JP5134772B2

JP5134772B2 - 間葉系幹細胞の遊離または増殖、および創傷治癒または創傷治癒促進のためのサブスタンスｐの使用

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Publication number: JP5134772B2
Application number: JP2005313174A
Authority: JP
Inventors: ヨンスクソン; ヨンスクホン; ゼチャンキム
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Chung Ang University
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Chung Ang University
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2025-10-27
Also published as: US20060127373A1; EP1658855B1; ATE423565T1; EP1658855A3; EP1658855A2; KR20060037176A; JP2006124389A; CN1824289A; US9254305B2; US8551470B2; US20140065109A1; CN1824289B; KR100593397B1; DE602005012905D1

Description

本発明は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cells）を遊離または増殖させるか、これら遊離または増殖を促進する薬剤を製造するためのサブスタンスＰ（Substance P）の使用、および創傷治癒または創傷治癒促進のための薬剤を製造するため
のサブスタンスＰの使用に関するものである。

サブスタンスＰは、肉芽組織の他に感覚ニューロン、マクロファージ、好酸球、内皮細胞、および上皮細胞や角膜実質細胞のような角膜細胞で発現するものであり、１１個のアミノ酸からなるニューロペプチドである。このサブスタンスＰが、造血調節における神経−免疫コミュニケーションに関与していることが、幾つか報告されている。サブスタンスＰ神経繊維が骨髄支質に分布しており、サブスタンスＰは骨髄支質細胞の表面受容体であるＮＫ−１を介し信号を伝達して骨髄支質細胞を刺激することによって、骨髄支質細胞が供給者として造血促進に有効な幹細胞因子とインターロイキン−１を生産するようにする。しかし、従来、ＭＳＣの遊離と骨髄支質におけるＭＳＣの再増殖（repopulation）に対するサブスタンスＰの役割は報告されていない。

創傷自体は、隣接細胞、血液由来細胞および感覚ニューロンから分泌される成長因子、サイトカイン、神経ホルモンおよび細胞外基質からなる独特かつ特異な微小環境（microenvironment）を創出する。かかる創傷微小環境の因子のいくつかは、十分に長い期間持続して末梢血液に広がった後、骨髄の幹細胞に影響を及ぼし、骨髄細胞の末梢血液への遊離、骨髄細胞の創傷部位への供給、および骨髄細胞の創傷治癒への関与を誘発する。

骨髄幹細胞と培養された間葉系幹細胞（以下、「ＭＳＣ」という場合がある）を用いた最近の細胞移植実験の結果、これらが肺、胃腸管および梗塞された心筋の組織修復に関与することが示された。しかし、創傷のない正常的な生理状態において、ＭＳＣは脂肪組織や翼状片（pterygium）のような骨髄以外の組織では検出されるが、末梢血液ではほとん
ど検出されなかった。従って、組織修復や病理学的進展中に、骨髄から他の末梢組織へＭＳＣを移動させるシステムが存在する可能性があると考えられる。

角膜は透明、無血管および大量の神経支配組織からなり、角膜損傷や疾患時にその本来の状態が破壊され得る。角膜が損傷すると、輪部幹細胞により提供される可能性が高い角膜上皮細胞の側面移動、炎症性細胞の浸潤、および創傷基質での血管新生が刺激されるが、それらの全てはユニークな角膜創傷微小環境により刺激されている可能性がある。従来の報告によると、角膜脱神経が創傷治癒過程の実質的な遅延を誘発し、非糖尿患者より糖尿患者において低い水準のサブスタンスＰが、再上皮化と治癒の遅延の原因であることが提案された。角膜表面は三叉神経節ニューロンにより非常に多くの神経を有し、内因性サブスタンスＰが角膜上皮細胞と角膜実質細胞で発現するので、サブスタンスＰの創傷微小環境での関与と角膜修復での関与が予想される。

本発明者らは、角膜にアルカリ損傷を負わせたマウスにおいて、サブスタンスＰが、眼球と末梢血液での発現水準が増加する最初のニューロペプチドであることを見出した。また、角膜に熱傷を負わせないマウスにサブスタンスＰを静脈注射した場合にも、多くのＣＤ２９＋間葉系幹細胞が末梢血液に移動した。さらに、インビトロの３−Ｄコラーゲンゲ
ルでサブスタンスＰが基質分解酵素を誘導し、これらの阻害剤を阻害してヒト間葉系幹細胞の移動を促進していることを明らかにした。その上、サブスタンスＰが間葉系幹細胞の増殖、β−カテニンの核への移動、およびこれらの標的遺伝子であるＶＥＧＦとフィブロネクチンの発現を促進することを確認し、サブスタンスＰが間葉系幹細胞の移動後において骨髄での間葉系幹細胞の再増殖に関与することを明らかにした。さらに、本発明者らはアルカリ損傷ウサギの耳静脈に注入したＤｉ１標識間葉系幹細胞が成功裏に創傷層へ提
供され、角膜透明度と視力回復を改善して角膜創傷治癒を促進するという事実を明らかにした。また、サブスタンスＰをアルカリ損傷ウサギに静脈注射することによって、創傷治癒回復が実際に促進されることを明らかにした。

そこで、本発明の第１の目的は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ)を遊離または増殖
するか、上記遊離または増殖を促進する薬剤を製造するためのサブスタンスＰの使用を提供することにある。

本発明の第２の目的は、創傷治癒または創傷治癒促進のための薬剤を製造するためのサブスタンスＰの使用を提供することにある。

本発明の第３の目的は、上記有効成分としてサブスタンスＰを含有するものであり、骨髄由来の間葉系幹細胞を遊離または増殖するか、かかる遊離または増殖を促進させる薬剤を提供することにある。

本発明の第４の目的は、有効成分としてサブスタンスＰを含有する創傷治癒または創傷治癒促進剤を提供することにある。

本発明の第５の目的は、サブスタンスＰ処理により遊離または増殖した骨髄由来の間葉系幹細胞を有効成分として含有する創傷治癒または創傷治癒促進剤を提供することにある。

本発明の第６の目的は、サブスタンスＰ処理して骨髄から間葉系幹細胞を遊離させるステップを含む間葉系幹細胞の分離方法を提供することにある。

本発明の第７の目的は、サブスタンスＰの存在下に間葉系幹細胞を増殖させるステップを含む間葉系幹細胞の増殖方法を提供することにある。

本発明の第８の目的は、治療有効量のサブスタンスＰを投与することを含む創傷治癒または創傷治癒促進方法を提供することにある。

本発明の第９の目的は、サブスタンスＰ処理により骨髄から遊離または増殖治療有効量の間葉系幹細胞を投与することを含む創傷治癒または創傷治癒促進方法を提供することにある。

第一に、本発明は骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を遊離または増殖させるか、或いは当該遊離または増殖を促進する薬剤を製造するためのサブスタンスＰの使用に関するものである。本発明の具体例として、当該薬剤は間葉系幹細胞を含むことができる。他の具体例として、当該薬剤は細胞治療剤であってもよい。

第二に、本発明は、角膜や皮膚の創傷治癒または創傷治癒促進のための薬剤を製造するためのサブスタンスＰの使用に関するものである。本発明の具体例として、当該薬剤は間葉系幹細胞を含むことができる。他の具体例として、当該薬剤は、例えば角膜または皮膚
細胞に対する細胞治療剤であってもよい。

第三に、本発明は有効成分としてサブスタンスＰを含有するものであり、骨髄由来の間葉系幹細胞を遊離または増殖するか、当該遊離または増殖を促進させる薬剤に関するものである。

第四に、本発明は有効成分としてサブスタンスＰを含有するものであり、例えば角膜または皮膚における創傷の創傷治癒または創傷治癒促進剤に関するものである。なお、本発明において「創傷治癒または創傷治癒促進剤」とは、創傷治癒効果と創傷治癒促進効果を有する薬剤をいい、単に「創傷治癒剤」といい変えてもよいものとする。

第五に、本発明は有効成分として間葉系幹細胞を含有するものであり、当該間葉系幹細胞がサブスタンスＰ処理により骨髄から遊離または増殖されたものである創傷治癒または創傷治癒促進剤に関するものである。

第六に、本発明はサブスタンスＰ処理により骨髄から間葉系幹細胞を遊離させるステップを含む間葉系幹細胞の分離方法に関するものである。

第七に、サブスタンスＰの存在下に間葉系幹細胞を増殖させるステップを含む間葉系幹細胞の増殖方法に関するものである。

第八に、本発明は治療有効量のサブスタンスＰを投与することを含む創傷治癒または創傷治癒促進方法に関するものである。なお、本発明において「創傷治癒または創傷治癒促進方法」とは、創傷治癒するためと創傷治癒を促進するための方法をいい、単に「創傷治癒方法」といい変えてもよいものとする。

第九に、本発明は治療有効量の間葉系幹細胞を投与することを含み、当該間葉系幹細胞はサブスタンスＰ処理により骨髄から遊離または増殖させたものである創傷治癒または創傷治癒促進方法に関するものである。

本発明によって、角膜損傷モデルにおいて、サブスタンスＰは角膜のアルカリ損傷の初期に分泌され、血液を通じて骨髄に移動し、骨髄に存在する間葉系幹細胞を刺激し、骨髄で再増殖するように誘導することが明らかにされた。従って、サブスタンスＰは、間葉系幹細胞の遊離または増殖、或いは遊離または増殖促進剤、創傷治癒または創傷治癒促進剤、或いは細胞治療剤として使用できる。

また、間葉系幹細胞は創傷治癒に直接関与することが明らかにされた。従って、間葉系幹細胞は、創傷治癒または創傷治癒促進剤、或いは細胞治療剤として使用できる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明者らは、角膜が透明性と無血管性を示すことから、創傷治癒過程中に幹細胞の全身的な関与を調べるに当たり別の創傷モデルに比べて長所のあるアルカリ損傷角膜動物モデルを用いた。

本発明者らは、角膜にアルカリ損傷を負わせたウサギの角膜と末梢血液でｃ−ｋｉｔ＋細胞が出現していることを確認した後、ＲＴ−ＰＣＲ分析とＥＬＩＳＡを利用して、角膜アルカリ損傷を負わせたマウスの創傷微小環境と末梢血液におけるサイトカインと他の因
子の発現プロファイルを調べた。その結果、サブスタンスＰが、角膜にアルカリ損傷を負わせた後のマウスにおいて、眼球と末梢血液で発現水準が増加する最初のニューロペプチドであることを確認した。この際、サブスタンスＰは角膜で先ず増加した後、次いで末梢血液で増加する。このことは、サブスタンスＰが炎症性細胞やマクロファージ細胞の全身的浸潤によるものではなく、感覚ニューロン、上皮細胞、角膜実質細胞および内皮細胞のような角膜に常駐する細胞によって分泌されていることを示す。血液におけるサブスタンスＰ濃度の増加は、サブスタンスＰの全身拡散によるものと考えられる。また、好中球でのサブスタンスＰ免疫反応性の欠乏、炎症期（創傷後５日まで）より早い段階でのサブスタンスＰの誘導と終結、および創傷治癒後期（創傷後７−１０日）での上皮細胞と線維芽細胞性細胞における微弱なサブスタンスＰ染色は、サブスタンスＰが感覚ニューロンの損傷刺激により供給されるという仮説を裏付ける。

続いて、創傷微小環境で発現される他の因子とは別に、サブスタンスＰの全身的影響を決定するために、サブスタンスＰを創傷のないマウスに静脈注射し、ＣＤ２９＋ＭＳＣの末梢血液への移動を調べた。その結果、サブスタンスＰを静脈注射した場合、注射しないマウスに比べて約１５倍多いＣＤ２９＋ＭＳＣが末梢血液に移動していることを確認した。この時、創傷のないマウスではＭＳＣが移動すべき創傷部位が存在しないことから、ＭＳＣが血液に移動したものと考えられる。

また、骨髄内表面からのＭＳＣ移動におけるサブスタンスＰの作用機序を決定するために、インビトロの細胞遊走アッセイを使用して、ＭＳＣの遊離、基質分解酵素のダイナミクス、細胞増殖およびβ−カテニンの局在に関するサブスタンスＰの効果を調べた。その結果、インビトロの３−ＤコラーゲンゲルでサブスタンスＰが基質分解酵素を誘導し、これらの阻害剤を阻害して、ヒトＭＳＣの遊離を促進することを明らかにした。このことは、ＭＳＣ遊離におけるサブスタンスＰの役割をさらに裏付ける。また、発明者らは、サブスタンスＰが細胞増殖とβ−カテニンの核への移動を促進することによって、ＭＳＣの遊離後、ＭＳＣの骨髄再増殖を促進することを確認した。

さらに本発明者らは、静脈注射されたＭＳＣが損傷された組織に達して角膜修復に関与するか否かを、角膜透明度および視力回復スコアに基づいて調べた。その結果、アルカリ損傷を負わせたウサギの耳静脈に注入されたＤｉ１標識ＭＳＣが創傷層へ成功裏に供給
され、角膜透明度と視力回復を改善することによって、角膜創傷治癒を促進することを確認した。

最後に、本発明者らは、サブスタンスＰの静脈投与が損傷された角膜の修復を直接促進するのか否かを、顕微鏡検査、Ｈ＆Ｅ染色および免疫組織化学的染色に基づいて調べた。その結果、アルカリ損傷を負わせた後、サブスタンスＰを静脈投与した群で角膜創傷治癒が対照群（サブスタンスＰ非投与群）よりも速かに行われていることを確認した。

結論として、角膜アルカリ損傷時、サブスタンスＰが損傷角膜と血液で先ず上昇し、ＭＳＣの末梢血液への遊離を促進し、さらに角膜創傷治癒と骨髄でのＭＳＣ再増殖を促進していることが見出された。従って、サブスタンスＰが、ＭＳＣの骨髄から創傷部位への移動と供給に関与する創傷信号伝達の開始剤として役割を果たすものと結論付けた。また、ＭＳＣは創傷部位に移動し、創傷治癒に関与することが明らかにされた。

上記結果を考慮すれば、ＭＳＣは創傷治癒または創傷治癒促進剤、或いは細胞治療剤として使用できる。また、サブスタンスＰは創傷治癒または創傷治癒促進剤、或いは細胞治療剤、ＭＳＣの遊離剤や増殖剤、または当該遊離や増殖の促進剤、または細胞治療剤として使用できる。

本発明において、サブスタンスＰの有効投与量は０．１〜１００μｇ／ｋｇとすることができ、ＭＳＣの有効投与量は３×１０⁴〜３×１０⁷細胞／ｋｇ、特に１×１０⁵〜１×
１０⁷細胞／ｋｇとすることができる。しかし、これらの投与量は患者の体重、年齢、性
別、創傷の程度に応じて適宜増減することができる。

本発明に係る薬剤は非経口または局所投与により人体に適用できるが、静脈注射、皮下注射、内皮注射、筋肉注射などの注射、特に静脈注射により投与することが好ましい。かかる目的のために、有効成分を通常の方法に従って薬剤学的に許容しうる担体に懸濁させるか溶解することができるが、好適には水溶性担体を使用する。

以下、本発明を実施例によりさらに詳述するが、これらによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。

実施例１：角膜のアルカリ損傷後における末梢血液内ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞の増加、およびそれらの創傷層への供給の確認
体重２〜３ｋｇのニュージーランドホワイトラビットを、ＳａｍｔａｋｏＢｉｏＫｏｒｅａから購入した。全ての動物実験は、原子力医学院と中央大学校倫理委員会の承認を得て、眼科および視力研究における動物使用のためのＡＲＶＯ陳述書に従って行なった。アルカリ損傷させるために、１ＮＮａＯＨを染み込ませた６ｍｍピースワットマン過紙とウサギの目を３０秒間接触させた。アルカリ損傷から１、３、５、７、１０および１４日後に、眼球と全血を摘出した。末梢血液の塗抹標本と角膜の断片を抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Santa Cruz Biotechnology；Cat # sc-1493，1:100）で染色し、その結果を図１に表した。

無傷の角膜には血管がないので、角膜の深刻な損傷を修復するためには、血管を通じた炎症性細胞と他の幹細胞の供給が必要であると考えられる。図１に示されるように、ラビット角膜をアルカリ損傷させたとき、末梢血液におけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の数が正常対照群に比べて増加した。このことは、アルカリ損傷後から５日目の角膜創傷層からも探知された。この結果から、骨髄由来幹細胞が角膜修復に積極的に関与していることを確認することができた。

実施例２：角膜アルカリ損傷により誘導された創傷信号伝達開始剤としてのサブスタンスＰの役割の確認
体重３０〜４０ｇのＢａｌｂ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂ（West Grove，PA）から購入した。アルカリ損傷させるために、１ＮＮａＯＨを染み込ませた３ｍｍピースのワットマン濾紙とマウスの目を１０秒間接触させた。アルカリ損傷から１、３、５、７、１０および１４日後に、眼球と全血を摘出した。

組織が損傷するとユニークな微小環境が形成され、損傷組織を修復するために、炎症のような全身的反応と骨髄からの幹細胞移動を誘発する。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、アルカリ損傷した角膜の創傷微小環境において、これらの機能を有する因子の候補を分析した。具体的には、トリゾール（Invitrogen）によりアルカリ損傷を負った眼球からＲＮＡを分離した。合計で１μｇのＲＮＡを、逆転写−ポリメラーゼキット（Takara）を利用して逆転写（ＲＴ）した後、下記マウス遺伝子−特異的プライマーを利用してＰＣＲを遂行した。

ＶＥＧＦ（予想サイズ：４０７）、（センス）５’ＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＴ３’、（アンチセンス）５’ＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＡ３’、
ＴＮＦ−α（予想サイズ：４３８）、（センス）５’ＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧ
ＧＣＡＣＴ３’、（アンチセンス）５’ＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＡＧＴ３’、
ＩＬ−１（予想サイズ：４３２）、（センス）５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＴＧＡＣ３’、（アンチセンス）５’ＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＣＧ３’、
サブスタンスＰ（予想サイズ：３０９）、（センス）５’ＴＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＴＡ３’、（アンチセンス）５’ＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＴＣＴＴ３’
結果を図２ａに示す。図２ａの通り、角膜創傷後、眼球でサブスタンスＰ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦが誘導されることが明らかになった。

さらに、これらの因子の全身的プロファイルをモニターし、骨髄からの幹細胞移動におけるこれら因子の役割を評価するために、末梢血液につきＥＬＩＳＡ（R&D system）を行なった。その結果を図２ｂに示す。図２ｂの通り、無創傷状態と比較して、血清中のサブスタンスＰの濃度は、１日に約３．２倍、３日に４．４倍、５日に１．３倍増加した。しかし、前炎症性サイトカインリンＴＮＦ-αとＩＬ−１誘導は、アルカリ損傷後５日と３
日目にそれぞれ検出され、ＶＥＧＦはさらに遅い７日目から誘導された。

組織学的試験のために、角膜創傷層をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、サブスタンスＰ抗体（Santa Cruz Biotechnology：Cat # sc-9758，1:200）で免疫組織化学染色した。即ち、マウス眼球を４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定した。パラフィン包埋標本を４μｍ断片に縦方向に切断し、ポリＤリジン−コーディングされたスライドに移した。次いで、組織学的試験のためにＨ＆Ｅ染色を行なった。サブスタンスＰの免疫組織化学的染色のために、０．５％Ｈ₂Ｏ₂で５分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。その後、組織を０．３％トリトンＸ−１００で５分間透過化し、一次抗体と共に培養した後、残りの過程を製造者（ABC kit，Vector）の説明書に従って行ない、細胞をファーストレッドで対比染色した。

その結果を図２ｃに示す。Ｈ＆Ｅ染色の結果、炎症性好中球は５日間保持され、遊走性上皮細胞が５日目に観察されており、線維芽細胞浸潤が７日目に明確に現れ、大部分のマクロファージ細胞は１４日目に消失した。免疫反応性サブスタンスＰは、１日後に創傷層で最も強く検出され、３日までに弱まった。サブスタンスＰは５日目に線維芽細胞性細胞と遊走性上皮細胞でわずかに検出されたが、炎症性細胞では検出されておらず、初期炎症性細胞はサブスタンスＰを分泌しないであろうことが示唆された。従って、角膜創傷自体が角膜に常駐する細胞により提供されるサブスタンスＰ豊富な微小環境を形成し、その後、血清でサブスタンスＰの増加を誘発することが明らかにされた。

骨髄由来ＭＳＣが創傷部位に供給されるか否かを調べるために、ＭＳＣマーカー、抗ＣＤ−２９（Santa Cruz Biotechnology；Cat # sc-6622，1:200）、抗ｃ−ｋｉｔ（Santa Cruz Biotechnology；Cat # sc-1493，1:100）および抗α−ＳＭアクチン抗体（Progen，Cat # 61001，1:200）を利用して、免疫組織化学染色を行なった。その結果を図２ｄに示す。図２ｄから明らかなように、ＣＤ−２９、ｃ−ｋｉｔおよびα−ＳＭ−アクチン発現線維芽細胞性細胞は、５日までの初期炎症期では検出されなかった。これらは繊維増殖期に該当する７日から１０日に創傷層で検出され、再形成期に該当する１４日以後には大部分が消失した。この結果は、創傷治癒初期には線維芽細胞性細胞は存在せず、７日目に線維芽細胞性細胞が初めて現れたこととも一致する。但し、少数の線維芽細胞性細胞が正常な角膜基質に存在し（図２ｃ）、この常駐線維芽細胞は７日前の炎症期には存在しないので、７日目の創傷層にあるＣＤ−２９、α−ＳＭ−アクチンおよびｃ−ｋｉｔ陽性細胞は血液から流入されたものと判断された。

実施例３：サブスタンスＰの静脈注射による骨髄から末梢血液へのＭＳＣの移動確認
幹細胞の血流への移動をサブスタンスＰが担うのか、或いは創傷微小環境中の他の未確認因子が関与するかを決定するために、サブスタンスＰにつき実験した。

創傷微小環境で他の因子の影響を区別するために、サブスタンスＰ（０．１ｎｍｏｌ／体重ｇ）（Calbiochem）を、角膜にアルカリ損傷を付していないＢａｌｂ−ｃマウスの尾静脈に静脈注射し、１日後に全血を採取した。パーコール勾配遠心分離により赤血球を除去した後、リンパ球を除去するために吸着細胞を４８時間培養した。次いで、リンパ球からＭＳＣを区別するために、マクロファージ細胞では発現しない抗ＣＤ−２９（β１インテグリン）抗体で免疫染色した。

その結果を図３ａと図３ｂに示す。１日内に、サブスタンスＰの静脈注射によって、ＣＤ−２９陽性ＭＳＣの末梢血液への移動は、非注射マウスに比して約１５倍促進した（図３ｂ）。このことは、サブスタンスＰが創傷治癒過程の初期に発現し、ＭＳＣを骨髄から全身血に移動させ、ＭＳＣを角膜創傷部位に供給して角膜修復を促進するという新たに見出された役割を果たしていることを示す。

実施例４：サブスタンスＰによるＭＭＰ活性向上作用の確認
骨髓内の表面に強く付着しているＭＳＣを移動させるサブスタンスＰの作用機序を決定するために、先ず、サブスタンスＰが３−Ｄコラーゲンゲル上で培養されたヒトＭＳＣの移動を促進するかを調べた。即ち、１２ｍｍミリセルメンブラン（ミリポア：１２μｍ孔サイズ）内にタイプＩコラーゲンゲルマトリックスを製造者（Nitta gelatin，日本）の
説明書に従って調製し、タイプＩＶコラーゲン（Nitta）で一晩コーティングした。ＭＳ
Ｃ（Cambrex Bio Science）をコラーゲンゲル上にプレートし、外側のチャンバーをサブ
スタンスＰ含有ＭＳＣＧＭ（Cambrex Bio Science）で充填した。コラーゲンゲルの除去
を、位相差顕微鏡（Olympus）を利用してモニターした。７２時間後に、ミリセル挿入物
と外側の皿を固定し、ヘマトキシリンで染色した後、培養上清をゼラチンゲル内活性酵素測定法（gelatin zymography）のために貯蔵した。その結果を図４ａに示す。図４ａの通り、下部皿に適用されたサブスタンスＰは、容量依存的にコラーゲンゲルの分解とＭＳＣ移動を促進した。

培養上清について、ゼラチンゲル内活性酵素測定法（gelatin zymography）を行なった。具体的には、培養上清にメルカプトエタノールを含まない標本緩衝溶液を加え、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＳＤＳを除去するために、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００で復元した後、展開緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＣａＣｌ₂）と共に３７℃で一晩培養し、ゲルをクマシーブルーで
染色した。その結果を図４ｂに示す。図４ｂの通り、ＭＳＣの移動中、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２活性が強力に誘導された。

ＭＭＰ（matrix metalloproteinase）の生合成とその阻害剤に対するサブスタンスＰの影響を、³⁵Ｓ−メチオニンで標識されたＭＳＣの培養培地と細胞溶解物の免疫沈澱により調べた。即ち、ＭＳＣをサブスタンスＰで処理し、５０μＣｉ／ｍＬの³⁵Ｓ−メチオニン（Amersham）で１６時間標識した。細胞溶解物を溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ）により調製した。分泌されたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の免疫沈澱のために、培養上清を一定に回転させながら、それらに特異的な抗体（抗ＭＭＰ−１（Chemicon；Cat # MAB3307，1:100）、抗ＭＭＰ−２（Chemicon；Cat # MAB13405，1:200）、抗ＭＭＰ−９（Calbiochem；Cat # 444236，1:100)、抗
ＴＩＭＰ−１（Calbiochem；Cat # IM32L，1:250)および抗ＴＩＭＰ−２（Calbiochem；Cat # IM11L，1:250)）で２時間培養し、抗体をタンパク質−Ｇセファロース−４Ｂ（Biorad）により収集した。ペレットを免疫沈澱緩衝液（１５０ｍＭＮａＯＨ、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．２％ＳＤＳおよび０．５％Ｎａデオキシコールレート）で３回、高塩緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５ＭＮａＣｌ）で１回、低塩緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを２Ｍサリチル酸ナトリウムに浸漬し、乾燥した後、Ｘ線フィルムに２週間（昼間）露光した。ＭＭＰ−９の免疫沈澱のために、細胞溶解物をＭＭＰ−９抗体と共に培養し、残りの過程は上記同様に行なった。その結果を図４ｃに示す。

ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の生合成が、サブスタンスＰによって容量依存的に促進された。その反面、それらの阻害剤であるＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２の生合成は、サブスタンスＰによって抑制された。

結果として、サブスタンスＰは、３−Ｄコラーゲンゲル中でのヒトＭＳＣの移動、ＭＭＰの誘導およびこれらの阻害剤であるＴＩＭＰの抑制を促進した。

実施例５：サブスタンスＰによるＭＳＣ再増殖の促進の確認
サブスタンスＰが骨髄からＭＳＣを移動させる能力しか有していないのであれば、移動後、骨髄支質でＭＳＣプールが空になる可能性がある。サブスタンスＰの効果を、その細胞増殖能と自己再生能の側面について再び調べた。

サブスタンスＰ処理から３日目、トリファンブルー（triphan blue）で染色された生存細胞を計数した。その結果を図５ａに示す。サブスタンスＰは、対照群に比べて生存細胞数をそれぞれ１ｎＭで１．７倍、１０ｎＭで２．１倍、１００ｎＭで２．２倍増加させた。

サブスタンスＰがヒトＭＳＣの自己再生能力に影響を及ぼすかを決定するために、ｗｎｔ信号伝達経路の下流作用因子であるβ−カテニンにつき実験した。即ち、ＭＳＣ（Cambrex Bio Science）を１×１０⁴／ウェルの密度で接種し、ＭＳＣＧＭ（Cambrex Bio Science）と共に培養した。細胞の付着後に各濃度のサブスタンスＰで処理し、１６時間およ
び４８時間、３７℃で培養した。ＭＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．３％トリトンＸ−１００で透過化した。リン酸緩衝溶液に希釈した２０％正常塩素血清で１時間、非特異的抗原を遮断した後、カバーガラスをβ−カテニンに対する抗体（BD Biosciences；Cat # 610153，1:100）とＦＩＴＣ−コンジュゲート二次抗体（Vector）で９０分
間培養した。次いで、細胞をＤＡＰＩで対比染色し、共焦点顕微鏡（Leica）を利用して
観察した。その結果を図５ｂに示す。

サブスタンスＰ処理から１６時間後、β−カテニンが主にヒトＭＳＣの細胞質で観察されたが、１００ｎＭで処理すると極少数のＭＳＣでβ−カテニンの核局在が観察された。しかし、サブスタンスＰ処理から４８時間後、β−カテニンの核への移動がさらに優勢となり、特に１００ｎＭサブスタンスＰでは、全てのＭＳＣがβ−カテニンの核移動を示した。

Ｔｃｆ／β−カテニンの下流遺伝子であるフィブロネクチンとＶＥＧＦについて、ＥＬＩＳＡとウェスタンブロット分析を行なった。それら結果を図５ｃと５ｄにそれぞれ示す。図５ｃと５ｄの通り、サブスタンスＰがＶＥＧＦとフィブロネクチンを誘導した。このことは、サブスタンスＰが既知の標準ｗｎｔ信号伝達経路を通じて細胞増殖と自己再生を促進することによって、ＭＳＣの再増殖を担っていることの証拠となる。

結論として、サブスタンスＰは、細胞増殖、β−カテニンの核移動、およびβ−カテニンの下流遺伝子であるＶＥＧＦとフィブロネクチンの誘導を刺激するものであり、これらは、サブスタンスＰが骨髄のＭＳＣ再増殖で役割を果たしていることを示す。

実施例６：静脈注射されたＭＳＣの角膜創傷層への供給と視力回復改善の確認
図３に示す通り、サブスタンスＰの静脈注射は、マウスＣＤ２９＋ＭＳＣが末梢血液
へ移動することを刺激するのに充分であった。移動されたＭＳＣが実際に角膜創傷治癒に関与するのか否かを調べるために、Ｄｉ１標識されたＭＳＣを角膜アルカリ損傷から２
４時間後に非照射（non-irradiated）ウサギの耳静脈に注入し、ＭＳＣの骨髄へのホーミングを最小化することによって、創傷部位への供給を最大化した。

骨髄洗浄と吸引によって、１月齢のallogenicウサギの脛骨からＭＳＣを分離し、ＭＳ
ＣＧＭと共に３継代まで培養した。付着した細胞を、ｃ−ｋｉｔ、ＳＴＲＯ−１およびα−平滑筋（ＳＭ）アクチンの発現によりＭＳＣとして同定し、細胞注入実験に用いた。注入されたＭＳＣを追跡するために、トリプシン処理細胞をＤｉ１溶液（Celltracker^TM CM-Di I（Cat # C-7000）；Molecular Probes）と共に３７℃で５分間および４℃で１５分間培養した。ラベリングし更にＰＢＳで３回洗浄した後、ＭＳＣ（１×１０⁶細胞／ｍＬ
）を新鮮な無血清培地に再懸濁し、角膜アルカリ損傷から１日後、１０匹のウサギの耳に注射した。

アルカリ損傷から２週および４週間後、無注入およびＤｉ１標識されたＭＳＣ注入群
の眼球を細隙灯で調べた。その結果を図６ａに示す。ＭＳＣ注入群が、無注入群よりも角膜視力回復に優れていることが確認された。

上皮治癒時間を、写真−スリット顕微鏡照射と写真−記録を用いた上皮欠陥の閉鎖によって決定した。角膜不透明度を、下記基準に基づいて等級化した：等級０−不透明でない、等級１−虹彩構造が若干不透明に見える、等級２−微細な虹彩構造が見えない、等級３−虹彩の存在だけが褐色として現れる、および等級４−全不透明。その結果を表１に示す。

表１に示されるように、ＭＳＣ注射ウサギは非注射群に比べて上皮治癒時間が２倍短縮され、より優れた角膜不透明度を示し、角膜血管新生が抑制された。

注入されたＤｉ１標識ＭＳＣが創傷層に局在するか否かを確認するために、ＦＬＡＴ
マウントを行なった。角膜でＤｉ１標識されたＭＳＣを確認するために、１日、２週お
よび３カ月後に蛍光立体顕微鏡（Leica）によりＦＬＡＴマウントを試験した。その結果
を図６ｂに示す。図６ｂの通り、Ｄｉ１標識されたＭＳＣが基質（ストロマ）レベルと
同様に上皮レベルでも検出された。また、静脈注入から１日後という早い段階でも、創傷層でＤｉ１標識されたＭＳＣが検出された。これらの存在は、Ｄｉ１強度は低くなっているものの、注入３カ月後まで検出された。

実施例７：静脈注射されたサブスタンスＰによる角膜創傷治癒促進の確認
図３の通り、サブスタンスＰの静脈注射はマウスＣＤＭＳＣが末梢血液へ移動するこ
とを刺激するのに充分であり、図６の通り、ＭＳＣの静脈注入は損傷された角膜の視力回
復を改善した。そこで、サブスタンスＰを静脈投与するのみで角膜損傷治癒が促進されるのか否かを試験した。サブスタンスＰの静脈注射による損傷治癒効果を試験するために、ニュージーランドホワイトウサギにアルカリ損傷を負わせた後、サブスタンスＰを６．５μｇ／ｋｇ容量で熱傷直後と２日後に２回静脈注射した。静脈注射から７日後、デジタルカメラで撮影して、角膜の回復程度を肉眼で評価した。その結果を図７ａに示す。図７ａの通り、サブスタンスＰを投与したウサギでは、角膜の再生が非投与群よりも顕著に早まっていた。つまり、サブスタンスＰの静脈投与によって、非投与対照ウサギに比して、角膜の不透明の解消と出血部位の消失により角膜の治癒が顕著に進行していた。

創傷治癒程度を組織学的水準で観察するために、眼球を摘出して固定した後、Ｈ＆Ｅ染色とＣＤ−２９抗体を用いた免疫組織化学染色を行なった。Ｈ＆Ｅ染色結果を図７ｂに示す。図７ｂの通り、サブスタンスＰを投与したウサギの場合、上皮が充分に厚く被覆しており、血管系がよく組織され、密度の高いコラーゲン束が配列していた。このコラーゲン束は、上皮下におけるマクロファージと多形核球巨大細胞が以前として存在している以外は、非投与の側副側でも同様であった。それに対して、サブスタンスＰを投与しない対照群では、同日において、上皮の被覆と大きな繊維芽細胞の活発な浸潤、および基質における未組織的コラーゲン繊維の遊離のみが観察され、これらはサブスタンスＰ投与群でも５日目に観察された。

ＣＤ−２９免疫組織化学染色の結果を図７ｃに示す。図７ｃの通り、サブスタンスＰを投与しない対照群では、まだ分化されない間葉系幹細胞（ＣＤ−２９を発現する大きな細胞群）が観察されたが、サブスタンスＰ投与群では、正常角膜基質と同様に、コラーゲン繊維束中にスピンドル形態の小さなＣＤ−２９＋細胞が認められた。従って、サブスタンスＰ投与群と非投与群の角膜を全期間で組織学的観察により比較することによって、サブスタンスＰ投与群での創傷回復が対照群よりも顕著に早く進行していることを確認することができた。これらの結果は、サブスタンスＰの投与により角膜損傷の回復効果が得られることを意味するものである。

角膜にアルカリ損傷を負わせたウサギで、末梢血液と創傷層にｃ−ｋｉｔ＋幹細胞が発現されることを示す写真である（→：創傷層におけるｃ−ｋｉｔ＋細胞）。角膜にアルカリ損傷を負わせたマウスから摘出した眼球のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す写真である。角膜にアルカリ損傷を負わせてから０、１、３、５、７、１０、１４日後に得たマウスの末梢血液のＥＬＩＳＡ分析結果を示すグラフである。マウスの眼にアルカリ損傷を負わせた後における角膜創傷層のＨ＆Ｅ染色およびサブスタンスＰに対する抗体への免疫組織化学染色結果を示す写真である。マウスの眼にアルカリ損傷を負わせた後における角膜創傷層のｃ−ｋｉｔ、ＣＤ−２９およびα−ＳＭアクチンに対する抗体への免疫組織化学染色結果を示す写真である。サブスタンスＰを静脈注射したマウスから分離した吸着細胞の抗ＣＤ２９抗体による免疫組織化学染色結果を示す写真である。以下の図において、「ＳＰ」はサブスタンスＰを示し、「ＮｏＳＰ」はサブスタンスＰを投与していない場合を示す。サブスタンスＰの静脈注射前後における血液内のＣＤ−２９＋細胞数の平均値を示すグラフである。サブスタンスＰ処理によりヒト間葉系幹細胞が移動して３−Ｄコラーゲンゲル上でコラーゲンを分解することを示す写真である。サブスタンスＰ処理（０〜１００ｎＭ）の後、３−Ｄコラーゲンゲル上のヒトＭＳＣ培養液から収集した培養上清のゼラチンゲル内活性酵素測定法の結果を示す写真である。サブスタンスＰ処理（０〜１００ｎＭ）の後、ヒトＭＳＣから収集した培養上清における抗ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２抗体による免疫沈澱の結果を示す写真である。サブスタンスＰ処理後、ヒトＭＳＣの生存数を示すグラフである（ｎ＝４、平均±標準偏差）。サブスタンスＰ存在下に培養されたヒトＭＳＣのβ−カテニン抗体を用いた免疫蛍光染色結果を示す写真である。サブスタンスＰ処理されたヒトＭＳＣの培養上清から収集したＶＥＧＦのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。サブスタンスＰ存在下にヒトＭＳＣが培養上清由来の抗ヒトフィブロネクチンモノクローナル抗体でウェスタンブロット分析した結果を示す写真である。角膜にアルカリ損傷を負わせてから１４、３０日後のウサギにおいて、Ｄｉ１標識されたウサギＭＳＣを注入した場合と注入した場合の眼球を細隙灯で観察した結果を示す写真である。蛍光立体顕微鏡下を用いてＦＬＡＴマウントで観察した角膜におけるＤｉ１標識ＭＳＣの存在の写真である。ウサギの角膜にアルカリ損傷を負わせた後、サブスタンスＰを静脈投与した群と対照群の損傷回復程度を示す写真である。角膜にアルカリ損傷を負わせた後、サブスタンスＰを静脈投与した群と対照群の組織断面をＨ＆Ｅ染色した結果を示す写真である。角膜にアルカリ損傷を負わせた後、サブスタンスＰを静脈投与した群と対照群の組織断面をＣＤ−２９抗体で免疫組織化学染色した結果を示す写真である。

Claims

創傷治癒または創傷治癒促進のための薬剤を製造するための、有効成分としてサブスタンスＰおよび間葉系幹細胞を含む組成物の使用であって、当該間葉系幹細胞がサブスタンスＰの静脈注射により骨髄から遊離したか或いは増殖したものである使用。
上記薬剤が細胞治療剤である請求項１に記載の使用。
有効成分としてサブスタンスＰと間葉系幹細胞を含み、当該間葉系幹細胞がサブスタンスＰの静脈注射により骨髄から遊離したか或いは増殖したものである、創傷治癒または創傷治癒促進のための薬剤。