HU214507B - Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány szerint úgy járnak el, hőgy a szőkásős módőn előállítőtt,ismert módőn kinyert, előtisztítőtt, fertőzésképes vírűs-tartalmútápközeget egy űltracentrifűga főlyamatős átömlésű rőt rjába NTEpűfferból és különböző kőncentrációjú szacharóz őldatőkból képzettgradiensre táplálják, a szűszpenzió vírűstartalmát a rőtőrban fellépőradiális irányú erő hatásával a gradiens legmagasabb szacharózkőncentrációjú rétegébe jűttatják, majd a nagytisztaságú fertőzőképesvírűssal feldúsűlt gradienst annak töménységénél magasabb szacharózkőncentrációjú őldatnak a főrgó rőtőrba ellenáramba valóbetáplálásával kinyerik, ezt védőkőllőiddal hígítják, kriőprőtektív ésvázképző anyagőkat adnak hőzzá és fagyasztva szárítják. ŕ

Description

A találmány tárgya: eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására.

A készítmények tisztaságuknál és magas vírus-koncentrációjuknál fogva alkalmasak a humán terápiában való alkalmazásra, különböző vírusbetegségek és daganatos betegségek kezelésére. Az utóbbi években számos tanulmány és szabadalmi leírás foglalkozott különböző attenuált vírustörzsek humán terápiában való felhasználásával, vírusbetegségek és rosszindulatú daganatok elleni hatásával.

A 197517 és 197846 számú magyar szabadalmi leírások fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények második indikációját tárgyalják, ugyanis az említett műszaki megoldásokban ismertetett készítmények első indikációja különböző, vírusok okozta baromfi betegségek prevenciója, illetve azok terápiája, míg a második terápiás hatás az a felismerés, hogy ezen fertőzőképes vírus-tartalmú állatgyógyászati oltóanyagok eredményesen alkalmazhatók emberek vírus okozta betegségeinek és rosszindulatú daganatos betegségeinek gyógyítására.

A felismerés szükségessé tette azt, hogy az állatgyógyászati célokra készült, kevéssé tiszta, fertőző vírust tartalmazó készítmények olyan tisztaságban és olyan titerrel kerüljenek előállításra, hogy azok alkalmasak legyenek az embergyógyászatban való felhasználásra.

Nem ipari méretekben, laboratóriumi vizsgálatokhoz állítottak elő nagytisztaságú víruskoncentrátumokat. Kardi V., Székely-Tóth K., Perényi T., és BallaÉ. szerint (Acta Veterinaria Hungaricae 55(4), 458, (1987) NDV (Newcastle Disease Virus) törzseit tenyésztettek embrionált tyúktojásokban. Hétnapos inkubálás után az allantois folyadékot learatták, 20 percen át 750 g értékkel centrifugálták, majd az így előtisztított felülúszót centrifugálták (HITACHI ISCP 854) 52000 g értékkel 2,5 órán át. Az üledéket NTE pufferben reszuszpendálták és állni hagyták 4 °C hőmérsékleten 18 órán át. A víruskoncentrátumot 30%-os szacharózpámára rétegezték és 131000 g értékkel centrifugálták 6 órán át. A szacharözpáma alatti vírusüledéket NTE pufferben reszuszpendálták és -70 °C hőmérsékleten tárolták.

Szövetvírus koncentrátum előállítását ismerteti Kardi

V., Perényi T., Kocsis Gy., Neumayer Gy., Varró Cs., Nagy B., és Pergel I. (Acta Veterinaria Hungaricae 36(1-2), 124 (1988). Eljárásuk szerint 3 hetes korú SPF csirkéket fertőztek IBD vírussal. A betegség klinikai tüneteinek megjelenése után a bursa fabriciit eltávolították, PBS-sel (összetétele: 8 g nátriumklorid; 0,2 g kálium-klorid; 1,442 g dinátrium-hidrogén-foszfát két kristályvizes; 0,2 g kálium-dihidrogén-foszfát ad 1000 ml víz) homogenizálták és 15 percen át 8000 g értékkel centrifugálták. Az üledéket reszuszpendálták 20 ml PBS-ben és az előzőek szerint ülepítették. Ezt a lépést egyszer megismételték. Az összegyűjtött felülúszó folyadékot háromszor kezelték Freon 113-mal és végül az összegyűjtött freonos fázisokat PBS-sel extrahálták. A vizes fázisból ultracentrifugával (HITACHI SCP85H, SRP 28SA rotor), 131000 g értékkel, 120 percen át a fertőzőképes vírustartalmat ülepítették. Az üledéket 0,2 M TRIS-HC1 pufferben (trisz-[hidroxi-metil]-amino-metán - HC1), (pH=7,4) reszuszpendálták és az előzőeknek megfelelően ultracentrifugálással 30%-os szacharözpáma alá ülepítették. Az így kapott üle déket ugyanazon pufferban reszuszpendálták.

Az ismertetett eljárások hátrányaként említhető, hogy ipari méretben nem valósíthatók meg, mivel centrifügálási lépésük nem folyamatos, hanem szakaszos, a tisztítandó vírusszuszpenzió betáplálása részletekben történik és a tisztított, vírus-tartalmú tápközeget centrifugacsövekben fogják fel külön-külön. A vírustisztítás szacharózpáma alá való ülepítéssel történik, így a vírustisztítás csak korlátozott mértékben valósítható meg, továbbá számolni kell jelentős mennyiségű vírus-aggregátum kialakulásával is. Ez utóbbi következtében a fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzióból készített gyógyszerkészítmény hatóanyag (vírustartalom) szempontjából inhomogén lesz.

Ugyancsak az említett eljárások hátrányának kell tekinteni, hogy a szakaszosan végzett centrifugálás miatt kivitelezésük zárt rendszerben nem valósítható meg, így a feldolgozás során a vírusszuszpenzió visszafertőződésének veszélye fennáll.

Ismertek folyamatos eljárások vírusokat tartalmazó tápközegek folyamatos áramlású rotorral rendelkező centrifugával való tisztítására (Boll.Ist.Sieroter.Milan. 54,45-56 [1975]), de ez esetben a vírusok fertőzőképességének megőrzését nem kellett figyelembe venni, ugyanis inaktivált vírusszuszpenziók kerültek feldolgozásra.

Célul tűztük ki olyan eljárás kidolgozását, amely lehetővé teszi fertőzőképes vírust tartalmazó tápközegek olyan mértékben való koncentrálását és megtisztítását, valamint stabilizálását, hogy az, vagy az abból előállított gyógyszerkészítmények az embergyógyászati követelményeknek megfeleljenek.

A találmány tárgya tehát eljárás magas infektív titerű, vagyis nagy víruskoncentrációjú, nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására és azok stabilizálására.

A találmány tárgyát képezi továbbá az a védőkolloid rendszer, amely a készítményekben optimálisan képes a tisztított vírus fertőzőképességét hosszabb tárolás során megőrizni.

A találmány alapja az a felismerés, hogy ha a szokásos módon előállított nyers, fertőzőképes vírust tartalmazó tápközeget egy folyamatos áramlású rotorral rendelkező centrifuga rotorjában egy NTE puffer oldatból (összetétel: 8,77 g nátrium-klorid; 0,37 g Selecton B2 2H₂0; 1,21 g trisz-[hidroxi-metil]-amino metán; sósav 1 M-os szükség szerint; víz ad 1000 ml; pH=7,4) és szacharózból előállított, különböző szacharóz koncentrációjú gradiensbe áramoltatjuk, akkor a forgó rotorban fellépő radiális irányú erő hatására a vírus partikulák a külső, legmagasabb töménységű szacharóz réteg felé vándorolnak és a sűrűségüknek megfelelő sűrűségű szacharóz rétegben koncentrálódnak. Innen a legmagasabb koncentrációjú szacharóz gradiens rétegnél magasabb koncentrációjú NTE puffer-szacharóz elegynek a rotorba való ellenáramú betáplálásával nyerjük ki a magas koncentrációjú vírusszuszpenziót, míg a szennyezések

HU 214 507 Β (vérsejtek, sejttörmelékek, fehérje fragmentumok, fehérjék, lipidek, inkomplett vírusok) sűrűségük következtében az alacsonyabb szacharóz koncentrációjú gradiens rétegben maradnak.

A találmány alapját képezi továbbá az a felismerés, hogy a hidroxi-etil-keményítő túlmenően azon, hogy védőkolloid összetevő, aminosavakkal vagy azok származékaival kiegészítve kitűnő krioprotektív és vázképző tulajdonságokkal rendelkezik, amely további krioprotektív anyagokkal (humán albumin, polivinil-pirrolidon) lehetővé teszi a magas vírustartalmú készítmény fagyasztva-szárítással történő stabilizálását.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy embrionált tyúktojásban vagy szövettenyészetben szokásos módon megtermelt és ismert módon kinyert vírusszuszpenziót +4 °C körüli hőmérsékleten ülepítjük, a mechanikai szennyezésektől szűréssel megtisztítjuk, majd -20 °C körüli hőmérsékleten lefagyasztjuk.

Néhány órán át ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd hőmérsékletét fagypont fölé engedjük emelkedni. Ezt követően jól zárható centrifugapoharakban ülepítőcentrifugával 4000-5000 g értékkel 0,5-1,5 órán át ülepítjük, a kapott felülúszót vattán átszűrjük és az így kapott, szennyezéseket tartalmazó, alacsony, mintegy ΙΟ^7,5-ΙΟ^8,5 EID₅₀/ml infektív titerű fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenziót dolgozzuk fel a találmány szerinti eljárással a következők szerint.

Egy ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában rétegezéssel NTE puffer oldatból és szacharózból különböző szacharóz-koncentrációjú (0-50 tömeg%) lineáris szacharóz gradienst állítunk elő. Ezt követően a rotort beindítjuk és 20 000-40 000 ford/perc fordulatszámra felgyorsítjuk. A fordulatszám elérése után megkezdjük az előkészített, nyers vírusszuszpenziónak aratorba való betáplálását, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót a rotorból folyamatosan elvezetjük.

A vírusszuszpenzió teljes mennyiségének betáplálása után a gradiens legmagasabb szacharóztartalmú rétegénél magasabb szacharóz koncentrációjú NTE puffer szacharóz-oldat elegyének ellenáramú betáplálásával kinyerjük a magas vírustartalmú frakciót, melynek infektív titere ΙΟ'θ-ΙΟ¹¹ EIDjo/ml.

A centrifuga rotorjából folyamatosan távozó gradienst spektrofotometriásán ellenőrizzük és további feldolgozáshoz csak a 10⁹ EID₅o/ml-nél magasabb infektív titerű frakciókat használjuk fel.

A spektrofotometriásán alkalmasnak talált vírustartalmú frakciókat homogenizáljuk, majd szacharózból, hidroxi-etil-keményítőből, L-glutaminsavból vagy Na-L-glutamátból vagy L-prolinból, humán albuminból vagy polivinil-pirrolidonból álló védőkolloiddal elegyítjük és fagyasztva szárítással stabilizáljuk. A találmány szerinti eljáráshoz felhasznált minden anyag ismert és a kereskedelemben beszerezhető.

A találmány szerinti eljárás előnye, hogy így magas víruskoncentrációjú, legalább 10⁸EID₅₀/ml infektív titerű készítményhez jutunk, amely nem tartalmazza a humán felhasználásnál nem-kívánatos olyan szennyezéseket mint a vérsejtek, sejttörmelékek, fehérje fragmentumok, fehérjék, lipidek és inkomplett vírusok.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására szokásos módon előkeltetett tojásokból vagy szövettenyészetekből, ismert módon kinyert, fagyasztással, szűréssel és centrifugálással előtisztított fertőzőképes vírus-tartalmú tápközegekből oly módon, hogy egy folyamatos üzemű ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában 50-60 tf-rész NTE pufferből, 10-15 tf-rész 10-20 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 25-35 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 40-50 tömeg%-os szacharóz oldatból gradienst képezünk, majd a 0 ±5 °C hőmérsékleten tárolt, előtisztított, 10⁷’⁵-10⁸’⁵ EID50/ml vírustiterű, fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzió 25-35 ml/perc térfogatáramú folyamatos betáplálása mellett, 20 000-40 000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a szuszpenzió vírustartalmát a gradiens legmagasabb szacharóz-tartalmú rétegébe juttatjuk, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót folyamatosan eltávolítjuk, majd a nagytisztaságú, fertőzőképes vírussal feldúsult gradienst 80-100 tf-rész, 50-60 tömeg%-os szacharóz oldatnak ellenáramban való betáplálásával, 3000 4000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a centrifugarotorjából eltávolítjuk, edényekbe gyűjtjük, a további feldolgozásra alkalmas összegyűjtött frakciókat homogenizáljuk. Ennek vírustitere legalább 10⁹EID5O/ml, ezt védőkolloiddal 1:50-10:1 térfogatarányban legalább 10⁸·⁰ EID_5(>/ml vírustiterű szuszpenzióra hígítjuk, védőkolloid és krioprotektív anyagokat adunk hozzá, és fagyasztva szárítjuk. Védőkolloidként előnyösen fiziológiás sóoldatban készített 4-5 vegyes%os 200 000—400 000 molekulatömegű hidroxi-etil-keményítő és 0,1-2 vegyes L-glutaminsav vagy Na-L-glutamát vagy L-prolin elegyét alkalmazzuk. Krioprotektív anyagként előnyösen a fertőzőképes vírust és szacharózt tartalmazó vizes szuszpenzióhoz annak térfogatára vonatkoztatva 0,1-5 vegyes% mennyiségben humán albumint és/vagy polivinil-pirrolidont alkalmazunk.

A találmányt a következő példákkal kívánjuk megvilágítani anélkül, hogy az oltalmi kört azokra korlátoznánk.

1. példa

Ismert módon embrionált tyúktojásban megtermelt ND (Newcastle Disease) vírusszuszpenziót +4 °C hőmérsékleten ülepítjük, gézen megszüljük, majd -20 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Egy órán át ezen hőmérsékleten tartjuk, majd hőmérsékletét +4 °C-ra emeljük. Felmelegedés után steril, zárható centrifugapoharakba töltjük és ülepítőcentrifugába helyezve 4300 g-vel 60 percen át centrifugáljuk. A felülúszót steril vattán átszűrjük és ez kerül további feldolgozásra. Ennek infektív titere ΙΟ⁷·⁵-10⁸·⁵ EID₅₀/ml. Egy HITACHI ΕΡ65β típusú ultracentrifuga (gyártja: HITACHI Ltd., Japán) P32 CT jelű folyamatos áramlású rotorját a berendezésbe beszereljük és a hozzá kapcsolódó csővezetékekkel együtt 4 vegyes%-os formaldehid oldattal fertőtlenítjük, majd steril, pirogénmentes vízzel alaposan átmossuk. Ezt követően 230 ml NTE puffer és 100 ml 15 tömeg%-os, 50 ml 30 tömeg%-os és 50 ml 49 tömeg %-os szacharóz oldat felhasználásával gradiens rendszert alakítunk ki a

HU 214 507 Β centrifuga rotorjában. Ezt követően 30 ml/perc térfogatárammal a gradiensre tápláljuk az előkészített vírusszuszpenziót és 30 000 ford/perc fordulatszámmal elvégezzük a centrifugálást. A forgó rotorban fellépő erő hatására a víruspartikulák a külső, legmagasabb töménységű szacharóz rétegben koncentrálódnak, miközben a szennyezések a nekik megfelelő sűrűségű, alacsonyabb szacharózkoncentrációjú gradiens rétegben dúsulnak fel.

A centrifügálás folyamata alatt a vírusban elszegényedett felülúszót a rotorból folyamatosan elvezetjük.

így mintegy 8-10 liter nyers vírusszuszpenzió folyamatos, egyetlen lépésben való centrifugálását valósítjuk meg zárt rendszerben.

A művelet során a felhasználásra kerülő vírusszuszpenziót jéggel hűtött tartályból tápláljuk be. A centrifugálással nyert tisztított, fertőzőképes vírussal dúsított gradienst 430 ml 50 tömeg%-os szacharóz oldatnak a rotorba ellenáramban való betáplálásával, 3000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával távolítjuk el. A folyamatosan távozó gradiens abszorbanciáját spektrofotométerrel, 254 nm hullámhossszon folyamatosan ellenőrizzük és regisztráljuk. A gradienst 20ml-enként steril kémcsövekben gyűjtjük és a készítmény előállítására alkalmas frakciókat, amelyek a mért abszorbancia alapján magas virustartalmúak, összegyűjtjük és homogenizáljuk védőkolloiddal 1:10 térfogatarányban hígítjuk és az értékmérések elvégzéséig -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A további feldolgozáshoz a legalább lO⁹EID₅o/ml vírustiterű homogenizátumot használjuk fel.

A védőkolloid összetétele: hidroxi-etil-keményítő (mól. tömeg:

200 000-400 000) 5,5 g

Na-L-glutamát 0,55 g fiziológiás sóoldat ad 100 ml

Az infektív titer és a szacharóztartalom ismeretében összeállítjuk a liofilizálandó készítményt úgy, hogy annak következő legyen az összetétele (az infektív titer maghatározása embrionált tyúktojáson történik vírustitrálással, a szacharóztartalom meghatározása enzimatikus-kolorimetriás eljárással történik):

vegyes% szacharóz, vegyes% hidroxi-etil-keményítő (mól. tömeg 200 000-400 000),

0,5 vegyes% humán albumin,

0,5 vegyes% Na-L-glutamát, vírusszuszpenzió, titere min. 10⁸ EID₅o/ml, ad 100 ml fiziológiás sóoldat

Az összetevőket alaposan összekeverjük, majd 3 mles liofilizálásra alkalmas üvegekbe 1 ml-enként adagoljuk és fagyasztva szárítjuk.

2. példa

Az 1. példa szerint előállított tisztított, koncentrált vírusszuszpenzió felhasználásával a következő összetételű, liofilizálásra alkalmas készítményt állítjuk össze:

vegyes% szacharóz, vegyes% hidroxi-etil- keményítő (mól. tömeg:

200 000-400 000),

0,5 vegyes% L-prolin,

0,5 vegyes% polivinil-pirrolidon, vírusszuszpenzió, titere min. 10⁸ EID₅₀/ml ad 100 ml fiziológiás sóoldat.

Claims (5)

10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására szokásos módon előkeltetett tojásokból vagy szövettenyészetekből ismert

15 módon kinyert, fagyasztással, szűréssel és centrifugálással előtisztított, fertőzőképes vírus-tartalmú tápközegekből, azzal jellemezve, hogy egy folyamatos üzemű ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában 50-60 tf-rész NTE pufferből, 10-15 tf-rész 10-20 tömeg%-os szacha20 róz oldatból, 10-15 tf-rész 25-35 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 40-50 tömeg%-os szacharóz oldatból gradienst képezünk, majd a 0 ±5 °C hőmérsékleten tárolt, előtisztított, fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzió 25-35 ml/perc térfogatáramú folyamatos

25 betáplálása mellett, 20 000-40 000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a szuszpenzió vírustartalmát a gradiens legmagasabb szacharóz-tartalmú rétegébe juttatjuk, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót folyamatosan eltávolítjuk, majd a nagytisztaságú, fertőző30 képes vírussal feldúsult gradienst 80-100 tf-rész, 50-60 tömeg%-os szacharóz-oldatnak ellenáramban való betáplálásával, 3000-4000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a centrifuga rotorjából folyamatosan eltávolítjuk, edényekbe gyűjtjük, a legalább 10⁹·⁰ EID₅o/ml

35 vírustiterű frakciókat összegyűjtjük, homogenizáljuk, majd védőkolloiddal 1:50-10:1 térfogatarányban legalább ΙΟ⁸·⁰ EID₅₀/ml vírustiterű szuszpenzióra hígítjuk, védőkolloid és krioprotektív anyagokat adunk hozzá, és fagyasztva szárítjuk.

40

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előtisztított, fertőzőképes vírust tartalmazó kiindulási tápközeg infektív titere 10^7,5-10⁸’⁵ EID₅o/ml.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőkolloidként fiziológiás sóoldatban

45 készített 4-6 vegyes%-os hidroxi-etil-keményítő és 0,1-2 vegyes% L-glutaminsav vagy Na-L-glutamát, vagy L-prolin elegyét alkalmazzuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 200 000-400 000 molekulatömegű hidroxi-etil50 -keményítőt alkalmazunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fertőzőképes vírust és szacharózt tartalmazó vizes szuszpenzióhoz annak térfogatára vonatkoztatva krioprotektív anyagként 0,1-1 vegyes%

55 mennyiségben humán albumint és/vagy polivinil-pirrolidont adagolunk.