JP5004392B2

JP5004392B2 - インドリノン化合物を用いてｃ−ｋｉｔチロシン蛋白質キナーゼ機能を調節する方法

Info

Publication number: JP5004392B2
Application number: JP2001546428A
Authority: JP
Inventors: リプソン，ケン; マクマホン，ジェラルド
Original assignee: スージェン，インク．
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: ATE331514T1; AU3436301A; CY1106165T1; US7211600B2; EP1255536B1; WO2001045689A2; US20040002534A1; NZ519697A; AU784266B2; WO2001045689A3; CA2395461C; HK1050642A1; US20020010203A1; JP2004500363A; DK1255536T3; US20050288353A1; MXPA02006263A; ES2267605T3; CA2395461A1; PT1255536E

Description

【０００１】
本出願は，米国特許出願６０／１７１，６９３（１９９９年１２月２２日出願，この全体を本明細書の一部としてここに引用する）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，細胞増殖性疾患を阻害する方法，化合物，および組成物に関する。本発明は，ｃ−ｋｉｔキナーゼの過剰活性および／または不適切な活性により特徴づけられる細胞増殖性疾患を阻害するのに特に有用である。
【０００３】
発明の背景
以下の本発明の背景の記載は，本発明の理解を助けるために提供されるものであり，本発明に対する先行技術であるかまたはこれを記載すると認めるものではない。
【０００４】
Ｋｉｔシグナリングは，胎児性腺の発生に重要であり，成人の生殖能力においても役割を果たし続ける（Ｍａｕｄｕｉｔｅｔａｌ．（１９９９）ＨｕｍａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＵｐｄａｔｅ５：５３５−５４５）。精子形成は，ＳＣＦの非存在下で（Ｏｈｔａｅｔａｌ．（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２７：２１２５−２１３１），またはＫｉｔがＰＩ３キナーゼ経路を介してシグナリングする能力がない場合（ＢｌｕｍｅＪｅｎｓｅｎｅｔａｌ．（２０００）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ２４：１５７−１６２；Ｋｉｓｓｅｌｅｔａｌ．（２０００）ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１９：１３１２−１３２６），阻害される。Ｋｉｔ発現はまた，生殖能の劣る精巣においては正常な精巣組織より低いことが観察されている（Ｆｅｎｇｅｔａｌ．（１９９９）Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ＆Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ７１：８５−８９）。Ｋｉｔシグナリングは，卵子形成および小胞形成にも重要である（Ｐａｒｒｏｔｔ＆Ｓｋｉｎｎｅｒ（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４０：４２６２−４２７１；Ｄｒｉａｎｃｏｕｒｔｅｔａｌ．（２０００）ＲｅｖｉｅｗｓｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ５：１４３−１５２）。これらの知見は，Ｋｉｔキナーゼ阻害剤は，雄および雌の両方の生殖能を減少させるであろうことを示唆する。
【０００５】
Ｋｉｔは，肥満細胞機能の鍵となるメディエータとして，肥満細胞に関連する病理において役割を果たすかもしれない。例えば，肥満細胞は，ヒト腎臓同種移植片の慢性拒絶における間質性繊維症と関連づけられている（Ｐａｒｄｏｅｔａｌ．（２０００）ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈｉｖ４３７：１６７−１７２）。肥満細胞はまた，肝臓同種移植片拒絶（Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２９：１３３−１３９），および肥満細胞をリクルートするＳＣＦを肝星細胞が産生する肝臓繊維症（Ｇａｃａｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３０：８５０−８５８）における関与が示唆されている。これらの知見は，Ｋｉｔキナーゼ阻害剤が臓器拒絶および繊維症の予防を助けるかもしれないことを示唆する。
【０００６】
肥満細胞はまた，肥満細胞において不十分な変異型Ｋｉｔレセプターを有するマウスを用いる実験動物において多発性硬化症（Ｓｅｃｏｒｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ１９１：８１３−８２２）および虚血−再灌流障害（Ａｎｄｏｈｅｔａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１６：９０−９３）の病理における関与が示唆されている。いずれの場合も，疾病の病理は，正常なＫｉｔおよび肥満細胞集団を有するマウスと比較して，有意に弱体化していた。すなわち，これらの疾病における肥満細胞の役割は，Ｋｉｔキナーゼ阻害剤が有用な治療剤であるかもしれないことを示唆する。
【０００７】
細胞シグナル伝達は，細胞外の刺激が細胞の内部にリレーされ，次に多様な細胞プロセスを制御する基本的なメカニズムである。シグナル伝達の鍵となる生化学的メカニズムの１つには，蛋白質の可逆的リン酸化が関与する。ポリペプチドのリン酸化は，成熟蛋白質の構造および機能を変化させることによりその活性を制御する。リン酸は，ほとんどの場合，蛋白質中のセリン，トレオニン，またはチロシンアミノ酸のヒドロキシル基（−ＯＨ）に存在する。
【０００８】
細胞エフェクターのリン酸化を媒介する酵素は一般に２つの群に分けられる。第１の群は，アデノシン三リン酸から蛋白質基質にリン酸基を転移する蛋白質キナーゼからなる。第２の群は，ホスホリル蛋白質基質からのリン酸基を加水分解する蛋白質ホスファターゼからなる。蛋白質キナーゼと蛋白質ホスファターゼの逆の機能は，シグナル伝達プロセスにおけるシグナルの流れを平衡させ制御する。
【０００９】
蛋白質キナーゼおよび蛋白質ホスファターゼは，一般に２つのグループに分けられる：レセプターおよび非レセプタータイプの蛋白質。ほとんどのレセプタータイプ蛋白質チロシンホスファターゼは，２つの保存された触媒ドメインを含み，それぞれは，２４０アミノ酸残基のセグメントを包含する（Ｓａｉｔｏ，ｅｔａｌ．，１９９１，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆ．２：５９−６５）。レセプター蛋白質チロシンホスファターゼは，さらに，その細胞外ドメインのアミノ酸配列の多様性に基づいて副分類することができる（Ｓａｉｔｏ，ｅｔａｌ．，上掲；Ｋｒｕｅｇｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７４１７−７４２１）。
【００１０】
蛋白質キナーゼおよび蛋白質ホスファターゼはまた，これが作用するアミノ酸に基づいて，典型的には３つのクラスに分けられる。あるものはセリンまたはトレオニンのみでリン酸の付加または加水分解を触媒し，あるものはチロシンのみでリン酸の付加または加水分解を触媒し，あるものはセリン，トレオニン，およびチロシンのみでリン酸の付加または加水分解を触媒する。
【００１１】
チロシンキナーゼは，細胞増殖に関与する他の蛋白質キナーゼの触媒活性を制御することができる。不適切な活性を有する蛋白質キナーゼはまた，ある種の癌に関与する。異常に上昇したレベルの細胞増殖は，制御されない活性を有するレセプターおよび非レセプター蛋白質キナーゼと関連する。
【００１２】
蛋白質キナーゼは，細胞増殖におけるその役割に加えて，細胞分化プロセスに関与していると考えられている。細胞分化は，ある細胞においては，神経成長因子（ＮＧＦ）または表皮成長因子（ＥＧＦ）刺激によって生ずる。細胞分化は，急速な膜波打ち運動，細胞の平板化，および細胞接着の増加により特徴づけられる（Ｃｈａｏ，１９９２，Ｃｅｌｌ６８：９９５−９９７）。
【００１３】
疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は，蛋白質ポリペプチドの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。いくつかの小さい有機分子は蛋白質ポリペプチドの機能を調節する化合物の一群を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（ＰＣＴＷＯ９２／２０６４２），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴＷＯ９４／１４８０８），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル化合物（Ｌｅｖｉｔｚｋｉｅｔａｌ．米国特許５，２１７，９９９，表題"ＳｔｙｒｙｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｈｉｃｈＩｎｈｉｂｉｔＥＧＦＲｅｃｅｐｔｏｒＰｒｏｔｅｉｎＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅｓ，Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２０８／０５０），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴＷＯ９４／０３４２７），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴＷＯ９２／２１６６０），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴＷＯ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗｅｔａｌ）が挙げられる。
【００１４】
細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与された後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する可能性がある。しかし，これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは，蛋白質キナーゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【００１５】
癌を治療するための化合物の開発における著しい進歩にもかかわらず，当該技術分野においては，特定の蛋白質キナーゼの機能を調節することができる化合物を形成する特定の構造および置換パターンを同定することが求められている。
【００１６】
発明の概要
本発明は，部分的には，インドリノン化合物およびこれらの化合物を用いて蛋白質キナーゼの機能を調節する方法に関する。さらに，本発明は，本明細書に記載される方法により同定される化合物を用いて，生物において蛋白質キナーゼに関連する異常な状態を治療および予防する方法を記載する。さらに，本発明は，本発明の方法により同定される化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明は，ｃ−ｋｉｔファミリーのレセプター蛋白質キナーゼを強力に阻害するインドリノン化合物，および関連する製品および方法を特徴とする。ｃ−ｋｉｔ蛋白質キナーゼの他の阻害剤および／または活性化剤は，非置換インドリノン化合物（下記の式ＩおよびＩＩを参照）に化学置換基を付加することにより得ることができる。本発明の化合物は，１またはそれ以上の機能的ｃ−ｋｉｔ蛋白質キナーゼに関連する疾病の治療および／または予防を提供する。ある種のタイプの癌が，この種類の疾病に含まれ，さらに，肥満細胞の過剰生成または過剰刺激に関連するある種の免疫疾患も含まれる。化合物は，その標的に特異的であり，したがって，ほとんど副作用を引き起こさないように修飾することができる。これらの特性は，多数の副作用を引き起こして，心身に有害なように患者を弱らせる，現在用いられている癌治療剤からの著しい改良である。
【００１８】
本発明の化合物，組成物，および方法は，ｃ−ｋｉｔレセプター蛋白質キナーゼの活性を阻害することにより，ある種の固形腫瘍および白血病を最小化するか除去するであろう。あるいは，少なくとも腫瘍成長および／または転移を調節するか阻害するであろう。ある種の癌，例えば小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は，ｃ−ｋｉｔレセプター蛋白質キナーゼとｃ−ｋｉｔリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）の両方を発現する。
【００１９】
本発明を実施するためには，化合物がホスホチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）（例えば，貫膜チロシンキナーゼ成長因子レセプターであるｃ−ｋｉｔレセプターキナーゼ）を阻害するメカニズムを詳細に理解することは必要ではないが，化合物は，ＰＴＫの触媒領域のアミノ酸と相互作用すると考えられる。ＰＴＫは，典型的には二葉構造を有し，ＡＴＰはＰＴＫの間でアミノ酸が保存されている領域中の２つの葉の間の裂け目に結合するようである。ＰＴＫの阻害剤は，非共有結合的相互作用，例えば，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水性相互作用，およびイオン結合を介して，ＡＴＰがＰＴＫに結合するのと同じ一般的領域でＰＴＫに結合すると考えられる。より詳細には，本発明の化合物のオキシインドール成分（下記の式ＩＩＩを参照）は，ＡＴＰのアデニン環によって占められる一般的空間と同じ空間に結合すると考えられる。特定のＰＴＫに対するＰＴＫ阻害剤の特異性は，オキシインドールコアの周りの構成成分と個々のＰＫに特異的なアミノ酸ドメインとの間の相互作用により付与されるのであろう。すなわち，異なる置換基が特定のＰＫに対する優先的結合に寄与しているのであろう。選択された化合物は，異なるＡＴＰ結合部位において活性であるため，これらはそのような部位を有する任意の蛋白質，例えば蛋白質チロシンキナーゼのみならずセリン／トレオニンキナーゼをもターゲティングするのに有用であろう。すなわち，そのような化合物は，そのような蛋白質のインビトロアッセイにおいて，およびそのような蛋白質によるインビボでの治療効果において有用性を有する。例えば，上述したように，ある種の癌はｃ−ｋｉｔレセプター蛋白質キナーゼおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）の両方を発現し，この対はこれらの癌性細胞の成長を刺激するオートクリンループを構成することができる。したがって，ｃ−ｋｉｔ蛋白質キナーゼの阻害は，このオートクリンループを破壊し，このことにより腫瘍成長を遅らせ，および／またはアポトーシスの正常なメカニズムにより腫瘍を消滅させることができる。
【００２０】
すなわち，第１の観点においては，本発明は，生物において異常な状態を治療または予防する方法を提供する。異常な状態は，ｃ−ｋｉｔキナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用により媒介されるシグナル伝達経路の異常に関連する。該方法は，生物に治療上有効量のインドリノン化合物を投与することを含む。インドリノン化合物は，ｃ−ｋｉｔキナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用を調節する。したがって，この相互作用を促進するかまたは破壊する（好ましくは破壊する）ことは，そのような治療を必要とする所定の集団の患者に治療的有益性を有すると推定される。好ましい態様においては，ｃ−ｋｉｔキナーゼを介するシグナリングの量が異常であり，化合物はシグナリングを促進するかまたは破壊する。
【００２１】
"治療する"との用語は，治療効果を有し，生物において異常な状態を少なくとも部分的に緩和するかまたは排除することを表す。"治療する"との用語は，好ましくは，インドリノンを投与した患者の群において，インドリノンを投与していない対照群と比較して，異常な状態の症状を改善することを表す。治療の効果は，細胞表現型の変化または不変，細胞増殖の変化または不変，このｃ−ｋｉｔキナーゼの触媒活性の変化または不変，およびこの蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化または不変を測定することによりモニターすることができる。"治療する"または"治療"との用語は，必ずしも総合的な治癒を意味しない。疾病の任意の望ましくない症状を任意の程度に改良するか，または疾病の進行を遅らせることも，治療であると考えることができる。さらに，治療は，患者の全体的幸福感覚または外観を悪くするかもしれない作用を含んでいてもよい。例えば，癌患者に化学療法剤を投与することは，患者の感覚を"より体調が悪い"とするかもしれないが，これも治療であると考えられる。
【００２２】
本発明の文脈においては，上で用いられる"触媒活性"との用語は，蛋白質キナーゼが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，生成物に変換される基質の量を時間の関数として測定することにより測定することができる。基質のリン酸化は，蛋白質キナーゼの活性部位で生ずる。活性部位は，通常は基質が蛋白質キナーゼに結合し，リン酸化される空洞である。
【００２３】
上でまたは本明細書において用いられる場合，"基質"との用語は，蛋白質キナーゼによりリン酸化される分子を表す。基質は，好ましくはペプチドであり，より好ましくは蛋白質である。
【００２４】
"予防する"との用語は，異常な状態を獲得するかまたはこれを発達させる確率が減少することを表す。"予防する"との用語は，好ましくは，インドリノンを投与していない対照群と比較して，異常な状態を発達させる者のパーセンテージが減少することを表す。
【００２５】
"異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織において，その生物における正常な機能からはずれている機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，または細胞生存と関連しうる。異常な状態には，肥満細胞症，１またはそれ以上の肥満細胞腫瘍の存在，ぜん息，アレルギーに伴う慢性鼻炎，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，急性骨髄性白血病，急性リンパ性白血病，脊髄形成異常症候群，慢性骨髄性白血病，結腸直腸癌腫，胃癌腫，胃腸間質腫瘍，精巣癌，神経膠芽細胞腫，および星状細胞腫が含まれる。好ましい態様においては，これらの異常な状態，例えば肥満細胞腫瘍および肥満細胞症は，ヒト以外の生物において生じ，獣医学の実施の間に予防または治療することができる。
【００２６】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化または排除されている状態に関連する。多くの蛋白質キナーゼがアポトーシス経路に関連している。いずれか１つの蛋白質キナーゼの機能の異常は，細胞の不死化または未成熟細胞死につながりうる。
【００２７】
上述の蛋白質キナーゼに関して用いる場合，"機能"との用語は，蛋白質キナーゼ，好ましくはｃ−ｋｉｔキナーゼの細胞における役割を表す。蛋白質キナーゼファミリーは，シグナリングカスケード，例えば，細胞成長，移動，分化，遺伝子発現，筋肉収縮，グルコース代謝，細胞蛋白質合成，および細胞サイクルの制御等を調節するカスケードにおける多くの段階を制御するメンバーを含む。通常，膜レセプターキナーゼの"機能"は，細胞の膜の外からのシグナルを細胞の内部に伝達することである。これを行うために，膜レセプターキナーゼは，以下の他の機能の１または全てを行うことができる：リガンドに結合する，別の膜レセプターキナーゼと二量体を形成する，細胞内の他の蛋白質をリン酸化する，細胞内の他の蛋白質に結合する，細胞中における蛋白質の局在を引き起こす。
【００２８】
"生物"との用語は少なくとも１つの細胞からなる任意の生きているものに関する。生物は，１つの真核生物細胞程度の単純なものであってもよく，哺乳動物等の複雑なものであってもよい。生物は好ましくは哺乳動物であり，より好ましくはヒトである。
【００２９】
"哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾サルを表す。好ましい態様においては，哺乳動物に関連する異常な状態には，肥満細胞症，および１またはそれ以上の肥満細胞腫瘍の存在が含まれる。
【００３０】
"異常"との用語は，生物において過剰発現または過少発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，蛋白質キナーゼ，例えばｃ−ｋｉｔキナーゼを表す。好ましくは，異常には，天然の結合パートナーと相互作用する際の過剰なまたは不十分なシグナリングが関与する。
【００３１】
"シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播して，細胞内シグナルとする分子を表す。このシグナルは，次に細胞の応答を刺激することができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子には，レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有する蛋白質，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ²⁺結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子，および転写因子が含まれる。
【００３２】
"媒介される"との用語は，シグナル伝達経路の異常に及ぼすｃ−ｋｉｔキナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の制御または影響における関与を表す。すなわち，異常を有し，かつ異常な状態と関連するシグナル伝達経路は，天然の結合パートナーと相互作用するｃ−ｋｉｔキナーゼを含む。
【００３３】
ｃ−ｋｉｔキナーゼ分子の"相互作用"とは，そのｃ−ｋｉｔキナーゼ分子と天然の結合パートナーまたは細胞内の分子との結合，ｃ−ｋｉｔキナーゼ分子による他の蛋白質または細胞内の分子のリン酸化，または細胞中におけるｃ−ｋｉｔキナーゼの他のいずれかの結合を表す。これらの相互作用には，非共有結合的相互作用，例えば，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水性相互作用，およびイオン結合が含まれる。
【００３４】
"ｃ−ｋｉｔキナーゼ"との用語は，好ましくは幹細胞因子（ＳＣＦ）がその細胞外ドメインに結合すると活性化される膜レセプター蛋白質チロシンキナーゼを表す（Ｙａｒｄｅｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｑｉｕｅｔａｌ．，１９８８）。レセプターチロシンキナーゼであるｃ−ｋｉｔキナーゼは，細胞外ドメインおよび細胞質"スプリット"キナーゼドメインに５つの免疫グロブリン様モチーフを含む（図１）。ｃ−ｋｉｔキナーゼの全長アミノ酸配列は，好ましくは以下に記載されるものである：Ｙａｒｄｅｎ，ｅｔａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯＪ．１１：３３４１−３３５１；およびＱｉｕ，ｅｔａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯＪ．７：１００３−１０１１（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。変異型のｃ−ｋｉｔキナーゼは，"ｃ−ｋｉｔキナーゼ"との用語に含まれ，例えば，次の２つの種類に分類されるものを含む：（１）ヒトｃ−ｋｉｔキナーゼのコドン８１６または他の種における同等の位置に一アミノ酸置換を有するもの（Ｍａｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．ＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ１１２：１６５−１７０），および（２）蛋白質の推定膜近傍のｚ−ヘリックスが関与する変異を有するもの（Ｍａ，ｅｔａｌ．，１９９９，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７４：１３３９９−１３４０２）。これらの刊行物はいずれも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【００３５】
"天然の結合パートナー"との用語は，細胞において蛋白質キナーゼに結合するポリペプチドまたはＡＴＰ等の化合物を表す。天然の結合パートナーは，蛋白質キナーゼシグナル伝達プロセスにおいてシグナルを伝播する役割を果たすことができる。蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，または蛋白質キナーゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として現れることができる。
【００３６】
"治療上有効量"とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するか，または治療対象の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。癌の治療に関して"治療上有効量"は，以下の１またはそれ以上の結果を引き起こすのに十分な量を表す：癌の大きさを減少させる，癌の転移を阻害する，癌の成長を阻害する，癌の成長を停止させる，癌による不快を軽減する，または癌に苦しむ患者の生存を長くする。癌以外の細胞増殖性疾患の治療に関して，"治療上有効量"とは，以下の１またはそれ以上の結果を引き起こすのに十分な量を表す：疾患を引き起こす細胞の成長を阻害する，疾患による不快を軽減する，または疾患に罹患した患者の生存を長くする。
【００３７】
"インドリノン"との用語は，この用語が当該技術分野において一般に理解されているように用いられ，アルデヒド成分とオキシインドール成分から合成することができる置換または非置換化合物の大きなサブクラスを含む。好ましい態様においては，本発明の方法に含まれるインドリノンは，式ＩおよびＩＩの構造（下記を参照）を有し，より好ましくは化合物１−１３から選択される（下記を参照）。
【００３８】
代表的なインドリノン化合物およびその合成は，以下の出願に記載されている：（１）ＰＣＴ出願ＵＳ９９／０６４６８（１９９９年３月２６日出願，Ｆｏｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧＴＹＲＯＳＩＮＥＰＲＯＴＥＩＮＫＩＮＡＳＥ"（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３１／２５０ＰＣＴ），（２）米国特許仮出願６０／１３１，１９２（１９９９年４月２６日出願，Ｔａｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"ＤＩＡＲＹＬＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳＡＳＫＩＮＡＳＥＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ"（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３９／２０５），（３）米国特許仮出願６０／１３２，２４３（１９９９年５月３日出願，Ｔａｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"ＳＹＮＴＨＥＳＩＳＯＦ４−ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤＯＸＩＮＤＯＬＥＡＮＤＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳＡＮＤＴＨＥＩＲＵＳＥＩＮＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＤＥＳＥＡＳＥＳ"（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３１／２５１），（４）米国特許出願０９／２８３，６５７（１９９９年４月１日出願，Ｔａｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧＴＹＲＯＳＩＮＥＰＲＯＴＥＩＮＫＩＮＡＳＥＦＵＮＣＴＩＯＮＷＩＴＨＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳ"（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２４１／１８０），および（５）米国特許５，７９２，７８３（１９９８年８月１１日発行，Ｔａｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"３−ＨＥＴＥＲＯＡＲＹＬ−２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳＦＯＲＴＨＥＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＤＥＳＥＡＳＥＳ"）。これらは図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【００３９】
好ましくは，本発明において用いられる化合物は，式Ｉ：
【化９】

［式中，
（ａ）Ｙは，酸素，イオウおよび水素で置換されている窒素からなる群より選択され；
（ｂ）Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，およびＲ₄は，それぞれ独立して，水素，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，トリハロメチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ₂ＮＲＲ’，ＳＯ₃Ｒ，ＳＲ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，ＯＨ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択され；
（ｃ）Ｒ₅は，水素，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，トリハロメチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ₂ＮＲＲ’，ＳＯ₃Ｒ，ＳＲ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，ＯＨ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，ＣＯＮＲＲ’，１または２個のＮ，Ｏ，またはＳ原子を含む６員のヘテロアリール環系；および６員のアリール環系からなる群より選択され；および
（ｃ）Ｒ₆およびＲ₇は，それぞれ，独立して，水素，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，トリハロメチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ₂ＮＲＲ’，ＳＯ₃Ｒ，ＳＲ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，ＯＨ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，およびＣＯＮＲＲ’からなる群より選択され，ここでＲは種々の置換基であることができる］
に記載される構造を有する。
【００４０】
より好ましくは，本発明において用いられる化合物は，式ＩＩ：
【化１０】

［式中，
（ａ）Ｙは，イオウおよび水素で置換されている窒素からなる群より選択され；
（ｂ）Ｒ₁は，水素およびメチルからなる群より選択され；
（ｃ）Ｒ₂は，
（ｉ）水素；
（ｉｉ）塩素；
（ｉｉｉ）臭素；
（ｉｖ）式−ＣＯ−ＣＨ₃のケトン；
（ｖ）式−ＳＯ₂ＮＨ₂，または−ＳＯ₂ＮＣＨ₃ＣＨ₃のスルホンアミド；
からなる群より選択され；
（ｄ）Ｒ₃，Ｒ₄，およびＲ₅は，それぞれ独立して，
（ｉ）水素；
（ｉｉ）メチル；
（ｉｉｉ）式−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨのカルボン酸；および
（ｉｖ）Ｒ₈およびＲ₉は，一緒になって，６員の飽和炭素環を形成する；
からなる群より選択される］
に記載される構造を有する。
【００４１】
より好ましくは，化合物は以下のいずれかである：
化合物１：
【化１１】

化合物２：
【化１２】

化合物３：
【化１３】

化合物４：
【化１４】

化合物５：
【化１５】

化合物６：
【化１６】

化合物７：
【化１７】

化合物８：
【化１８】

化合物９：
【化１９】

化合物１０：
【化２０】

化合物１１：
【化２１】

化合物１２：
【化２２】

化合物１３：
【化２３】

化合物１４：
【化２４】

化合物１５：
【化２５】

化合物１６：
【化２６】

【００４２】
"オキシインドール"との用語は，化学置換基で置換されているオキシインドール化合物を表す。オキシインドール化合物は式ＩＩＩで示される一般構造の化合物である：
【化２７】

【００４３】
本発明に関して，"置換された"との用語は，任意の数の化学置換基で誘導化されたオキシインドール化合物を表す。
【００４４】
本発明のインドリノン化合物は，好ましくは，インビトロで蛋白質チロシンキナーゼの活性を調節する。これらの化合物は，好ましくは，問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイ（例えば，以下の実施例に記載されるアッセイ）において陽性の結果を示す。本発明のインドリノン化合物により調節される蛋白質チロシンキナーゼは，好ましくはｃ−ｋｉｔキナーゼである。そのような調節の方法および結果は，以下の実施例に記載される。
【００４５】
"化合物"との用語は，任意の同定可能な分子またはその薬学的に許容しうる塩，エステル，アミド，プロドラッグ，異性体，または代謝産物を意味する。
【００４６】
"プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に変換される薬剤を表す。プロドラッグは，場合により親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが，親薬剤はそうではないかもしれない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定されないが，エステル（"プロドラッグ"）として投与されて，水溶性であることが不利である細胞膜の通過を容易にし，次に，水溶性であることが有利である細胞内に入った後，代謝的に加水分解されて活性物質であるカルボン酸となるような，本発明の化合物であろう。
【００４７】
プロドラッグの別の例は，短いポリペプチド，例えば，限定されないが，末端アミノ基を介して本発明の化合物のカルボキシ基に結合した２−１０アミノ酸のポリペプチドであろう。ポリペプチドは，インビボで代謝されて活性分子を放出する。
【００４８】
"調節する"との用語は，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，蛋白質キナーゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，より好ましくは，蛋白質キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存して蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させ，最も好ましくは，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を減少させる。調節剤は，好ましくは蛋白質キナーゼの触媒活性を活性化し，より好ましくは蛋白質キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存して，蛋白質キナーゼの触媒活性を活性化または阻害し，最も好ましくは蛋白質キナーゼの触媒活性を阻害する。
【００４９】
"複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合体を表す。シグナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を含む。
【００５０】
"活性化する"との用語は，蛋白質キナーゼの機能を増加させることを表す。蛋白質キナーゼの機能は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用であり，最も好ましくは触媒活性である。
【００５１】
"阻害する"との用語は，蛋白質キナーゼの機能を低下させることを表す。蛋白質キナーゼの機能は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用であり，最も好ましくは触媒活性である。
【００５２】
蛋白質キナーゼの天然の結合パートナーは，蛋白質キナーゼの細胞外または細胞内領域に高い親和性をもって結合することができる。高い親和性とは，１０^-6Ｍのオーダーまたはそれより低い平衡結合定数を表す。さらに，天然の結合パートナーはまた，蛋白質キナーゼの細胞外または細胞内領域と過渡的に相互作用して，これを化学的に修飾することができる。蛋白質キナーゼの天然の結合パートナーは，限定されないが，ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）または３（ＳＨ３）ドメイン，他のホスホリルチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン，グアニンヌクレオチド交換因子，蛋白質ホスファターゼ，他の蛋白質キナーゼ，およびＡＴＰ等の化合物等から選択される。蛋白質キナーゼとその天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化を検出する方法は，当該技術分野において容易に利用可能である。
【００５３】
"・・・に関連する"との用語は，生物から単離された同じ非疾病組織と比較したときに，不適切なｃ−ｋｉｔキナーゼ発現を伴うことが示されている疾病を表す。不適切な発現とは，正常な活性の上昇，正常な活性の低下，または通常は見いだされないｃ−ｋｉｔキナーゼ活性の存在でありうる。
【００５４】
"インビトロ"との用語は，ｃ−ｋｉｔキナーゼ酵素を生きた生物の外で本発明に有用な化合物で試験し，このことによりそのような化合物を有効性についてスクリーニングする場合を表す。"インビトロ"との用語には，組織培養細胞の使用が含まれる。
【００５５】
"異常な相互作用を促進するかまたは破壊する"との用語は，本発明の化合物を細胞または生物の組織に投与することにより達成することができる方法を表す。化合物は，複合体界面において多数の原子と望ましい相互作用を形成することにより，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用を促進することができる。あるいは，化合物は，複合体表面において原子間に形成される望ましい相互作用に欠陥を生じさせることにより，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害することができる。好ましい態様においては，異常な相互作用の促進または破壊は，本発明の化合物が蛋白質の１つのコンフォメーション変化を促進することを表す。
【００５６】
別の観点においては，本発明は，本明細書に記載されるインドリノン化合物，特に上述の式Ｉのインドリノン，とりわけ化合物１−１３の合成に関する。代表的なインドリノン化合物の合成の一般的スキームは，ＰＣＴ公開ＵＳ９９／０６４６８（１９９９年３月２６日出願，Ｆｏｎｇｅｔａｌ．，表題"ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧＴＹＲＯＳＩＮＥＰＲＯＴＥＩＮＫＩＮＡＳＥＳ"（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３１／２５０ＰＣＴ））および米国特許５，７９２，７８３（１９９８年８月１１日発行，Ｔａｎｇｅｔａｌ．，表題"３−ＨＥＴＥＲＯＡＲＹＬ−２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳＦＯＲＴＨＥＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＤＥＳＥＡＳＥＳ"）に記載されており，これらは図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。当業者は，上述の文献を精査することにより，いずれのオキシインドールおよびいずれのアルデヒドをいずれの適当な条件下で反応させて，本発明の化合物を得るかを理解するであろう。
【００５７】
本発明はまた，ｃ−ｋｉｔキナーゼの機能を調節するインドリノン化合物，またはその薬学的に許容しうる塩，エステル，アミド，プロドラッグ，異性体，または代謝産物等の化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は，以下の工程を含む：（ａ）ｃ−ｋｉｔキナーゼを発現する細胞を化合物と接触させ；そして（ｂ）細胞に及ぼす影響をモニターする。細胞に及ぼす影響は，本明細書に記載されるように，好ましくは細胞表現型の変化または不変であり，より好ましくは細胞増殖の変化または不変であり，さらに好ましくはｃ−ｋｉｔキナーゼ触媒活性の変化または不変であり，最も好ましくはｃ−ｋｉｔキナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化または不変である。
【００５８】
"モニターする"との用語は，本発明の方法の細胞に化合物を加える影響を観察することを表す。"モニターする"ことは，試験細胞を対照細胞と比較することにより行うことができる。
【００５９】
"影響"との用語は，細胞表現型または細胞増殖の変化または不変を記述する。"影響"はまた，プロｃ−ｋｉｔキナーゼの触媒活性の変化または不変を記述してもよい。"影響"はまた，ｃ−ｋｉｔキナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化または不変を記述してもよい。
【００６０】
"細胞表現型"との用語は，細胞もしくは組織の外観または細胞もしくは組織の機能を表す。細胞表現型の例は，細胞サイズ（減少または拡大），細胞増殖（細胞数の増加または減少），細胞分化（細胞形状，細胞機能，または蛋白質発現の相違の変化または不変），細胞生存，アポトーシス（細胞死），または代謝性栄養の利用（例えばグルコース取り込み）である。細胞表現型の変化または不変は，当該技術分野において知られる手法により容易に測定することができる。
【００６１】
好ましい態様においては，本発明は，本発明のインドリノン同定する方法を特徴とする。該方法は以下の工程を含む：（ａ）細胞を溶解させてｃ−ｋｉｔキナーゼを含む溶解物とし；（ｂ）ｃ−ｋｉｔキナーゼを抗体に吸着させ；（ｃ）吸着したｃ−ｋｉｔキナーゼを基質とともにインキュベートし；そして（ｄ）検出抗体をｃ−ｋｉｔキナーゼに吸着させる。次に，キナーゼに及ぼす影響をモニターする。キナーゼの影響をモニターする工程は，ｃ−ｋｉｔキナーゼに取り込まれたリン酸濃度を測定することを含む。
【００６２】
"抗体"との用語は，ｃ−ｋｉｔキナーゼまたはそのフラグメントまたはホスホチロシンに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナルまたはポリクローナル抗体），または抗体フラグメントを表す。
【００６３】
"特異的結合親和性"とは，特定の条件下で，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって標的（ｃ−ｋｉｔキナーゼ）ポリペプチドに結合する抗体を意味する。ｃ−ｋｉｔキナーゼに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫複合体が形成されるような条件下で試料を抗体と接触させ，そしてｃ−ｋｉｔキナーゼにコンジュゲートした抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中におけるｃ−ｋｉｔキナーゼの存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーと放射性同位体等の標識とのコンジュゲートを有する第２の容器を含むよう構築することができる。診断キットはまたＦＤＡに認可された使用の通知書およびその指針を含んでいてもよい。
【００６４】
"ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクローナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫することができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増加させることができる。
【００６５】
"モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団である。モノクローナル抗体は，連続培養細胞株による抗体分子の生成を与える任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０）。
【００６６】
"抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００６７】
上述の本発明の概要は非限定的なものであり，本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００６８】
図面の簡単な説明
図１は，ｃ−ｋｉｔキナーゼの細胞外ドメインおよび細胞質"スプリット"キナーゼドメインにおける５つの免疫グロブリン様モチーフを示す概略図である。ハーフループは免疫グロブリン様モチーフを表し，影付きボックスはレセプターの保存されたキナーゼ領域を表す。
【００６９】
図２は，実験の節の実施例１に記載されるＥＬＩＳＡにより測定した，インドリノン誘導体がｃ−ｋｉｔキナーゼの活性に及ぼす影響を示す。
【００７０】
発明の詳細な説明
本発明は，細胞シグナル伝達，好ましい態様においてはｃ−ｋｉｔキナーゼシグナル伝達を，制御および／または調節することができる方法，化合物および組成物に関する。
【００７１】
レセプターキナーゼにより媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因子（リガンド）との細胞外相互作用により開始され，続いてレセプターの二量化，固有の蛋白質キナーゼ活性の過渡的刺激，およびリン酸化が生ずる。このことにより，細胞内シグナル伝達分子の結合部位が形成され，適切な細胞応答（例えば，細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝性の影響）を促進する一群の細胞質シグナリング分子との複合体の形成につながる。ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒａｎｄＵｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ９：３０３−３９１を参照。
【００７２】
キナーゼシグナル伝達により，他の応答の中でも特に，細胞増殖，分化および代謝が生ずる。異常な細胞増殖により，新生物の発達等の広範な種類の疾患および疾病，例えば，癌腫，肉腫，白血病，神経膠芽細胞腫，血管腫，乾癬，動脈硬化症，関節炎および糖尿病性網膜症（制御されない新脈管形成および／または脈管形成に関連するまたは他の疾患）が生ずる。
【００７３】
したがって，本発明は，レセプターキナーゼの酵素活性に影響を与え，そのような蛋白質により伝達されるシグナルを妨害することにより，キナーゼシグナル伝達を制御，調節および／または阻害する方法，化合物，および組成物に関する。より詳細には，本発明は，多くの種類の固形腫瘍および白血病，例えば，限定されないが，癌腫，肉腫，赤芽球腫，神経膠芽細胞腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫および筋原細胞腫を治すための治療方法として，ｃ−ｋｉｔレセプターチロシンキナーゼおよび／または他のキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路を制御，調節および／または阻害する方法，化合物および組成物に関する。適応症には，限定されないが，肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌の両方を含む），脳癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，および骨癌が含まれる。本発明はまた肥満細胞の過剰発現または肥満細胞の不適切なアップレギュレーションにより特徴づけられる病気，例えば，限定されないが，肥満細胞症，およびアレルギーに伴う慢性鼻炎，炎症およびぜん息の治療および／または予防に関する。これらの病気は以下により詳細に説明する。
【００７４】
Ｉ．本発明の化合物により治療すべき標的疾病
本明細書に記載される化合物は，制御されないキナーゼシグナル伝達に関連する疾患，例えば，細胞増殖性疾患，繊維性疾患および代謝性疾患の治療に有用である。本発明により治療することができるかまたはさらに研究することができる細胞増殖性疾患には，癌および肥満細胞増殖性疾患が含まれる。
【００７５】
ＰＴＫは，そのような細胞増殖性疾患と関連づけられている。例えば，レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのあるメンバーは，癌の発達と関連づけられている。これらのレセプターのいくつか，例えばＥＧＦＲ（Ｔｕｚｉ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６３：２２７−２３３；Ｔｏｒｐ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＡＰＭＩＳ１００：７１３−７１９），ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：７０７−７１２）およびＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ７：６２７−６３３）は，多くの腫瘍において過剰発現されているか，および／またはオートクリンループにより持続的に活性化されている。実際，最も一般的な重症の癌においては，これらのレセプターの過剰発現（ＡｋｂａｓａｋａｎｄＳｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１１：１１９−１３３；Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔａｌ．，１９９２，ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔＲｅｓ．６１：２４９−２７３；Ｋｏｒｃ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１３５２−１３６０）およびオートクリンループ（ＬｅｅａｎｄＤｏｎｎｇｈｕｅ，１９９２，Ｉ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１８：１０５７−１０７０；Ｋｏｒｃ，ｅｔａｌ．，上掲；ＡｋｂａｓａｋａｎｄＳｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ，ｅｔａｌ．，上掲）が示されている。例えば，ＥＧＦＲレセプターは，扁平上皮癌，星状細胞腫，神経膠芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌および膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ２は，乳，卵巣，胃，肺，膵臓および膀胱癌と関連づけられている。ＰＤＧＦ−Ｒは，神経膠芽細胞腫，肺，卵巣，黒色腫および前立腺癌と関連づけられている。
【００７６】
ｃ−ｋｉｔレセプターキナーゼは，そのような細胞増殖性疾患と関連づけられている。例えば，ｃ−ｋｉｔキナーゼレセプターは，調べたＳＣＬＣ細胞の半分以上でそのリガンドＳＣＦとともに異常に発現されていることが見いだされている（Ｈｉｂｉ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６：２２９１−２２９６）。おそらく，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は，ＳＣＬＣを有する患者の長期生存を改善するであろう。
【００７７】
以下に記載されるように，ｃ−ｋｉｔＲＴＫおよび／またはＳＣＦの存在はまた，他のタイプの癌とも関連づけられている。しかし，ＲＴＫの異常と疾病との関連性は癌に限られない。例えば，ｃ−ｋｉｔレセプターキナーゼは，免疫疾病，例えば，肥満細胞症，ぜん息および慢性鼻炎と関連づけられている。ｃ−ｋｉｔの過剰な活性化は，肥満細胞の数の過剰により生ずる疾病と関連するであろう。肥満細胞症は，過剰な肥満細胞増殖により特徴づけられる異質の一連の疾患を記述するために用いられる用語である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，１９９１，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ９３：２Ｓ−４Ｓ；Ｖａｌｅｎｔ，１９９６，Ｗｅｉｎ／ＫｌｉｎＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ１０８：３８５−３９７；およびＧｏｌｋａｒ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ３４９：１３７９−１３８５）。上昇したｃ−ｋｉｔ発現は，侵略的な肥満細胞症を有する患者の肥満細胞に見られるが，無活動性の肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞には見られないことが報告されている（Ｎａｇａｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ１２：１７５−１８１）。
【００７８】
さらに，肥満細胞および好酸球は，アレルギー，炎症およびぜん息に関与する鍵となる細胞である（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ２７：５９３−５９７；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ７７：１０３３−１０７９；Ｈｏｌｇａｔｅ，１９９７，ＣＩＢＡＦｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．；Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ２７８：１８４２−１８４８およびＣｏｓｔａ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ２７８：１８１５−１８２２）。ＳＣＦ，したがってｃ−ｋｉｔは，肥満細胞および好酸球の両方の活性化を直接的および間接的に制御し，このことにより，多数のメカニズムを介して，アレルギーおよびぜん息に関与する主な細胞に影響を与える。肥満細胞および好酸球機能のこの相互的制御，およびＳＣＦがこの制御において果たす役割のため，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害はアレルギーに伴う慢性鼻炎，炎症およびぜん息を治療する手段を提供するであろう。
【００７９】
ＩＩ．ｃ−ｋｉｔキナーゼ
ｃ−ｋｉｔキナーゼは，メラノサイト，肥満細胞，胚細胞および造血細胞の発達に重要な役割を果たす。Ｓｌ遺伝子座によりコードされる蛋白質は，これを同定するために用いられた生物学的特性に基づいて，ｋｉｔリガンド（ＫＬ），幹細胞因子（ＳＣＦ）または肥満細胞成長因子（ＭＧＦ）と称されてきた（概説として，Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，１９９６，ＰａｔｈｏｌＩｎｔ４６：９３３−９３８；Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１５３：３３７−３４４；Ｖｌｉａｇｏｆｔｉｓ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ１００：４３５−４４０；Ｂｒｏｕｄｙ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ９０：１３４５−１３６４；Ｐｉｇｎｏｎ，１９９７，ＨｅｒｍａｔｏｌＣｅｌｌＴｈｅｒ３９：１１４−１１６；およびＬｙｍａｎ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９１：１１０１−１１３４．）。簡単のために，ここではｃ−ｋｉｔＲＴＫのリガンドを表すためにＳＣＦを用いる。ＳＣＦは，エクソン６をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより分子量２２０または２４８ダルトンの貫膜蛋白質として合成される。大きい方の蛋白質は，蛋白質加水分解的に切断されて，可溶性のグリコシル化された蛋白質を形成することができ，これは非共有結合的に二量体を形成する。可溶性および膜結合型のＳＣＦは，両方ともｃ−ｋｉｔに結合してこれを活性化することができる。例えば，皮膚においては，ＳＣＦは主として繊維芽細胞，ケラチノサイト，および内皮細胞において発現され，ｃ−ｋｉｔを発現するメラノサイトおよび肥満細胞の活性を調節する。骨においては，骨髄間質細胞がＳＣＦを発現し，ｃ−ｋｉｔを発現する幹細胞の造血を制御する。胃腸管においては，腸上皮細胞がＳＣＦを発現し，カハル腸細胞および上皮内リンパ球に影響を与える。精巣においては，セルトーリ細胞および顆粒膜細胞がＳＣＦを発現し，これは胚細胞のｃ−ｋｉｔと相互作用することにより精子形成を制御する。
【００８０】
ａ．ｃ−ｋｉｔキナーゼおよび／またはＳＣＦが関与する本発明の標的悪性腫瘍
ｃ−ｋｉｔの異常な発現および／または活性化は，種々の腫瘍における関与が示唆されている。新生物病理学に対するｃ−ｋｉｔの寄与の証拠には，白血病および肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，胃腸管のある種の癌，および中枢神経系との関連性が含まれる（下記を参照）。さらに，ｃ−ｋｉｔは，雌生殖管の発癌（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔａｌ．，１９９４，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４（１１）：３０４９−３０５３），神経外胚葉由来の肉腫（Ｒｉｃｏｔｔｉ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９１：２３９７−２４０５），および神経線維腫症に伴うシュヴァン細胞新生物（Ｒｙａｎ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．３７：４１５４３２）において役割を果たすことが示唆されている。
【００８１】
白血病：ＳＣＦのｃ−ｋｉｔＲＴＫへの結合は，造血幹細胞および先祖細胞をアポトーシスから保護し（Ｌｅｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２１１−３２１９），このことにより，コロニー形成および造血に寄与する。ｃ−ｋｉｔの発現は，急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において頻繁に見られるが，急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）においてはあまり一般的ではない（概説として，Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｈａｅｍａｔ８２：６１７６２１；Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈ．３０：４５９−４６６を参照）。ｃ−ｋｉｔは大部分のＡＭＬ細胞で発現されているが，この発現は疾病の進行の前兆ではないようである（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｈａｅｍａｔ８２：６１７−６２１）。しかし，ＳＣＦはＡＭＬ細胞を化学療法剤により誘導されるアポトーシスから保護した（Ｈａｓｓａｎ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ａｃｔａ．Ｈｅｍ．９５：２５７−２６２）。本発明によるｃ−ｋｉｔの阻害は，これらの薬剤の効力を増強し，ＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘導するかもしれない。
【００８２】
脊髄形成異常症候群（Ｓａｗａｄａ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ８８：３１９−３２７）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｓａｗａｉ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２：１１６−１２２）を有する患者からの細胞のクローン成長は，ＳＣＦと他のサイトカインとの組み合わせにより著しく促進されることが見いだされている。ＣＭＬは，骨髄のフィラデルフィア染色体陽性細胞の増殖により特徴づけられる（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋ．１２：１３６−１３８）。これは，主としてアポトーシス性死の阻害に起因するようである（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃ．９：３−７）。フィラデルフィア染色体の産物であるｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬは，アポトーシスの阻害を媒介することが報告されている（Ｂｅｄｉ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ８６：１１４８−１１５８）。ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬおよびｃ−ｋｉｔＲＴＫは，両方ともアポトーシスを阻害し，ｐ６２ｄｋが基質として示唆されているため（Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ８８：１９７−２０４），これらのキナーゼにより媒介されるクローン増殖は共通のシグナリング経路を介して生ずる可能性がある。しかし，ｃ−ｋｉｔはまた，ｐ２１ｏＢＣＲ−ＡＢＬと直接相互作用すると報告されている（Ｈａｌｌｅｋ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：５−１６）。このことは，ｃ−ｋｉｔがＣＭＬ病理学においてより大きな原因的役割を有するかもしれないことを示唆する。したがって，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は上述の疾患の治療に有用であることが明らかとなるであろう。
【００８３】
胃腸癌：正常な結腸直腸粘膜はｃ−ｋｉｔを発現しない（Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔａｌ，１９９７，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。しかし，ｃ−ｋｉｔは，結腸直腸癌腫において頻繁に発現されており（Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１），いくつかの結腸癌腫細胞株においてＳＣＦおよびｃ−ｋｉｔのオートクリンループが観察されている（Ｔｏｙｏｔａ，ｅｔａｌ．，１９９３，ＴｕｒｎＢｉｏｌ１４：２９５−３０２；Ｌａｈｍ，ｅｔａｌ．，１９９５，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ６：１１１１−１１１８；Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。さらに，中和抗体を用いるオートクリンループの破壊（Ｌａｈｍ，ｅｔａｌ．，１９９５，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ．６：１１１１−１１１８）およびｃ−ｋｉｔおよび／またはＳＣＦのダウンレギュレーションは，細胞増殖を阻害する（Ｌａｈｍ，ｅｔａｌ．，１９９５，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ６：１１１１−１１１８；Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。
【００８４】
胃癌腫細胞株においてＳＣＦ／ｃ−ｋｉｔオートクリンループが観察されており（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｂｌｏｏｄ８０：３７４−３８１；Ｈａｓｓａｎ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｄｉｇｅｓｔ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ４３：８１４），構成的ｃ−ｋｉｔ活性化もまた胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴには重要であるようである）。ＧＩＳＴは消化系の最も一般的な間葉腫瘍である。ＧＩＳＴの９０％以上がｃ−ｋｉｔを発現しており，このことは，これらの腫瘍細胞の推定起源がカハルの腸細胞（ＩＣＣ）であることと一致する（Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：５７７−５８０）。ＩＣＣは胃腸管の収縮を制御していると考えられており，ＩＣＣでｃ−ｋｉｔを欠失している患者は筋障害性型の慢性特発性腸偽閉塞を示した（Ｉｓｏｚａｋｉ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆＧａｓｔ．９３３２−３３４）。何人かの異なる患者からのＧＩＳＴにおいて発現されるｃ−ｋｉｔは，このＲＴＫの構成的活性化につながる細胞内膜近傍ドメインにおいて変異を有することが観察された（Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：５７７−５８０）。したがって，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの癌の治療の有効な手段であろう。
【００８５】
精巣癌：雄の胚細胞腫瘍は，歴史的に，胚細胞の特徴を保持するセミノーマ，および胎生期分化の特徴を示すことができる非セミノーマに分類されている。セミノーマおよび非セミノーマは両方とも，癌腫インサイチュウー（ＣＩＳ）と称される前侵襲段階から開始されると考えられている（Ｍｕｒｔｙ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１３３−１４４）。ｃ−ｋｉｔおよびＳＣＦは両方とも，胚形成の間の正常な生殖腺の発達に必須であると報告されている（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１５３：３３７−３４４）。レセプターまたはリガンドのいずれかが欠損すると，胚細胞のない動物が得られる。出生後試験においては，ｃ−ｋｉｔはライディヒ細胞および精原細胞において発現しているが，ＳＣＦはセルトーリ細胞において発現していることが見いだされている（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１５３：３３７−３４４）。ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）Ｅ６およびＥ７オンコジンを発現するトランスジェニックマウスにおいては，ライディヒ細胞から高い頻度で精巣腫瘍が発達する（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３３３５−３３３９；Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｕｒａｌ１５２：２１５１−２１５４）。これらの腫瘍では，ｃ−ｋｉｔおよびＳＣＦの両方が発現しており，機能的ｐ５３の細胞からの欠失，およびＥ６およびＥ７との結合により生ずる網膜芽細胞腫遺伝子産物と関連する（Ｄｙｓｏｎ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：９３４−９３７；Ｗｅｒｎｅｓｓ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：７６−７９；Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ６３：１１２９−１１３６）オートクリンループが発癌に寄与しているかもしれない（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０：３４１−３４７）。ＳＣＦ（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０：３４１−３４７）またはｃ−ｋｉｔ（Ｌｉ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６：４３４３−４３４６）の欠陥シグナリング変異体は，ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７を発現するマウスにおいて精巣腫瘍の形成を阻害した。ｃ−ｋｉｔキナーゼ活性化は，これらの動物における腫瘍発生に重要であり，したがって，本発明によるｃ−ｋｉｔキナーゼ経路の調節は，そのような疾患を予防または治療するであろう。
【００８６】
胚細胞腫瘍におけるｃ−ｋｉｔの発現は，レセプターは癌腫の大部分でインシトゥーで，およびセミノーマで発現されているが，ｃ−ｋｉｔは少数の非セミノーマでのみ発現されていることを示す（Ｓｔｒｏｈｍｅｙｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５１：１８１１−１８１６；Ｒａｊｐｅｒｔ−ｄｅＭｅｙｔｓ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１７：８５−９２；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：２５３−２５８；Ｓｔｒｏｈｍｅｙｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５３：５１１−５１５；Ｂｏｋｅｎｍｅｙｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃａｎｃｅ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２：３０１−３０６；Ｓａｎｄｌｏｗ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１７：４０３−４０８）。したがって，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの疾患を治療する貴重な新たな手段を提供するであろう。
【００８７】
ＣＮＳ癌：ＳＣＦおよびｃ−ｋｉｔは，発生中の齧歯類のＣＮＳの全体で発現されており，発現のパターンは，神経外胚葉細胞の成長，移動および分化における役割を示唆する。レセプターおよびリガンドの両方の発現はまた，成人脳においても報告されている（Ｈａｍｅｌ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃ．３５：３２７−３３３）。ｃ−ｋｉｔの発現はまた正常ヒト脳組織においても観察されている（Ｔａｄａ，ｅｔａｌ．１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ８０：１０６３−１０７３）。頭蓋内腫瘍の大部分を占める神経膠芽細胞腫および星状細胞腫は，星状細胞の新生物性トランスフォーメーションから生ずる（Ｌｅｖｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆ＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ：２０２２−２０８２）。ｃ−ｋｉｔの発現は，神経膠芽細胞腫細胞株および組織において観察されている（Ｂｅｒｄｅｌ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５２：３４９８−３５０２；Ｔａｄａ，ｅｔａｌ．１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ８０：１０６３−１０７３；Ｓｔａｎｕｌｌａ，ｅｔａｌ．，１９９５，ＡｃｔＮｅｕｒｏｐａｔｈ８９：１５８−１６５）。
【００８８】
ｃ−ｋｉｔと星状細胞腫の病理との関連性はあまりわかっていない。正常な星状細胞においてｃ−ｋｉｔが発現していると報告されているが（Ｎａｔａｌｉ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．５２：１９７−２０１），（Ｔａｄａ，ｅｔａｌ．１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ８０：１０６３−１０７３），他の者はこれは発現されていないと報告している（Ｋｒｉｓｔｔ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｎｅｕｒｏ．３３：１０６−１１５）。後者の場合，高い等級の腫瘍において高レベルのｃ−ｋｉｔ発現が観察されているが（Ｋｒｉｓｔｔ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｎｅｕｒｏ．３３：１０６１１５），前者のグループは，星状細胞腫において発現を検出することができなかった。さらに，神経芽細胞腫におけるｃ−ｋｉｔとＳＣＦの発現の相反する報告が存在する。ある研究により，神経芽細胞腫細胞株はしばしばＳＣＦを発現するが，ｃ−ｋｉｔをほとんど発現しないことが見いだされた。原発性腫瘍においては，ｃ−ｋｉｔは神経芽細胞腫の約８％において検出されたが，ＳＣＦは腫瘍の１８％において見いだされた（Ｂｅｃｋ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ８６：３１３２−３１３８）。これに対し，他の研究（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ８４：３４６５−３４７２）は，試験した１４種すべての神経芽細胞腫細胞株がｃ−ｋｉｔ／ＳＣＦオートクリンループを含んでおり，調べた腫瘍試料の４５％でレセプターとリガンドの両方の発現が観察されたことを報告している。２つの細胞株において，抗−ｃ−ｋｉｔ抗体は細胞増殖を阻害し，このことは，ＳＣＦ／ｃ−ｋｉｔオートクリンループが成長に寄与していることを示唆する（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ８４：３４６５−３４７２）。したがって，ｃ−ｋｉｔキナーゼ阻害剤は，これらの癌を治療する手段として治療上有用であることが証明されるであろう。
【００８９】
ｂ．ｃ−ｋｉｔキナーゼおよび／またはＳＣＦが関与する，本発明により治療／予防される標的脂肪細胞疾病
肥満細胞症：上述したように，ＳＣＦ（肥満細胞成長因子としても知られる）によるｃ−ｋｉｔの刺激が，肥満細胞の成長および発達に必須であると報告されている（Ｈａｍｅｌ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃ．３５：３２７−３３３；Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：５４−５６）。ｃ−ｋｉｔにそのシグナリング活性を弱める変異を有するマウスは，皮膚に有意に少ない肥満細胞を示していた（Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，１９９６，ＰａｔｈｏｌＩｎｔ４６：９３３−９３８）。ｃ−ｋｉｔの過剰な活性化は，肥満細胞の数の過剰から生ずる疾病と関連するであろう。
【００９０】
肥満細胞症は，過度の肥満細胞増殖を特徴とする一連の異種の疾患を記述するために用いられる用語である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，１９９１，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ９３：２Ｓ−４Ｓ；Ｖａｌｅｎｔ；１９９６；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ３４９：１３７９−１３８５）。肥満細胞症は，大部分の患者においては皮膚に限定されているが，１５−２０％の患者では他の組織も関与しうる（Ｖａｌｅｎｔ，１９９６，Ｗｅｉｎ／ＫｌｉｎＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ１０８：３８５−３９７；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ３４９：１３７９−１３８５）。全身性肥満細胞症を有する患者の間でも，疾病は，比較的良性の予後を有する者から侵略的な肥満細胞症および肥満細胞白血病を有する者まで様々でありうる（Ｖａｌｅｎｔ，１９９６，Ｗｅｉｎ／ＫｌｉｎＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ１０８：３８５−３９７；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ３４９：１３７９−１３８５）。ｃ−ｋｉｔは，イヌの肥満細胞腫瘍からの悪性肥満細胞（Ｌｏｎｄｏｎ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｏｍｐａｒ．Ｐａｔｈｏｌ．１１５：３９９−４１４），ならびに侵略的な全身性肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞（Ｂａｇｈｅｓｔａｎｉａｎ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｌｅｕｋ．：１１６−１２２；Ｃａｓｔｅｌｌｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｌｌｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：８３１−８４０）にも認められている。
【００９１】
上昇したｃ−ｋｉｔ発現は，侵略的な肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞に見いだされるが，無活動性肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞には見られないことが報告されている（Ｎａｇａｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，ＭａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓＬｅｕｋ１２：１７５−１８１）。ＳＣＦは，間質細胞で膜結合蛋白質として発現されることが示されており，その発現は，繊維形成誘導性成長因子，例えばＰＤＧＦ（Ｈｉｒａｇｕｎ，ｅｔａｌ．１９９８）により誘導されることができる。また，これは正常皮膚においてケラチノサイトで膜結合蛋白質として発現されることが示されている。しかし，肥満細胞症を有する患者の皮膚においては，可溶性ＳＣＦの量の増加が観察されている（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔａｌ．，１９９３，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１３０２−１３０７）。
【００９２】
肥満細胞カイメースは，膜付随ＳＣＦを切断して可溶の生物学的に活性な形にすることが報告されている。この肥満細胞により媒介されるプロセスは，肥満細胞の増殖および機能を促進するフィードバックループを生成するよう働くことができ（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９０１７−９０２１），これは肥満細胞症の病因論に重要であろう。ケラチノサイトから蛋白質分解的に放出されることができない形のＳＣＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは，肥満細胞症を発達させないが，ケラチノサイトで正常なＳＣＦを発現する同様の動物は，ヒト皮膚の肥満細胞症に似た表現型を示す（Ｋｕｎｉｓａｄａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１５６５−１５７３）。ある患者においては，大量の可溶性ＳＣＦの形成は，肥満細胞症に伴う病理に寄与することができ，本発明は，ＳＣＦとｃ−ｋｉｔキナーゼとの間の相互作用を調節することにより，そのような疾患を治療または予防することができる。構成的キナーゼ活性をもたらすｃ−ｋｉｔＲＴＫのいくつかの異なる変異が，ヒトおよび齧歯類の肥満細胞腫瘍細胞株において見いだされている（Ｆｕｒｉｔｓｕ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１７３６−１７４４；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ９：２６１９−２６２６；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１０６：３７７−３８５；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，１９９６，ＰａｔｈｏｌＩｎｔ４６：９３３−９３８）。さらに，ｃ−ｋｉｔ遺伝子の活性化変異が，肥満細胞症および付随する血液疾患を有する患者から単離された末梢単核細胞（Ｎａｇａｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，ＭａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓＬｅｕｋ１２：１７５−１８１），および色素性じんま疹および侵略的な肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．１２：３１２−３１４）において観察されている。したがって，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの疾患の治療において優れた治療的役割を有することが明らかとなるであろう。
【００９３】
ある患者においては，ｃ−ｋｉｔＲＴＫの活性化変異は，疾病の病因に関与しており，ＳＣＦのｃ−ｋｉｔキナーゼとの相互作用を調節することにより，これらの患者を治療することができるか，またはその疾病を予防することができる。ｃ−ｋｉｔのＳＣＦ活性化は，肥満細胞のアポトーシスを予防することが示されており，これは皮膚の肥満細胞のホメオスタシスの維持に重要であるかもしれない（Ｉｅｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ１４４：３２１−３２８；Ｙｅｅ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１７７７−１７８７；Ｍｅｋｏｒｉ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５３：２１９４−２２０３；Ｍｅｋｏｒｉ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．１０７：１３７−１３８）。肥満細胞アポトーシスの阻害は，肥満細胞症に伴う肥満細胞蓄積につながる可能性がある。したがって，レセプターの過剰発現により生ずるｃ−ｋｉｔ活性化，可溶性ＳＣＦの過剰な形成，またはそのキナーゼを構成的に活性化するｃ−ｋｉｔ遺伝子の変異の知見は，ｃ−ｋｉｔのキナーゼ活性の阻害が，肥満細胞の数を減少させ，肥満細胞症を有する患者に利益を与えるであろうという理論的根拠を提供する。
【００９４】
ぜん息およびアレルギー：肥満細胞および好酸球は，寄生虫感染，アレルギー，炎症，およびぜん息における鍵となる細胞である（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ２７：５９３−５９７；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ７７：１０３３−１０７９；Ｈｏｌｇａｔｅ，１９９７，ＣＩＢＡＦｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．；Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ２７８：１８４２−１８４８；Ｃｏｓｔａ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ２７８：１８１５−１８２２）。ＳＣＦは，肥満細胞の発生，生存および成長に必須であることが示されている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：５４−５６；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ７７：１０３３−１０７９）。さらに，ＳＣＦは，好酸球特異的レギュレータであるＩＬ−５と共同で働いて，好酸球先祖の発達を増加させる（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９５：６４０８−６４１２）。ＳＣＦはまた，肥満細胞が好酸球の生存を促進する因子（Ｋａｙ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１９６−１９９）を分泌することを誘導すると報告されており（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５），これは慢性の好酸球媒介性炎症に寄与するかもしれない（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５）。このようにして，ＳＣＦは肥満細胞および好酸球の両方の活性化を直接的および間接的に制御する。
【００９５】
ＳＣＦは，肥満細胞からのメディエータの放出，ならびにこれらの細胞のＩｇＥ誘導性脱顆粒の誘発（Ｃｏｌｕｍｂｏ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４９：５９９−６０２），および好酸球由来顆粒主要塩基性蛋白質に対するこれらの応答性の感作（Ｆｕｒｕｔａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９２：１０５５−１０６１）を誘導する。活性化肥満細胞により放出される因子の中でも，ＩＬ−５，ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αは好酸球蛋白質分泌に影響を与える（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５）。ＳＣＦは，肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導することに加え（Ｌｕｃｋａｃｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３９４５−３９５１；Ｈｏｇａｂｏａｍ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１６６−６１７１），肥満細胞による好酸球走化性因子であるエオタキシンの産生（Ｈｏｇａｂｏａｍ，ｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１６６−６１７１），および好酸球浸潤（Ｌｕｃｋａｃｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３９４５−３９５１）を促進する。
【００９６】
ＳＣＦはまた，肥満細胞（Ｄａｓｔｙｃｈ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２１３−２１９；Ｋｉｎａｓｈｉ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ８３：１０３３−１０３８）および好酸球（Ｙｕａｎ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：３１３−３２３）の両方の接着に直接影響を及ぼし，これは次に組織浸潤を制御する。すなわち，ＳＣＦは，多数のメカニズムにより，アレルギーおよびぜん息に関与する主な細胞に影響を及ぼすことができる。現在，コルチコステロイドが，アレルギーに伴う慢性鼻炎および炎症の最も有効な治療である（Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ２７８：１８４２−１８４８；Ｍｅｌｔｚｅｒ，１９９７，Ａｌｌｅｒ．５２：３３−４０）。これらの薬剤は，肥満細胞および好酸球の循環および浸潤の減少，およびサイトカイン産生の阻害に伴う好酸球の生存の減少（Ｍｅｌｔｚｅｒ，１９９７，Ａｌｌｅｒ．５２：３３−４０）を含む多数のメカニズムにより作用する。また，ステロイドは繊維芽細胞および内在結合組織細胞によるＳＣＦの発現を阻害し，これが肥満細胞生存の減少につながると報告されている（Ｆｉｎｏｔｔｏ，ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７２１−１７２８）。肥満細胞および好酸球の機能の相互的制御，およびこの制御においてＳＣＦが果たしうる役割のため，ｃ−ｋｉｔキナーゼの阻害は，アレルギーに伴う慢性鼻炎，炎症およびぜん息の治療手段を提供するであろう。
【００９７】
ｃ．ｃ−ｋｉｔレセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストの同定
内皮細胞増殖および潜在的には発癌の統制，制御および調節におけるＲＴＫの推定される重要性に鑑みて，種々の方法を用いてＲＴＫ"阻害剤"を同定する多くの試みがなされてきた。これには，変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプターおよび抗体（ＷＯ９４／１０２０２；ＫｅｎｄａｌｌａｎｄＴｈｏｍａｓ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０７０５−１０７０９；Ｋｉｍ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６２：８４１−８４４）；およびＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１０４５０−１０４５６）の使用が含まれる。
【００９８】
さらに，キナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；ＷＯ９１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍａｒｉａｎｉ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３５：２２６８），およびレセプターキナーゼシグナル伝達経路に作用する阻害剤，例えば蛋白質キナーゼＣ阻害剤（Ｓｃｈｕｃｈｔｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９１，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：６８２−６８７）；Ｔａｋａｎｏ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ４：３５８Ａ；Ｋｉｎｓｅｌｌａ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１９９：５６−６２；Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．ＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓ．１５２：４４８−５７）が同定されている。
【００９９】
最近，癌の治療において用いるためにキナーゼ阻害剤として作用する小分子を同定することが試みられている。したがって，このオートクリンループを有効にかつ特異的に抑制するために，ｃ−ｋｉｔＲＴＫのシグナル伝達を選択的に阻害する有効な小化合物を同定し製造することが必要とされている。
【０１００】
本発明のある化合物は，生物学的アッセイにおいて優れた活性を示し，したがって，これらの化合物および関連する化合物は，ｃ−ｋｉｔＲＴＫ関連疾患，例えば上述した疾患の治療に有効であることが予測される。さらに，本明細書に記載されるアッセイおよび条件を用いて，ｃ−ｋｉｔキナーゼ機能のさらに別の調節剤を同定することができる。
【０１０１】
ＩＩＩ．本発明の化合物の生物学的活性
本発明のインドリノン化合物を，ほとんどの蛋白質キナーゼの活性を阻害する能力について試験した。生物学的アッセイおよびこれらの阻害実験の結果は本明細書に記載される。インドリノン化合物による蛋白質キナーゼ機能の調節を測定するために用いられる方法は，ハイスループットの観点の方法に関して，国際公開ＷＯ９８／０７６９５（１９９８年３月２６日公開，Ｔａｎｇｅｔａｌ．，表題"ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬＬＩＢＲＡＲＩＥＳＡＮＤＲＥＬＡＴＥＤＰＲＯＤＵＣＴＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＴＨＥＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＤＥＳＥＡＳＥＳ"および米国特許５，７９２，７８３（１９９８年８月１１日発行，Ｔａｎｇｅｔａｌ．，表題”３−ＨＥＴＥＲＯＡＲＹＬ−２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥＣＯＭＰＯＵＮＤＳＦＯＲＴＨＥＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＤＥＳＥＡＳＥＳ”に記載されているものと同様である。ＷＯ９８／０７６９５公報は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１０２】
ＩＶ．医薬処方および投与経路
本明細書に記載される化合物は，それ自体で，または医薬組成物中でヒト患者に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるように化合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形剤と混合されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，"ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことができる。
【０１０３】
ａ）投与経路
投与の適当な経路には，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸投与；非経口輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０１０４】
あるいは，化合物を全身ではなく局所的に投与してもよく，これには，例えば，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射することが含まれる。
【０１０５】
さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソームは腫瘍に選択的にターゲティングされて取り込まれるであろう。
【０１０６】
ｂ）組成物／処方
本発明の医薬組成物は，それ自体よく知られる方法，例えば，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
【０１０７】
すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使用することができる製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で処方することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０１０８】
注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０１０９】
経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。そのような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することを可能とする。経口で使用するための医薬製剤は，１またはそれ以上の固体賦形剤を１またはそれ以上の本発明の化合物と混合物し，得られた混合物を任意にすりつぶし，所望の場合には適当な助剤を加えた後に顆粒の混合物を加工して，錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤は，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などである。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０１１０】
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のためには，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加してもよい。
【０１１１】
経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そのような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０１１２】
口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形にすることができる。
【０１１３】
吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたはネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０１１４】
化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性または水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０１１５】
非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０１１６】
あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０１１７】
化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０１１８】
上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として，処方することができる。
【０１１９】
本発明の疎水性化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０１２０】
あるいは，疎水性の医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０１２１】
本発明のＰＴＫ調節化合物の多くは，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向にある。
【０１２２】
ｃ）有効投与量
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図される目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１２３】
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ₅₀（すなわちＰＴＫ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【０１２４】
本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ₅₀（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ₅₀とＥＤ₅₀の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方するために用いることができる。このような化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ₅₀を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌｅｔａｌ．１９７５，"ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１２５】
投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節することができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決定することができる。
【０１２６】
投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
【０１２７】
局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ないであろう。
【０１２８】
投与される特定の組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０１２９】
ｄ）包装
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用の化合物の形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置され，さらに指示された状態の治療のためにラベルを付すことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０１３０】
化合物の医薬処方を製造する別の方法，患者に投与すべき化合物の量を決定する方法，および化合物を生物に投与するモードは，米国特許出願０８／７０２，２３２（Ｔａｎｇ，ｅｔａｌ．，表題"ＩｎｄｏｌｉｎｏｎｅＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＬｉｂｒａｒｉｅｓａｎｄＲｅｌａｔｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＤｅｓｅａｓｅｓ"，１９９６年８月２３日出願），および国際公開ＷＯ９６／２２９７６（Ｂｕｚｚｅｔｔｉ，ｅｔａｌ．，表題"Ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ３−Ａｒｙｌｉｄｅｎｅ−２−ＯｘｉｎｄｏｌｅＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓａｓＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ"，１９９６年８月１日公開）に開示されており，これらのいずれも図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易に適合させることができることを理解するであろう。
【０１３１】
実施例
以下の実施例は，非限定的なものであり，本発明の種々の観点および特徴の代表例にすぎない。実施例は，本発明の化合物を合成する方法，および蛋白質キナーゼ機能のに及ぼす化合物の影響を測定する方法を記載する。
【０１３２】
この方法において用いられる細胞は，市販されているか，学術的研究室から入手可能であるか，または市販の細胞から工学処理した。細胞に含まれる核酸ベクターもまた市販されており，種々の蛋白質キナーゼの遺伝子の配列は配列データバンクで容易にアクセス可能である。すなわち，当業者は，市販の細胞，市販の核酸ベクター，および蛋白質キナーゼ遺伝子を当業者には容易に利用可能な手法を用いて組み合わせることにより，短時間で容易に細胞株を再形成することができる。
【０１３３】
アッセイ方法
以下のインビトロアッセイを用いて，活性のレベル，および本発明の種々の化合物が１またはそれ以上のＰＫに及ぼす影響を測定することができる。当該技術分野においてよく知られる手法を用いて，任意のＰＫについても同様に，類似のアッセイを設計することができる。
【０１３４】
本明細書に記載される細胞／触媒アッセイは，ＥＬＩＳＡフォーマットで実施する。一般的方法は以下のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キナーゼを発現する細胞に化合物を導入する。ある時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。細胞を溶解し，酵素的リン酸化反応の基質を認識する特異的抗体であらかじめコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウエルに溶解物を移す。細胞溶解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で基質のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。アッセイはまたウエスタンブロッティングによる検出ように適合させることができる。
【０１３５】
本明細書に記載される細胞／生物学的アッセイは，試験キナーゼの活性化に応答して生成したＤＮＡの量を測定し，これは一般的な増殖性応答の測定である。このアッセイの一般的方法は次のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キナーゼを発現する細胞に化合物を導入する。ある時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合にはレセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。少なくとも一夜インキュベーションした後，ＤＮＡ標識試薬，例えばブロモデオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）または３Ｈ−チミジンを加える。抗ＢｒｄＵ抗体でまたは放射活性を測定することにより標識されたＤＮＡの量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。
【０１３６】
細胞／触媒アッセイ
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて，ＰＫ活性の存在を検出し測定することができる。ＥＬＩＳＡは，例えば，Ｖｏｌｌｅｒ，ｅｔａｌ．，１９８０（"Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ，" ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，ＲｏｓｅａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎ編，ｐｐ３５９−３７１Ａｍ．Ｓｏｃ．ＯｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に記載の既知のプロトコルに従って実施することができる。
【０１３７】
開示されるプロトコルを，特定のＰＫに関する活性を検出するように適合させることができる。例えば，特定のＰＫであるｃ−ｋｉｔキナーゼに関するＥＬＩＳＡ実験を実施するための好ましいプロトコルは以下に記載される。しかし，ＲＴＫファミリーの他のメンバー，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を検出するためにこれらのプロトコルを適合させることは，当業者の知識の範囲内である。
【０１３８】
実施例１：本発明の化合物の活性
本発明のいくつかの化合物の生化学的活性を，記載されるアッセイを用いて試験した。本発明の化合物のいくつかについてＩＣ₅₀値を測定した。結果は図２に示される。
【０１３９】
Ａ．材料および試薬
１）ＨＮＴＧ：５Ｘ保存濃度：１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２，７５０ｍＭＮａＣｌ，５０％グリセロール，２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００．
２）ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ
３）１Ｘブロッキング緩衝液：１０ｍＭＴＲＩＳ−ｐＨ７．５，１％ＢＳＡ，１００ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
４）１Ｘキナーゼ緩衝液：２５ｍＭＨＥＰＥＳ，１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ２，６ｍＭＭｎＣｌ２
５）ＰＭＳＦ保存溶液＝１００ｍＭ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ−７６２６）
６）１０ｍＭＡＴＰ（細菌起源）ＳｉｇｍａＡ−７６９９，５ｇ．
７）ＵＢ４０抗ホスホチロシンｍＡｂ（Ｔｅｒｒａｎｃｅ，Ｓｕｇｅｎから入手可能）
８）ＨＲＰコンジュゲート化ヒツジ抗マウスＩｇＧ．（ＡｍｅｒｓｈａｍＮＡ９３１）
９）ＡＢＴＳ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ７−５７９８４４）
１０）ＴＲＩＳＨＣＬ：ＦｉｓｈｅｒＢＰ１５２−５
１１）ＮａＣｌ：ＦｉｓｈｅｒＳ２７１−１０
１２）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：ＦｉｓｈｅｒＢＰ１５１−１００
１３）Ｎａ₃ＶＯ₄：ＦｉｓｈｅｒＳ４５４−５０
１４）ＭｇＣｌ₂：ＦｉｓｈｅｒＭ３３−５００
１５）ＭｎＣｌ₂：ＦｉｓｈｅｒＭ８７−５００
１６）ＨＥＰＥＳ：ＦｉｓｈｅｒＢＰ３１０−５００
１７）アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：ＳｉｇｍａＡ−８５５１
１８）ＴＢＳＴ緩衝液：５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１９）ヤギアフィニティー精製抗体ラビットＩｇＧ（全分子）：Ｃａｐｐｅｌ５５６４１
２０）抗ｋｉｔ（Ｃ−２０）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体：ＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−１６８
２１）ｋｉｔ／ＣＨＯ細胞：ＧｙｒＢ／ｋｉｔを安定に発現するＣＨＯ細胞，１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した標準的ＣＨＯ培地で成長させる
２２）インドリノン化合物：インドリノン化合物は，以下の出願に記載されるように合成した：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６４６８（１９９９年３月２６日出願，Ｆｏｎｇ，ｅｔａｌ．，表題”ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧＴＹＲＯＳＩＮＥＰＲＯＴＥＩＮＫＩＮＡＳＥ”（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２３１／２５０ＰＣＴ，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１４０】
Ｂ．方法
以下の全ての工程は特に示さない限り室温で行う。すべてのＥＬＩＳＡプレート洗浄はＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。
【０１４１】
ｋｉｔ細胞溶解
この方法は，レセプター捕捉の開始の１時間前に行う。
１）９５％以上コンフルエントの１５ｃｍ皿をＰＢＳで洗浄し，可能な限り吸引する。
２）１５ｃｍ皿１枚あたり１ｍＭＰＭＳＦを含む３ｍｌの１ｘＨＮＴＧで細胞を溶解する。細胞をプレートから掻き取り，５０ｍｌ遠心管に移す。
３）上清をプールし，氷上に１時間，時々ボルテックスしながら放置する。これを行わないと，バックグラウンドが増加する（約３倍高くなる）。
４）管を平衡させ，１０，０００ｘｇで１０分間，４℃で遠心分離する。蛋白質測定のためにアリコートを取り出す。
５）蛋白質測定用ＳＯＰにしたがって，ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を行う。
【０１４２】
ＥＬＩＳＡ法
１）Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり２μｇのＰＢＳ中のヤギ抗ウサギ抗体でウエル総容量１００μｌで被覆する。４℃で一夜保存する。
２）プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合ヤギ抗ウサギ抗体を除去する。
３）１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
４）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
５）ウエルあたり０．２μｇのＴＢＳＴ中に希釈したウサギ抗−ｋｉｔ抗体を加え，ウエルの総容量を１００μｌとする。室温で６０分間振盪する。
６）溶解物をＨＮＴＧで希釈する（１８０μｇの溶解物／１００μｌ）。
７）１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
８）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
９）化合物／抽出物（または記載される他のもの）をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１ｘキナーゼ緩衝液および５μｌのＡＴＰ中で希釈する。
１０）１００μｌの希釈薬剤をＥＬＩＳＡプレートのウエルに移す。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１１）１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。この段階でプレートはある程度の時間安定である。
１２）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１３）ウエルあたり１００μｌのＵＢ４０（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を加える。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１４）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１５）ウエルあたり１００μｌのヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＴＢＳＴ中１：５０００希釈）を加える。振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。
１６）ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
１７）ウエルあたり１００μｌのＡＢＴＳを加える。振盪しながら１５−３０分間インキュベートする。
１８）ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ₇０００ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む。試験フィルター＝４１０ｎｍ，参照フィルター＝６３０ｎｍ。
【０１４３】
実施例２：本発明の化合物の活性
本発明の２つの化合物の生化学的活性を，以下に記載されるアッセイを用いて試験した。
【０１４４】
方法：
細胞株
Ｍ０７Ｅ細胞（ヒト骨髄白血病細胞株）は，１０％ウシ胎児血清および各１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
【０１４５】
ｃ−ｋｉｔチロシンリン酸化の検出
Ｍ０７Ｅ細胞を，０．１％血清中で一夜血清飢餓とした。細胞を化合物８で２時間，または化合物６で２２時間（血清飢餓と同時）前処理した後，リガンド刺激を行った。細胞を２５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣＦで１５分間刺激した。刺激後，細胞を溶解し，抗−ｃ−ｋｉｔ抗体で免疫沈澱させた。ホスホチロシンおよび蛋白質レベルは，ウエスタンブロッティングにより検出した。
【０１４６】
ＭＴＴ増殖アッセイ
Ｍ０７Ｅ細胞を血清飢餓とさせ，リン酸化実験について記載したように，化合物で前処理した。細胞を９６ウエル皿に１００μｌＲＰＭＩ＋１０％血清中で４Ｘ１０⁵細胞／ウエルで播種した。ｒｈ−ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え，プレートを４８時間インキュベートした。４８時間後，１０μｌの５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を加え，４時間インキュベートした。酸イソプロパノール（１００μｌのイソプロパノール中０．０４ＮＨＣｌ）を加え，波長５５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１４７】
アポトーシスアッセイ
Ｍ０７Ｅ細胞を，＋／−ＳＣＦおよび＋／−化合物（化合物６または化合物８：５および２５μＭ）で，１０％ＦＢＳ中でｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈ−ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。試料は２４および４８時間後にアッセイした。活性化カスパーゼ−３を測定するためには，試料をＰＢＳで洗浄し，氷冷７０％エタノールで浸透性にした。次に細胞をＰＥ−コンジュゲート化ポリクローナルウサギ抗−活性カスパーゼ−３で染色し，ＦＡＣＳで分析した。切断されたＰＡＲＰを測定するためには，試料を溶解させ，抗−ＰＡＲＰ抗体を用いてウエスタンブロッティングで分析した。
【０１４８】
化合物８および化合物６によるｃ−ｋｉｔの生物学的機能の阻害
結果：
ｃ−ｋｉｔのチロシンリン酸化の阻害
化合物８および化合物６は，Ｍ０７Ｅ細胞（ヒト骨髄白血病細胞株）において，幹細胞因子（ＳＣＦ）によるリガンド刺激に応答して，ｃ−ｋｉｔのチロシンリン酸化を阻害する。化合物８で処理した細胞においては，０．０１μＭではリン酸化の阻害は観察されず，部分阻害は０．１μＭで，完全な阻害は１および１０μＭで観察された。化合物６で処理した細胞においては，０．０１μＭまたは０．１Ｍでは，ｃ−ｋｉｔチロシンリン酸化の阻害は観察されなかった。部分的阻害は１μＭで観察され，完全な阻害は１０μＭで観察された。
【０１４９】
ｃ−ｋｉｔ媒介性増殖の阻害
化合物８および化合物６はまた，ＭＴＴ増殖アッセイにおいてＭ０７Ｅ細胞においてｃ−ｋｉｔ媒介性シグナリングを阻害する。化合物８の増殖の阻害のＩＣ₅₀値は約０．５−１．０μＭであり，化合物６のＩＣ₅₀値は約５−７μＭである。
【０１５０】
アポトーシスの誘導
化合物８および化合物６はまた，Ｍ０７Ｅ細胞において，用量および時間依存的様式でアポトーシスを誘導する。アポトーシスは，２つのアッセイを用いて評価した：細胞中でアポトーシスの間に誘導される活性化カスパーゼ−３を認識する抗体を用いるＦＡＣＳ分析，およびやはりアポトーシスの間に誘導されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断されたフラグメントのウエスタンブロッティングアッセイ。
【０１５１】
カスパーゼ−３アッセイを用いて，ＳＣＦ刺激および２５μＭの化合物８処理により，４８時間で，未処理ＳＣＦ刺激細胞と比較してアポトーシス性細胞の数の約５０％の増加が観察された。ＳＣＦ刺激なしでは，２５μＭの化合物８で４８時間ではわずかの影響が観察された。２５μｇの化合物８（＋／−ＳＣＦ刺激）で２４時間処理すると，測定可能であるがより少数のアポトーシス性細胞が認められた。
【０１５２】
細胞を５Ｍの化合物８で２４または４８時間（＋／−ＳＣＦ刺激）処理すると，やはり測定可能であるがより少数のアポトーシス性細胞が認められた。
【０１５３】
化合物６についても類似の結果が得られた。ただし，５μＭの化合物６で２４時間では，ＳＣＦ刺激がある場合もない場合も影響は観察されなかった。
【０１５４】
ＰＡＲＰアッセイを用いた場合，２５μＭの化合物８で４８時間処理すると，切断されたＰＡＲＰの量の最も大きな増加が得られた。この影響は，ＳＣＦ刺激によりわずかに増強された。２５μＭの化合物８で２４時間処置した試料は，４８時間の試料と同様であった。
【０１５５】
５μＭの化合物８で処理すると，いずれの時点においても，切断されたＰＡＲＰの増加は非常に少なかった。
化合物６についても類似の結果が得られた。
【０１５６】
結論
当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者がなすであろう，本発明の精神の範囲内に含まれる変更および他の用途は，特許請求の範囲により定義されている。
【０１５７】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して置換基の変更および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
【０１５８】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０１５９】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１６０】
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載されている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０１６１】
本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般的記載が含まれる。
【０１６２】
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，ｃ−ｋｉｔキナーゼの細胞外ドメインおよび細胞質"スプリット"キナーゼドメインにおける５つの免疫グロブリン様モチーフを示す概略図である。
【図２】図２は，インドリノン誘導体がｃ−ｋｉｔキナーゼの活性に及ぼす影響を示す。

Claims

下記の化合物

を含む、生物においてc-kitキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路の異常に関連する異常な状態を治療する為の医薬組成物であって、該異常な状態が胃腸間質腫瘍である、医薬組成物。
下記の化合物

を含む、生物においてc-kitキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路の異常に関連する異常な状態を治療する為の医薬組成物であって、該異常な状態が肥満細胞症である、医薬組成物。
下記の化合物

および

から選択される化合物を含む、生物においてc-kitキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路の異常に関連する異常な状態を治療する為の医薬組成物であって、該異常な状態がアレルギー関連慢性鼻炎、炎症、あるいはぜん息である、医薬組成物。
下記の化合物

を含む、生物においてc-kitキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路の異常に関連する異常な状態を治療する為の医薬組成物であって、該異常な状態が肥満細胞腫瘍である、医薬組成物。