JP4968542B2

JP4968542B2 - 過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法

Info

Publication number: JP4968542B2
Application number: JP2008089955A
Authority: JP
Inventors: 裕後藤; 晃平田; 洋平阿部; 登久松江; 清美水越
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2028-03-31
Also published as: JP2009244041A

Description

本発明は、例えば牛の乳汁における過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法に関する。

乳房炎は、乳頭孔から例えば大腸菌や黄色ブドウ球菌等の原因菌が乳房内に侵入し、定着および増殖することで発症する。乳房炎に感染した場合には、防御反応として血液中から感染部位へ白血球が集まるので、乳汁中の体細胞（主に白血球）の数が変化する。
従来、この乳汁中の体細胞数の変化は乳房炎の判定基準として用いられており、通常、乳汁中内の体細胞数が２０万個／ml以上で乳房炎が疑われるとされている。

乳房炎は、乳牛個体の産乳量を低下させ、潜在的な損失を与えるだけでなく、乳質低下に対するペナルティや、治療費、廃用など、経済的に多大な損失を与えている。このため、一般の酪農家において、従来、様々な乳房炎検出方法が行われてきた。

最も簡単な方法としては、乳汁をストリップカップに受け、凝固物（ブツ）の有無を目視によって確認する方法がある。この方法は簡単である一方、白血球の死骸であるブツの発見によって明らかに乳房炎であることを知る方法であるため、早期発見が不可能であることが問題点となっている。

また、乳汁に界面活性剤とｐＨ指示薬を含んだ試薬を混合し、目視によって乳汁の凝集程度と色調を判定するＣＭＴ変法がある。この方法では、乳汁の体細胞数が５０万個／ml以上の場合が乳房炎と判定される。しかし、乳汁内の体細胞数が２０万個／ml以上の場合に乳房炎が疑われるとされているため、このＣＭＴ変法の精度は不十分であり、この点が問題になっている。

また、乳汁の電気伝導度を測定することで、乳汁内の体細胞数を測定する方法が考えられているが、体細胞数には、牛個体間で差があるので絶対的な測定法であるとはいえない点が問題となる。

一方、牛の体細胞数は、月に１回行われる牛群検定成績で確認することも可能である。しかし、ここで行われる測定法は、直接顕微鏡で鏡検し細胞数を数える方法か、あるいは蛍光光学式体細胞測定機等を用いる自動測定法であるため、測定技術や測定設備等が必要となり、簡単に行うことができないという問題点がある。さらに、月に１回の牛群検定成績でのみの測定では一般の酪農家にとっては不十分であり、乳房炎検出方法としての実用性に乏しい。

そこで、特許文献１では乳汁と過酸化水素を混合した後、発生した気体量を毛細管を用いて測定し、乳汁内の体細胞数を推定することで乳房炎の判定をする方法が提案されている。
ＥＰ−０４７６８５０号公報

しかしながら、上記特許文献１に記載された乳房炎の判定方法では、測定にかかる時間が長くなってしまい、機械搾乳時間内に判定ができない。そのため、実用性に乏しいという問題点があり、さらに、発生した気体量を測定するに際し、乳汁内に残留している気体については測定の範囲外となっており、正確な測定ができないという問題点がある。

そこで、本発明の目的は、日々の搾乳作業の中で、搾乳インラインから乳汁サンプルを採取し、短時間で自動的に測定、診断することにより、通常の乳房炎検出に加え、感染初期の乳房炎および外見上異常の認められない潜在性乳房炎を検出する乳房炎検出方法を提供することにあり、さらに、市販の電気化学用炭素電極センサを用いて過酸化水素消去能や酵素分布による乳房炎検出を可能とし、搾乳インラインから乳汁サンプルを採取し、機械搾乳時間内（例えば約３分）に自動的に測定することができる測定装置を提供することにある。

本発明によれば、乳房炎検出方法であって、乳汁に所定の量の過酸化水素を供給し、前記乳汁の過酸化水素消去能を電気化学的方法または化学的酸・アルカリ反応測定によって検出することを特徴とする、乳房炎検出方法が提供される。

また、前記電気化学的方法は、サイクリックボルタンメトリーであってもよい。

前記サイクリックボルタンメトリーにおいて、電圧値が−０．７〜−０．９Ｖ間の電流値積分値を用いることとしてもよい。

また、前記電気化学的方法は、電気伝導度の測定であってもよい。

また、前記化学的酸・アルカリ反応測定は、リトマス試験紙による色調判定であってもよい。

さらに、前記化学的酸・アルカリ反応測定は、ｐＨ測定であってもよい。

本発明によれば、測定および判定方法が簡便であり、かつ短時間で結果のわかる乳房炎検出方法が提供される。

以下、本発明の実施の形態を、図面を参照にして説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。

本実施の形態においては、サイクリックボルタンメトリー（以下、ＣＶとする）を利用した本発明にかかる乳房炎検出方法について説明する。

図１は本願発明者らが４つの活性酸素種センサＡ〜Ｄを用いて知見した、乳汁中の体細胞数と３分後電流値の関係を示す図である。なお、３分後電流値とは、活性酸素種センサを用いて乳汁中の活性酸素種の存在を電流として検出する際の電流値である。乳汁中の体細胞数が高いと、３分後電流値が低くなる、即ち、活性酸素濃度が低くなることとなっている。４つの活性酸素種センサＡ〜Ｄの３分間電流測定値には、センサごとに多少のばらつきが見えたが、図１より、体細胞数の異常な乳汁と正常な乳汁の活性酸素種濃度の違いについては明らかな相違を読み取ることができる。

上記知見に基き、本願発明者らは、乳房炎に感染したことで、乳汁中の体細胞数が増加した場合に、乳汁中のＳＯＤ（スーパーオキシドジムスターゼ）やＬｆ（ラクトフェリン）等の活性酸素を消去する物質が増加するため、活性酸素濃度が低下することを合わせて知見した。乳汁には活性酸素種の１種である過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）はごく微量しか含まれていないことから、本発明にかかる過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法が実現される。

図２〜５は、正常な分房乳（体細胞数：１．９万個／ｍｌ）に過酸化水素の分解酵素であるカタラーゼ（製造元：MP Biomedicals, Inc. 、製造元コード：100402のカタラーゼを純水にて１００分の１に希釈したもの）を混合したものに対して、１００ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素１ｍｌを供給する前と後で、ＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。乳汁と添加するカタラーゼの量の組み合わせを（乳汁，カタラーゼ）＝（９ｍｌ，0）、（８．９９９ｍｌ，1μｌ）、（８．９９ｍｌ，１０μｌ）、（８．９８ｍｌ，２０μｌ）の4通りとし、条件を変えて測定を行った。
図６〜９は、乳房炎である分房乳（体細胞数：１１４．３万個／ｍｌ）について、正常乳と同様の条件でＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。
図１０は、正常な分房乳に添加したカタラーゼ量と、図２〜５のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係をグラフにしたものである。図１１は、乳房炎である分房乳について、同様に、添加したカタラーゼ量と電流値の差の関係をグラフにしたものである。乳汁中のカタラーゼ濃度が高くなると、それに比例して、−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖにおける電流値の差は増加する。
図１２〜１４は、正常な分房乳（体細胞数：１．９万個／ｍｌ）に過酸化水素の分解酵素であるグルタチオンパーオキシダーゼ（ＧＬＵＰ；製造元：Cayman Chemical Co. 、製造元コード：703114のグルタチオンパーオキシダーゼ (コントロール)１ｅａを溶解後、２００μｌの純粋に希釈したもの）を混合したものに対して、１００ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素１ｍｌを供給する前と後で、ＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。乳汁と添加するグルタチオンペルオキシダーゼの量の組み合わせを（乳汁，グルタチオンパーオキシダーゼ）＝（９ｍｌ，０）、（８．９９ｍｌ，１０μｌ）、（８．９７ｍｌ，３０μｌ）の３通りとし、条件を変えて測定を行った。
図１５〜１７は、乳房炎である分房乳（体細胞数：１１４．３万個／ｍｌ）について、同様にＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。
図１８は、正常な分房乳に添加したグルタチオンパーオキシダーゼ量と、図１２〜１４のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係をグラフにしたものである。図１９は、乳房炎である分房乳について、同様に、添加したグルタチオンパーオキシダーゼ量と電流値の差の関係をグラフにしたものである。乳汁中のグルタチオンパーオキシダーゼ濃度が高くなると、それに比例して、−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖにおける電流値の差は増加する。

カタラーゼの場合になるが、図１０と図１１で、例えば電圧−０．９Ｖに注目すると、線形近似直線の傾きは正常な分房乳、乳房炎である分房乳ともにほぼ同じ値となっている。正常な分房乳（体細胞数：１．９万個／ｍｌ）では、体細胞数が０に近いことからカタラーゼはほとんど含まれてないとすれば、乳房炎である分房乳（体細胞数：１１４．３万個／ｍｌ）には、図２０に示すように近似直線の切片の差１６４０ｎＡだけ電流値差を増加させるだけの１４μｌ相当のカタラーゼがもともと含まれていると推察される。それを考慮して、図２０のように、電圧−０．９Ｖ、体細胞１１４．３万のデータを１４μｌのカタラーゼ量分だけＸ軸方向に平行移動させると、電圧−０．９Ｖ、体細胞１．９万のデータの近似直線と一致する。また、グルタチオンパーオキシダーゼの場合についても同様な近似直線の一致が確認できる。これらのことから、乳汁中の過酸化水素分解酵素の濃度が過酸化水素供給前後の電流値の差に比例していることがわかる。さらに、体細胞数が高くなると酵素の濃度も高くなることもわかる。従って、体細胞数が高くなれば過酸化水素供給前後の電流値の差も増加する関係にあるといえる。さらに、体細胞数と電流値差が比例関係にあると仮定するならば、体細胞数３０万個／ｍｌの乳汁については、電流値差が７８０ｎＡと推定できる。図２１は、図２０に体細胞数３０万個／ｍｌの場合（点線部分）を加えたものである。先と同様に体細胞数３０万個／ｍｌの乳汁には４μｌ相当のカタラーゼがもともと含まれていると推察できる。
以上のことから、乳汁に過酸化水素を供給する前と後のＣＶ測定を行うことにより、乳汁中に存在する様々な過酸化水素消去物質の過酸化水素消去能を総合的に捉え、体細胞数を推定できることが証明される。

また、図１０と図１１、図１８と図１９について、近似直線の傾きに注目すると、カタラーゼの場合（図１０と図１１）には、−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖと電圧値が高くなるにつれ、線形近似直線の傾きが大きくなる傾向がある。これに対し、グルタチオンパーオキシダーゼの場合（図１８と図１９）では−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖと電圧値が変化しても、傾きに大きな変動が見られない。過酸化水素の分解酵素の種類によって、過酸化水素供給による乳汁のＣＶ曲線の形状変化に特徴があることがわかる。従って、あらかじめ様々な種類の過酸化水素消去物質のＣＶ曲線の形状変化の特徴を把握しておき、検出対象のＣＶ曲線の形状を分析することによって、その乳汁の酵素分布を捉えて、乳房炎原因菌の種類を簡易に推定することも可能となる。

図２２は正常な分房乳（体細胞数：０．８万個／ｍｌ）から搾乳した乳汁でのＣＶの測定結果を示すＣＶ曲線である。この図２２において、ＣＶ１は正常な乳汁９ｍｌのみの場合のＣＶ曲線であり、ＣＶ２は正常な乳汁９ｍｌに１００ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素１ｍｌを供給した場合のＣＶ曲線である。このとき、ＣＶ１のＣＶ曲線とＣＶ２のＣＶ曲線を比較してもほぼ差のないものとなっていることがわかる。つまり、正常な乳汁においては過酸化水素の分解反応はほぼ起こっていないことが図２２からわかる。

一方、図２３は乳房炎である分房乳（体細胞数：１４４．３万個／ｍｌ）から搾乳した乳汁でのＣＶの測定結果を示すＣＶ曲線である。なお、ＣＶ１は乳房炎乳汁９ｍｌのみのＣＶ曲線であり、ＣＶ２は乳房炎乳汁９ｍｌに１００ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素１ｍｌを供給した場合のＣＶ曲線である。図２３におけるＣＶ２と上記図２２でのＣＶ２とを比べるとＣＶ２が電圧値−０．９〜−０．７Ｖ間において図２３のほうが下がっていることがわかる。そこで、本実施の形態では、ＣＶ１とＣＶ２を比較し、ＣＶ２における電圧値−０．９〜−０．７Ｖ間の電流値の積分値とＣＶ１における電圧値−０．９〜−０．７Ｖ間の電流値の積分値の差を過酸化水素消去能とする。

そして、図２４は上記の過酸化水素消去能を求める方法によって、のべ供試頭数５頭の体細胞数の測定済みである分房乳について、ＣＶ測定を行い、得られた過酸化水素消去能およびその乳汁の体細胞数をプロットした結果を示す図である。一般的に、体細胞数の数が２０万個以上であれば乳房炎が疑われる可能性があるとされ、図２４においても、体細胞数が約２０万個を超える数値の乳汁から、過酸化水素消去能が上昇していることが読み取れる。

上述してきた実験結果をもとに乳房炎検出方法が実現される。体細胞数の測定済みである分房乳に過酸化水素を供給し、その分房乳より得られたＣＶ測定結果である図２４を利用し、体細胞数の不明な分房乳の過酸化水素を供給していない状態でのＣＶ測定結果と、過酸化水素を供給した後、ＣＶ測定器によって測定したＣＶ測定結果とのＣＶ曲線の差異から算定される過酸化水素消去能を比較検討することによってその分房乳が乳房炎分房乳かあるいは正常分房乳であるかの推定が可能となる。なお、ＣＶ測定を行う際にＣＶ曲線（電圧スペクトル）が得られるので、そのＣＶ曲線の形状を事前に測定していた分房乳のＣＶ曲線の形状と比較し、そのＣＶ曲線を分析することで乳房炎の原因菌の種類の推定も可能となる。

なお、本実施の形態において、過酸化水素消去能を算出するに際し、ＣＶ２における電圧値−０．９〜−０．７Ｖ間の電流値の積分値とＣＶ１における電圧値−０．９〜−０．７Ｖ間の電流値の積分値の差によって定めたが、本発明における過酸化水素消去能の算定基準はこれに限るものではない。

以上、本発明の好ましい実施の形態の一例を説明したが、当業者であれば、特許請求の範囲に記載された思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に相到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。例えば、上述したように、本発明では、体細胞数の測定済みである分房乳からＣＶ測定結果を得て、そこから算定される過酸化水素消去能を用いることで乳房炎検出を行うわけであるが、その際に測定誤差を避けるために、測定温度等の影響を受けないような条件下において測定方法を行うといったことは当然本発明の思想の範疇内である。

また、本発明にかかる上記実施の形態では、過酸化水素を供給した分房乳の乳房炎検出方法として、ＣＶ測定を利用している。しかし、本発明は、これに限らず、例えば、より簡易な方法として、過酸化水素を供給した分房乳をリトマス試験紙の色調により、その過酸化水素消去能を推定する方法やｐＨを測定することで過酸化水素消去能を推定する方法も考えられる。この場合、過酸化水素の分解反応が進むにつれ、ｐＨは中性に近づくこととなる。さらには、過酸化水素を供給した分房乳の電気伝導度を測定することによって過酸化水素消去能を推定することも考えられる。

図２５はＣＶ測定を行うＣＶ測定装置１の概略図である。ＣＶ測定装置１は、測定制御ボックス１０と、乳汁測定器２０、測定制御ボックス１０に接続しているデータ収集用ＰＣ３０および電源１３により構成されている。乳汁測定器２０には２極電極２１、２２が備えられ、各電極２１、２２が測定制御ボックス１０に接続されている。

以上のように構成されたＣＶ測定装置１において、搾乳した乳汁を乳汁測定器２０へ投入し、ＣＶ測定を行った。その後、乳汁測定器２０に所定の量の過酸化水素を供給した後に、再びＣＶ測定を行った。なお、本実施例では、各電極２１、２２はそれぞれ炭素電極および銀塩化銀電極とし、上記実施の形態の図２２および図２３にある、乳汁９ｍｌに１００ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素１ｍｌを供給することとした。測定制御ボックス１０によって測定されたデータは、データ収集用ＰＣ３０へ送られ、測定結果から、乳汁の過酸化水素消去能が算出されることとなる。算出された過酸化水素消去能の数値（電流値）を、上記図２４のようにデータ化した過酸化水素消去能と体細胞数の関係に照らし合わせることによって、測定した乳汁内に存在する体細胞の数が推定されることとなった。

本実施例においては、市販の電気化学用炭素電極センサを用いて、簡便に過酸化水素消去能や酵素分布による乳房炎検出が可能となり、また、搾乳インラインから乳汁サンプルを採取し、自動的に測定する等の装置化が可能となると考えられる。さらに、一検体の測定時間は約３分であり、機械搾乳時間内に測定できる。

本発明は、例えば牛の乳汁における過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法に適用できる。

乳汁中の体細胞数と３分後電流値の関係を示す図である。正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁９ｍｌ＋カタラーゼなし）正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９９ｍｌ＋カタラーゼ１μｌ）正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９ｍｌ＋カタラーゼ１０μｌ）正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９８ｍｌ＋カタラーゼ２０μｌ）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁９ｍｌ＋カタラーゼなし）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９９ｍｌ＋カタラーゼ１μｌ）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９ｍｌ＋カタラーゼ１０μｌ）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９８ｍｌ＋カタラーゼ２０μｌ）正常な分房乳に添加したカタラーゼ量と、図２〜５のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係を示すグラフである。乳房炎である分房乳に添加したカタラーゼ量と、図６〜９のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係を示すグラフである。正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁９ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼなし）正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼ１０μｌ）正常な分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９７ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼ３０μｌ）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁９ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼなし）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９９ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼ１０μｌ）乳房炎である分房乳のＣＶの測定を行ったＣＶ曲線グラフである。（乳汁８．９７ｍｌ＋グルタチオンペルオキシターゼ３０μｌ）正常な分房乳に添加したグルタチオンパーオキシダーゼ量と、図１２〜１４のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係を示すグラフである。乳房炎である分房乳に添加したグルタチオンパーオキシダーゼ量と、図１５〜１７のＣＶ曲線グラフで電圧−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖ、−０．９Ｖ時における過酸化水素供給前後の電流値の差の関係を示すグラフである。図１０と図１１において電圧−０．９Ｖの場合に注目し、電圧−０．９Ｖ、体細胞１１４．３万のデータを１４μｌのカタラーゼ量分だけＸ軸方向に平行移動させた場合のグラフである。図２０に体細胞数３０万個／ｍｌの場合（点線部分）を加えたグラフである。ＣＶの測定結果を示すＣＶ曲線である。（正常な分房乳）ＣＶの測定結果を示すＣＶ曲線である。（乳房炎分房乳）乳汁の過酸化水素消去能および体細胞数をプロットした結果を示す図である。ＣＶ測定を行うＣＶ測定装置の概略図である。

符号の説明

１…ＣＶ測定装置
１０…測定制御ボックス
１３…電源
２０…乳汁測定器
２１…電極
２２…電極
３０…データ収集用ＰＣ

Claims

乳房炎検出方法であって、乳汁に所定の量の過酸化水素を供給し、前記乳汁の過酸化水素消去能を電気化学的方法または化学的酸・アルカリ反応測定によって検出することを特徴とする、乳房炎検出方法。
前記電気化学的方法は、サイクリックボルタンメトリーであることを特徴とする、請求項１に記載の乳房炎検出方法。
前記サイクリックボルタンメトリーにおいて、電圧値が−０．７〜−０．９Ｖ間の電流値積分値を用いることを特徴とする、請求項２に記載の乳房炎検出方法。
前記電気化学的方法は、電気伝導度の測定であることを特徴とする、請求項１に記載の乳房炎検出方法。
前記化学的酸・アルカリ反応測定は、リトマス試験紙による色調判定であることを特徴とする、請求項１に記載の乳房炎検出方法。
前記化学的酸・アルカリ反応測定は、ｐＨ測定であることを特徴とする、請求項１に記載の乳房炎検出方法。