JP5110696B2 - 安定かつ濾過可能なエンベロープで覆われたウイルス処方物 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、治療用生ウイルスおよび生ウイルスワクチンの処方物に関する。

（発明の背景）
−２０℃における凍結液体生ウイルスワクチンの安定化については、非常に限定された例しか報告されていない。これらのほとんどは、精製された生のエンベロープで覆われたウイルスを使用していない（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。凝固点より低い温度でのエンベロープで覆われたウイルスを安定化するための主な挑戦の１つは、凍結の間および保存段階での構造成分および機能成分（すなわち、タンパク質、脂質二重層およびウイルスゲノム）の物理的破壊を防止することである。タンパク質は、変性を受けやすく（非特許文献６）、そして脂質二重層は、凍結の間に破裂する傾向がある（非特許文献７）ことが報告されている。幾種類かの賦形剤が、凍結の間および凍結状態において、脂質二重層およびタンパク質の構造を安定化することが報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。これらの賦形剤としては、ポリオール、糖、緩衝液、アミノ酸およびポリマーが挙げられる。

凝固点より低い温度におけるエンベロープで覆われたウイルスの安定化のための主な課題は、凍結の間および保存段階の両方における、このウイルスの構造成分および機能成分の物理的破壊を防止することである。このエンベロープで覆われたウイルス成分としては、以下が挙げられる：（１）脂質二重層エンベロープ膜；（２）このウイルスゲノムによってコードされるタンパク質、および（３）一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡゲノム。

保存の間の安定性を確実にするために、感染性ウイルスのストックは、その複雑性ゆえに、一般に、超低温（例えば、−６０℃以下）で保存されている。Ｇｏｕｌｄ、Ｅ．Ａ．（非特許文献１）は、エンベロープで覆われたウイルスの液体が、−６０℃より低い超低温で非常によく生存したが、−２０℃での保存は、「ウイルス感染性の保持が必須ではない」場合にのみ使用されるべきであることを教示している。Ｄ．Ｒ．Ｈａｒｐｅｒは、広範な種々のエンベロープで覆われていないウイルスおよびエンベロープで覆われたウイルスの保存条件を記載した（非特許文献３）。全ての場合において、ウイルスは、感染性を保持するために、液体形態で−７０℃で保存されるべきであるかまたは親液性物質として４℃で保存されるべきであるかのどちらかである。ニューカッスル病ウイルスの液体調製物についての保存条件は、特に−７０℃であると言及される。

Ｙａｎｎａｒｅｌｌら（非特許文献５）は、低温適合型（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）インフルエンザワクチンの、−２０℃におけるＳＰＧ（ショ糖、ホスフェートおよびグルタミン酸塩（０．２１８Ｍ ショ糖、０．００３８Ｍ リン酸二水素カリウム、０．００７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．００４９Ｍ グルタミン酸カリウム）の混合物）を用いる保存のための条件を記載する。鼻腔内投与のために尿膜腔液中で調製されたインフルエンザウイルスは、ＳＰＧの１０×溶液で１０％に希釈された。この混合物中のショ糖の最終濃度は、７．５％であった。ホスフェートの存在は、ＮＤＶを安定化することを助けないが、一方、グルタミン酸塩は、濾過滅菌を妨げる。従って両化合物は、ＮＤＶの調製および−２０℃での保存に有害である。

非経口投与は、さらなる処方の問題を追加する。安全性の理由のため、非経口用途のための製品は、０．２μｍフィルターを通して濾過滅菌されなければならず、従って、生ウイルス調製物のための最終滅菌は、不可能である。ニューカッスル病のビリオンは、多形態性であるが、直径約０．１〜０．５ｎｍの範囲の大きさのおよそ球状の粒子である。０．２μｍ滅菌フィルターを通したＮＤＶの回収率は、処方物依存的であり、そして−２０℃液体ＮＤＶ処方物を開発するための重要な要因であると考えられる。

ＮＤＶが０．２μｍ滅菌フィルターを通る能力に影響を与える要因としては、ウイルスの直径、フィルター孔サイズおよびＮＤＶのフィルターへの吸着性が挙げられる。ＮＤＶの視覚上の直径は、（１）この処方物の張度および（２）ＮＤＶの表面電荷によって影響され得、これは、分子の立体配置および種々の緩衝液の存在下でのＮＤＶの表面上のタンパク質もしくは核酸の吸着に影響を及ぼし得る。

ＮＤＶのフィルター膜への吸着もまた、ウイルスの滅菌フィルターに対する能力に重要な影響を有し得る。いくつかの要因が、ＮＤＶの表面特性に影響を有し得、従って、ＮＤＶのフィルターへの吸着性に影響し得る。これらの要因としては、以下が挙げられる：（１）ｐＨ、（２）イオン強度、（３）疎水性相互作用もしくはファンデルワールス相互作用およびイオン性相互作用を含む表面相互作用、ならびに（４）界面活性剤のような表面活性剤の存在。

（背景についての引用文献）
１．非特許文献１
２．非特許文献２
３．非特許文献３
４．非特許文献４
５．非特許文献５
６．非特許文献６
７．非特許文献７
Ｅ．Ａ．Ｇｏｕｌｄ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９年，第１３巻，ｐ．５７−６６ Ｔ．Ｂａｒｒｅｔｔら，「Ｇｒｏｗｔｈ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ」，Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｏｋｓ，１９８５年，第６章，ｐ．１１９−１４６ Ｄ．Ｒ．Ｈａｒｐｅｒ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｌａｂ Ｆａｘ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、１９９３年 Ｌｏｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｇｅｌｂ、「Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ」，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８５年，第２８章，ｐ．５９１−６２６ Ｄ．Ａ．Ｙａｎｎａｒｅｌｌら，「Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２年，第１０２巻，ｐ．１５−２５ Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉら，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ− ａｎｄ Ｄｒｙｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９３年６月，第３０３巻，第２号，ｐ．４６５−４７３ Ｎ．Ｇｕｏら，Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００年２月，第１８巻，ｐ．１６８−１７１

（発明の要旨）
本発明は、中程度に低い温度の保存のために、エンベロープで覆われたウイルスを安定化するための方法を提供し、この方法は、以下を含有する水溶液を調製する工程を包含する：１０^６ＰＦＵ／ｍＬ〜１０^１２ＰＦＵ／ｍＬの濃度のエンベロープで覆われたウイルス；および非還元糖。この非還元糖が二糖である場合、この非還元糖は、５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度でこの溶液中に存在し、そしてこの非還元糖が単糖である場合、この非還元糖は、２．５％（ｗ／ｖ）〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度でこの溶液中に存在する。本発明に従って使用される溶液は、２５０ｍＯｓもしくはそれより高い浸透圧を有し、かつ５〜１０のｐＨを有する。

本発明は、非還元糖を含有する水溶液中にエンベロープで覆われたウイルスを処方することが、濾過滅菌および中程度に低い温度での長期間の安定性の両方を達成する有効な方法であることの驚くべき知見に基づく。

（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、無制限である。この用語を用いている特許請求の範囲は、このような特許請求の範囲に挙げられている要素に加えて要素を含み得る。従って、例えば、挙げられた要素もしくはその均等物が存在する限り、特許請求の範囲から、この特許請求の範囲の中に具体的に挙げられていない他の治療剤もしくは治療用ウイルスを含む処置レジメンを読み取り得る。

本明細書中で使用される場合、「ＮＤＶ」は、ニューカッスル病ウイルスについての略称である。本発明に従い、ウイルスがニューカッスル病ウイルスである場合、これは、低ビルレンス（長潜伏期性）であってもよく、中程度のビルレンス（亜病原性）であってもよく、または高ビルレンス（短潜伏期性）であってもよい。ビルレンスのレベルは、卵における平均死亡時間（Ｍｅａｎ Ｄｅａｔｈ Ｔｉｍｅ ｉｎ Ｅｇｇｓ、ＭＤＴ）試験に従って決定される。（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，「Ｃｈａｐｔｅｒ ２７：Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，第３版，Ｐｕｒｃｈａｓｅら編（Ｋｅｎｄａｌｌ／Ｈｕｎｔ、Ｉｏｗａ），１１７頁。）ウイルスは、ＭＤＴ試験によって、長潜伏期性（ＭＤＴ＞９０時間）；亜病原性（６０〜９０時間のＭＤＴ）、および短潜伏期性（ＭＤＴ＜６０時間）と分類される。

本明細書中で使用される場合、所定の成分もしくは不純物の「実質的にゼロ」の量は、上記溶液中に存在する化合物が、１０ｐｐｍもしくはそれより低い濃度でこの溶液中に存在することを意味する。

プラーク形成単位アッセイの固有の変動性を考慮し、ウイルスは、初期時点と後期時点との間でＰＦＵ／ｍＬの量の変化を測定した場合に感染性の５０％未満が失われている場合、所定の時間にわたって「安定である」とみなされる。個々のウイルスタンパク質の酵素活性を保存するのみで、感染性をも保存しないことは、本発明の意味において「安定性」の保存であるとはみなされない。

本発明は、水溶液を利用する。何故なら、水は、液体処方物中のエンベロープで覆われたウイルスの三次元構造および安定性の維持において必須であるからである。

ウイルスが非常に希釈されている溶液は、エンベロープで覆われたウイルスがより安定でないので、望ましくない。一方、高濃度のウイルスは、保存の間に安定性を害されないようである。凍結プロセスにおいて、このエンベロープで覆われたウイルスは、間隙領域内に濃縮され、この条件下で、このエンベロープで覆われたウイルスは、非常に濃縮された状態であると考えられる。本発明に従い、エンベロープで覆われたウイルスの濃度は、１０^６ＰＦＵ／ｍＬ〜１０^１２ＰＦＵ／ｍＬであり、好ましくは、１×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ〜７×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬである。

任意のエンベロープで覆われたウイルスが、本発明に従う水溶液を用いて処方され得る。例えば、ニューカッスル病ウイルスのようなパラミクソウイルスが、使用され得る。ニューカッスル病ウイルス亜病原性株が、現在好ましい。

中程度に低い温度（例えば、−２０℃）での不活性化からエンベロープで覆われたウイルスを保護するための２つの重要な要因が存在すると考えられる：液体状態の等張性ならびに凍結の間のタンパク質の変性および脂質膜の破壊の防止。浸透圧が等張点（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ｐｏｉｎｔ）よりずっと低い場合、ウイルス膜の破裂が生じる。高い浸透圧は、保存の間のエンベロープで覆われたウイルスの安定性に影響を及ぼさないようである。本発明に従って、約２５０ｍＯｓもしくはそれより高い浸透圧が、適している。好ましくは、この浸透圧は、約３００ｍＯｓである。この溶液中の糖の濃度が１０％（ｗ／ｖ）よりずっと低い場合、この溶液は、所望の浸透圧を達成するために、他の賦形剤を添加する必要がある場合がある。

安定性に影響を及ぼし得る他の重要な要因は、凍結および保存の間の構造成分および機能成分の破壊である。非還元糖、特に二糖は、凍結の間の不活性化からエンベロープで覆われたウイルスを保護することにおいて最も有効である。メカニズムに限定されることを意図しないが、この保護は、タンパク質の三次元構造の変性および脂質二重層構造の破壊を防止することによってもたらされると考えられる。非還元糖はまた、最終処方物中の浸透圧を調整するためにも使用され得る。対照的に、還元糖である乳糖は、同じ安定化効果を示さなかった。任意の非還元糖が、本発明の溶液において使用され得る。この糖が二糖である場合、この糖は、５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度でこの溶液中に存在する。特定の実施形態において、この二糖は、７．５％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。好ましい実施形態において、この二糖は、１０％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、より具体的には約１０％で存在する。適切な二糖の例としては、ショ糖もしくはトレハロースが挙げられる。この糖が単糖である場合、この糖は、２．５％（ｗ／ｖ）〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは４％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約５％（ｗ／ｖ）の濃度でこの溶液中に存在する。

本発明に従って、上記溶液は、必要に応じて、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジン（Ｌ−リジンおよびＤ−リジンが適する）もしくはアルギニン、または合わせて０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンおよびアルギニンをさらに含み得る。好ましくは、リジンおよび／もしくはアルギニンの濃度は、約１％（ｗ／ｖ）である。

このウイルスの安定性は、ｐＨによって影響される。本発明に従い、この溶液は、５〜１０、好ましくは６．５〜９、より好ましくは７〜９、より具体的には約７．５のｐＨを有し得る。

種々の化合物が、安定性、濾過可能性またはその両方に負の効果を有する。そして溶液中のこれらの存在は、最小化される。最適な安定性のために、本発明に従う溶液は、還元剤（例えば、還元糖、システイン）または抗酸化剤（例えば、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸）を実質的に含んではならない。特定の他の化合物は、より有害性は低く、従って、完全に除去する必要はない。例えば、以下を含むことが、本発明に従って使用される溶液について受容可能である：０．１％（ｗ／ｖ）までの塩化ナトリウム；１％（ｗ／ｖ）までのデキストラン；０．５％（ｗ／ｖ）までのマンニトール；０．１％（ｗ／ｖ）までのソルビトール；０．０１％（ｗ／ｖ）までのＴｗｅｅｎ；０．０１％（ｗ／ｖ）までのグルタミン酸塩；０．５％（ｗ／ｖ）までのポリエチレングリコール；０．１ｍＭまでの塩化カルシウム；０．５％（ｗ／ｖ）までのホスファチジルコリン；０．０５％（ｗ／ｖ）までのグリシン；および０．０１％（ｗ／ｖ）までのホスフェート。それでもやはり、塩化ナトリウム、デキストラン、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ、グルタミン酸塩、ポリエチレングリコール、塩化カルシウム、ホスファチジルコリン、グリシン、およびホスフェートを実質的に含まない溶液が、好ましい。グリシンおよび負に荷電した緩衝液（例えば、グルタミン酸塩緩衝液もしくはホスフェート緩衝液）は、濾過滅菌および回収のためによくない。

この溶液が非経口的に投与される場合、この溶液は無菌であるべきである。無菌性は、局所投与もしくは経口投与のためには重要ではない。この溶液は、低温保存の前に、薬学等級の滅菌フィルターによって滅菌され得、そして好ましくは滅菌されるべきである。滅菌のための好ましい方法は、エンベロープで覆われたウイルスの有効なサイズより大きいが、細菌より小さいサイズを有するフィルターを用いるサイズ濾過（ｓｉｚｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。０．２μｍの滅菌フィルターが、好ましい。通常、溶液の粘度は、濃度によって増大し、この粘度は、ＮＤＶが濾過されることを難しくし得る。濾過滅菌の間に良好なウイルス回収率を得るために、圧力は、好ましくは、１０〜１５ｐｓｉの間に維持されるべきである。高い粘度および低い圧力設定を用いてエンベロープで覆われたウイルスを濾過することは、非常に困難であり得る。高粘度による問題は、ウイルスの濾過滅菌後の無菌的混合を用いることによって、克服され得る。高粘度を回避するために、高濃度の賦形剤を用いないことが好ましい。例えば、デキストラン（グルコースベースのポリマー）は、濾過および最終濾過の間のウイルスの回収に影響し得る。

これまで、エンベロープで覆われたウイルスの液体処方物は、−６０℃もしくは−７０℃のような超低温でのみ安定であると考えられていたが、驚くべきことに、本発明に従って処方されたエンベロープで覆われたウイルスは、−２０℃で長期間にわたって安定であることが見出された。例えば、本発明において処方されるエンベロープで覆われたウイルスは、−４℃〜−３０℃、好ましくは−１０℃〜−３０℃、より好ましくは−１５℃〜−２５℃、なおより好ましくは−２０℃の温度で安定である。約−２０℃での保存は、便利である。−２０℃で安定性を維持する能力は、病院および薬局（代表的に、−２０℃の冷凍庫を有するが、通常は−７０℃の冷凍庫を有さない）で治療用製品を貯蔵することを可能にする。さらに、従来的な容器の閉鎖は、−２０℃において−７０℃におけるよりも良好な可撓性を維持し、無菌性の維持およびそれによる患者の安全は、−２０℃での保存によって保障される。本発明の方法を用いて、エンベロープで覆われたウイルスは、６ヶ月間、１２ヶ月間、２４ヶ月間またはそれより長くにわたって、安定である。

本発明は、以下の実施例を参照してよりよく理解される。この実施例は、例示であるが、本明細書中に記載される本発明を限定しない。以下の実施例において、ＮＤＶは、三重プラーク精製された（ｔｒｉｐｌｅ−ｐｌａｑｕｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ＭＫ１０７株であり、この株は、ニューカッスル病ウイルスの弱毒化（亜病原性）型である。この株は、２０００年１０月２６日公開の国際特許出願公開第００／６２７３５号（Ｐｒｏ−Ｖｉｒｕｓ、Ｉｎｃ．）においてより完全に記載される。国際特許出願公開第００／６２７３５号の内容全体は、本明細書により本明細書中で参照として援用される。

ＭＬは、５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン（ｐＨ８．０）と規定される。

（実施例１：５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン溶液中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、亜病原性ニューカッスル病ウイルス株Ｍａｓｓ−ＭＫ１０７から、三重プラーク精製によって誘導し、そして１０日の胚含有（ｅｍｂｒｏｎａｔｅｄ）ニワトリ卵の齢尿膜腔液腔内にウイルスを接種することによって産生した。３６℃で２日間のインキュベーション後、この卵を冷却し、そして尿膜腔液を収集した。収集した尿膜腔液を、５％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンニトールおよび１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン（ｐＨ８．０）緩衝液（ＭＬ）を用いてダイアフィルトレーションし、清澄化し、そして接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）およびサイズ排除クロマトグラフィーによって１〜４Ｅ＋１０ＰＦＵ／ｍＬの濃度に精製して、等分し、そして−２０℃で保存した。ＮＤＶ力価を、プラークアッセイによって測定し、そして１ｍｌあたりの感染性ＮＤＶプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量で表した。このアッセイのために、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、組織培養プレート中に播種し、そしてコンフルーエンスまで増殖させた。この増殖培地を除去し、細胞単層を培地で洗浄し、そして０．５ｍＬのＮＤＶサンプルを添加した。このプラークを、９０分間、３７℃かつ５％ ＣＯ_２で振とうすることによってインキュベートした。この単層を、記載のように洗浄し、そして３ｍＬの半固体寒天培地を、各ウェル上に積層した。この培養物を、４８時間、３７℃かつ５％ ＣＯ_２でインキュベートした。この細胞単層を、ニュートラルレッドで染色し、プラークを計数し、そしてウイルス力価をＰＦＵ／ｍＬで決定した。この結果（表Ｉ）は、−２０℃で５％マンニトール／１％リジン中で保存されたＮＤＶは、平均８０％を超える活性を失っており、安定ではなかったことを示した。安定性を、０時間力価に対する残留した力価の割合（％）で表した。

（表Ｉ：５％ Ｄ−マンニトール（ｗ／ｖ）および１％ Ｌ−リジン（ｗ／ｖ）中に処方したＮＤＶの−２０℃における安定性）

^＊ＮＴ：試験せず
（実施例２：１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによって緩衝液を１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液に交換し、等分し、そして−２０℃で保存した。安定性を、実施例１に記載のプラークアッセイによって測定した。この結果（表ＩＩ）は、−２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液中で保存されたＮＤＶは、２４ヶ月間まで安定であったことを示した。

（表ＩＩ：−２０℃におけるＮＤＶ １０％（ｗ／ｖ）ショ糖処方物の安定性）

^＊ＮＴ：試験せず
（実施例３：他の賦形剤を含有する１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液中ＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによって緩衝液を１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液に交換した。別個の、アミノ酸を含有する１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶中のＮＤＶの処方物を、Ｌ−リジン、Ｌ−グリシンもしくはＬ−グルタミン酸のいずれかを１％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加することによって調製した。この処方物を、等分し、そして−２０℃で保存した。安定性を、実施例１に記載のプラークアッセイによって測定した。この結果（表ＩＩＩ）は、−２０℃で、１％リジン、１％グリシンもしくは１％グルタミン酸を含有する１０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液中で保存されたＮＤＶは、１４ヶ月間まで安定であったことを示した。

（表ＩＩＩ：−２０℃におけるアミノ酸含有１０％（ｗ／ｖ）ショ糖中のＮＤＶの安定性）

（実施例４：他の緩衝溶液中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製した。このＮＤＶサンプルの一部分を、以下を含有する異なる処方物に緩衝液交換した：５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン／２％（ｗ／ｖ）ゼラチン加水分解産物、１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン、５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン中２００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン中２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）。これらを等分し、そして−２０℃で保存した。安定性を、実施例１に記載のプラークアッセイによって測定した。２％（ｗ／ｖ）ゼラチン加水分解産物の５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン中で調製したＮＤＶへの添加は、マンニトール／Ｌ−リジン処方物中で調製したＮＤＶ（実施例１参照）と比較して、安定性を有意に改善した。一方で、２％ ＨＳＡの添加は、より控えめなレベルの保護を提供した。

（表ＩＶ：−２０℃におけるゼラチン加水分解産物、ＨＳＡ、酢酸Ｎａ、およびトレハロースを含有する緩衝液中のＮＤＶ処方物の安定性）

（実施例５：−２０℃におけるデキストラン緩衝液中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製した。このＮＤＶサンプルの一部分を、以下を含有する異なる処方物に緩衝液交換した：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ／５％（ｗ／ｖ）デキストランおよび１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／２０％（ｗ／ｖ）デキストラン。デキストランは、ＮＤＶを−２０℃で保存した場合、ＮＤＶに対して中程度のレベルの保護を提供する（表Ｖ）ことを見出した。

（表Ｖ：−２０℃におけるデキストラン緩衝液中のＮＤＶの安定性）

（実施例６：他の緩衝溶液中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、異なる緩衝液に緩衝液交換し（実施例４および実施例５を参照）、等分し、そして−２０℃で保存した。安定性を、実施例１に記載のプラークアッセイによって測定した。この結果（表ＶＩ）は、−２０℃で、表ＶＩ中に記載の緩衝液中で保存されたＮＤＶは、安定ではなかったことを示した。

（表ＶＩ：−２０℃において緩衝液中のＮＤＶは不十分な安定性を示す）

^＊ＮＴ：試験せず
（実施例７：マンニトール中で調製したＮＤＶの濾過滅菌）
５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン中のＮＤＶを、実施例１に記載のように調製した。一部分を５％（ｗ／ｖ）マンニトールにダイアフィルトレーション（ｈｏｗ）した。デキストランを、ＮＤＶ ＭＬの別の一部分に添加し、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン含有ＭＬ中のＮＤＶのサンプルを調製した。これらのサンプルを、約３０ｍＬの各サンプルを連続的に０．４５μｍ ＳａｒｔｏｂｒａｎOプレフィルターおよび０．２２μｍ ＳａｒｔｏｂｒａｎOフィルターに１５ｐｓｉ下で通すことによって、これらのサンプルが濾過滅菌を受ける能力について試験した。これらのフィルターを、ＭＬ緩衝液によって事前に湿らせた。各サンプル由来の濾液を、収集し、そして実施例１に記載のように、回収したウイルスプラーク活性（ＰＦＵ）の総量についてのプラークアッセイによって分析した。ＭＬ緩衝液中もしくは５％（ｗ／ｖ）マンニトール中のＮＤＶは、容易に濾過されたが、一方、１０％（ｗ／ｖ）デキストランを含有するＭＬ緩衝液は、かなりフィルターを通りにくかった（表ＶＩＩ）。

（表ＶＩＩ：マンニトール／リジン／デキストランを含有するＮＤＶについての濾過研究のまとめ）

（実施例８：リジン／ホスフェート／ＮａＣｌを含有するＮＤＶマンニトール緩衝液の濾過滅菌）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、図１に記載の緩衝液に緩衝液交換し、そして実施例７に記載のように、これらが濾過滅菌を受ける能力について試験した。フィルターを、この処方物において使用した緩衝液で事前に湿らせた。各処方物について、フィルターを通るＮＤＶ緩衝液の容量を、収集し、そして蓄積した容量を計算した。５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン中で調製したＮＤＶは、良好に濾過された。３２４ｍＯｓ ＮａＣｌ中で調製したＮＤＶはいくらか濾過されたが、１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン、２０ｍｍホスフェート含有５％（ｗ／ｖ）マンニトールまたは０．９％ＮａＣｌもしくは２０ｍＭホスフェート含有５％（ｗ／ｖ）マンニトール／１％（ｗ／ｖ）リジン中で調製したＮＤＶは、よく濾過滅菌されなかった。

（実施例９：１０％（ｗ／ｖ）ショ糖もしくは１０％（ｗ／ｖ）トレハロースを含有する緩衝液中で調製したＮＤＶの濾過滅菌）
ＮＤＶサンプルを、実施例１に記載のように調製し、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖もしくは１０％（ｗ／ｖ）トレハロースにダイアフィルトレーションした。これらの溶液から、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖／１％ Ｌ−リジン、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖／１％ Ｌ−リジン／１０％（ｗ／ｖ）デキストラン、および１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／１％ Ｌ−リジンを含有するＮＤＶのさらなるサンプルを、それぞれの成分を添加することによって調製した。このサンプルを、実施例６に記載のように、これらが濾過滅菌を受ける能力について試験した。１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジンもしくは１０％（ｗ／ｖ）トレハロース中で調製したＮＤＶは、非常に良好な回収率で濾過滅菌された。１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン中で調製したＮＤＶは、合理的な回収率で濾過されたが、一方、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン／１０％（ｗ／ｖ）デキストラン中で調製したＮＤＶは、十分に濾過滅菌されなかった（表ＶＩＩＩ）。

（表ＶＩＩＩ：ショ糖／トレハロース／リジン／デキストランを含有するＮＤＶについての濾過研究のまとめ）

（実施例１０：１％ Ｌ−リジン、１％ Ｌ−グルタミン酸塩もしくは１％ Ｌ−グリシンを含有する１０％ショ糖中で調製したＮＤＶの濾過滅菌）
ＮＤＶサンプルを、実施例１に記載のように調製し、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖にダイアフィルトレーションした。これらの材料を、４つの部分に分配した。Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸塩、もしくはＬ−グリシンを、これらの部分のうち３つに各々添加し、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖および１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸塩、もしくはＬ−グリシンを含有するサンプルを産生した。これらのサンプルを、実施例６に記載のように、これらが濾過滅菌を受ける能力について試験した。１０％（ｗ／ｖ）ショ糖もしくは１％ Ｌ−リジン含有１０％（ｗ／ｖ）ショ糖中で調製したＮＤＶは容易に濾過されたが、一方、１％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミン酸塩もしくはグリシンを含有する１０％（ｗ／ｖ）ショ糖中で調製したＮＤＶは、わずかに濾過された（表ＩＸ）。

（表ＩＸ：ショ糖／リジン／グルタミン酸／グリシンを含有するＮＤＶについての濾過研究のまとめ）

（実施例１１：異なるｐＨにおける１０％ショ糖／リジン中のＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、そして１０％（ｗ／ｖ）ショ糖に緩衝液交換した。異なるｐＨにおけるＮＤＶ／１０％ショ糖溶液の試験サンプルを、ｐＨ調整した（異なるｐＨの）ショ糖／リジン緩衝液を添加することによって調製し、そして−２０℃で保存した。安定性サンプルを、実施例１に記載のプラークアッセイによって試験した。この結果は、ＮＤＶ／１０％ショ糖溶液は、ｐＨ７．３〜ｐＨ８．８の範囲において、より低いｐＨよりも安定であることを示した。

（表Ｘ：−２０℃における、異なるｐＨでの１０％ショ糖（ｗ／ｖ）／１％リジン（ｗ／ｖ）中で処方されたＮＤＶの安定性）

ＴＮＴＣ：数が多すぎて計数できず
（実施例１２：異なるショ糖濃度におけるＮＤＶの安定性）
ＮＤＶを、実施例１に記載の方法によって調製し、そして１０％（ｗ／ｖ）ショ糖に緩衝液交換した。異なる濃度のショ糖溶液におけるＮＤＶの試験サンプルを、異なる濃度のショ糖を添加するか、または注射用水を添加することによって調製し、そして−２０℃で保存した。各処方物の最終力価を、約２Ｅ１０に調整した。安定性サンプルを、実施例１に記載のプラークアッセイによって試験した。この結果は、１０〜２０％（ｗ／ｖ）ショ糖中で調製したウイルスは、より低いショ糖濃度中で調製したウイルスよりも安定であったことを示す。

（表ＸＩ：−２０℃でのＮＤＶ安定性におけるショ糖濃度の効果）

種々の緩衝液におけるＮＤＶの濾過可能性。

Claims (24)

1. エンベロープで覆われたウイルスを−４℃〜−３０℃の温度での保存のために安定化させるための方法であって、該方法は、本質的に以下：
   １０^６ＰＦＵ／ｍＬ〜１０^１２ＰＦＵ／ｍＬの濃度の、該エンベロープで覆われたウイルス；および
   非還元糖であって、ここで、該糖は、二糖でありかつ５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する、非還元糖
   からなる水溶液を調製する工程を包含し、ここで、該溶液は、約２５０ｍＯｓもしくはそれより高い浸透圧を有し、かつ５〜１０のｐＨを有し、そして該溶液を−４℃〜−３０℃の温度で維持または保存する工程をさらに包含する、方法。
2. エンベロープで覆われたウイルスを−４℃〜−３０℃の温度での保存のために安定化させるための方法であって、該方法は、本質的に以下：
   １０^６ＰＦＵ／ｍＬ〜１０^１２ＰＦＵ／ｍＬの濃度の、該エンベロープで覆われたウイルス；
   非還元糖であって、ここで、該糖は、二糖でありかつ５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する、非還元糖；および
   ０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンもしくはアルギニン、または合わせて０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンおよびアルギニンより選択されるアミノ酸
   からなる水溶液を調製する工程を包含し、ここで、該溶液は、約２５０ｍＯｓもしくはそれより高い浸透圧を有し、かつ５〜１０のｐＨを有し、そして該溶液を−４℃〜−３０℃の温度で維持または保存する工程をさらに包含する、方法。
3. エンベロープで覆われたウイルスを−４℃〜−３０℃の温度での保存のために安定化させるための方法であって、該方法は、以下：
   １０^６ＰＦＵ／ｍＬ〜１０^１２ＰＦＵ／ｍＬの濃度の、該エンベロープで覆われたウイルス；および
   非還元糖であって、ここで、該糖は、二糖でありかつ５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する、非還元糖
   を含有する水溶液を調製する工程を包含し、ここで、該溶液は、約２５０ｍＯｓもしくはそれより高い浸透圧を有し、かつ５〜１０のｐＨを有し、そして、還元剤もしくは抗酸化剤を１０ｐｐｍもしくはそれより低い濃度で含み、かつ以下：
   ０．１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム；
   １％（ｗ／ｖ）デキストラン；
   ０．５％（ｗ／ｖ）マンニトール；
   ０．１％（ｗ／ｖ）ソルビトール；
   ０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ；
   ０．０１％（ｗ／ｖ）グルタミン酸塩；
   ０．５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール；
   ０．１ｍＭ塩化カルシウム；
   ０．５％（ｗ／ｖ）ホスファチジルコリン；
   ０．０５％（ｗ／ｖ）グリシン；および
   ０．０１％（ｗ／ｖ）ホスフェート
   未満しか含有しない溶液であり、そして
   該溶液を−４℃〜−３０℃の温度で維持または保存する工程をさらに包含する、方法。
4. 前記溶液は、塩化ナトリウム、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ、グルタミン酸塩、ポリエチレングリコール、塩化カルシウム、ホスファチジルコリン、グリシン、およびホスフェートを１０ｐｐｍもしくはそれより低い濃度で含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記溶液は、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンもしくはアルギニン、または合わせて０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンおよびアルギニンより選択されるアミノ酸をさらに含有する、請求項３に記載の方法。
6. リジンおよび／またはアルギニンの前記濃度は、約１％である、請求項２または請求項５に記載の方法。
7. 前記維持温度または保存温度は、−３０℃〜−１０℃である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記維持温度または保存温度は、約−２０℃である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ウイルスは、パラミクソウイルスである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項９に記載の方法。
11. 前記ウイルスは、ニューカッスル病ウイルスの亜病原性株である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ウイルス濃度は、１×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ〜７×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記二糖濃度は、７．５％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記二糖濃度は、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記糖は、ショ糖である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記糖は、トレハロースである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記浸透圧は、約３００ｍＯｓである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記ｐＨは、７〜９である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記溶液は、無菌である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記エンベロープで覆われたウイルスがニューカッスル病ウイルスであり、そして前記糖が約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記エンベロープで覆われたウイルスがニューカッスル病ウイルスであり、そして前記糖が約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖であり、そして前記アミノ酸が約１％（ｗ／ｖ）の濃度のリジンである、請求項２または請求項５に記載の方法。
22. 前記溶液は、前記温度で６ヶ月間もしくはそれより長く維持される、請求項１に記載の方法。
23. 前記溶液は、前記温度で１２ヶ月間もしくはそれより長く維持される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記溶液は、前記温度で２４ヶ月間もしくはそれより長く維持される、請求項２３に記載の方法。

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