JP4998473B2 - 質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は質量分析装置に関し、さらに詳しくは、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization）によるイオン源を備え、試料上の所定位置又は所定範囲の質量分析を行うための質量分析装置に関する。

マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）は、レーザ光を吸収しにくい試料やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい試料を分析するために、レーザ光を吸収し易く且つイオン化し易い物質をマトリックスとして試料に予め混合しておき、これにレーザ光を照射することで試料をイオン化するものである。このＭＡＬＤＩを用いた質量分析装置（以下、ＭＡＬＤＩ−ＭＳと称す）は、分子量の大きな高分子化合物をあまり開裂させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、特に生命科学などの分野で広範に利用されている。

ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、照射レーザ光のスポット径を小さく絞り、その照射位置を試料上で相対的に移動させることにより、例えば試料上で或る質量を持つイオンの強度分布（２次元物質分布）を表す画像を得ることができる。こうした装置は質量分析顕微鏡又は顕微質量分析装置として知られており、特に、生化学分野、医療分野等において、生体内細胞に含まれるタンパク質の分布情報を得るといった応用が期待されている（例えば非特許文献１など参照）。

上記のような様々な利用分野において試料についての有用な知見を得るには、質量分析の空間分解能が高いことが望ましい。空間分解能を向上させる最も簡便で確実な方法は、レーザ光の照射面積を小さくすることで物質をイオン化する面積そのものを小さく限定する方法である。一般的なＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、レーザ光の集束径は数百μｍ程度であるが、上記文献に記載の顕微質量分析装置ではレーザ光の集束径が約３０μｍまで絞られている。さらに、非特許文献２などにはレーザ光の集光径を約０．５μｍにまで絞り込み、数十μｍ程度の大きさの細胞内において物質分布像を取得した例もある。こうしたＭＡＬＤＩ−ＭＳは空間分解能が優れているため、１次元又は２次元の物質分布を求めるだけでなく、非常に微小な領域の局所分析にも有用である。

例えば上記文献に記載のような顕微質量分析装置を用いてサンプル中の局所分析や物質分布像の取得を行う際には、サンプルは通常、厚さ数μｍ〜数十μｍにスライスされた状態でサンプルプレート上に載置される。従来の一般的な分析の手順としては、オペレータは装置からサンプルプレートを取り外して該プレート上にサンプルを載せ、続いてそのサンプルにマトリックスを塗布し、再びそのプレートを装置に装着する。そして、ＣＣＤカメラ又は接眼レンズを通してサンプルを観察し、その際の観察画像（一般にはリアルタイム画像）を用いて分析位置や分析領域を指定する。それに引き続いて、指定された分析位置や分析領域にレーザ光が照射されて質量分析が実行される。

マトリックスは一般的には固体であり、これを有機溶媒等に溶解させたマトリックス溶液をサンプル上に載せる。マトリックス溶液がサンプル上に載せられると、被測定物質がサンプルから溶液中に溶け出してきて、その後、溶媒の蒸発によりマトリクス結晶が形成される際にその結晶中に被測定物質も取り込まれる。この結晶にレーザ光が照射されることにより、被測定物質がイオン化されることになる。

サンプル上へマトリックス溶液を載せる方法としては様々な方法が提案されている。最も簡単なのは数百ｎＬ程度のマトリックス溶液を所望の位置に滴下する方法である。これは一般的な手動ピペッタを用いて行うことができるため最も簡便でコストも安価で済むが、液滴径が大きい（５００ｎＬの滴下で直径２〜３ｍｍ）ためサンプルから溶け出してきた被測定物質の位置情報が失われてしまうという欠点がある。そのため、おおまかな位置情報しか必要ない場合には有用であるが、物質の分布情報を得たい場合や局所分析を行う場合には適さない。

最も広く用いられているのは、マトリックス溶液をスプレーでサンプルに噴霧する方法である。この方法ではサンプル上に一様に大きな面積でマトリックスを載せることができるため、物質分布像を得るのに適している。また、液滴径が小さいため、上記滴下法よりも位置情報が失われにくく、高空間分解能での物質分布像を得ることができる。

そのほか、自動ピペッタを用いて離散的に微小な液滴を載せた例もある。この方法では、少なくとも隣接する液滴の間で被測定物質が移動することはないので、正確な物質分布像を得ることができる。しかしながら、上記噴霧法と同程度の小さな液滴を作ることは難しく、そのために物質分布像の空間分解能も噴霧法と同等又はそれ以上にすることができない。

いずれの方法でも、サンプル上に載せた溶液の乾燥後にマトリックスが結晶化することは同じである。マトリックスの結晶は一般に透明であるが、その形状が複雑であったり微細であったりするために観察像が不鮮明になる傾向にある。図１３はマトリックス溶液をサンプルに噴霧する前（ａ）と噴霧した後（ｂ）の観察画像を示す図である。ここでは、マウスの脳をスライスしたサンプルにＣＨＣＡ溶液をスプレーで噴霧した例である。図１３（ｂ）に示すようにマトリックスを付着した後にはサンプル表面の様子がかなり不鮮明になっていることが分かる。このため、サンプル上の任意の領域についての物質分布像を得たい場合や或る一点のみを局所分析したい場合でも、その領域や位置を正確に指定することは難しい。

即ち、上述した従来のＭＡＬＤＩを用いた顕微質量分析装置では、サンプル上で所望の位置や領域の質量分析を正確に行うことが必ずしもできず、そのために本当に必要とする情報を見逃してしまったり何度も分析し直したりしなければならないおそれがある。

小河潔、ほか５名、「顕微質量分析装置の開発」、島津評論、島津評論編集部、平成１８年３月３１日、第６２巻、第３・４号、pp. 125-135 スペングラー（B. Spengler）ほか１名、「スキャンニング・マイクロプローブ・マトリクス−アシステッド・レーザ・デソープション・イオナイゼイション（ＳＭＡＬＤＩ）・マス・スペクトロメトリー： インストゥルメンテイション・フォー・サブ−マイクロメータ・リソルブド・ＬＤＩ・アンド・ＭＡＬＤＩ・サーフェイス・アナリシス（Scanning Microprobe Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (SMALDI) Mass Spectrometry: Instrumentation for Sub-Micrometer Resolved LDI and MALDI Surface Analysis）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリ（Jounal of American Society for Mass Spectrometry）、2002, Vol.13, No.6, pp.735-748

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、ＭＡＬＤＩ分析においてサンプル上の所望の分析位置や分析領域を正確に指定して、その位置や領域における物質分布などの情報を精度良く収集することができる質量分析装置を提供することにある。

上記課題を解決するために成された第１発明は、サンプルを載せるためのサンプルプレートが装置本体に着脱自在であり、該プレートを装置本体から取り外した状態で該プレート上に載せたサンプル上にマトリックスを付着させた後に該プレートを装置本体に装着し、マトリックスが付着されたサンプルにレーザ光を照射してイオン化を行うマトリックス支援レーザ脱離イオン化法によるイオン源を有する質量分析装置において、
a)マトリックス付着前のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、該プレート上のサンプルの２次元画像を取得して保持する画像取得手段と、
b)該画像取得手段により保持された２次元画像を表示手段に表示した表示画面上でオペレータが所望の位置を指定するための指定手段と、
c)マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、前記指定手段により指定されたマトリックス付着前のサンプル上の位置に対応したマトリックス付着後のサンプル上の位置に対してレーザ光を照射して該位置についての質量分析を実行する分析制御手段と、
を備えることを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された第２発明は、サンプルを載せるためのサンプルプレートが装置本体に着脱自在であり、該プレートを装置本体から取り外した状態で該プレート上に載せたサンプル上にマトリックスを付着させた後に該プレートを装置本体に装着し、マトリックスが付着されたサンプルにレーザ光を照射してイオン化を行うマトリックス支援レーザ脱離イオン化法によるイオン源を有する質量分析装置において、
a)マトリックス付着前のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、該プレート上のサンプルの２次元画像を取得して保持する画像取得手段と、
b)該画像取得手段により保持された２次元画像を表示手段に表示した表示画面上でオペレータが所望の１次元的な又は２次元的な領域を指定するための指定手段と、
c)マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、前記指定手段により指定されたマトリックス付着前のサンプル上の領域に対応したマトリックス付着後のサンプル上の領域に対して照射位置を走査しながらレーザ光を照射して該領域の各微小領域についての質量分析を実行する分析制御手段と、
を備えることを特徴としている。

第１発明に係る質量分析装置はサンプル上の或る１個所又は複数個所の局所的な質量分析を行うものであり、他方、第２発明に係る質量分析装置は、サンプル上の１次元的な又は２次元的な領域（範囲）の全体に亘り、その中の各微小領域についての質量分析をそれぞれ実行して例えばその領域内の物質の空間的分布を得ようとするものであるが、発明の趣旨は基本的に同じである。即ち、画像取得手段により、マトリックスを付着させる前のサンプルの２次元画像を撮像する。この画像情報はサンプルプレートを装置本体から取り出しても保持されるため、任意の時点で、例えば装置本体から取り出したサンプルプレート上のサンプルにマトリックスを付着させた後に該プレートを再び装置本体に装着した後に、マトリックス付着前のサンプルの２次元画像を表示手段に表示することが可能である。そこでオペレータは指定手段によりサンプル上で分析を行いたい所望の位置や領域を指定する。

前述のようにマトリックス付着後にはサンプルの２次元画像が不鮮明になって所望の分析位置や領域を見つけるのが難しい場合があるが、マトリックス付着前の鮮明な２次元画像において分析位置や領域を指定すればよいので、確実に観察したい部位を指定することができる。その後に分析実行が指示されると、分析制御手段は、先に２次元画面上で指定された分析位置や領域に対応したサンプル上の実際の位置や領域の質量分析を行うように、レーザ光の照射位置を設定したりレーザ光の照射位置を走査するためにサンプルプレートを載せたステージの駆動を制御したりする。

装置本体にサンプルプレートを装着する際にその位置が一意に定まる場合、つまり位置の再現性がある場合には、装置本体に対しサンプルプレートを何回脱着してもサンプルの位置ずれは生じない（又は実質的に無視できる程度の位置ずれである）。したがって、分析制御手段は、サンプルの２次元画像上で指定された分析位置や領域の位置アドレスをそのまま用いてレーザ光の照射位置を決めることができる。これに対し、例えば平板状のステージ上に単にサンプルプレートを置くことで装置本体にサンプルプレートを装着するような構成では、サンプルプレートを装置本体から取り外して再び装着する際にサンプルプレート及び該プレート上のサンプルの位置ずれが発生する。そこで、指定手段により指定された分析位置や領域に対応するマトリックス付着後のサンプル上の実際の位置や領域にレーザ光を照射するには、サンプルプレート脱着前後の位置ずれを補正することが必要になる。

こうしたことから第１及び第２発明に係る質量分析装置では、好ましくは、装置本体に対するサンプルプレートの脱着の前後における該サンプルプレート又は該プレート上のサンプルの位置ずれの方向及び量を把握する位置ずれ把握手段と、該位置ずれ把握手段により把握された位置ずれの方向（角度も含む）及び量に応じてレーザ光の照射位置を修正するように該レーザ光とサンプルとの相対位置を変更する照射位置調整手段と、をさらに備える構成とするとよい。

上記位置ずれ把握手段による位置ずれの方向及び量を把握する方法としては様々な態様を採り得る。第１及び第２発明に係る質量分析装置の第１の態様として、前記位置ずれ把握手段は、マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で取得された該プレート上のサンプルの２次元画像と、前記画像取得手段により保持されているマトリックス付着前のサンプルの２次元画像とを比較可能に表示し、両２次元画像上での１乃至複数の同一個所についてのオペレータの指示に基づいて位置ずれの方向及び量を把握するものとすることができる。

前述のようにマトリックス付着後のサンプルの２次元画像は不鮮明になることが多いものの、サンプルに明瞭な形状、模様、色の濃淡などがある場合には、マトリックス付着後にもそれらを視認できることがある。そこで、上記第１の態様の構成では、マトリックス付着前後のサンプルの２次元画像をオペレータが見比べて同一個所を指示すると、その指示に応じて位置ずれの方向や量が計算される。

また第１及び第２発明に係る質量分析装置の第２の態様として、前記位置ずれ把握手段は、マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で取得された該プレート上のサンプルの２次元画像を取得する比較画像取得手段と、該比較画像取得手段により得られた２次元画像と前記画像取得手段により保持されているマトリックス付着前のサンプルの２次元画像とを画像解析することにより両画像の位置ずれの方向及び量を検出するずれ検出手段と、を含むものとすることができる。

この第２の態様の構成では、上記第１の態様の構成においてオペレータが目視上で行っていた識別や判断を自動化する。こうした２枚の画像の間の位置ずれの方向や量を検出するずれ検出手段としては、一般的に市販されている各種の高性能の画像処理ソフトウエアを利用することができる。

但し、マトリックスの付着後にも撮影画像上で識別可能な程度に明瞭な形状や模様などが、常にサンプル自体にあるとは限らない。そこで、好ましくは、サンプルプレート上に位置識別用の標識を設ける構成とし、サンプルの形状や模様の代わりにこのサンプルプレート上の標識を利用してオペレータ自らが同一個所の指示を行うか、或いは自動的な画像解析を行うようにするとよい。

またサンプルが大きい場合には、サンプルプレート上に標識を設けてもこれがサンプルによって隠れてしまう場合もある。そこで、サンプルプレートを保持するホルダを装置本体に装着する構成とし、該ホルダに位置識別用の標識を設けるようにするとよい。

なお、上述のようにサンプルプレート上又はホルダに設ける位置識別用の標識は１個でなく複数であることが好ましく、複数の場合にできるだけ距離を離すほうがよい。

第１及び第２発明に係る質量分析装置によれば、マトリックスをサンプルに付着させる前の鮮明なサンプル画像に基づいて質量分析を行う位置や領域を決めることができるので、所望の位置や領域を正確に指定して目的とする質量分析結果や物質分布像などを確実に得ることができる。また、従来のように不鮮明なサンプル画像を見ながら分析位置や領域を探す必要がなくなるので、分析位置や領域の指定を簡単に行うことができる。

本発明の第１実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図。 第１実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置での分析の手順及びそれに伴う処理動作を示すフローチャート。 第１実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置でサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図。 本発明の第２実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図。 第２実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置での分析の手順及びそれに伴う処理動作を示すフローチャート。 第２実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置でサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図。 第２実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置でサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図。 本発明の第３実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図。 本発明の第４実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置でサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図。 第４実施例の変形例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置でサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図。 本発明の第５実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置で利用されるプレートホルダの構造を示す組立図（ａ）及び完成図（ｂ）。 第５実施例の変形例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置で利用されるプレートホルダの構造を示す組立図（ａ）及び完成図（ｂ）。 サンプル上にマトリックスを噴霧する前（ａ）と噴霧した後（ｂ）のサンプル観察画像の一例を示す図。

符号の説明

１…気密チャンバ
２…ステージ
３…サンプルプレート
４…サンプル
５…照射用窓
６…観察用窓
７…真空チャンバ
８…イオン輸送光学系
９…質量分析器
１０…検出器
１１…レーザ照射部
１２…レーザ光
１３…レーザ集光光学系
１４…ＣＣＤカメラ
１５…観察用光学系
１６…データ処理部
１７…ステージ駆動部
２０、３０、４０…制御部
２１、３１、４１…分析位置／領域設定部
２２、３３、４３…分析位置／領域決定部
２３…画像データ記憶部
２４…表示部
２５…操作部
３２、４２…位置ずれ補正部
３４…位置ずれ認識処理部
３５…位置ずれ算出部
４４…画像解析処理部
５０…プレートホルダ
５１…本体部
５１１…凹部
５１２…開口
５１３…光通過窓
５２…蓋部
５２１…開口窓
５３…ネジ
Ｍ１、Ｍ２…マーキング

［第１実施例］
以下、本発明に係る質量分析装置の一実施例（第１実施例）であるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置について図１〜図３を参照しつつ説明する。図１は本実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図である。

気密性を有する気密チャンバ１の内部にはサンプル４を上に載せたサンプルプレート３を積載するためのステージ２が配設され、気密チャンバ１と連結して設けられ、図示しない真空ポンプにより真空排気される真空チャンバ７の内部には、イオン輸送光学系８、質量分析器９、検出器１０等が配設されている。気密チャンバ１及び真空チャンバ７の外側には、レーザ照射部１１、レーザ集光光学系１３、ＣＣＤカメラ１４、観察用光学系１５などが配置されている。イオン輸送光学系８としては例えば、静電的な電磁レンズや多極型の高周波イオンガイド、或いはそれらの組み合わせなどが用いられる。質量分析器９としては四重極型分析器、イオントラップ、飛行時間型分析器や磁場セクター型分析器など、種々の形式のものが用いられる。

ステージ２には、互いに直交するｘ軸、ｙ軸の２軸方向に該ステージ２を高精度で駆動するためのステッピングモータ等を含む駆動機構（図示しない）が付設され、この駆動機構は制御部２０の制御の下にステージ駆動部１７により駆動される。

制御部２０の制御の下にレーザ照射部１１から出射されたイオン化用のレーザ光１２はレーザ集光光学系１３により絞られ、気密チャンバ１の側面に設けられた照射用窓５を通してサンプル４に向けて照射される。このときのサンプル４上でのレーザ光の照射径は例えば１μｍ〜数十μｍと微小径である。前述のように駆動機構によりステージ２がｘ軸−ｙ軸面内で移動されると、サンプル４上でレーザ光１２が当たる位置、つまりサンプル４上で質量分析の実行対象となる微小領域が移動する。これにより、サンプル４上でレーザ光照射位置、つまりは質量分析が実行される位置の走査が行われる。

一方、ＣＣＤカメラ１４は気密チャンバ１の側面に設けられた観察用窓６及び観察用光学系１５を介してサンプルプレート３上の所定の範囲を撮像し、ここで得られた２次元の画像信号は制御部２０に送られ、必要に応じて画像データ記憶部２３に格納される。撮像の範囲（倍率）は所定範囲で調整可能である。制御部２０は本装置の全体的な動作の制御を司るものであり、特徴的な機能ブロックとして分析位置／領域設定部２１と分析位置／領域決定部２２とを含む。また制御部２０には、オペレータが操作や指示を与える操作部２５と、サンプル４の２次元観察画像や２次元物質分布画像などを表示するための表示部２４が接続されている。

上述のようにレーザ光１２の照射によってサンプル４から出射したイオンは真空チャンバ７に導入され、イオン輸送光学系８を経て質量分析器９に送られ、質量分析器９により質量電荷比に応じて各種イオンが分離される。そして分離されたイオンが検出器１０に到達すると、検出器１０は入射したイオン量に応じた検出信号を出力し、この検出信号はデータ処理部１６に入力される。データ処理部１６は検出信号をデジタル化して適宜のデータ処理を実行する。例えばサンプル４上の或る１点又は複数点の局所的な質量分析を行う場合には、データ処理部１６では例えばその各点の質量スペクトルが作成され、該質量スペクトルに基づいて定性解析や定量解析を行うことで物質の特定やその含有量の推定が成される。また、サンプル４上の所定領域の質量分析を行う場合には、例えば上述したようにレーザ照射位置が走査される毎に特定の質量の信号強度を求めてこれを２次元画像化することで物質分布画像を作成する。

なお、制御部２０やデータ処理部１６の機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータに搭載した専用のソフトウエアを実行することにより実現することができる。

この顕微質量分析装置では、使用されるサンプルプレート３の形状及びサイズは決まっており、ステージ２の上面にはサンプルプレート３の外形サイズに適合する大きさの凹部が形成されている。したがって、オペレータがサンプルプレート３をこの凹部に嵌め込むように載置することで、ステージ２上でのサンプルプレート３の位置は一意に定まる。即ち、オペレータがサンプルプレート３をステージ２上から取り出して再び該ステージ２上に置いたときに、サンプルプレート３の位置ずれは生じず、サンプルプレート３上のサンプル４が同一であればサンプル４の位置ずれも生じない。

次に本実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置を用いた一般的な分析の手順とそのときの装置の処理動作について図２及び図３を参照して説明する。図２はこの顕微質量分析装置での分析の手順及びそれに伴う処理動作を示すフローチャート、図３はサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図である。

まずオペレータは、気密チャンバ１の外側において分析対象であるサンプル４をサンプルプレート３上に載せ、該プレート３を装置のステージ２にセットする（ステップＳ１）。そして、操作部２５より撮影の指示を行うと（ステップＳ２）、この指示を受けた制御部２０による制御の下に、ＣＣＤカメラ１４はサンプル観察画像を撮影して表示部２４の画面上に表示する。このときに表示部２４に表示される観察画像はリアルタイム画像であり、オペレータはこの観察画像を見ながら倍率を変化させたりステージ２の移動操作を行ったりしてサンプル４上の適宜の２次元範囲の観察画像を表示させるようにし、画像確定の操作を行う。すると、このときのサンプル観察画像が画像データ記憶部２３に記憶される（ステップＳ３）。このとき例えば図３（ａ）に示すサンプル観察画像Ｓが記憶されたものとする。

次にオペレータはサンプルプレート３を一旦装置から取り出し、サンプル４上にマトリックスを吹き付ける作業を行う。このときのマトリックスの付着方法は前述のように様々な方法のいずれかを用いることができ、特に限定されるものではないが、高い空間分解能を得るためにマトリックス溶液をスプレーする方法が有用である。そうしてサンプル４上にマトリックスを付着させたサンプルプレート３をステージ２に再びセットする（ステップＳ４）。前述のように、ｘ軸−ｙ軸平面上におけるサンプル４の位置はサンプルプレート３を取り出す前と同じになる。一般的には、マトリックスが付着された後にはサンプル４は不鮮明にしか観察できなくなる。

上述のように分析対象のサンプル４の準備ができ、これをオペレータが操作部２５より指示すると、制御部２０は画像データ記憶部２３から画像データを読み出して表示部２４の画面上に表示させる。これにより、表示部２４には図３（ａ）に示すような（但し領域指示枠Ａは無し）サンプル付着前のサンプル観察画像Ｓが表示される（ステップＳ５）。即ち、その時点で実際にステージ２上にセットされているサンプル４はマトリックスで被覆されていて鮮明な画像が取得できないものであっても（実際のサンプルの観察画像は例えば図３（ｂ）のようになる）、表示部２４の画面にはマトリックスが付着されていない鮮明な画像が表示される。

オペレータはこのサンプル観察画像Ｓにおいて所望の分析位置又は領域（１次元領域又は２次元領域）を指定する（ステップＳ６）。例えば分析位置／領域設定部２１は図３（ａ）に示すように領域指示枠Ａをサンプル観察画像Ｓ上に重ねて表示し、オペレータは操作部２５によりこの領域指示枠Ａの大きさや位置を変更することで２次元領域を指定するようにすることができる。もちろん、指定の方法はこれに限らず、例えば座標を数値で入力する等の方法も採り得る。

その後に制御部２０は上記指定されたサンプル４上の位置又は領域の質量分析を実行するように各部を制御する（ステップＳ７）。例えば分析位置／領域設定部２１で上述のようにサンプル４上の２次元領域が指定された場合には、分析位置／領域決定部２２は上記２次元領域を分析対象範囲として確定し、該２次元領域の座標（位置アドレス）を算出する。前述のようにステージ２上のサンプルプレート３の位置は一意に決まるため、図３（ａ）に示したマトリックス付着前の２次元サンプル観察画像Ｓ上で指定した領域から求まる座標と図３（ｂ）に示したマトリックス付着後の実際のサンプル４上での分析領域の座標とは一致する。

制御部２０は算出された座標に基づいて、レーザ光１２が照射される微小領域がステップ状に順次移動するようにステージ駆動部１７を介し駆動機構を制御する。これによりステージ２はステップ状に微小距離ずつ移動する。そして、ステージ２が微小距離移動して停止する毎に、レーザ照射部１１からパルス状にレーザ光１２を照射してサンプル４上の微小領域に対応する質量分析を実行する。こうしてサンプル４上に設定された分析対象領域内の微小領域に対する質量分析を漏れなく行い、データ処理部１６は例えば目的物質についての特定質量の信号強度のマップ（２次元物質分布画像）を作成し、これを表示部２４の画面上に表示する（ステップＳ８）。

また、サンプル４上の或る１点の局所分析又は位置が離れた複数点の局所分析を行いたい場合でも基本的な手順や処理動作は同じである。即ち、マトリックス付着前のサンプル観察画像上で１乃至複数の分析位置を指定すると、該分析位置の座標が求められ、マトリックス付着後のサンプル４上でその座標位置にレーザ光１２が照射されるようにステージ２の位置が調整されて質量分析が実行される。

なお上記説明では、ステップＳ６における分析位置又は領域の指定をマトリックス付着後のサンプル４をステージ２にセットした後に行ったが、分析位置又は領域の指定に用いるサンプル観察画像Ｓが画像データ記憶部２３に保持されている状態であれば、任意の時点で、つまりマトリックス付着前のサンプル４がステージ２上にセットされた状態やサンプルプレート３がステージ２上にない状態でも分析位置又は領域の指定を行うことが可能である。

以上のように本実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置によれば、マトリックス付着前の鮮明なサンプル観察画像を利用して分析位置や領域を設定することができるので、簡単に且つ高い精度で所望の位置や領域を指定することができる。また、マトリックス付着後のサンプル観察画像は不鮮明でも構わないので、液体マトリックスではなく、α−ＣＨＣＡ（α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid）やＤＨＢ（2,5-Dihydroxybenzoic Acid）、シナピン酸などの固体マトリックスを利用することができ、固体マトリックスの溶液をスプレーで噴霧するマトリックス付着方法などを併用することで高い空間分解能での質量分析が行える。

［第２実施例］
次に本発明に係る質量分析装置の他の実施例（第２実施例）であるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置について図４〜図７を参照しつつ説明する。図４はこの第２実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図である。図１に示した第１実施例の構成と同じ構成要素には同一符号を付して説明を略す。

上記第１実施例では、サンプルプレート３をステージ２に装着する際のその位置が一意に定まることを前提としている。しかしながら、その機械的精度が十分に高くない場合やステージ２にサンプルプレート３を装着する際にその位置が規制されていない場合には、始めにマトリックス付着前のサンプルプレート３をステージ２に装着した際と該プレート３を一旦取り出してマトリックスを付着させた後に再び該プレート３をステージ２に装着した際とでは、サンプルプレート３やその上のサンプル４に位置ずれが生じる可能性が高い。そのため、第１実施例のようにマトリックス付着前のサンプル観察画像Ｓを用いて指定した分析位置や領域から求めた座標をそのまま用いて質量分析を行う位置を決めると、サンプル４上で分析位置や領域がずれてしまうことになる。この第２実施例以降の実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置ではこうした位置ずれを考慮して、それを補正する機能を備えるものである。

この第２実施例の顕微質量分析装置は、第１実施例の顕微質量分析装置における制御部２０に代わる制御部３０を有し、制御部３０は、分析位置／領域設定部３１、位置ずれ補正部３２、分析位置／領域決定部３３、位置ずれ認識処理部３４、位置ずれ算出部３５を含む。

次に本実施例のＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置を用いた一般的な分析の手順とそのときの装置の処理動作について図５乃至図７を参照して説明する。図５はこの顕微質量分析装置での分析の手順及びそれに伴う処理動作を示すフローチャート、図６、図７はサンプル上の２次元領域を分析する場合の領域指定動作の説明図である。

図５においてステップＳ１１〜Ｓ１６の操作及び処理動作は図２におけるステップＳ１〜Ｓ６と基本的に同じであるので説明を略す。ここでは、マトリックス付着後のサンプル４を載せたサンプルプレート３がステージ２に装着された後、ＣＣＤカメラ１４によりマトリックス付着後のサンプル観察画像を撮影し、この例えば図６（ｂ）に示すようなサンプル観察画像Ｓ’と画像データ記憶部２３に格納されている図６（ａ）に示すようなマトリックス付着前のサンプル観察画像Ｓとを表示部２４の画面上に表示する。サンプル４に分かり易い明確な形状や色分布、色の濃淡などの特徴的な部位がある場合にはマトリックス付着後のサンプル観察画像でもその部位を認識できることがある。そこで、オペレータは両画像Ｓ、Ｓ’を比較し、同一個所であると推測できる部位をそれぞれの画像上で操作部２５のクリック操作等で指示する（ステップＳ１７）。

例えばいま、図６（ａ）、（ｂ）のＰ１とＰ１’及びＰ２とＰ２’がそれぞれ同一個所であると指示されたものとする。位置ずれ認識処理部３４はこうした操作部２５による指示を受け付け、位置ずれ算出部３５は同一個所であるとされた点の座標から位置ずれの方向（又は角度）や量を計算する（ステップＳ１８）。例えば、点Ｐ１が点Ｐ１’まで移動し点Ｐ２は点Ｐ２’まで移動したと考えると２本のベクトルを描くことができるから、画像の拡大や縮小はなく単純な移動（回転を含む）であるとの条件の下で、この２本のベクトルから画像Ｓから画像Ｓ’への移動方向や移動量を求めることができる。

上記第１実施例における分析位置／領域設定部２１と同じ機能を有する分析位置／領域設定部３１ではマトリックス付着前のサンプル観察画像Ｓにおいて分析位置又は領域の座標が設定される。そして、位置ずれ補正部３２は位置ずれ算出部３５で得られた位置ずれの方向及び量の情報に基づいて分析位置又は領域の座標を修正する。分析位置／領域決定部３３は位置ずれが修正された分析位置又は領域の座標を受け取って、これをマトリックス付着後のサンプル４上での分析対象範囲として確定する（ステップＳ１９）。これにより、例えば図７（ａ）に示すようにサンプル観察画像Ｓ上で領域指示枠Ａが設定されたのに対し、マトリックス付着後のサンプル４上では図７（ｂ）に示すようにサンプル４の位置ずれに応じてずれた分析領域Ａ’が設定され、この分析領域Ａ’内の微小領域の質量分析が実行される（ステップＳ２０）。

なお、上記説明では、ステップＳ１７において２点の同一個所の指定を行っていたが、１点のみでもよい。但し、その場合には位置が平行移動するような位置ずれしか補正できず、回転移動を伴うような位置ずれは十分に補正できない。一方、３点以上の同一個所の指定を行うことで、位置ずれの方向や量の算出精度を高めることができる。

［第３実施例］
次に本発明に係る質量分析装置の他の実施例（第３実施例）であるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置について図８を参照しつつ説明する。図８はこの第３実施例によるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置の全体構成図である。図１に示した第１実施例、図４に示した第２実施例の構成と同じ構成要素には同一符号を付して説明を略す。

上記第２実施例では、マトリックス付着前と付着後のサンプル観察画像をオペレータが確認して同一個所と思われる部位を操作部２５より指定するようにしていたが、この第３実施例では画像解析処理により同一個所の判定を自動的に行う。即ち、第２実施例における制御部３０に代わる制御部４０は、分析位置／領域設定部４１、位置ずれ補正部４２、分析位置／領域決定部４３のほかに、画像解析処理部４４を含む。

マトリックス付着後のサンプルプレート３がステージ２に装着されてＣＣＤカメラ１４によりそのサンプル観察画像が取得されると、画像解析処理部４４はそのマトリックス付着後のサンプル観察画像Ｓ’と画像データ記憶部２３に格納されているマトリックス付着前のサンプル観察画像Ｓとを取り込んで、両者を比較して位置ずれの方向や量を算出する。こうした処理機能は近年市販されている高性能な画像解析ソフトウエアで実現することができる。これにより、オペレータが目視による判断を行うことなく、マトリックス付着後のサンプルの位置ずれを補正して所望の分析位置や領域に対する質量分析を実行することができる。

［第４実施例］
次に本発明に係る質量分析装置の他の実施例（第４実施例）であるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置について図９を参照しつつ説明する。この第４実施例の顕微質量分析装置の構成は基本的に第２実施例又は第３実施例と同じである。

分析対象のサンプルは様々であり、サンプルによっては明瞭な形状、模様、色の濃淡などの特徴的な部位がない場合がある。またそうした部位があってもマトリックスの付着の仕方によっては特徴的な部位をうまく見つけられない場合もある。そこで、より確実に観察画像上で位置ずれを捉えられるように、この第４実施例ではサンプルプレート３の表面上に予めマーキング（又はパターン）を設けておく。即ち、図９（ａ）に示すようにサンプルプレート３上で互いに離れた２個所にマーキングＭ１、Ｍ２が設けられている。このマーキングＭ１、Ｍ２は図９（ｂ）に示すようにマトリックスが濃く吹き付けられても観察可能であるような明瞭なものとなっており、マーキングＭ１、Ｍ２を目印としてオペレータがマトリックス付着前と付着後の２枚のサンプル観察画像Ｓ、Ｓ’上で同一個所を指示することができる。

また第３実施例のように画像解析処理により自動的に位置ずれを検出する場合でも、マーキングＭ１、Ｍ２を目標として位置ずれの方向や量を容易に算出することができる。この場合、予めマーキングＭ１、Ｍ２の形状等に関する情報を画像解析処理部４４に与えておくことで、マーキングＭ１、Ｍ２を容易に認識して迅速に位置ずれ方向及びずれ量を求めるようにすることができる。

なお、吹き付けられたマトリックスによってマーキングＭ１、Ｍ２が認識しにくくなってしまった場合でも、サンプルプレート３上であるので、その個所だけマトリックスを拭き取ってマーキングＭ１、Ｍ２を認識し易いようにすることができる。

また、サンプルプレート３上に設けるマーキングの数を３個以上としてもよい。また図９の例は、複数のマーキングＭ１、Ｍ２が同一の観察視野内（つまりは１枚のサンプル観察画像内）に入るようにした状態で、マーキングＭ１、Ｍ２の位置を同一個所であるとして指定した例であるが、必ずしも同一観察視野内で複数のマーキングの位置指定を行う必要はない。

図１０はサンプルプレート３上で大きく離した位置に２個のマーキングＭ１、Ｍ２を設けた例であり、この場合には同一観察視野内に２個のマーキングＭ１、Ｍ２を捉えようとすると観察画像の倍率を低くする必要があり、マーキングＭ１、Ｍ２の正確な位置を認識しにくくなる。そこで、まずマーキングＭ１がサンプル観察画像Ｓの範囲に入るようにステージ２の位置を調整した上で、そのサンプル観察画像Ｓ内でマーキングＭ１の位置を指示する。その後に他方のマーキングＭ２がサンプル観察画像Ｓの範囲に入るようにステージ２の位置を調整した上で、そのサンプル観察画像Ｓ内でマーキングＭ２の位置を指示する。このように駆動機構によりステージ２を移動させた場合でもその移動距離を正確に求めれば、該移動距離は座標に換算することが可能であるから、マトリックス付着前後のサンプルプレート３の位置ずれを座標として求めることができる。

但し、このようにステージ２を移動することで複数のマーキングＭ１、Ｍ２の位置を指示する場合には、マトリックス付着前のサンプルプレート３上のマーキングＭ１、Ｍ２の位置の指定は該プレート３をステージ２から一旦取り出す前に行う必要がある。即ち、例えば図５のフローチャートでは、ステップＳ１１以降でステップＳ１４よりも前の時点でマトリックス付着前のサンプルプレート３上のマーキングＭ１、Ｍ２の位置の指定を行う必要がある。このように複数のマーキングの距離が離れていると、特に回転方向の位置ずれの補正精度を向上させることができる。

［第５実施例］
次に本発明に係る質量分析装置の他の実施例（第５実施例）であるＭＡＬＤＩ顕微質量分析装置について図１１を参照しつつ説明する。この第５実施例は第４実施例を発展させたものであり、サンプルプレート３自体に位置ずれ検知用のマーキングを設ける代わりに、サンプルプレート３を固定保持するプレートホルダにマーキングを設けている。

図１１（ａ）はサンプルプレート３をプレートホルダ５０に固定する場合の組立斜視図、（ｂ）はその完成斜視図である。プレートホルダ５０は、サンプルプレート３の外形よりも僅かに大きなサイズの凹部５１１が形成された本体部５１と、この上に被せられ、サンプルプレート３の外形サイズよりも小さな開口窓５２１を有する蓋部５２とから成る。この蓋部５２の上面の互いに離れた位置に２個のマーキングＭ１、Ｍ２が設けられている。上面にサンプル４を載せたサンプルプレート３は本体部５１の凹部５１１に嵌め込まれ、その上に蓋部５２を被せて両端のネジ孔にネジ５３を螺入して蓋部５２を本体部５１に対して固定する。サンプルプレート３の周縁部は蓋部５２により押圧され、このプレートホルダ５０に対して固定される。

装置のステージ２にはサンプルプレート３を上述のようにプレートホルダ５０に固定保持した状態で装着し、またマトリックスを吹き付ける場合にもプレートホルダ５０ごとステージ２から取り外す。プレートホルダ５０がステージ２に装着された状態で蓋部５２上のマーキングＭ１、Ｍ２を利用して位置ずれを把握し、それを補正する点は第２乃至第４実施例と同じである。

通常、サンプル４はサンプルプレート３に載せた状態で運搬や保管される。したがって、通常サンプル４と同数のサンプルプレート３を用意する必要がある。第４実施例のようにサンプルプレート３に直接マーキングを設ける構成では、マーキングを設けない場合に比べてサンプルプレート３のコストが上がり、これを多数用意する必要があるとなるとユーザのコスト負担が大きくなる。これに対し、プレートホルダ５０は多数のサンプルプレート３に対して使い回しができるため、全体的なコスト削減に有利である。また、ステージ２への脱着時にプレートホルダ５０でサンプルプレート３が保持されるので、取扱いがし易いという利点もある。

このようにプレートホルダ５０にマーキングＭ１、Ｍ２を設ける方法は、第３実施例のように自動的にマーキングを探索する際に特に有利である。例えばサンプルプレート３のサイズはサンプルに応じて様々なものが使用されるとしても、分析時に同じプレートホルダ５０を用いるか、或いは複数のプレートホルダ５０を用いるにしてもその寸法公差を小さくしておけば、ほぼ同じ位置にマーキングＭ１、Ｍ２の存在を確認することができる。したがって、自動的にステージ２を移動させてマーキングＭ１、Ｍ２を検出することが容易になる。もちろん、第４実施例の場合でもサンプルプレート３の寸法誤差を小さくしておけば同様の効果が得られるが、多数のサンプルプレート３を小さい寸法公差で作製するのはコストがかさむ。これに対し少数のプレートホルダ５０を小さい寸法公差で作製するほうがコストは小さくて済む。

図１２（ａ）は第５実施例の変形例によるプレートホルダ５０にサンプルプレート３を固定する場合の組立斜視図、（ｂ）はその完成斜視図である。図１１に示したプレートホルダ５０の構成は基本的に、サンプル観察を行う際に上方から照明を当てる落射光学系を使用することを前提としている。しかしながら、サンプルが生体試料であるような場合には、サンプルの下方側から照明を当てて上方からサンプル画像を取得する透過観察を行いたいことがある。そこで、図１２に示したプレートホルダ５０では本体部５１の凹部５１１の底面に開口５１２を形成し、この開口５１２を通して下方からサンプルプレート３の下面に光を照射することが可能となっている。この場合、サンプルプレート３としてはガラスや透明樹脂シートなど透明なものを用い、サンプルプレート３の下面に当たった光が上方に透過するようにする。なお、帯電によるイオン化効率の低下を防止するために、上記ガラスや透明樹脂シートの表面を例えばＩＴＯ（Indium Tin Oxide:酸化インジウムスズ）でコーティングするなど、その表面が導電性を有するようにすることが好ましい。

また蓋部５２は透明樹脂製などとし、マーキングＭ１、Ｍ２は基材にパターンを切刻する等により下からの透過光により容易に認識できるものとする。また本体部５１にあって蓋部５２を取り付けた際にマーキングＭ１、Ｍ２の直下となる位置には光通過窓５１３を形成しておく。これによって、図１２（ｂ）に示すように透過光学系により下方から光が照射されたときに、サンプル４を透過照明で観察することができ、またマーキングＭ１、Ｍ２も容易に認識することができる。

なお、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜に変更、修正、追加を行っても本願請求の範囲に包含されることは当然である。

例えば上記第２乃至第５実施例の顕微質量分析装置はＣＣＤカメラ１４による撮影画像を用いてサンプルプレート３やサンプル４の位置ずれを検出するものであるが、観察画像を利用する以外に、例えばレーザ方式、静電容量方式、光ファイバ方式などの非接触式の位置センサを別途設け、この位置センサによりステージ２に装着されたサンプルプレート３やプレートホルダ５０の位置を検知して位置ずれを求めるようにしてもよい。

Claims (7)

1. サンプルを載せるためのサンプルプレートが装置本体に着脱自在であり、該プレートを装置本体から取り外した状態で該プレート上に載せたサンプル上にマトリックスを付着させた後に該プレートを装置本体に装着し、マトリックスが付着されたサンプルにレーザ光を照射してイオン化を行うマトリックス支援レーザ脱離イオン化法によるイオン源を有する質量分析装置において、
   a)マトリックス付着前のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、該プレート上のサンプルの２次元画像を取得して保持する画像取得手段と、
   b)該画像取得手段により保持された２次元画像を表示手段に表示した表示画面上でオペレータが所望の位置を指定するための指定手段と、
   c)マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、前記指定手段により指定されたマトリックス付着前のサンプル上の位置に対応したマトリックス付着後のサンプル上の位置に対してレーザ光を照射して該位置についての質量分析を実行する分析制御手段と、
   を備えることを特徴とする質量分析装置。
2. サンプルを載せるためのサンプルプレートが装置本体に着脱自在であり、該プレートを装置本体から取り外した状態で該プレート上に載せたサンプル上にマトリックスを付着させた後に該プレートを装置本体に装着し、マトリックスが付着されたサンプルにレーザ光を照射してイオン化を行うマトリックス支援レーザ脱離イオン化法によるイオン源を有する質量分析装置において、
   a)マトリックス付着前のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、該プレート上のサンプルの２次元画像を取得して保持する画像取得手段と、
   b)該画像取得手段により保持された２次元画像を表示手段に表示した表示画面上でオペレータが所望の１次元的な又は２次元的な領域を指定するための指定手段と、
   c)マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で、前記指定手段により指定されたマトリックス付着前のサンプル上の領域に対応したマトリックス付着後のサンプル上の領域に対して照射位置を走査しながらレーザ光を照射して該領域の各微小領域についての質量分析を実行する分析制御手段と、
   を備えることを特徴とする質量分析装置。
3. 装置本体に対するサンプルプレートの脱着の前後における該サンプルプレート又は該プレート上のサンプルの位置ずれの方向及び量を把握する位置ずれ把握手段と、
   該位置ずれ把握手段により把握された位置ずれの方向及び量に応じてレーザ光の照射位置を修正するように該レーザ光とサンプルとの相対位置を変更する照射位置調整手段と、
   をさらに備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の質量分析装置。
4. 前記位置ずれ把握手段は、マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で取得された該プレート上のサンプルの２次元画像と、前記画像取得手段により保持されているマトリックス付着前のサンプルの２次元画像とを比較可能に表示し、両２次元画像上での１乃至複数の同一個所についてのオペレータの指示に基づいて位置ずれの方向及び量を把握するものであることを特徴とする請求項３に記載の質量分析装置。
5. 前記位置ずれ把握手段は、マトリックス付着後のサンプルが載せられたサンプルプレートが装置本体に装着された状態で取得された該プレート上のサンプルの２次元画像を取得する比較画像取得手段と、該比較画像取得手段により得られた２次元画像と前記画像取得手段により保持されているマトリックス付着前のサンプルの２次元画像とを画像解析することにより両画像の位置ずれの方向及び量を検出するずれ検出手段と、を含むことを特徴とする請求項３に記載の質量分析装置。
6. 前記サンプルプレート上に位置識別用の標識を設け、前記位置ずれ把握手段は該標識を利用して位置ずれの方向及び量を把握することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の質量分析装置。
7. 前記サンプルプレートを保持するホルダを装置本体に装着する構成とし、該ホルダに位置識別用の標識を設け、前記位置ずれ把握手段は該標識を利用して位置ずれの方向及び量を把握することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の質量分析装置。

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