JP4982635B2 - 元素分析とリンクしたフローサイトメトリーの方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明の別の態様は、本発明の方法を実行する試薬およびこれらの方法についての指示書を有するキットを提供することである。
ICP−MS:誘導結合プラズマ質量分析計である。
FACS:蛍光活性化細胞選別器である。
単一粒子:単一の実体(要素、材料、元素、物質、構造、生体、物体、本体、物品または事物)または所定の数(例えば、2、3または4)の個別の実体の単一のパケットであり、単細胞、単ビーズ、単一細菌、単一ウイルス粒子、単一花粉粒子、チリダニなど単独微細虫を含むがこれらに限定されない。
TOF−MS:飛行時間型質量分析計である。
粒子を連続的に導入(例えば、細胞ごとまたはビーズごとに)する手段であって、好ましくは離散型事象の分析に適用される手段;
粒子、または該粒子に結合した所定の分析対象物を定量化するために、粒子上または粒子内の、対象とする所定の分析対象物に結合した元素タグ(または分類可能な元素成分)を気化、原子化および励起またはイオン化させる手段;および
粒子、または粒子上の分析対象物に結合した元素タグの元素成分に関する情報を記録する手段
とを含む。これは、例えば、質量分析計(MS)によりまたは発光分光分析計(OES)により実行できる。
アフィニティー物質を有するビーズは、サンプル中の分析対象物を測定するキャリアとして使用できる。元素タグまたは標識の配置は、分析対象物上、アフィニティー物質上および/またはビーズ自体の上または内部である。
質量分析計に基づいたフローサイトメーター(MS FC)は、
粒子を連続的に導入する手段;
粒子および/または該粒子に結合した任意のタグを気化、原子化およびイオン化させる手段;および
気化、原子化およびイオン化された粒子および/または該粒子に結合した任意のタグの元素成分を分析する質量分析計
とからなる。
単一粒子を気化、原子化およびイオン化させる手段は、グロー放電、黒鉛炉および容量結合プラズマ装置または他の適当な装置を含む。好ましくは、単一粒子を気化、原子化およびイオン化させる手段は誘導結合プラズマ(ICP)装置を含む。この理由は、ICP装置がプラズマ中の短い残留時間の間に細胞およびビーズを分解、気化、原子化およびイオン化させる能力を有し、そしてICPが特に、付随する物質に耐性を有し、プラズマガスの組成の変化に対して堅固であり、極めて効果的な有効な噴霧器およびイオン化装置であるからである。
粒子を連続的に導入する手段;
粒子および/または該粒子に結合した任意のタグを気化、原子化および励起またはイオン化させる手段;および
気化/原子化および励起またはイオン化された粒子および/または該粒子に結合した任意のタグの元素成分を分析する発光分光分析計
とからなる。
次に、実施態様を詳細に説明する。
図2を参照すると、質量分析計に基づいたサイトメーター100の実施態様101は、粒子を連続的に導入する手段102、例えば、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化および励起またはイオン化させる装置104、すなわち誘導結合プラズマ(ICP)気化器/噴霧器/イオン化装置の上流に機能的に接続された細胞または粒子注入器171を含む。図示された実施態様においては、手段102は任意のインライン溶解システム110を含む。
飛行時間型(TOF)質量分析計106、116、126はイオン前処理装置の下流に機能的に接続される。
次に、図2の質量分析計に基づいたフローサイトメーター101の主要な構成要素および使用方法を詳細に説明する。
ある特定の場合においては、粒子(例えば単細胞)はタグ付けを必要としない。
場合によっては、粒子はタグ付けを必要としない。例えば、単細胞は、質量分析計によりバックグラウンドに対して検出可能な元素を含むかまたは元素に結合されている場合、タグ付けは必要とされない。例えば、バイオレメディエーション(微生物を活用した汚染環境の修復)において、元素種を蓄積している、細菌細胞または植物細胞の分析については、追加のタグ付けは必要とされない。さらに、金属、例えばプラチナまたは金を含む薬剤の細胞内蓄積に対しては、追加のタグ付けを必要としない。
粒子のタグ付けは当業者には公知の多くの方法により実施される。例えば、サクシニミジルエステル部を有する蛍光色素は、蛋白質(抗体)の1級アミンと効果的に反応して安定な色素−蛋白質結合物を形成する。DNAをタグ付けするための第1工程では、アミンが修飾されたヌクレオチド、すなわち5−(3−アミノアリル)−dUTPは、従来の酵素のタグ付け方法を用いてDNAに組み込むことができる。第2工程では、アミンが修飾されたDNAは、アミン反応性蛍光色素を用いて化学的にタグ付けできる。抗体のビオチン化はメルカプト基を標的とする固相化学反応を用いて実施される。これらの方法はよく確立されており、例えば、Molecular Probe社、Pierce Chemical社、他を含む、様々な会社からキット形式で入手可能である。特定の化学反応は放射免疫化学において公知である。例えば、放射性核種(88/99)Yおよび(177)Luを使用することにより、環状ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物(cDTPA)、イソチオシアネートベンジル−DTPA(SCN−Bz−DTPA)または1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン四酢酸(DOTA)(PMID:14960657)を用いて抗体をタグ付けできる。
サンプル導入システム102は、他のフローサイトメーターサンプル導入システムにおいて現在使用されている幾つかの装置を含むことができる。例えば、現在、フローサイトメトリーに使用している、様々な形式のシース流注入を含む幾つかの、細胞または粒子注入器171システムが存在する。ICPの溶剤充填(典型的には25から80μL/分に対して最適)に対する考慮のため、特定の状況における「空気の流れ」(またはICPの場合、「アルゴンの流れ」)注入器が最適であると考えられる(ただし、現在の設計に関するいくつかの改良は、細胞の凝集を最小化するためには好ましい)。ICP装置を含むここに開示される目的に適するすべてのサンプル導入装置は、現在存在するかまたは以後に開発されるかまたは改良されるかどうかに関係なく、この目的に役立つであろう。
インライン溶解システム110は、幾つかの情況下においては、有利に使用される。例えば、全細胞の導入が実施できない場合、インラインの溶解システムの使用が有利である。これは、本明細書に開示される目的に適する如何なる方法によっても実施することができ、当業者に現在知られている多数の方法を含み、細胞破壊をもたらすシース流の液体の酸性化、または浸透圧による細胞破壊を誘発する高純度(低導電率)水のシース流の液体の酸性化を含む。この例では、元素タグは保持され、サンプルを気化、原子化およびイオン化する装置に輸送される。ただし、トランジェントパルスはフローストリーム内での拡散によりわずかに広がる。
本明細書に開示される目的に適する任意の手段104、例えば黒鉛炉、グロー放電および容量結合型プラズマは、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化および励起またはイオン化するために利用できる。好ましくは、気化器/噴霧器/イオン化装置は誘導結合プラズマである。事例によっては、気化、原子化およびイオン化および/または励起は、様々な装置および様々な時間(例えば、原子化およびイオン化および/または励起のためにICPと組み合わせた気化のための黒鉛炉内で)に発生する。
ある状況下では、例えばMS FCの場合、イオン前処理装置112を使用して、質量分析計のためにイオンを適当な状態に調整することができる。質量分析計は減圧(典型的には10―4トル未満)で作動し、上記したイオン源は典型的にはより高圧(例えば、従来のICPにおける大気圧)で作動するため、イオン前処理装置の1つの機能は、圧力低減工程(真空インターフェイス)によってサンプルから抽出されたイオンを効果的に輸送することである。この工程および後続工程では、引き続いて質量分析計に輸送される中性原子に対するイオンの割合を増加することが望ましい。イオン光学構成要素(イオンレンズ)は典型的には、イオンを局在化し、中性原子が真空ポンプを通して除去されることを可能にして、この機能を果たす。イオン光学系の追加の機能は、イオンビーム(空間およびエネルギー)を調整して、質量分析計への受け入れ条件に適合させることである。
したがって、イオン前処理装置は
真空インターフェイス;
真空インターフェイスの下流の高域通過質量フィルター;および
真空インターフェイスの下流のガス充填されたイオン冷却セル
とを含む。
必要に応じて、例えば高質量フィルターおよびガス充填イオン冷却器などの様々な構成要素を、単一ハウジング内に設けることができる。これにより、例えば、向上した耐久性、ならびに向上した動作、操作および設置品質を提供できる。
前処理されたイオン雲は、同時式質量分析計を用いて分析できる。連続的な質量分析(例えば、四重極装置を利用する)もまた可能である。同時式質量分析器の例としては、TOF、3Dトラップおよびリニアトラップを含む。
MS FC 101法の利用が最も有利である(例えば、個別粒子の多重分析)、幾つかの例においては、同時式質量分析計が好ましい。例えば、気化器、噴霧器およびイオン化装置としてICPを使用する例では、単一粒子からの過渡的信号は20から200マイクロ秒の範囲の間、継続し、例えば、四重極質量分析計など連続的な質量分析計を使用する定量的な多重分析を可能にするには不十分である。そのような場合、好ましい質量分析計としては、TOF、アレイ検出磁場型、3Dイオントラップおよびリニアイオントラップが挙げられる。例えば、チューブ長さまたは衝突工程を通る、気化された粒子、原子またはイオンの輸送によって、気化、原子化およびイオン化させる装置の特性または過渡的信号の広がりのいずれかに起因して、過渡的信号の期間が著しく長い他の例においては(D.R.Bandura、VI BaranovおよびS.D.Tanner,J Anal.At.Spect.,2000年,V15,021−928など)、連続的質量分析器の有用性を見出すことができる。
白血病幹細胞およびそれらの前駆細胞は精製することができる[10]。これらの細胞は、組み合わせスクリーニングの新規方法を用いて幹細胞および前駆細胞に対して選択することにより、アプタマー選択のターゲットとして使用できる。選択されたアプタマーは、そのスクリーニングの多重分析に係る他のアプタマーとの交差反応性に対して試験および選択される。アプタマーは、当業者には公知のとおり、識別可能な安定な同位元素タグを用いて標識化できる。
慢性骨髄性白血病からのp210 bcr/ablチロシンキナーゼ融合タンパク質で形質導入された均一なMO7E細胞株が使用される。この細胞はCD33表面マーカーを発現し、また内部に多量のp210を含む。このマーカーは、市販されているタグ付きキット(NanoGoldTM、DELFIATM)を用いて好適にタグ付けされた抗体またはアプタマーでタグ付けできる。タグ付けされたアフィニティー生成物は固定された透過性細胞を用いて培養できる。
概念の説明は、四重極に基づいたICP−MSおよび実施例2のタグ付けされた細胞を用いて達成できる。
フローセルは、直接注入噴霧器またはシース−フロー非イオン化ナノスプレイヤーに基づいて構成できる。市販のフローサイトメーターは、蛍光に関連する部分を除いて改良を加えることで、利用可能である。
図4の注入器171を参照すると、注入器を用いて細胞(あるいはビーズまたは他の粒子)400を緩衝液と共に、ヒーター405で囲まれた脱溶剤チャンバー403内に注入する。緩衝液流は高圧ガスにより霧状化される。緩衝液および細胞(大部分は水)の揮発成分は、脱溶剤工程の間にエアロゾルからガス相に移行され、噴霧ガスの大部分と共に排出口407を通って脱溶剤チャンバーから外に放出される。大抵の場合、噴霧ガス流は注入器(噴霧器)の大きさと設計により制限される。したがって、完全な脱溶剤を達成するために、若干の補充ガスを導入できる。脱溶剤された重い細胞(またはビーズ)は、残りのガスと共に直線状の円筒流路409内に直接入り、EFCの気化器/噴霧器/イオン化装置104に導入される。一実施態様においては、この気化器/噴霧器/イオン化装置はICPプラズマであり、これは、〜1リットル/分のガスを導入できる。したがって、脱溶剤チャンバーと円筒形流路ハウジングとの間の空隙411を調整することにより、脱溶剤およびICPプラズマ中への流れを制御できる。
ICP−TOF−MS測定器は市場で入手可能である。TOF質量分析計は、例えば稀な白血病幹細胞の多様な分析に有益な同時分析計を備えている。
ICP−TOF−MSは、フローセルを装備できる。図1、2、3に示される測定器および好ましい実施態様に記載された測定器の構成要素は、組み合わせることができる。市販品の関連する構成要素(ELANTM ICP−MSおよびprOTOFTMオーソゴナルMALDI−TOF)は、作動システムの基本として調達できる。作動システムは、サイトメーターのプロトタイプの具体的データ収集の課題に対処するために若干の改良が必要となるであろう;当業者であれば適当な改良点はよく理解される。改良は、迅速、効率的な研究を可能にするように、ICP源およびTOF分析計に対する独立したコンピューター制御システムを操作することで十分である。
以下の実施例では、免疫沈降および洗浄後に、サンプルをHClで酸性にして得た溶液を通常の噴霧化により比較的均質な溶液を生成することが、従来の四重極ICP−MS測定器(連続走査)を用いて証明された。
図5はICP−MSとリンクした3×FLAG−BAPの免疫沈降分析の検量線である。M2アガロースビーズは、100μl当たり0.05ng〜1500ngの濃度範囲にわたり連続して希釈した3×FLAG−BAPのサンプルを取り込むために使用された。3×FLAG−BAPは、抗BAP1次抗体および抗マウス−ナノAu2次抗体を用いて検出した。希釈HClを用いてICP−MSサンプリングのナノゴールドタグを溶解した。この結果は、検出信号(金に対する)が抗原(FLAG−BAP)濃度に正比例すること、および少なくとも4.5桁の大きさの線形ダイナミックレンジを達成できることを示す。細胞またはビーズ当たり大きく異なる複製数で現れるバイオマーカーの同時測定を可能にするためには、サイトメトリック用途では大きなダイナミックレンジが重要である。
TNF−αまたはIK−6のいずれかに対するFluorokineTM捕捉抗体に結合したビーズを混合し、TNF−αおよびIK−6を含むサイトカイン混合物に曝し、インキュベートし、その後、Eu(抗TNF−αに対し)およびTb(抗IL−6に対し)でタグ付けされたサイトカイン特異的抗体を用いて精査した。HClを用いて洗浄、消化した後、溶液をEuおよびTbについて分析した。図6は、この同時免疫測定試験から得られた検量線を示す。少なくとも3桁の大きさ以上の抗原濃度を有する信号直線性が見られた。
図7はICP−MS検出器に接続された、Reacti−bind Maleic Anhydride 96ウェルプレート内で実施される直接免疫測定を用いる2つのタンパク質の同時測定結果を示す。この試験では、l×PBS内の2つのタンパク質(ヒトIgGおよび3×FLAG−BAP)を室温で1時間、3回、インキュベートして、無水マレイン酸プレートのウェル表面に結合させた。陰性コントロールは、タンパク質を含まない100μlのPBSとした。該プレートは、1次抗体である抗ヒトFab’−ナノAuおよび抗FLAG−Euを用いて分析し、内部標準として、1ppb のIrおよび1ppbのHoを有する10%HClで洗浄し、酸性化した[11]。均質なサンプルが使用され、そこではICP−MSへの従来の噴霧器導入のために、元素タグが酸性溶液に放出される。なお、ナノゴールドタグを使用するIgGに対する感度は、Euタグを使用するFLAG−BAPの感度に比べてほぼ10倍の大きさであることに注目すべきである;この理由は、各ナノゴールドタグが約70の金の原子(Auはモノアイソトピック(単一同位体)である)を含むのに対し、各Euタグはわずか6〜10のEu原子を含み、Euの2つの天然同位元素(151Euおよび153Euであり、その和が測定される)の間にほぼ等しく分布しているからである。この実施例は、少なくとも2つのタンパク質が同時に免疫反応し、相互干渉なく検出できることを示し、また、感度は抗原の濃度およびタグ当たりの測定された同位元素の原子数により変化することを示している。
キットは、(1)単細胞に結合した対象とする分析対象物に結合するタグ付けされた生物学的活性物質と、(2)質量分析計による単細胞分析の手順とからなり、組み立てられる。
本発明の方法および装置は法科学用途に利用できる。例えば、本発明の方法および装置を用いて、
抗原血液型(ABO式血液型およびルイス式血液型)を決定し、
体液(血液、精液、唾液)および他のバイオサンプル(全血、血漿、血清、尿、髄液、硝子体液、肝臓または毛髪)を識別し、
組織起源(種、個人識別情報、その他)を決定し、
親子関係を決定する、
ことができる。
本発明の方法および装置を輸血医療に利用して、
A型、B型およびD型の血液型タイピングの不一致を解明し、
幹細胞移植患者における移植白血球の起源を決定し、
移植片対宿主拒絶反応を有する患者のリンパ球の起源を決定する、
ことができる。
本発明者らは、本発明の概念を確証するために実施可能性試験を行った。従来の元素分析用に設計された(したがって、フローサイトメトリー用途には最適化されていない)四重極(連続質量走査)ICP−MS測定器を使用した。この測定器に2点だけ改良を加えた;すなわち、改良したサンプル導入システムを搭載し、オシロスコープを元の検出器システムの信号処理ハードウェアおよびソフトウェアと並列に接続した。
MO7e細胞株はヒト巨核球性白血病由来の細胞である。MO7eはCD33抗原(67kDaの一本鎖膜貫通型糖タンパク、骨髄細胞表面抗原CD33前駆体(gp67))を発現する。この細胞は細胞当たり約5000〜10000コピーを発現すると考えられる。この細胞株を用いて、個々の細胞を本発明による方法で観測できることを立証し、電流測定器を用いてこの方法の感度を評価した。CD33表面マーカーは、モノクローナル抗CD33(IgGlマウス)およびNanogoldTMでタグ付けされた抗マウス2次抗体(タグ当たり約70Au原子)を使用して検出された。2次抗体染色の効率は約10%と推定される。
MO7e細胞をT75フラスコ内で3日間培養した。細胞濃度は血球計を用いて測定し、0.5×106細胞/mlであった。
コンジュゲートされていないモノクローナル抗体の抗CD33。
2mg/mlで供給され、イムノテック社のカタログ番号1134の0.1%アジ化ナトリウムを用いてPBS/BSA中で精製されたIgGl(マウス)アイソタイプ。
Nonogold社のナノゴールド(タグ当たり約70のAu原子)でコンジュゲートされた2次抗マウスIgG。
37%ホルマリンから調製された1%ホルマリン;PBS中で希釈されている。
洗浄および抗体希釈用緩衝剤PBS/1%BSA。
50mM重炭酸アンモニウム緩衝剤、PH8.0。
チューブをPBS/1%BSA中に1時間浸漬した。MO7e細胞を5分間1500rmp(約200gで)でペレット状にし、5mlのPBS中で再懸濁し、ペレット状にし、洗浄液を廃棄した。
細胞ペレットを3mlのPBS/1%BSA中で再懸濁し、以下のように表記された3つのエッペンドルフ型チューブ(約106細胞/チューブ)に分配した。
1次および2次抗体添加
2次抗体のみ添加
抗体添加なし。
1次抗体をPBS/1%BSA中で1:50に希釈し、氷上で30分間細胞ペレットに添加した。
細胞をPBS/1%BSAで一度洗浄した。
2次抗体をPBS/1%BSA中で1:50に希釈し、氷上で30分間細胞ペレットに添加した。
細胞をPBS/1%BSAで1回、PBSで1回洗浄した。
染色された生細胞を室温で10分間、1%ホルマリン/PBS中で固定し、氷上でこの固定液中に一晩放置した。
抗体を受け入れない細胞は、染色された細胞と調和するようにPBS/1%BSAだけを用いて処理した。
染色されたホルマリン固定細胞を、5分間1500rmp(約200gで)でペレット状にし、翌日、チューブ当たり1mlの50mM重炭酸アンモニウム緩衝剤、PH8.0中で再懸濁した。遠心分離後に上清液を廃棄し、新しい重炭酸塩(0.5〜1ml)を各チューブに添加した。
チューブをゆっくり回してペレットを分解し、5分間放置して大きな凝集体が底に沈殿するのを待ち、細胞懸濁液全体の上部25μLをICP−MS測定器に注入した。
個別細胞導入に対するAuの集積信号(パルス検出器)は、300〜500カウント/秒(cps)、2次抗体のみでは100cps未満、抗体なしでは10cps未満、緩衝剤のみでは3cps未満を得た。
図9は、100ppt Rh(1%HNO3)の分離した直接注入と、上記の細胞懸濁液(分離した注入、50mM NH4HNO3)サンプルとの重ね合わせた結果を示す。
図10は、図9に関連するオシロスコープデータを示す。図A(左側)はAr2+(約107cps)信号に対する信号を示す。上側の図形は比較的大きい時間窓(約100μs)をカバーし、この線から平均イオン信号率を測定できる。下側の図形線は単一イオン検出事象におけるパルスを示す(非常に拡大した時間スケールにわたる)。図B(右側)は細胞導入からのAu+を示す。上側の図形は、多重イオン信号パルスが観測されないことを示している。下側の図形線は単一Auイオン検出事象における信号パルスを示す。典型的には、1つだけのイオンパルスが粒子事象時間窓内で観測され、このことは細胞当たり約1つのAu原子のみが平均して観測されることを示唆している。
本発明者らは、以下の条件、すなわち―約1×106細胞/サンプル、25μL/分でサンプリングする50μL/分での1mL/サンプルがICPに送られる―として算出し、サンプル導入速度を(非常に)近似的に400細胞/秒と概算する。
したがって、本発明者らは細胞当たり約1つのAu原子が観測されると推定する。
使用した測定器の検出効率は、1%硝酸中に100ppt(兆分率、質量/容積)を含むサンプルの連続吸引から得られた信号から予測した。得られた信号は約2000cpsであって、以下の条件、すなわち―100ppt(10−10g/mL、原子量103g/モル、25μL/分でプラズマに送る―として算出してRhの検出効率1×10−5が提示され、2000cpsが観測されるプラズマに送られる2×108原子Rh/秒を生成した。本発明者らは、この効率を以下の事項に帰属する;すなわち、100%イオン化、真空インターフェイスの1%透過(中心プラズマの100%がサンプラーを通って吸入されるイオンを含み、サンプラー流の1%がスキマーを透過する)、10%が四重極質量分析計を透過、したがって約1%がイオン光学系を透過する。(これらの予測から、本発明者らは、サイトメトリック用途における感度の向上は、真空インターフェイス構成の保持を仮定して、主として質量分析計(例えば、高い負荷サイクルを有するTOF)の透過率、およびさらに重要な点は、イオン光学系(先の説明によれば、主として加速光学系および空間−電荷―誘導イオンの除去によって))の透過率を向上させることに集中すべきであると推論する。
実施可能性テスト1で使用されたMO7e細胞サンプルは、MS FCの設計および最適化に重要な、単一粒子事象の過渡期間の予測の機会を提供する。細胞のNaCl含有量は0.9%w/wと予測される。16マイクロメータ細胞については、これは細胞当たりNaの2×1011原子に変換する。Na検出のこれらの試験に使用された測定器の効率、Rhに比べて低く、約1×10−6である。したがって、単細胞事象については、2×105イオンが検出器に到達するであろう。これは十分に大きい数であり、単一MO7e細胞事象に対応するNaイオンの到達期間が測定できる。
図11は幾つかの細胞導入事象の期間にわたりオシロスコープで検出されたNa+信号を示す。図Aに示されるデータは、細胞が30mM CaCl2緩衝剤に導入されたときのNa+信号を示す。図Bに示されるデータは、緩衝剤のみについての結果を表す。観測された信号の変化は、細胞群の細胞サイズ(容積したがってNa含有物)の変化を反映するか、またはNaが含有するMO7e細胞以外の粒子の存在を示す。ただし、本発明の目的にとって重要な観測は、単一粒子事象についての過渡信号が100〜150μsのオーダーであることである。
本発明者らは、現在のFACSの性能と実施可能性テスト1に記載された細胞注入を備えたICP−MS測定器の性能とを直接比較する機会を得た。さらに、このテストは、細胞内タンパク質のタグ付けを可能にするように構成した;これらの内部タグを検出できる場合、これは、表面タグの気化でなく、細胞全体およびその含有物が気化され、原子化され、イオン化されたことを意味する。
材料
ヒト単核細胞株:
MO7e親細胞株はヒト巨核球性白血病由来の細胞である。MO7eはCD33抗原(67kDa一本鎖膜貫通型糖タンパク、骨髄細胞表面抗原CD33前駆体(gp67))を表す。細胞当たり約5000〜10000のCD33抗原のコピー。
MBA−1およびMBA−4はp210 BCR/Abl発現プラスミドで形質転換されたM07eの安定クローンである。
HL−60(ATCCカタログ番号CCL−240)、抗CD33モノクローナル抗体の産生において抗原として使用される骨髄性白血病細胞株。
抗体:
抗CD33、マウスモノクロナール、コンジュゲートされていない、IgGl(マウス)アイソタイプ。0.1%アジ化ナトリウム(イムノテック社のカタログ番号1134)を用いてPBS/BSA中で精製され、2mg/mlで供給。
抗IgGl2a、マウス、(BD PharMingen、カタログ番号555571)(0.5mg/mlストック)
ウサギで生成された抗BCR抗体(Cell Signaling Techカタログ番号3902)、フローサイトメトリーに対して1:25で使用。
2次抗体:2001ナノゴールド−抗マウスIgG(NMI)および2004ナノゴールド−抗ウサギFab’(NRF)(Nanoprobes社)を製造業者の薦めに従い(1:50)で使用。
緩衝剤:
BD Biosciences FACS透過性溶液2(カタログ番号347692)
Ca++/Mg++を有するPBS;
PBS/1%BSA
37%ホルマリンから調製された1%および0.5%ホルマリン;PBS中で希釈
50mM重炭酸アンモニウム緩衝剤、PH8.0
操作手順:
チューブをPBA/1%BSA中に1時間浸漬した。
細胞を5分間1500rpm(〜200gで)でペレット状にし、5mlPBS中で再懸濁し、血球計を使用してカウントした。細胞生成量:
M07e−le6/ml
MBA−1−le6/ml
MBA−4−le6/ml
HL−60−le6/ml
生のM07e(チューブ番号1)およびHL−60(チューブ番号2)を氷上で30分間、抗体CD33(1:50)を用いて染色し、その後PBS/BSAで1回洗浄した。抗マウスIgG−Au(1:50)を、氷上でさらに30分間、洗浄された細胞ペレットに添加した。生きた染色細胞を1%ホルマリン/PBS中、10分間室温で固定し、48時間以上氷上でそのホルマリン/PBS液中に放置した。
透過処理した細胞を抗BCR抗体(1:25(チューブ番号3,4,5)または非特異的IgG(チューブ番号30,40,50 w/o 1次抗体)を用いて、45分間室温で処理した。2次抗体を洗浄された細胞抗ウサギ−IgG−Au(1:50)に45分間室温で添加した。
染色された細胞を0.5%ホルマリン中での後固定の前に2度洗浄し、ホルマリンを50mM重炭酸アンモニウム緩衝剤に置きかえたときは、MS分析する前に週末の間、冷蔵庫内に保存した。
材料
抗体:
抗IgG1−FITCマウスアイソタイプ(BD PharMingen)
マウス内で産生された抗CD45−FITC抗体(BD PharMingen)をフローサイトメトリーに対して1:50で使用。
CD45はすべてヒト白血球上で発現される。FACS設定のために陽性サンプルとして使用した。
2次蛍光抗体:抗マウスIgG−FITC(BD PharMingen)および抗ウサギFITC(Biolab)を(1:50)で使用した。
緩衝剤:
BD Biosciensces FACS透過性溶液2(カタログ番号347692)
Ca++/Mg++を有するPBS;
PBS/1%BSA
37%ホルマリンから調製された1%および0.5%ホルマリン;PBS中で希釈
50mM 重炭酸アンモニウム緩衝剤、PH8.0
操作手順:
細胞調製および1次抗体染色は、le6細胞/ml/チューブを用いてICP−MSに対するサンプルと並列に実施した。
蛍光2次抗体染色および細胞洗浄の全手順は、暗所で氷冷下、実施した。
最終PBS洗浄細胞をPBS(ホルマリンでない)中で再懸濁し、直ちにFACS(BD FACSCalibur)により処理した。
ゲートおよび設定は、正(R4)チャネルとして抗CD45−FITC染色HL−60を用い、負(R3)チャネルとして抗マウスIgG−FITC染色HL−60を用いて測定した。
ICP−MS検出(灰色)および従来のFACS(白色)の両方の結果が、図12にまとめて示されている。ICP−MSによる3重分析の標準偏差はエラーバーに示され、FACSについての等価不確実性は示されていない。
CD33(MO7eおよびHL60上の表面マーカー)およびBCR(MO7e、MBA1、MBA4における内部マーカー)は、FACSおよびICP−MS検出器の両方により測定した。これは細胞全体(透過処理した)およびそれら細胞の含有物がICP−MS内で気化、原子化、イオン化されたことを意味する。さらに、FACSおよびICP−MSの結果の大部分は、表面および内部マーカーの両方に対して、ならびに処理空白に対して主としてむしろよく一致する。
多重分析に関する別の方法は、抗原を固定する様々な識別可能ビーズを使用することである。ビーズは概して、それらの表面に結合した捕獲親和剤(例えば、抗体)を有する。サンプルに曝された後、ビーズ−抗原複合体は、一般に、上記のとおり(本明細書内や2002年7月4日付け米国特許第2002/0086441号で公開された米国特許出願第09/905,907号および第10/614,115号)、元素または同位元素でタグ付けされる第2アフィニティー生成物(抗体、アプタマー等)に曝される。ビーズはそれらの元素組成(表面元素標識およびカプセル化された元素標識またはビーズ材料中に組み込まれた元素標識であってもよい)により識別される。ビーズの識別は、ビーズまたはサンプルに結合した捕獲親和剤の種類と連動している(例えば、異なる元素標識を有するビーズは異なるサンプルに曝されるか、あるいは96−または384−または1536−ウェルプレートの異なるウェル内に置かれる)。したがって、2次アフィニティー生成物タグを検出することにより、抗原の存在が測定され、そしてビーズの元素組成(元素標識)は、どの抗原が捕獲されるのか、あるいはその中に抗原が捕獲されたサンプルを指摘している。この方法は、Luminexに譲渡された米国特許第6,524,793号や、そこに引用されている文献を模倣している。
以下の出版物はここに引用することにより本明細書に取り込まれるものとする。
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本出願は、2004年3月25日に出願された米国仮特許出願第60/555,952号「発明の名称:元素分析とリンクしたフローサイトメトリーニオケル方法および装置(Method and Apparatus for Flow Cytometry Linked with Elemental Analysis)」の利益を主張するものであり、この引用により上記仮出願の全内容が本明細書に取り込まれるものとする。
Claims (60)
- 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子を気化、原子化および励起またはイオン化させる手段;
粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、大気圧又はより高圧で作動するように構成されている、粒子を気化、原子化および励起またはイオン化させる装置;および
前記一つ以上の個々に気化、原子化および励起またはイオン化された粒子の元素成分を分析する分光計
とからなる、元素のフローサイトメーター。 - 粒子は、生物細胞、生物粒子、および生物粒子と他の粒子との接合物の中の少なくとも一つを含む、請求項1に記載の元素のフローサイトメーター。
- 粒子は、複数の元素タグ又は一つ以上の元素の原子を含む、請求項2に記載の元素のフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、1秒間に400個又はそれ以上の速度で粒子を連続的に導入する、請求項3に記載の元素のフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、1つずつ粒子を導入する、請求項4に記載の元素のフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、細胞注入器である、請求項4に記載の元素のフローサイトメーター。
- 気化、原子化および励起またはイオン化させる装置の下流に、イオン前処理装置を有する、請求項4に記載の元素のフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、大気圧より低い圧力で作動する、請求項7に記載の元素のフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を加速し、一つ以上の優性イオンの質量を有するイオンを除去する、請求項8に記載の元素のフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる手段;
粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、大気圧又はより高圧で作動するように構成されている、粒子または元素タグを気化、原子化およびイオン化させる装置;および
前記気化、原子化およびイオン化させる装置の下流で、一つ以上の個々に気化、原子化およびイオン化された粒子又は元素タグの元素成分を分析する、この装置に機能的に接続された質量分析計とからなる、質量分析計に基づいたフローサイトメーター。 - 粒子は、生物細胞、生物粒子、および生物粒子と他の粒子との接合物の中の少なくとも一つを含む、請求項10に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子は、複数の原子又は元素タグを含む、請求項11に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、1秒間に400個又はそれ以上の速度で粒子を連続的に導入する、請求項12に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 気化、原子化およびイオン化させる前記装置が、誘導結合プラズマを含む、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が細胞注入器を含む、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段と、気化、原子化およびイオン化させる前記装置との間にインライン溶解をさらに含む、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段と、気化、原子化およびイオン化させる前記装置との間にインライン脱溶媒をさらに含む、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、飛行時間型質量分析計からなる、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、アレイ検出磁場型質量分析計からなる、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、3Dイオントラップ質量分析計からなる、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、リニアイオントラップ質量分析計からなる、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 気化、原子化およびイオン化させる装置の下流に、イオン前処理装置を有する、請求項13に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、大気圧より低い圧力で作動する、請求項22に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を加速し、一つ以上の優性イオンの質量を有するイオンを除去する、請求項23に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる手段;
粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、大気圧又はより高圧で作動するように構成されている、粒子を気化、原子化およびイオン化させる装置;
気化、原子化およびイオン化させる前記装置の下流で、この装置に機能的に接続されたイオン前処理装置;および
前記イオン前処理装置の下流で、一つ以上の個々に気化、原子化およびイオン化された粒子の元素成分を分析する、このイオン前処理装置に機能的に接続された質量分析計;とからなる、質量分析計に基づいたフローサイトメーター。 - 前記イオン前処理装置が真空インターフェースを有し、
前記真空インターフェースの下流にある高域通過質量フィルター;および
前記真空インターフェースの下流にあるガス充填イオン冷却セル;
とからの少なくとも1つを含む、請求項25に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。 - 粒子は、生物細胞、生物粒子、および生物粒子と他の粒子との接合物の中の少なくとも一つを含む、請求項25に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子は、複数の原子又は元素タグを含む、請求項27に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、1秒間に400個又はそれ以上の速度で粒子を連続的に導入する、請求項28に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 気化、原子化およびイオン化させる装置の下流に、イオン前処理装置を有する、請求項29に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、大気圧より低い圧力で作動する、請求項30に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を加速し、一つ以上の優性イオンの質量を有するイオンを除去する、請求項31に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる手段;
粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる装置;
前記気化、原子化およびイオン化させる装置の下流で、この装置に機能的に接続されたイオン前処理装置;および
前記イオン前処理装置の下流で、一つ以上の個々に気化、原子化およびイオン化された粒子又は元素タグの元素成分を分析する、この装置に機能的に接続された質量分析計;とからなり、
前記イオン前処理装置が真空インターフェースを有し、前記真空インターフェースの下流にある、低質量カットオフを有する帯域通過質量フィルターとして作動する高域通過質量フィルター;および前記真空インターフェースの下流にあるガス充填イオン冷却セル;とからの少なくとも1つを含む、
質量分析計に基づいたフローサイトメーター。 - 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる手段;
粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、粒子または該粒子に結合した元素タグを気化、原子化およびイオン化させる装置;
前記気化、原子化およびイオン化させる装置の下流で、この装置に機能的に接続されたイオン前処理装置;および
前記イオン前処理装置の下流で、一つ以上の個々に気化、原子化およびイオン化された粒子又は元素タグの元素成分を分析する、この装置に機能的に接続された質量分析計;とからなり、
前記イオン前処理装置が真空インターフェースを有し、前記真空インターフェースの下流にある高域通過質量フィルター;および前記真空インターフェースの下流にあるガス充填イオン冷却セル;とからの少なくとも1つを含み、
前記高域通過質量フィルターおよびガス充填イオン冷却セルを共有ハウジング内に含む、
質量分析計に基づいたフローサイトメータ。 - 粒子を連続的に装置内に導入して、粒子を気化、原子化およびイオン化させる手段; 粒子を連続的に導入する前記手段の下流で、大気圧又はより高圧で作動するように構成されている、粒子を気化、原子化およびイオン化させる装置;および
前記気化、原子化およびイオン化させる装置の下流で、一つ以上の個々に気化、原子化およびイオン化された粒子の元素成分を分析する、この装置に機能的に接続された質量分析計;
とからなる、質量分析計に基づいたフローサイトメーター。 - 粒子は、生物細胞、生物粒子、および生物粒子と他の粒子との接合物の中の少なくとも一つを含む、請求項35に記載の元素の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子は、複数の原子又は元素タグを含む、請求項36に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、1秒間に400個又はそれ以上の速度で粒子を連続的に導入する、請求項37に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 気化、原子化およびイオン化させる前記装置が、誘導結合プラズマを含む、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段が、細胞注入器を含む、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段と、気化、原子化およびイオン化させる装置との間にインライン溶解をさらに含む、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を連続的に導入する前記手段と、気化、原子化およびイオン化させる装置との間にインライン脱溶媒をさらに含む、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、飛行時間型質量分析計からなる、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、アレイ検出磁場型質量分析計からなる、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、3Dイオントラップ質量分析計からなる、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 前記質量分析計が、リニアイオントラップ質量分析計からなる、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 気化、原子化およびイオン化させる装置の下流に、イオン前処理装置を有する、請求項38に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、大気圧より低い圧力で作動する、請求項47に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- イオン前処理装置は、気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を加速し、一つ以上の優性イオンの質量を有するイオンを除去する、請求項48に記載の質量分析計に基づいたフローサイトメーター。
- 粒子を、大気圧又はより高圧で作動するように構成されている装置に連続的に導入して、粒子を気化、原子化および励起またはイオン化させ;
気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を分光計に導入して、前記一つ以上の個々に気化、原子化および励起またはイオン化された粒子の元素成分を分析する
ことからなる、粒子を分光計に導入する方法。 - 前記分光計が、質量分析計からなる、請求項50に記載の方法。
- 前記質量分析計が、飛行時間型質量分析計からなる、請求項51に記載の方法。
- 前記分光計が、発光分光分析装置からなる、請求項50に記載の方法。
- 前処理のために、大気圧より低い圧力で、装置から気化、原子化および励起またはイオン化された粒子の少なくともいくらかを搬送することを含む、請求項50に記載の方法。
- 前処理は、一つ以上の優性イオンの質量を有するイオンを除去するために、気化、原子化および励起またはイオン化された粒子の少なくともいくらかを前処理することを含む、請求項54に記載の方法。
- 粒子から製造されたイオンの質量対電荷の比率に従って実行された元素分析結果を得るために、分光計に導入された気化、原子化および励起またはイオン化された粒子を分析することを含む、請求項55に記載の方法。
- 元素分析結果を得るための気化、原子化および励起またはイオン化された粒子の分析は、粒子から製造されたイオンによる分散によって測定された質量対電荷の比率に従って実行される、請求項56に記載の方法。
- 粒子を、元素タグを用いて標識化する工程を含む、請求項56に記載の方法。
- 粒子がビーズであって、少なくとも一つの元素タグを前記ビーズの表面に結合させる、請求項58に記載の方法。
- 粒子がビーズであって、少なくとも一つの元素タグを前記ビーズ内に組み込ませる、請求項58に記載の方法。
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