JP4981305B2 - アルツハイマー病の発症リスク又はアルツハイマー病発症予後の予測方法 - Google Patents

Description

本発明は、アルツハイマー病発症リスク及びアルツハイマー病発症予後の予測方法に関する。より詳しくは、ヒトから採取された生体液中に存在する、アミロイドβペプチドの凝集に対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、変性Ｌ−ＰＧＤＳと称す）の定量測定、又は、ヒトから採取された生体液におけるアミロイドβペプチドのシャペロン活性の測定を行い、得られた測定値と基準の測定値とを比較することにより、個人が将来アルツハイマー病に発症するリスクを予測する又はアルツハイマー病に発症した個人の発症予後を予測する行程を含むアルツハイマー病発症リスク又はアルツハイマー病発症予後の予測方法に関する。

近年、高齢化社会に伴い、痴呆性疾患患者は増加の一途を辿っている。特にアルツハイマー病の患者は、約１５０万人存在する痴呆性疾患患者のうち、約半数存在すると推定される。アルツハイマー病の主たる原因は、アミロイドβペプチドが凝集し、脳の全般に蓄積し、老人斑を形成することにあると考えられている。しかしながら、脳内におけるアミロイドβペプチドの凝集及び蓄積の機構については解明されていない。この機構を解明することにより、アルツハイマー病を治療又は予防することができれば、老人福祉介護における労力を軽減することができる上に、個人の尊厳が保たれる。

一方、本発明者は、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、Ｌ−ＰＧＤＳともいう）が、脳脊髄液中に多量に存在することが知られているβ−トレースと同一であることを明らかにした（非特許文献１〜３）。この事実の発見により、本発明者は、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の各種痴呆性疾患への影響について解析を行い、各種痴呆性疾患の診断、治療及び予防への応用について検討を行っている。

例えば、本発明者は、被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の濃度を測定することにより、正常圧水頭症と、アルツハイマー病、パーキンソン病及び脳血管性痴呆などの外科手術による改善の見込みが薄い痴呆性疾患を鑑別することができることを見出し特許出願を行っている（特許文献１）。

また、本発明者は、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素がプロスタグランジンＤ_２を生合成するだけではなく、アミロイドβペプチドの凝集に対するシャペロン活性を有することを明らかにした。つまり、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素がアルツハイマー病に関与していることを明らかとした。そして、本発明者は鋭意検討を行った結果、当該Ｌ−ＰＧＤＳをアミロイドβペプチドの凝集抑制剤とする第二医薬用途として特許出願を行っている（特許文献２）。

近年、個人の体質及び病態などを測定することにより、複数存在する治療薬中から最も効果的な治療薬の選択、投与後の副作用の発生リスクの予測ならびに将来疾患にかかる可能性の予測など、患者に最適な医療を提供するテーラーメイド医療が注目を浴びている。

アルツハイマー病に関しても例外ではなく、例えば、アポリポ蛋白Ｅ及びミドコンドリア型アルデヒド脱水酵素遺伝子２のアイソフォームを特定することにより、アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法（特許文献３）、アポリポ蛋白Ｃ２遺伝子のマイクロサテライト配列の反復回数を測定により散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法（特許文献４）などの技術が開示されている。さらに、ヒトタウ遺伝子の第１１イントロンの遺伝子多型の測定によりアルツハイマー病の発症年齢を予測する方法（特許文献５）及びアポリポ蛋白Ａ２遺伝子多型の測定により散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法（特許文献６）などの技術が開示されている。

しかしながら、上記の文献におけるアルツハイマー病の発症リスクの予測方法は、個人の体質に由来するアルツハイマー病の発症リスクは予測できるものの、個人の生活習慣に基づく発症リスクは予測することは困難である。また、アルツハイマー病発症予後を予測できる方法は存在しない。

国際公開公報２００２／００８７５０号パンフレット 特願２００４−２１８９５２号 特開２００１−２９９３９７号公報 特開２００５−０１３１４８号公報 特開２００５−０６５５９４号公報 特開２００５−１１８０２６号公報 Hoffmann A et al., J Neurochem., 61, 451-456, 1993 Zhan M. et al., Neurosci. Let., 154, 93-95, 1993 Watanabe K. et al., Biochem. Biophys. Res. commun., 203, 1110-1116, 1994

新規なアルツハイマー病の発症リスク又はアルツハイマー病発症予後を予測する方法について提供する。

本発明者らは鋭意検討を行った結果、アルツハイマー病の発症リスク及びアルツハイマー病発症予後を予測する新規なマーカーを発見した。
したがって、本発明は、
［１］ 個人が将来アルツハイマー病に発症するリスクを予測する方法又はアルツハイマー病に発症した個人の発症予後を予測する方法であって、
(I) ヒトから採取された生体液中に存在する、アミロイドβペプチドのシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、変性Ｌ−ＰＧＤＳと称す）の定量測定；又は
(II) ヒトから採取された生体液におけるアミロイドβペプチドのシャペロン活性の測定；
を行い、
得られた測定値から個人が将来アルツハイマー病に発症するリスクを予測する又はアルツハイマー病に発症した個人の発症予後を予測する
ことを特徴とする予測方法、
［２］ 生体液が、脳脊髄液である前項１に記載の予測方法、
［３］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白に、プロスタグランジンＤ_２、レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンが不可逆的に結合した複合体である前項１に記載の予測方法、
［４］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳが、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の６５番目のシステインのチオール基が酸化ストレスにより酸化されたアミノ酸配列からなる蛋白である前項１に記載の予測方法、
［５］ (I) ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法である前項１に記載の予測方法、
［６］ (I) ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）法である前項１に記載の予測方法、
［７］ (I) ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、生体液から変性Ｌ−ＰＧＤＳを含む全ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を分離後、分離された全ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素中に存在する変性Ｌ−ＰＧＤＳを定量することを含む前項１に記載の予測方法、
［８］ 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白にプロスタグランジンＤ_２、レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンが不可逆的に結合した複合体、並びに、
［９］ 配列番号１に示されるアミノ酸配列中の６５番目のシステインのチオール基が酸化ストレスにより酸化されたアミノ酸配列からなる蛋白である。

本発明は、アルツハイマー病の発症リスクを予測することができる。特に睡眠不足や酸化ストレスなどの個人の生活習慣に基づくアルツハイマー病の発症リスクを予測することができる。さらに、本発明はアルツハイマー病発症予後を予測することができる。

本発明における「アルツハイマー病」とは、アミロイドβペプチドが脳の全般に蓄積（老人斑を形成）し、神経細胞間の情報伝達が阻害され、広汎な脳萎縮がみられる初老期痴呆の代表的疾患をいう。また、アルツハイマー病は、発症した患者が、
(i) 初期症状として記銘力障害及び空間的・時間的見当識障害などがみられ、
(ii) 病状が進行すると錐体外路症状として筋緊張の亢進がみられ、
(iii) 末期には痴呆が高度になり全身衰弱で死亡する、
疾患をいう。上記初期症状は、初老期でみられる場合がほとんどであるが、若年でみられる場合もあれば、６５歳以上でみられる場合もある。

本発明における「アルツハイマー病の発症リスク」とは、健常なヒトが将来アルツハイマー病を発症する可能性をいう。ここで、「発症する可能性」とは、アルツハイマー病になりやすい又はなりにくいなどの傾向による表現、ならびに、例えば１０％、２分の１及び７割などの確率による表現を含む。また、「将来」とは、基本的には初老期（約６０〜６５歳）未満の年齢のヒトにおける、初老期以上の年齢をいうが、本発明はこれらに限定されるものではない。

また、本発明における「アルツハイマー病発症予後」とは、アルツハイマー病が発症したと診断された患者における発症後の病状の進行の早さをいう。例えば、上記(i)の症状から(ii)の症状を経て、(iii)の症状に至る進行の早さをいう。

本発明における「アミロイドβペプチド」とは、４０〜４２、３のアミノ酸からなるペプチドをいい、β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼより前駆体蛋白（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ β Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ)から切り出されうるペプチドをいう。本発明においてアミロイドβペプチドは、Ａβと略すこともある。

本発明の第１の方法は、ヒトから採取された生体液中に存在する、アミロイドβペプチドの凝集に対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の定量測定を含む。

本発明における「生体液」とは、ヒトから侵襲的又は非侵襲的に採取しうる液体をいい、例えば、脳脊髄液（以下ＣＳＦと略すこともある）、細胞液、血液、汗、涙及び尿などが挙げられる。特にＬ−ＰＧＤＳの含有量が多い観点から脳脊髄液が好ましいが、これに限定されるものではない。

上記「ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）」とは、配列番号１のアミノ酸配列で示される蛋白をいい、特に脳脊髄液の多く存在し、プロスタグランジンＤ_２合成能、脂溶性生理活性物質の輸送能及びアミロイドβペプチド（Ａβ）のシャペロン活性を併せ持つ多機能蛋白をいう。また、本発明においてＬ−ＰＧＤＳは、β−トレースと置き換えていうこともある。

本発明者は、上記Ｌ−ＰＧＤＳが、
(1) レチノイド（活性型ビタミンＡ）、甲状性ホルモンなどの脂溶性生理活性物質、アミロイドβペプチド、ならびに、ビリルビン及びビリベルジンなどのヘム分解物と高い親和性を有する第１のサイト、
(2) アミロイドβペプチド（Ａβ）及びプロスタグランジンＤ_２を補足し、アミロイドβペプチドのシャペロン活性を有する第２のサイト
の２サイトを備えることを明らかとした。

したがって、上記「アミロイドβペプチド（Ａβ）の凝集に対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）」とは、Ｌ−ＰＧＤＳの第２のサイト及びその周辺部における他の物質との非可逆的な結合及び官能基の置換などにより、ＡβとＬ−ＰＧＤＳの第２のサイトとの弱い結合が阻害された状態のものをいう。また、この際、Ｌ−ＰＧＤＳの第１のサイトには、上記の高い親和性を有する物質が結合されていても、結合されていなくてもよい。

上記「アミロイドβペプチド（Ａβ）の凝集に対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）」とは、主に、
(A) 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白にプロスタグランジンＤ_２、レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンが結合した複合体、
及び、
(B) 配列番号１に示されるアミノ酸配列中の６５番目のシステインのチオール基が酸化ストレスにより酸化されたアミノ酸配列からなる蛋白
が挙げられる。本発明では、これらアミロイドβペプチドの凝集に対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）を、単に「変性ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（変性Ｌ−ＰＧＤＳ）」ということもある。

上記「(A) ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）とプロスタグランジンＤ_２、レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンとの複合体」とは、
(a) プロスタグランジンＤ_２が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５番目のシステインのチオール基と共有結合した複合体、
(b) プロスタグランジンＤ_２が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５番目のシステイン周辺のアミノ酸と不可逆的に結合した複合体、
及び、
(c) レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンが、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の第１のサイトに不可逆的に結合した複合体
を含む。

本発明における「プロスタグランジンＤ_２」とは、睡眠誘発、体温低下及び黄体ホルモン遊離ホルモン分泌抑制などの中枢作用を持つ物質をいい、ＩＵＰＡＣ名で（５Ｚ，１３Ｅ）−（１５Ｓ）−９α，１５−ジヒドロキシ−１１−オキソプロスタ−５，１３−ジエン−１−酸と称する物質をいう。本発明において、プロスタグランジンＤ_２はＰＧＤ_２と略すこともある。ＰＧＤ_２の化学構造式を以下に示す。

また、上記「(a) プロスタグランジンＤ_２が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５番目のシステインのチオール基と共有結合した複合体」及び「(b) プロスタグランジンＤ_２が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５番目のシステイン周辺のアミノ酸と不可逆的に結合した複合体」は、Ｌ−ＰＧＤＳの８９、１６７及び１８６番目のシステイン（つまり、配列番号１のアミノ酸配列のうち、６５番目のシステイン以外の全てのシステイン）をアラニンに置換した遺伝子組み換え産物が、ＰＧＤ_２と不可逆的に結合することが確認されたことによりその存在が実証された。

上記「Ｌ−ＰＧＤＳの６５番目のシステイン周辺のアミノ酸」とは、上記Ｌ−ＰＧＤＳの第２のサイトを形成するアミノ酸であれば、特に限定されるものではないが、例えば、４３番目のトリプトファンおよび１１１番目のヒスチジンまでのアミノ酸などが挙げられる。また、「不可逆的に結合した」とは、主に共有結合をいうが、Ｌ−ＰＧＤＳからＰＧＤ_２を分離が困難な程度に強固に結合しているものであれば、特に限定されるものではない。

以上のことから、睡眠不足などにより生体液、特に脳脊髄液中のＰＧＤ_２の濃度が高い状態が続くと、ＰＧＤ_２がＬ−ＰＧＤＳの第２のサイトに非可逆的に結合する可能性が高くなる。そして、このＬ−ＰＧＤＳとＰＧＤ_２が不可逆的に結合した複合体は、もはやＡβの凝集に対するシャペロン活性を喪失しているため、Ａβの凝集（老人班）形成の原因となると考えられる。

上記「レチノイド」とは、生体内で形態形成制御作用及び細胞の分化増殖制御などの作用を持つ物質をいい、例えば、オールトランスレチノイン酸、１３シスレチノイン酸、９シスレチノイン酸、オールトランスレチノール及びオールトランスレチナールなどが挙げられる。また、「ビリルビン」とは、老化赤血球や溶血赤血球に含まれるヘモグロビンの代謝産物をいい、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、抱合型ビリルビン及び非抱合型ビリルビンを含む。さらに「ビリベルジン」とは、青緑色を呈する胆汁色素をいい、還元により上記ビリルビンに変化する物質をいう。

上記のレチノイド、ビリルビン及びビリベルジンの３物質は、Ｌ−ＰＧＤＳの第１のサイトに結合する物質であり、一見Ａβの凝集に対するシャペロン活性を持つ第２のサイトに影響がないように思われる。しかしながら、これらの物質が第１のサイトに不可逆的に結合すると、第２のサイトのコンホメーションが変化し、シャペロン活性が低下する。

一方、上記「(B) ６５番目のシステインのチオール基が酸化ストレスにより酸化されたヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）」とは、上記チオール基が酸化ストレスにより、例えば、スルフィド、ジスルフィド、スルフィン酸、スルフェン酸及びスルホン酸などの官能基に酸化したものが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

上記「酸化ストレス」とは、生体内において生成される活性酸素群の酸化損傷力と生体がもつ抗酸化システムのポテンシャルの差として定義されているものをいい、活性酸素種が原因となる生体内の蛋白の酸化をいう。活性酸素種としては、例えば、一酸化窒素、グルタチオン及び過酸化水素水などが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明者らは、一酸化窒素、グルタチオン及び過酸化水素水による、Ｌ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインのチオール基の酸化を確認した。

したがって、食生活の欧米化、精神的ストレス及び排気ガスなどが多い生活環境などにより、Ｌ−ＰＧＤＳの第２のサイトにおける６５番目のシステインのチオール基は酸化される可能性が高くなる。そして、この酸化したＬ−ＰＧＤＳは、もはやＡβの凝集に対するシャペロン活性を喪失しているため、Ａβの凝集（老人班）形成の原因となると考えられる。

上述した変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量は、定量が可能であれば特に限定されるものではないが、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、水晶発振マイクロバランス法（ＱＣＭ法）、免疫比濁法、放射性免疫測定法（ＲＩＡ法）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などが挙げられる。特に測定の感度及び測定が容易である観点から、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）が好ましい。

上記「表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）」とは、金属薄膜の裏面の照射光は全反射すると同時に金属膜側に発生する微弱なエネルギー波（エバネッセント波）と、誘電体に接触した金属表面では粗密波（表面プラズモン）が共鳴し、反射光が減衰する現象（表面プラズモン現象）が生じる照射光の角度（共鳴角）の変化から、金膜表面上約１μｍの範囲内で起こる反応による、結合した物質の誘電率変化によりモニタリングする測定法をいう。

上記ＳＰＲ法における測定方法としては、例えば、第２のサイトに捕捉されうるＰＧＤ_２又はＡβを固定化したＳＰＲ用基板を用いることにより、ヒト生体液中の変性していない（第２のサイトの結合能を有する）Ｌ−ＰＧＤＳを定量する。この際、変性の有無を問わずＬ−ＰＧＤＳと結合するモノクローナル抗体、つまり、公知のＬ−ＰＧＤＳのモノクローナル抗体を二次的に結合させることにより、感度を増幅することができて好ましい。本発明においてこの公知のモノクローナル抗体を、「非識別型モノクローナル抗体」と呼ぶ。この非識別型モノクローナル抗体を産生する細胞株は、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）にブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７０９〜５７１３）。
一方で、非識別型モノクローナル抗体を固相化したＳＰＲ用基板を用いて、ヒト生体液中の全体のＬ−ＰＧＤＳを定量する。
そして、全体のＬ−ＰＧＤＳの量から、変性していないＬ−ＰＧＤＳの量を差し引くことにより、変性したＬ−ＰＧＤＳの量を間接的に定量する。

また、変性していないＬ−ＰＧＤＳとは結合せず、変性Ｌ−ＰＧＤＳと結合するモノクローナル抗体を使用すれば、変性Ｌ−ＰＧＤＳを直接的に測定できると共に、測定時間を短縮できて好ましい。本発明においてこのモノクローナル抗体は、「識別型モノクローナル抗体」と呼ぶ。この変性Ｌ−ＰＧＤＳ用モノクローナル抗体の製造方法は、常法にしたがって製造することができる。

上記プロスタグランジンＤ_２（ＰＧＤ_２）、アミロイドβペプチド（Ａβ）、ならびに、識別型及び非識別型モノクローナル抗体のＳＰＲ用基板への固定化方法は、例えば、インキュベートによる物理的吸着及び金属−チオール結合による化学的吸着（自己組織化ともいう）を利用する方法などが挙げられる。特に製造のコストの観点から物理的吸着が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。

一方、上記「酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）」とは、酵素で標識した抗原や抗体を用いて抗原−抗体反応を利用して目的の物質と結合させ、基質代謝による発色又は発光強度から目的の物質を定量する測定法をいう。上記ＥＩＡ法は、ＥＬＩＳＡ法、ＩＥＭＡ法、ＥＭＩＴ法及びＣＬＥＩＡ法などを含む。

上記ＥＩＡ法の測定方法として、例えば、固相化する物質として上記のＰＧＤ_２又はＡβを用い、そして、検出は上記識別型モノクローナル抗体に酵素を修飾したものを使用し、該酵素の基質を用いて検出する方法などが挙げられる。抗体の製造方法及び固相への固定化は、上述した方法と同様の方法であればよい。酵素としては、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼなどが挙げられる。一方、基質としては、上記酵素がアルカリホスファターゼの場合、１，２−ジオキセタン類、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム、ならびに、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）の併用などが挙げられる。また、上記識別型モノクローナル抗体にはビオチンを修飾したものを用い、別途ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼを用いれば、修飾モノクローナル抗体の製造コストが安価に抑えられて好ましい。これら酵素及びその基質の選択は、当業者が適宜選択しうるものであることから、特に限定されるものではない。

また、上述した生体液から直接変性Ｌ−ＰＧＤＳを定量するよりも工程が多くなるものの、本発明の第１の方法は、免疫クロマトグラフ法などにより生体液からＬ−ＰＧＤＳを分離後、分離されたＬ−ＰＧＤＳ中に存在する変性Ｌ−ＰＧＤＳを定量する方法を実施してもよい。ここで、免疫クロマトグラフ法に用いる抗体は、上記非識別型モノクローナル抗体であればよい。また、定量する方法としては、上述したＳＰＲ法、ＱＣＭ法、ＲＩＡ法及びＥＩＡ法の他にも、例えば、元素分析、質量分析及び赤外吸収スペクトル測定などを利用することができる。

本発明の予測方法における第２の方法とは、ヒトから採取された生体液におけるアミロイドβペプチド（Ａβ）の凝集に対するシャペロン活性測定を含む。生体液におけるアミロイドβペプチド（Ａβ）のシャペロン活性は、変性Ｌ−ＰＧＤＳの濃度が増加することにより低下する。

上記「シャペロン活性測定」としては、例えば、光散乱法、濁度測定法及び蛍光プローブ法などが挙げられる。中でも感度の観点から、蛍光プローブ法が好ましい。蛍光プローブとしては、例えば、チオフラビンＴ、ピレン、シアニン色素、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ_２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）及びＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などが挙げられる。特にＡβの凝集測定に一般的に用いられている観点から、チオフラビンＴが好ましい。

上記シャペロン活性測定においては、生体液中に存在するアミロイドβペプチドの凝集を測定してもよいが、新たにＡβ（ランダムコイル）を添加することにより、より迅速な測定が可能となるため好ましい。Ａβ（ランダムコイル）の添加量は、例えば、添加後の濃度が約１０〜３００μＭ、好ましくは約２５〜７５μＭである。さらに、Ａβのβシート核（ＳＥＥＤ）を添加することによっても迅速な測定が可能となり好ましい。Ａβのβシート核（ＳＥＥＤ）の添加量は、例えば、添加後の濃度が約１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜１５μｇ／ｍｌである。

以上に示したシャペロン活性の測定における条件などは、当業者が適宜設定できるものであり、特に限定されるものではない。

上記第１の方法又は第２の方法により得られた測定値から個人が将来アルツハイマー病に発症するリスクを予測する又はアルツハイマー病に発症した個人の発症予後を予測する。例えば、第１の方法で得られた変性Ｌ−ＰＧＤＳの濃度が高ければ高いほどアルツハイマー病を発症する可能性は高い、又は、アルツハイマー発症後の病状の進行が早いと予測することができる。また、第２の方法におけるシャペロン活性が低ければ低いほどアルツハイマー病を発症する可能性は低いと予測することができる。

＜Ｌ−ＰＧＤＳによるＡβシャペロン活性の確認＞
以下の参考例及び参考実験例は、Ｌ−ＰＧＤＳによるＡβの凝集に対するシャペロン活性について確認する。これらの参考例及び参考実験例で用いられる試料及び測定条件などは、Ｌ−ＰＧＤＳによるＡβシャペロン活性を確認するために設定されたものである。したがって、本発明のアルツハイマー病の発症リスク予測方法においては、これらの条件に限定されるものではない。

［参考例１］ Ａβの溶液
リン酸緩衝液に、Ａβ（１−４０）を溶解した溶液を調製した。Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［参考例２］ Ｌ−ＰＧＤＳ及びＡβの溶液
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ及びＡβ（１−４０）を溶解した溶液を調製した。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は５μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［実験例１］ 参考例１及び２のＡβ凝集測定
上記参考例１及び２のＡβ凝集測定を蛍光プローブ法で測定した。蛍光プローブとしては、チオフラビンＴを用いた。測定は、励起波長４４５ｎｍ、測定波長４９０ｎｍにて行った。また、測定を迅速に行うために、各溶液にはアミロイドβペプチドのβシート核（ＳＥＥＤ）を濃度約１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。

その結果、参考例１はＡβが凝集していることは明らかであった。一方、参考例２は、Ａβの凝集が見られないことから、Ｌ−ＰＧＤＳがＡβの凝集に対するシャペロン活性を有することを確認した。

＜変性Ｌ−ＰＧＤＳの存在及びＡβシャペロン活性の喪失＞
以下の実施例、比較例及び実験例は、変性Ｌ−ＰＧＤＳがＡβの凝集に対するシャペロン活性を喪失していることについて証明した。これらの実施例、比較例及び実験例で用いられる試料及び測定条件などは、変性Ｌ−ＰＧＤＳがＡβの凝集に対するシャペロン活性を喪失していることを証明するために設定されたものである。したがって、本発明の予測方法においては、これらの条件に限定されるものではない。

［実施例１］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳ含有溶液の調製１
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、ＰＧＤ_２及びＡβ（１−４０）を溶解し、約１時間攪拌した後の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は５μＭ、ＰＧＤ_２の濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［実施例２］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳ含有溶液の調製２
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、ＰＧＤ_２及びＡβ（１−４０）を溶解し、約３時間攪拌した後の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は５μＭ、ＰＧＤ_２の濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［比較例１］ Ｌ−ＰＧＤＳ、ＰＧＤ_２及びＡβの溶液
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、ＰＧＤ_２及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は５μＭ、ＰＧＤ_２の濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［比較例２］ Ｌ−ＰＧＤＳ及びＡβの溶液
比較例２の溶液は、参考例２の溶液と同じ溶液を用いた。

［実験例２］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳのＡβシャペロン活性の喪失の確認１
上記実施例１、２及び比較例１の溶液におけるＡβ凝集測定を蛍光プローブ法にて測定した。実験条件などは、実験例１と同様に設定した。

その結果を図１に示す。比較例１の溶液は、Ｌ−ＰＧＤＳによりＡβの凝集に対するシャペロン活性が促進されているが、実施例１及び実施例２の溶液は、Ｌ−ＰＧＤＳのＡβの凝集に対するシャペロン活性が喪失していることが明らかであった。また、１時間以上インキュベートしないと変性Ｌ−ＰＧＤＳが産生されないのは、ＰＧＤ_２のＬ−ＰＧＤＳへの結合が遅いためであると考えられる。この事から、ＰＧＤ_２が、Ｌ−ＰＧＤＳのシャペロン活性の喪失に影響していることが証明された。

［実施例３］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳ含有溶液の調製３
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、ビリルビン及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は２．５μＭ、ビリルビンの濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［参考例３］ ビリルビン及びＡβの溶液
リン酸緩衝液に、ビリルビン及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。ビリルビンの濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。この参考例は、チオフラビンＴの蛍光環境を実施例３と同じにするために行ったものであり、実質は参考例１のＡβのみの溶液と同等に扱うものとする。

［実験例３］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳのＡβの凝集に対するシャペロン活性の喪失の確認２
上記実施例３及び参考例３のＡβ凝集測定を蛍光プローブ法にて測定した。実験条件などは、実験例１と同様に設定した。

その結果を図２に示す。比較例２の溶液は、Ｌ−ＰＧＤＳによりＡβの凝集に対するシャペロン活性が促進されているが、実施例３の溶液はＬ−ＰＧＤＳのＡβの凝集に対するシャペロン活性が喪失していることが明らかであった。ビリルビンはＬ−ＰＧＤＳの第１のサイトに結合する物質であり、Ａβの凝集に対するシャペロンを促進する第２のサイトには結合しない。しかしながら、ビリルビンが第１のサイトに結合することにより、第２のサイトのコンホメーションが変化し、シャペロン活性を喪失するものと考えられる。また、ＰＧＤ_２と比較して、シャペロン活性の喪失がインキュベート時間に依存しないのは、ビリルビンの第１のサイトへの結合が早いためであると考えられる。この事から、ビリルビンが、Ｌ−ＰＧＤＳのシャペロン活性の喪失に影響していることが証明された。

［実施例４］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳ含有溶液の調製４
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、ビリベルジン及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は２．５μＭ、ビリベルジンの濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［参考例４］ ビリベルジン及びＡβの溶液
リン酸緩衝液に、ビリベルジン及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。ビリベルジンの濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。この参考例は、チオフラビンＴの蛍光環境を実施例４と同じにするために行ったものであり、実質は参考例１のＡβのみの溶液と同等に扱うものとする。

［実験例４］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳのＡβシャペロン活性の喪失の確認３
上記実施例４及び参考例４のＡβ凝集測定を蛍光プローブ法にて測定した。実験条件などは、実験例１と同様に設定した。

その結果を図３に示す。比較例２の溶液は、Ｌ−ＰＧＤＳによりＡβの凝集に対するシャペロン活性が促進されているが、実施例４の溶液はＬ−ＰＧＤＳのＡβの凝集に対するシャペロン活性が喪失していることが明らかであった。シャペロン活性の喪失した理由、及び、インキュベートに依存しない理由は、実験例２の考察と同じであると考えられる。この事から、ビリベルジンが、Ｌ−ＰＧＤＳのシャペロン活性の喪失に影響していることが証明された。

［実施例５］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳ含有溶液の調製４
リン酸緩衝液に、Ｌ−ＰＧＤＳ、レチノイン酸及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。Ｌ−ＰＧＤＳの濃度は２．５μＭ、レチノイン酸の濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。

［参考例５］ レチノイン酸及びＡβの溶液
リン酸緩衝液に、レチノイン酸及びＡβ（１−４０）を溶解した「直後」の溶液を用いた。ビリルビンの濃度は５０μＭ、Ａβ（１−４０）の濃度は５０μＭとした。この参考例は、チオフラビンＴの蛍光環境を実施例４と同じにするために行ったものであり、実質は参考例１のＡβのみの溶液と同等に扱うものとする。

［実験例５］ 変性Ｌ−ＰＧＤＳのＡβシャペロン活性の喪失の確認４
上記実施例５及び参考例５のＡβ凝集測定を蛍光プローブ法にて測定した。実験条件などは、実験例１と同様に設定した。

その結果を図４に示す。比較例２の溶液は、Ｌ−ＰＧＤＳによりＡβの凝集に対するシャペロン活性が促進されているが、実施例４の溶液はＬ−ＰＧＤＳのＡβの凝集に対するシャペロン活性が喪失していることが明らかであった。シャペロン活性の喪失した理由、及び、インキュベートに依存しない理由は、実験例２の考察と同じであると考えられる。この事から、レチノイン酸が、Ｌ−ＰＧＤＳのシャペロン活性の喪失に影響していることが証明された。

本発明は、アルツハイマー病の発症リスクを予測することができる。本発明の新規なマーカーは、睡眠不足、食生活の欧米化、精神的ストレス及び排気ガスなどが多い生活環境などの生活習慣が、アルツハイマー病の発症に相関があることを示唆するものである。また、アルツハイマー病の発症予後も予測することができる。したがって、この新規なマーカーを利用することによるテーラーメイド医療への応用が期待され、患者のクオリティーオブライフ（ＱＯＬ）の向上に貢献することができる。

実験例２のＡβ凝集測定の結果を示す図である。 実験例３のＡβ凝集測定の結果を示す図である。 実験例４のＡβ凝集測定の結果を示す図である。 実験例５のＡβ凝集測定の結果を示す図である。

Claims (7)

1. 個人が将来アルツハイマー病に発症するリスクを予測するため又はアルツハイマー病に発症した個人の発症予後を予測するために、ヒトから採取された生体液中に存在する、アミロイドβペプチドに対するシャペロン活性を喪失したヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、変性Ｌ−ＰＧＤＳと称す）の定量測定を行う方法。
2. 生体液が、脳脊髄液である請求項１に記載の方法。
3. 変性Ｌ−ＰＧＤＳが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白に、プロスタグランジンＤ_２、レチノイド、ビリルビン又はビリベルジンが不可逆的に結合した複合体である請求項１に記載の方法。
4. 変性Ｌ−ＰＧＤＳが、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の６５番目のシステインのチオール基が酸化ストレスにより酸化されたアミノ酸配列からなる蛋白である請求項１に記載の方法。
5. ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法である請求項１に記載の方法。
6. ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）法である請求項１に記載の方法。
7. ヒトから採取された生体液中に存在する、変性Ｌ−ＰＧＤＳの定量測定が、生体液から変性Ｌ−ＰＧＤＳを含む全ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を分離後、分離された全ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素中に存在する変性Ｌ−ＰＧＤＳを定量することを含む請求項１に記載の方法。

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