することもできる。また、上記標的物質検出素子および上記標識材料を標的物質検出キットとする。

（標的物質検出方法）
次に標的物質検出キットを用いて検出を行う。図６は本実施例の検出概念を模式的に示した図である。検出時の光源は、図６に模式的に示すように、標的物質検出素子に測定光を照射しうる位置に配置する。受光素子は標的物質検出素子を透過した測定光の特性を検出しうる位置に配置する。尚、この他に、図示しないが、分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示装置等が備えられていることが好ましい。また、表示装置と演算装置は一体のものでもよいし、別体であっても構わない。

まず、前述した標的物質検出素子とリン酸緩衝液と接触させて、図６に示す位置関係に標的物質検出素子、光源、受光素子を配置し、リン酸緩衝液中の標的物質検出素子スペクトルを検出する。その後、標的物質検出素子上に標的物質として抗ウシ血清アルブミン抗体が含まれたリン酸緩衝溶液からなる検体を供給し、標的物質と標的物質検出素子が有する第一の標的物質捕捉体とを反応させる。その後、再び、リン酸緩衝液を加え、結合していない物質を除く。その後、リン酸緩衝液に溶解させた前述の標識材料を加え、反応させた後、リン酸緩衝液を加え、結合していない標識材料を除く。再び、図６に示す位置関係に標的物質検出素子、光源、受光素子を配置し、標的物質および標識材料が結合した標的物質検出素子の吸収スペクトル（Ａ）を検出する。検体液と標識材料の供給前後のスペクトル変化は、金属構造体のプラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、標的物質検出素子表面で抗原抗体反応が起こり、第一の標的物質捕捉体により標的物質が捕捉され、その標的物質に標識材料が結合したことを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中の標的物質の存否及びその濃度を検出することが可能と成る。

また、ここでスペクトルの変化と標的物質濃度の関係について、あらかじめ、既知の複数濃度の標準検体を用いて、スペクトル変化と濃度の関係を取得しておく。この関係をもとに検量線を求めスペクトル変化と濃度の関数を求めておけば、この関数を用いて、実際の計測時のスペクトル変化から標的物質濃度を求めることができる。なお、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピークの波形の半値幅等ピーク形状の変化を用いてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度の変化を用いても構わない。

また、以上の実施例では、標的物質検出キットに含まれる標識材料を使用しなかった場合と比較して、検出感度が増大する。そのような効果を図７に模式的に示す。すなわち、図７の吸光度に関する図は、標識物質と第二の標的物質捕捉体からなる標識材料の標識物質が、前記吸収スペクトル特性を有している場合と、前記吸収スペクトル特性を有していない場合の図４（Ｆ）の状態での標的物質検出素子の吸収スペクトルを示している。従来例の吸収スペクトル（図７のスペクトルＩ）と比較し、本発明の吸収スペクトル（図７のスペクトルＩＩ）は、より長波長側にピークを有する吸収スペクトルとなる。なお、従来例とは、第二の標的物質捕捉体が標識材料で標識されていない場合、または、標的物質および第二の標的物質捕捉体と接触させた標的物質検出素子のリン酸緩衝液中での吸収スペクトル（Ｂ）（図４（Ｄ）のｃ）の最大吸収波長（λ_z）におけるリン酸緩衝液中での標識物質の吸収スペクトルの接線の傾きが０、または０より小さい標識物質９を用いた場合とする。また、ピークシフト量に関する図から明らかなとおり、抗ＢＳＡ抗体の検出に利用し得る測定濃度において有用なピークシフト量を得ることができる。これらにより、本発明によれば、標識化物質の吸収スペクトルの特性を利用することで、検体中に同濃度の標的物質が存在する場合のピークシフト量を増大させることができる。

以上説明したように、本発明によれば、上記構成の標的物質検出キットを用いる事で、感度を向上させることが可能となる。

本発明において用いることのできる標的物質検出用キットの一例を示す模式図である。 本発明において用いることのできる標的物質検出素子の作製方法の一例を説明する模式図である。 本発明において用いることのできる標的物質検出キットに含まれる標識材料と標的物質を捕捉した状態の標的物質検出素子の吸収スペクトルの関係の一例を示す模式図である。 本発明にかかる標的物質検出キットを使用した検出方法の一例およびその結果を示す模式図である。 本発明において用いることのできる標的物質検出素子の作製途中のSEM像の一例である。 実施例１における標的物質検出方法を説明するための模式図である。 本発明と従来例との効果の差異を示すための概念的な図である。

符号の説明

１ 基板
２ 金属構造体
３ 第一の標的物質捕捉体
４、９ 標識物質
５ 第二の標的物質捕捉体
６ 標的物質
７ 標的物質検出素子
８ 標識材料

Claims (2)

1. 検体中の標的物質を検出するための標的物質検出方法であって、
   基板と該基板の表面に存在する金属構造体と該金属構造体の表面に存在する第一の標的物質捕捉体とを少なくとも有する標的物質検出素子に、検体を接触させる第一の工程と、
   前記第一の工程の後にもしくは前記第一の工程と同時に行われる工程であって、前記標的物質検出素子に標識物質と第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料を接触させる第二の工程と、
   前記検体および前記標識材料と接触させた前記標的物質検出素子の吸収スペクトル（Ａ）を取得する第三の工程と、
   を有する標的物質の検出方法において、
   前記標識物質として、
   前記検体および前記第二の標的物質捕捉体と接触させた標的物質検出素子の液体中での吸収スペクトル（Ｂ）の最大吸収波長（λ_z）における前記液体中での前記標識物質の吸収スペクトル（Ｃ）の接線の傾きが０より大きい標識物質を用いる
   ことを特徴とする標的物質検出方法。
2. 前記標識物質が、無機酸化物あるいは有機物であることを特徴とする請求項１に記載の標的物質検出方法。