JP2719443B2

JP2719443B2 - ウィルス性疾患及び悪性疾患の治療のための安定化された生ウィルスを含む薬剤生成物及びその製造方法

Info

Publication number: JP2719443B2
Application number: JP5516706A
Authority: JP
Inventors: カー．チャタリー、ラスロー
Original assignee: カー．チャタリー、ラスロー
Priority date: 1992-03-24
Filing date: 1993-03-23
Publication date: 1998-02-25
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: JPH07505364A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はウィルス性疾患及び悪性疾患の治療のための
安定化された生ウィルスを含む薬剤生成物及びそのよう
な生成物の製造方法に関する。本発明はまた、精製され
たウィルスワクチン及びそのための精製方法にも関す
る。

ハンガリア特許第197517号及び同197846号はウィルス
起源の人の疾患の治療において或る種の非病原性生ウィ
ルスを使用することを記述している。すなわち、上記特
許第197517号はヘルペス、狂犬病、エイズ及び種々の悪
性疾患の治療に適した、弱毒化ニューカッスル病ウィル
スを含む薬剤生成物を提供する。上記特許第197846号は
肝炎、狂犬病及び他のウィルス起源の諸疾患並びに種々
の悪性疾患の処置に適した弱毒化ガンボロウィルスを含
む薬剤生成物を記述している。ガンポロウィルスもニュ
ーカッスル病ウィルスもともに家禽の疾病を引き起こす
けれども、これらの弱毒化ウィルスを含むワクチンは市
販において用いられている。上記の各特許はこれらのワ
クチンの治療的適用を記述している。

獣医学的ワクチン類の純度は人に必要な純度を満足し
ないので種々の感染症や合併症が有害な副作用としても
たらされることがある。その上に獣医学的なワクチン類
の安定性も劣っている。本発明は人の治療に適した非病
原性の、精製されたウィルスを得る方法並びに長期間に
わたり効果の明らかな損失なく安定である凍結乾燥生成
物を提供しようとするものである。

最近、ウィルス起源の人の種々の疾患の治療のために
他の非病原性ウィルス類をも使用できることが見出され
た。本発明により、人に対して非病原性であるいかなる
弱毒化されたウィルスもウィルス性疾患の処置において
単独で、又は組み合わせて用い得ることが証明された。
それらは獣医学的ウィルス、中でも鳥ウィルス類又は人
ウィルス類、すなわち例えば鳥パラミクソウィルス、鳥
ヘルペスウィルス、鳥ロタウィルス、鳥気管支炎ウィル
ス、鳥脳炎ウィルス、鳥滑液包炎ウィルス（ガンボロウ
ィルス）、マレク病ウィルス、パルボウィルス、ニュー
カッスル病ウィルス並びに人パラミクソウィルス、人パ
ルボウィルス及び人アデノウィルスであることができ
る。

本発明はウィルス起源の種々の疾患及び悪性疾患を処
置するのに有効な、人に対して非病原性の、弱毒化した
ウィルスに関し、それら疾患は例えばエイズ、直腸癌、
膀胱癌、乳癌、大腸ガン、頚部癌、食道癌、すい臓癌、
気管支癌、肝臓癌、腎臓癌及び胃癌、各種婦人科癌、頭
部癌及び頚部癌、種々のリンパ腫、悪性黒色腫、骨髄腫
及び放射線照射による免疫不全、多発性硬化症、インフ
ルエンザ、通常の風邪及び種々のウィルス起源の関連疾
患、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、いぼ、膠原病、急性
及び慢性の肝炎（Ｂ及びＣ）及び骨髄移植に続く種々の
症状である。

上記の治療目的のために適した種々のウィルスが例え
ば繊維芽細胞又は他の細胞系の培養或いは卵子胎芽の尿
膜−羊水液から通常のように得ることができる。尿膜−
羊水液は感染した鶏卵から得ることができる。この液体
は遠心分離によって精製し、そしてその上澄液を超遠心
分離によりペレット化する。沈降物を再水和させ、そし
て蔗糖密度勾配を通じて沈降させ、もう一度超遠心分離
し、そして得られたペレットを再水和して凍結乾燥させ
る。

本発明の好ましい具体例の１つにおいては尿膜−羊水
液を約5,000Gで遠心分離し、得られたペレットを捨てて
その上澄液を用いる（必要の場合に濾過段階を含むこと
ができる）。ウィルスをこの上澄液から超遠心分離によ
ってペレット化する（この超遠心分離は回転数と時間と
に左右され、そして広い範囲内で変化することができる
が、通常は35,000G、１時間である）。その上澄液を捨
て、そしてそのペレットを僅かな容積の緩衝液に再懸濁
させる。適当な均一性のためには比較的長い撹拌時間が
必要である。

この均一な懸濁液を高濃度蔗糖の上に層状に載せ、そ
して90,000−100,000G（最低60,000G）において超遠心
分離する。その上澄液を捨ててペレットを再水和し、そ
して凍結乾燥させる。

本発明のもう１つの目的は、そのウィルス調製物の安
定化である。一般にワクチンの製造において、種々の保
護コロイドが単独で、又は組み合わせて凍結乾燥の間に
用いられる。このようなコロイドは例えばミルク（３−
10％）、ポリビニルピロリドン及びゼラチン（0.1−0.2
％）及びグルコース、蔗糖又はデキストラン（１−10
％）である。しかしながら人に対して用いるにはこれら
のコロイドは不満足であるか、又は副作用を引き起こす
ことがある。

本発明者等は、変性澱粉、例えばヒドロキシエチル澱
粉（分子量＝100,000−300,000）を単独で、又は組み合
わせて保護コロイドとして好ましく使用できることを見
出した。平均分子量200,000のヒドロキシエチル澱粉が
血漿増量剤として使用されるけれども、このような化合
物がワクチンの製造のための保護コロイドとして用いら
れたことはない。

本発明の新規な安定化された生成物は、他の種々の化
合物と一緒に有効量の変性澱粉を保護コロイドとして含
む。

本発明を以下の諸例において詳述する。ニューカッス
ル病ウィルス及びガンボロウィルスはハンガリー国ブダ
ペストのPhylaxiaからそれぞれPHYLAVAC及びGUMBOPHYL
として購入することができる。

例１尿膜液からのニューカッスル病ウィルスの精製ウィルスを含んだ尿膜−羊水液の３を5,000Gにおい
て１時間遠心分離した。上澄液を多層に重ねたガーゼを
通して濾過した。この上澄液からウィルスを超遠心分離
〔SCP 85 H2超遠心機、RP 19ロータ、18,500rpm（35,00
0G、４℃、１時間）〕によりペレット化した。この上澄
液を捨てた後、得られたペレットをNTE緩衝液（0.15M N
aCl、0.001M EDTA、0.05M トリス、pH7.4）の30mlの中
に再懸濁させた。この懸濁液を氷浴中でゆるやかに24時
間にわたって撹拌した。

この懸濁液を更に蔗糖濃度勾配超遠心分離により精製
した。遠心分離チューブの中にNTE緩衝液の中の30％（W
/W）（＝33％W/V）濃度の蔗糖液30mlを入れ、そしてこ
の蔗糖の上に懸濁液5mlを層状に載せた。それら遠心分
離チューブをSRPロータの中で95,00G（27,500rpm）にお
いて80分間超遠心分離した。その上澄液を捨てた後で、
得られたペレットをNTE緩衝液の中に再懸濁させた（各
チューブ当り0.5ml）。集めた上澄液を氷浴中で24時間
にわたりゆるやかに撹拌した。

この精製操作の間合におけるウィルス濃度はノイラミ
ニダーゼの活性、赤血球凝集及びELISAによって調べ
た。このウィルスの感染性を予備インキュベーションし
た卵の接種により測定した。蛋白質濃度はスペクター
（Spector）の方法により測定した。この生成物の純度
は、HN、NP及びＭ蛋白質を除いてSDSゲール電気泳動法
により求め、他のピーク帯（不純物）は見られてはなら
ない。

以上の方法によって下記が示された。

例２ Vero細胞培養からのガンボロウィルスの精製 Vero細胞培養の上澄液2,300mlを４℃において5,000G
で30分間遠心分離した。その上澄液からウィルスを超遠
心分離〔SCP 85 H2超遠心機、RP 19ロータ、18,500rpm
（35,000G、４℃、１時間）〕によりペレット化した。
その上澄液を捨てた後で、そのペレットを23mlのNTE緩
衝液の中に再懸濁させた（もとの容積の１％）。この懸
濁液を氷浴中で24時間にわたりゆるやかに撹拌した。

この懸濁液を更に、蔗糖濃度勾配超遠心分離により精
製した。NTE緩衝液の中の30％（W/W）濃度（＝33％w/
v）の30mlを各遠心分離チューブの中に入れ、そして5ml
の懸濁液をこの蔗糖の上に層状に置いた。各チューブを
95,000G（27,500rpm）においてSRP 28 SAロータの中で8
0分間にわたり超遠心分離した。

その上澄液を捨てた後、そのペレットをNTE緩衝液の
中に再懸濁させ（各チューブ当り1ml）、次いでこれを1
mlの緩衝液で洗浄した。補集した上澄液を氷浴中で24時
間にわたりゆるやかに撹拌した。

この精製操作の間におけるウィルス濃度はELISAによ
って調べた。このウィルスの感染性をこのものの細胞変
性硬化により測定した。蛋白質濃度はSpectorの方法に
よって求めた。

上記の方法によって下記が示された例３人の治療に用いるための安定化されたウィルス 2.2％（V/V）のグルコース、蔗糖及びヒドロキシエチ
ル澱粉（分子量:200,000、ISOHES/HES:200/0.5）を例１
より得られたウィルス懸濁液に加え、次いで凍結乾燥さ
せた。再構築の後で、長期間の貯蔵の後においてももと
のELISAタイター値が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/255 Ａ６１Ｋ 39/255 // Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｎ 7/02

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】人に対して非病原性の、選ばれたウイルス
から、ウイルス起源の人の疾患及び種々の悪性疾患を処
置するための安定で高純度のワクチンを製造する方法に
おいて、ａ）上記選ばれたウイルスを含む液体を作り、ｂ）このウイルス含有溶液を約5,000Gにおいて約１時間
にわたり遠心分離して上記選ばれたウイルスの含まれる
上澄液を形成させ、ｃ）この上澄液を約４℃において約35,000Gで約１時間
にわたり超遠心分離してウイルス含有ペレットを作り、ｄ）このペレットを氷浴中で緩衝液の中で混合すること
により均一なウイルス含有懸濁液を形成させ、ｅ）約30％（V/V）濃度の蔗糖の上に上記懸濁液を層状
に載せ、そしてこの蔗糖の上に層状化させた懸濁液を6
0,000100,000Gにおいて超遠心分離してウイルス含有
ペレットを作り出すことにより精製し、ｆ）このウイルス含有ペレットを集めて緩衝液の中に再
懸濁させ、そしてこのペレット／緩衝液の溶液を氷浴中
で撹拌してウイルス懸濁液を作り出し、ｇ）このウイルス懸濁液に安定化化合物を加えることに
よってウイルス懸濁液を安定化させ、ｈ）この安定化されたウイルス懸濁液を凍結乾燥して人
に投与するのに適した安定な高純度ワクチンを作る各段階を含む方法。
【請求項２】上記ウイルスが鳥パラミクソウイルス、鳥
ヘルペスウイルス、鳥ロタウイルス、鳥気管支炎ウイル
ス、鳥脳炎ウイルス、鳥滑液包炎ウイルス（ガンボロウ
イルス）、マクレ病ウイルス、パルボウイルス、ニュー
カッスル病ウイルス、及びそれらの混合物よりなる、人
に対して非病原性のウイルスの群から選ばれる、請求の
範囲１の方法。
【請求項３】選ばれたウイルスを含む液体が、繊維芽細
胞培養上澄液、細胞系培養上澄液及び尿膜−羊水液より
なる群から選ばれる液体源より得られる、請求の範囲１
の方法。
【請求項４】安定化化合物が上記ウイルスに対して保護
コロイドのような作用をする変性澱粉を含む、請求の範
囲１の方法。
【請求項５】選ばれたウイルスが人に対して病原性であ
り、そして人パラミクソウイルス、人パルボウイルス、
人アデノウイルス及びそれらの混合物よりなる群から選
ばれる、請求の範囲１の方法。
【請求項６】段階ｄ）及びｆ）をNTE緩衝液の中で約7.4
のpHにおいて実施する、請求の範囲１の方法。
【請求項７】上記液体が尿膜−羊水液であり、そして選
ばれたウイルスがニューカッスル病ウイルスである、請
求の範囲３の方法。
【請求項８】上記液体が細胞系培養上澄液であり、そし
て選ばれたウイルスが鳥滑液包炎ウイルス（ガンボロウ
イルス）である、請求の範囲３の方法。
【請求項９】上記変性澱粉が、100,000ないし300,000の
分子量を有するヒドロキシエチル澱粉である、請求の範
囲４の方法。
【請求項１０】請求の範囲４の方法により作られた高純
度の安定な人ワクチン。
【請求項１１】請求の範囲５の方法により作られた高純
度な安定な人ワクチン。
【請求項１２】下記、すなわちａ）選ばれたウイルスを含む液体を作り、ｂ）このウイルス含有溶液を遠心分離してウイルス含有
上澄液を形成させ、ｃ）このウイルス含有上澄液を約35,000Gで超遠心分離
してウイルス含有ペレットを作り、ｄ）このウイルス含有ペレットを氷浴中で緩衝液の中で
混合して均一なウイルス含有懸濁液を形成させ、ｅ）上記ウイルス含有懸濁液を超遠心分離機の中で蔗糖
勾配において60,000100,000Gで精製して高純度ウイル
ス含有ペレットを作り出し、ｆ）このウイルス含有ペレットを氷浴中で撹拌すること
により高純度ウイルス含有懸濁液を形成させ、ｇ）この高純度ウイルス含有懸濁液をこの懸濁液に100,
000ないし300,000の分子量を有するヒドロキシエチル澱
粉を加えることによって安定化させ、ｈ）この安定化された高純度ウイルス含有懸濁液を凍結
乾燥して人に投与するのに適した安定な高純度ワクチン
を形成させる各段階を含む方法によって作られた、ウイルス起源の人
の疾患及び種々の悪性疾患を処置するための、人に対し
て非病原性の選ばれたウイルスから作られた、安定で高
純度のワクチン。
【請求項１３】段階ｄ）及びｆ）がNTE緩衝液の中で約
7.4のpHにおいて実施された、請求の範囲12の高純度の
ワクチン。
【請求項１４】選ばれたウイルスが、鳥パラミクソウイ
ルス、鳥ヘルペスウイルス、鳥ロタウイルス、鳥気管支
炎ウイルス、鳥脳炎ウイルス、鳥滑液包炎ウイルス（ガ
ンボロウイルス）、マクレ病ウイルス、パルボウイル
ス、ニューカッスル病ウイルス、及びそれらの混合物よ
りなる群から選ばれる、請求の範囲12の高純度のワクチ
ン。
【請求項１５】選ばれたウイルスがニューカッスル病ウ
イルスである、請求の範囲14の高純度のワクチン。
【請求項１６】選ばれたウイルスが鳥滑液包炎ウイルス
（ガンボロウイルス）である、請求の範囲14の高純度の
ワクチン。
【請求項１７】選ばれたウイルスが人に対して病原性で
あり、そして人パラミクソウイルス、人パルボウイル
ス、人アデノウイルス及びそれらの混合物よりなる群か
ら選ばれる、請求の範囲12の高純度のワクチン。
【請求項１８】ウイルス起源の人を除く哺乳動物疾患を
処置し、制御するための方法において、ａ）哺乳動物に対して非病原性の選ばれたウイルスを含
む液体を作り、ｂ）このウイルス含有溶液を遠心分離してウイルス含有
上澄液を形成させ、ｃ）このウイルス含有上澄液を約35,000Gで超遠心分離
してウイルス含有ペレットを作り、ｄ）このウイルス含有ペレットを氷浴中で緩衝液の中で
混合して均一なウイルス含有懸濁液を形成させ、ｅ）上記ウイルス含有懸濁液を超遠心分離機の中で蔗糖
勾配において60,000100,000Gで精製して高純度ウイル
ス含有ペレットを作り出し、ｆ）このウイルス含有ペレットを氷浴中で撹拌すること
により高純度ウイルス含有懸濁液を形成させ、ｇ）この高純度ウイルス含有懸濁液をこの懸濁液に100,
000ないし300,000の分子量を有するヒドロキシエチル澱
粉を加えることによって安定化させ、ｈ）この安定化された高純度ウイルス含有懸濁液を凍結
乾燥して投与するのに適した安定な高純度ワクチンを形
成させる各段階を含む方法によって、ウイルス起源の人を除く哺
乳動物の疾患及び種々の悪性疾患を処置するための、哺
乳動物に対して非病原性の選ばれたウイルスから作られ
た、安定で高純度のワクチンを用意し、該ワクチンの有効量を、処置を必要とする人以外の哺乳
動物宿主に対して投与することをことを特徴とする方
法。