JP4936568B2 - トランスジェニック動物乳房組織における活性ヒト第ｉｘ因子の発現 - Google Patents

Description

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、天然型および改変型の第ＩＸ因子の製造に関する。特に、本発明はトランスジェニック動物に関し、そのトランスジェニック動物は、乳房組織で特異的に発現する外因性の第ＩＸ因子遺伝子を含有し、これがそのゲノム内に安定に組み込まれており、その結果、動物が産生する乳内に第ＩＸ因子を分泌する。特に、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳におけるヒト第ＩＸ因子の製造に関し、その製造は、乳漿酸性タンパク質プロモーター遺伝子（すなわち、プロモーターを含有する５′制御配列）と、天然型ヒト第ＩＸ因子遺伝子の３′非翻訳領域全体の少なくとも一部または任意の部分またはその全体を含まず、マウス乳漿酸性タンパク質遺伝子の５′非翻訳領域および３′非翻訳領域を含有するヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡとを含むＤＮＡ分子が使用される。

２．背景
ヒト第ＩＸ因子すなわち「クリスマス因子」は、Ｘ染色体のｑ２７．１に存在する１コピー遺伝子によってコードされている。第ＩＸ因子遺伝子の構造および発現の総説については、Ｈｉｇｈら、「第ＩＸ因子」、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＡＮＤ ＨＥＭＯＳＴＡＳＩＳ、Ｈｉｇｈ（編）、２１５〜２３７頁（Ｄｅｋｋｅｒ １９９５）；Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７３：３３３（１９９５）を参照のこと。第ＩＸ因子遺伝子は、少なくとも３４キロ塩基（ｋｂ）対の大きさであり、８個のエキソンからなる。ヒト肝臓における第ＩＸ因子遺伝子の主要な転写開始部位は、ヌクレオチド１７６付近に位置している。ヒト第ＩＸ因子ｍＲＮＡは、５′非翻訳領域の２０５塩基、プレプロ第ＩＸ因子の１３８３塩基、停止コドンおよび３′非翻訳領域の１３９２塩基からなる。

第ＩＸ因子は、３つのドメインからなるプレプロポリペプチド鎖として合成される：２９アミノ酸のシグナルペプチド、１７アミノ酸のプロペプチド（これはグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされる）、および４１５アミノ酸残基の成熟第ＩＸ因子タンパク質。第ＩＸ因子の酵素前駆体（チモーゲン）は、血液中に分泌されるまでに３種類の翻訳後修飾を受ける：ビタミンＫに依存するグルタミン酸残基のカルボキシグルタミン酸への変換、炭化水素鎖の付加、およびアスパラギン酸のβ−ヒドロキシル化。成熟第ＩＸ因子タンパク質は、１２個のγ−カルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）残基を含有する。γ−カルボキラーゼによるビタミンＫ要求性のために、第ＩＸ因子は、いくつかのビタミンＫ依存性血液凝固因子の１つである。

第ＩＸ因子の活性化は、分子からの活性化ペプチド（Ａｌａ^１４６〜Ａｒｇ^１８０）の２段階の切除によって達成される。Ｂａｊａｊら、「ヒトの第ＩＸ因子および第ＩＸａ因子」、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９３）。最初の切断が、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子／組織因子のいずれかによってＡｒｇ^１４５−Ａｌａ^１４６部位で行われる。律速的な第２の切断が、Ａｒｇ^１８０−Ｖａｌ^１８１で行われる。第ＸＩａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子が関与する活性化経路は、ともにカルシウム依存性である。しかし、第ＶＩＩａ因子／組織因子の経路は、損傷した内皮細胞から放出される組織因子を必要とする。このように活性化されたヒト第ＩＸ因子は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマーとして存在する。充分な生物学的活性に関して、ヒト第ＩＸ因子は、プロペプチドもまた除去しなければならず、そして充分にγ−カルボキシル化しなければならない。Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：９５３（１９９３）。

第ＩＸ因子は、固有の凝固経路による血液凝固に必要なセリンプロテアーゼの前駆体である。第ＩＸ因子合成の欠損は、血友病Ｂ（すなわち、クリスマス病）、男性３０，０００人において約１人が発症するＸ連鎖疾患をもたらす。血友病Ｂの患者は、正常なヒトから集めた血漿から得られる第ＩＸ因子で処置されている。Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９４（Ｓｕｐｐｌ．１）：３５（１９９５）。しかし、そのような第ＩＸ因子調製物は、発熱性である可能性があり、病原体およびウイルスに汚染されている可能性がある。従って、ヒトの血漿からの抽出を必要としない精製された第ＩＸ因子を調製する手段を開発することは有益である。

従来、治療用タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで製造されてきた。しかし、すべての生細胞で起こっている分泌および翻訳後修飾が制限されていることによって、組換えタンパク質の製造は、種、組織および細胞に対して非常に特異的な事象になっている。哺乳動物細胞における組換えＦＩＸ発現の一例において、ベビーハムスター腎臓細胞で産生した組換えＦＩＸ集団は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で産生したＦＩＸと同じタンパク質産物ではなかった（Ｂｕｓｂｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：６８４−６８６（１９８５）；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９６２２−９６２８（１９８６））。これらのタンパク質は、γ−カルボキシル化およびプロペプチド除去において大きく異なっている。このような違いは、生物学的活性を測定する際に非常に重要であるとして認められている。最も重要なことに、ＣＨＯ細胞において、プロペプチド切断酵素ＰＡＣＥの同時発現、カルボキシラーゼ酵素の同時発現、および発現レベルおよび発現活性を増大させる目的でメトトレキセートによる十分な遺伝子増幅を行った後でさえもわずかに約４０ミリユニット／ｈｒ／ｍｌ未満の活性ｒＦＩＸが検出されたにすぎなかった（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５（１９９３）；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９０：４６１１−４６１５（１９９３））。研究者らは、活性ｒＦＩＸの分泌における複数の制限が哺乳動物細胞には存在しており（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３）、そして遺伝子転写の問題は二次的であり、哺乳動物細胞における生物学的な活性ｒＦＩＸの翻訳後プロセシングに関して、遺伝子転写の問題は実際には取るに足らないことであると結論した。すなわち、ＦＩＸのｍＲＮＡスプライシングは、ブタではなく、マウスそしておそらくはヒツジにおいて起こっている種特異的な結果である。ＦＩＸを発現することができると仮定できるとしても、そのような産物が、特定の血友病徴候に関する臨床的に許容され得る実用的な組換え治療ＦＩＸ産物であるかどうかを確実に予測することはできない。

組換え第ＩＸ因子の哺乳動物細胞培養（ＨｅｐＧ２細胞、マウス線維芽細胞、マウスヘパトーム細胞、ラットヘパトーム細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞）での産生は、分泌およびタンパク質分解プロセシングに対する細胞内制限、翻訳後修飾、発現レベル、生物学的活性、産生培地からの下流での回収、および循環半減期の強化に関して抵抗性でありそれらに関して細胞系に特異的であることが繰り返し示されている（Ｂｕｓｂｙら、（１９８５）；ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６８−２７０（１９８５）；Ａｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８４−６８６（１９８５）；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３；Ｗａｓｌｅｙら（１９９３）；Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８６）；Ｊａｌｌａｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：３２９５−３３０１（１９９０））。重要なことに、上記の研究は、これらの複合的な評価基準において、実用的な予防用ＦＩＸ治療産物を任意の組換え哺乳動物細胞産生源から入手できるようになり得る場合には大きく改善しなければならないと結論した。例えば、低すぎるカルボキシル化に関する問題をビタミンＫ依存性カルボキシラーゼ酵素の同時発現によって正すことによって、ＣＨＯ細胞が産生したｒＦＩＸの比活性を増大させようとする試みは、γ−カルボキシル化または生物学的活性を何ら改善しなかった（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３）。これは、この翻訳後修飾における制限が多数存在していることを示す。

著量の生物学的な活性ｒＦＩＸのトランスジェニック哺乳動物の乳房上皮細胞での産生における類似した困難性もまた文献に明らかにされている。ＷＯ−Ａ−９０／０５１８８およびＷＯ−Ａ−９１−０８２１６は、ｒＦＩＸ産生がそれらの産生系で可能であると予測しているが、結果はＷＯ−Ａ−９１−０８２１６には何ら示されておらず、生物学的活性を伴わないｒＦＩＸは、トランスジェニックヒツジにおいて非常に低いレベル（２５ｎｇ／ｍｌ）でしか分泌されないことがＷＯ−Ａ−９０／０５１８８および関連の出版物に報告されている（Ｃｌａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４８７−４９９２（１９８９））。より大きな発現レベルが、最近、ヒツジ乳で報告されている（５μｇ／ｍｌ）。しかし、再度ではあるが、その産生物は、生物学的活性を有していなかった（Ｃｏｌｍａｎ、ＩＢＣ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９５））。これは、ＷＯ−Ａ−９０／０５１８８、Ｃｌａｒｋら（１９８９）、およびＣｏｌｍａｎ（１９９５）において産生されたポリペプチドは、天然のヒトＦＩＸとは異なる種であり、ヒトＦＩＸとは異なる生物学的活性を有していたこと、そして治療目的には決して使用できないことを明らかにしている。Ｃｌａｒｋら（１９９２）による研究は、トランスジェニックマウス乳腺でのｒＦＩＸ合成における問題は、ｒＦＩＸ ｍＲＮＡの３′非翻訳領域での異常なスプライシングの結果であったと論じている。トランスジェニックマウスでの異常なスプライシングの矯正が明らかにされ（Ｙｕｌｌら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０８９９−１０９０３（１９９５）；Ｃｌａｒｋら（１９８９）；ＷＯ ９５／３００００））、約４０％の生物学的活性物質を伴う（６１μｇ／ｍｌにまで達する）より高い発現レベルが得られた。しかし、この異常なスプライシング現象は、マウス乳腺において種特異的および組織特異的であるようである；ＣＨＯ細胞株およびトランスジェニックマウス肝臓において３′ＵＴＲ配列を用いた他の報告は、異常なスプライシングの証拠を明確に示していない（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８６）；Ｊａｌｌａｔら、（１９９０））。さらに、３′ＵＴＲ配列を有するＦＩＸ転写物の異常なｍＲＮＡスプライシングに関する証拠は、ヒトヘパトーム細胞株（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅら、（１９８５））、マウス線維芽細胞株（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅら、（１９８５））、ラットヘパトーム細胞株（Ａｎｓｏｎら、１９８５）、またはＢＨＫ細胞株（Ｂｕｓｂｙら、（１９８５）においては何も報告されていなかった。ＷＯ９５／３００００の変化した導入遺伝子によって、トランスジェニック家畜類の乳または任意の細胞株でのｒＦＩＸの分泌および生物学的活性が必然的に改善されるという予測を正当化する結果は示されていない。従って、ＷＯ９５／３００００において示される特許請求の範囲は、純粋に推論的であり、トランスジェニックマウスの乳腺に限定される。

上流および下流での処理中のトランスジェニック家畜類の乳におけるｒＦＩＸ産生の安定性は、実用的な治療薬の製造に関する重要事項である。Ｃｌａｒｋら（１９８９）において示されるデータは、それらのトランスジェニックヒツジの乳中にほとんど存在しないｒＦＩＸのすべてを下流で回収するＣｌａｒｋ法は再現的でないことを示した：１つの調製物において、著量のｒＦＩＸがタンパク質分解的に活性化された。活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）を患者に注入することは死に至らしめる（Ｋｉｎｇｄｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｄｉａｔｈｅｓ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．（Ｓｔｕｔｔｇ．）３３：６１７（１９７５））。ＦＩＸは、ＦＸＩおよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子複合体によって、カルシウムおよびリン脂質の存在下で活性化され得る（Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：９５３−９７４（１９９３））。乳は、カルシウムおよびリン脂質表面を含有する媒体である。さらに、哺乳動物の血液凝固因子間において、特に、ブタＦＸＩとヒトＦＸＩとの間においては広範囲にわたる保存された相同性が存在する（Ｍａｓｈｉｋｏ ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７５：４８１−４８４（１９９４））。非トランスジェニックブタの乳において検出可能なレベルのブタのＦＶＩＩ（ａ）およびＦＸＩ（ａ）が、そして乳腺炎乳を有するブタの乳において上昇したレベルのＦＶＩＩ（ａ）およびＦＸＩ（ａ）が測定された。このように、トランスジェニック家畜類の乳中に産生した有用な非活性化ｒＦＩＸの回収は、乳腺の健康状態（すなわち、無症状的または臨床的な乳腺炎がないこと）、搾乳手順（すなわち、組織損傷がない）、採取直後の乳の前処理、加工前の乳の保存、ならびに精製および処方プロセス自体の影響を大きく受けると予想することができる。ｒＦＩＸの非所望のインビボ活性化はまた、ＦＶＩＩａ／ＴＦに対する阻害剤、ＬＡＣＩとも呼ばれる組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）タンパク質、またはＦＶＩＩａ／ＴＦに対する公知の阻害剤でもあるハイブリッドタンパク質ＦＸ−ＬＡＣＩの同時発現によって最小限にし得ることもまた予想される。ＦＸＩａの特異的阻害剤は同定されていないが、類似のアプローチを、アミド分解アッセイに関して市販の基質に類似するＦＸＩａのポリペプチド基質アナログを同時発現することによるＦＸＩａ活性化の中和に関して行うことができる。さらに別の方法は、ｒＦＩＸを非常に高いレベル（＞１ｇ／ｌ乳）で同時発現して、ＦＩＸ活性化酵素を著しく制限することであり得る。そうでなければ、活性化を最小限にするための工程を乳採取直後に取らなければならない。これらには、カルシウムのキレート化（例えば、ＥＤＴＡの添加）、リン脂質の除去、ｐＨ調節、超低温冷凍庫内での保存、制御された解凍手順、プロテアーゼ阻害剤の添加、および最小の活性化促進を維持する精製手順が含まれるが、これらに限定されない。活性化されたｒＦＩＸが依然として精製産物中に存在し続ける場合、レクチンクロマトグラフィー（Ｎ結合型炭水化物部が活性化ペプチド中にのみ存在する）、活性化ペプチドに対するＭａｂを使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、あるいは活性化ＦＩＸに対する非活性化ＦＩＸの分子安定性の違いに関して選択することができる金属イオン誘導沈澱技法によって容易に取り除くことができる。哺乳動物細胞およびトランスジェニック家畜類において十分に高いレベルでの活性ＦＩＸを産生することにおけるこれらの固有的な困難性のために、遺伝子療法が、組換え技術よりもむしろ、予防的治療を達成する、おそらくはより実用的な方法として言及されている（Ｋｕｒａｃｈｉら、（１９９３）；Ｋａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２３５３−２３５７（１９９４）；Ｆａｌｌａｕｘら、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｈａｅｍｏｓｔ．７４：２６６−７３（１９９５））。これは、十分に現実的であることが確かである。なぜなら、これは、哺乳動物細胞において、低いレベルではあるが、活性ＦＩＸを発現することが明らかにされている細胞においてさえも、ＦＩＸ予防に適切な産物は、組換え産生を使用してまだ見出されていないことを教示しているからである。ＣＨＯ細胞から作製された最も良い組換えＦＩＸ細胞産生系は、低い分泌レベルで産生し（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、（１９９３））、しかし実際には予防には適さない。さらに、結果は、相同的な血漿タンパク質のＦＩＸおよびプロテインＣはすべて、翻訳後プロセシング、タンパク質分解プロセシング、および分泌に対して非常に異なる細胞特異的な制限を有することを示し、これらは、タンパク質特異性に基づいて高い発現レベル、生物学的活性、産生培地からの下流での回収、および予想可能な循環半減期の予測を妨げることを明らかにした（Ｇｒｉｎｎｅｌｌら、「天然型および改変組換え型のヒトプロテインＣ；機能、分泌、および翻訳後修飾」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ、Ｄ．Ｆ．Ｂｒｕｌｅｙ ａｎｄ Ｄｒｏｈａｎ編 ２９−６３、Ｇｕｌｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ．（１９９０）；Ｙａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９８９）；Ｂｕｓｂｙら、（１９８５））。

従って、著量の精製された第ＩＸ因子をヒト血漿以外の供給源から得るための手段が依然として求められている。血友病Ｂの処置として適切なｒＦＩＸを哺乳動物細胞において製造するための実用的な手段もまた求められている。

国際公開第９０／０５１８８号 国際公開第９１／０８２１６号 国際公開第９５／３００００号

Ｈｉｇｈら、「第ＩＸ因子」、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＡＮＤ ＨＥＭＯＳＴＡＳＩＳ、Ｈｉｇｈ（編）、２１５〜２３７頁（Ｄｅｋｋｅｒ １９９５） Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７３：３３３（１９９５） Ｂａｊａｊら、「ヒトの第ＩＸ因子および第ＩＸａ因子」、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９３） Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：９５３（１９９３） Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９４（Ｓｕｐｐｌ．１）：３５（１９９５） Ｂｕｓｂｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：６８４−６８６（１９８５） Ｋａｕｆｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９６２２−９６２８（１９８６） Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５（１９９３） Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９０：４６１１−４６１５（１９９３） Ｂｕｓｂｙら、（１９８５）；ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６８−２７０（１９８５） Ａｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８４−６８６（１９８５） Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３；Ｗａｓｌｅｙら（１９９３） Ｊａｌｌａｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：３２９５−３３０１（１９９０） Ｃｌａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４８７−４９９２（１９８９） Ｃｏｌｍａｎ、ＩＢＣ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９５） Ｙｕｌｌら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０８９９−１０９０３（１９９５） Ｋｉｎｇｄｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｄｉａｔｈｅｓ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．（Ｓｔｕｔｔｇ．）３３：６１７（１９７５） Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ４：９５３−９７４（１９９３） Ｍａｓｈｉｋｏ ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７５：４８１−４８４（１９９４） Ｋａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２３５３−２３５７（１９９４） Ｆａｌｌａｕｘら、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｈａｅｍｏｓｔ．７４：２６６−７３（１９９５） Ｇｒｉｎｎｅｌｌら、「天然型および改変組換え型のヒトプロテインＣ；機能、分泌、および翻訳後修飾」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ、Ｄ．Ｆ．Ｂｒｕｌｅｙ ａｎｄ Ｄｒｏｈａｎ編 ２９−６３、Ｇｕｌｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ．（１９９０）

発明の要旨
従って、生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子をその乳中に分泌するトランスジェニック動物を製造するための方法を提供することが本発明の目的である。

乳１ミリリットル当り少なくとも１００μｇのヒト第ＩＸ因子を産生するトランスジェニック動物を提供することが本発明のさらなる目的である。

これらやその他の目的は、ゲノム内に安定に組み込まれた外来性ＤＮＡ分子を持つトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することにより、本発明のひとつの実施形態に従って達成される。そのゲノム内に安定に組み込まれた外来性ＤＮＡ分子を持つトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、外来性ＤＮＡ分子は次のものを含む：
（ａ）プロモーターを含む乳腺特異的遺伝子の５’調節配列；
（ｂ）５’から３’方向にシグナル配列、第ＩＸ因子プロ配列および第ＩＸ因子配列をコードする第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ配列［かかるシグナル配列は前記トランスジェニック哺乳動物の乳中への第ＩＸ因子の分泌を指令するのに有効であり、かかる第ＩＸ因子配列は第ＩＸ因子遺伝子の完全な５’非翻訳および３’非翻訳領域あるいは少なくとも完全な領域の一部を欠失している］；および
（ｃ）乳腺特異的遺伝子からの３’調節配列あるいは乳腺において活性な３’調節配列；
かかる５’および３’調節配列は機能可能（有効に機能するよう）に前記第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ配列に連結されている。

本発明において有用な乳腺特異的プロモーターは、短乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター、長ＷＡＰプロモーター、短α−カゼインプロモーター、短β−カゼインプロモーター、短κ−カゼインプロモーター、長α−カゼインプロモーター、長−βカゼインプロモーター、長κ−カゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーターおよびβ−ラクトグロブリンプロモーターからなる群から選択される。

本発明によって想定されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび雌ウシからなる群から選択される。

そのゲノム内に外来性ＤＮＡ分子が組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することによって第ＩＸ因子を生成するための方法を提供することはさらなる目的であり、かかる方法は次の事柄を含む：
（ａ）そのゲノム内に外来性ＤＮＡ分子が組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する、ただしかかる外来性ＤＮＡ分子は次のものを含む：（１）プロモーターを含む乳腺特異的遺伝子の５’調節配列；（２）５’から３’方向にシグナル配列、第ＩＸ因子プロ配列および第ＩＸ因子配列をコードする第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ配列、ただしかかるシグナル配列は前記トランスジェニック哺乳動物の乳中への第ＩＸ因子の分泌を指令するのに有効であり、かかる第ＩＸ因子配列は第ＩＸ因子遺伝子の完全な５’非翻訳および３’非翻訳領域あるいは少なくとも完全な領域の一部を欠失している；および（３）乳腺特異的遺伝子からの３’調節配列あるいは乳腺において活性な３’調節配列；ただしかかる５’および３’調節配列は機能可能に前記第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ配列に連結されている；
（ｂ）かかる第ＩＸ因子をコードする前記ＤＮＡ配列を発現させ、かかる第ＩＸ因子を前記トランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌させる；
（ｃ）かかる哺乳動物から前記乳を採集する；および
（ｄ）かかる乳から前記第ＩＸ因子を分離する。

上述したトランスジェニック哺乳動物が産生する第ＩＸ因子を用いて血友病Ｂを治療する方法を提供することはさらなる目的である。治療は、本発明の第ＩＸ因子と製薬学的に許容しうる担体を血友病Ｂ患者に投与することを含む。

第ＩＸ因子を産生する乳腺細胞のインビトロ培養物を提供することは本発明のさらなる目的である。本発明のもうひとつの目的は、そのような第ＩＸ因子乳腺細胞を患者に移植することによって血友病Ｂを治療する方法を提供することである。

図１Ａ−図１Ｄはキメラ第ＩＸ因子構築物の構築を図式的に表したものである。特に、図１ＡはｐＷＡＰ４の構築を示す。図１ＢはｐＵＣＦＩＸの作製を示す。図１Ｃは、ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡのｐＷＡＰ４への導入を示す。図１ＤはｐＣＷＡＰＦＩＸの作製を示す。３’および５’末端にＫｐｎＩ部位を導入するため、ＦＩＸ ｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾した。ＦＩＸ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下の表１に示すようなＰＣＲプライマー、ｈｕｍＦＩＸ５’ＫｐｎＩおよびｈｕｍＦＩＸ３’ＫｐｎＩを用いて、両方の末端にＫｐｎＩ部位を持つＦＩＸ ｃＤＮＡを作製した。修飾したｃＤＮＡは、キメラ遺伝子を構築するための「カセットベクター」に容易に挿入することができる。 図１Ａ−図１Ｄはキメラ第ＩＸ因子構築物の構築を図式的に表したものである。特に、図１ＡはｐＷＡＰ４の構築を示す。図１ＢはｐＵＣＦＩＸの作製を示す。図１Ｃは、ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡのｐＷＡＰ４への導入を示す。図１ＤはｐＣＷＡＰＦＩＸの作製を示す。３’および５’末端にＫｐｎＩ部位を導入するため、ＦＩＸ ｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾した。ＦＩＸ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下の表１に示すようなＰＣＲプライマー、ｈｕｍＦＩＸ５’ＫｐｎＩおよびｈｕｍＦＩＸ３’ＫｐｎＩを用いて、両方の末端にＫｐｎＩ部位を持つＦＩＸ ｃＤＮＡを作製した。修飾したｃＤＮＡは、キメラ遺伝子を構築するための「カセットベクター」に容易に挿入することができる。 図１Ａ−図１Ｄはキメラ第ＩＸ因子構築物の構築を図式的に表したものである。特に、図１ＡはｐＷＡＰ４の構築を示す。図１ＢはｐＵＣＦＩＸの作製を示す。図１Ｃは、ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡのｐＷＡＰ４への導入を示す。図１ＤはｐＣＷＡＰＦＩＸの作製を示す。３’および５’末端にＫｐｎＩ部位を導入するため、ＦＩＸ ｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾した。ＦＩＸ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下の表１に示すようなＰＣＲプライマー、ｈｕｍＦＩＸ５’ＫｐｎＩおよびｈｕｍＦＩＸ３’ＫｐｎＩを用いて、両方の末端にＫｐｎＩ部位を持つＦＩＸ ｃＤＮＡを作製した。修飾したｃＤＮＡは、キメラ遺伝子を構築するための「カセットベクター」に容易に挿入することができる。 図１Ａ−図１Ｄはキメラ第ＩＸ因子構築物の構築を図式的に表したものである。特に、図１ＡはｐＷＡＰ４の構築を示す。図１ＢはｐＵＣＦＩＸの作製を示す。図１Ｃは、ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡのｐＷＡＰ４への導入を示す。図１ＤはｐＣＷＡＰＦＩＸの作製を示す。３’および５’末端にＫｐｎＩ部位を導入するため、ＦＩＸ ｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾した。ＦＩＸ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下の表１に示すようなＰＣＲプライマー、ｈｕｍＦＩＸ５’ＫｐｎＩおよびｈｕｍＦＩＸ３’ＫｐｎＩを用いて、両方の末端にＫｐｎＩ部位を持つＦＩＸ ｃＤＮＡを作製した。修飾したｃＤＮＡは、キメラ遺伝子を構築するための「カセットベクター」に容易に挿入することができる。 図２は、ウエスタンブロット分析を用いたトランスジェニックブタ乳における組換え第ＩＸ因子の検出を示す。 図３Ａ−３ＣはｐＵＣＷＡＰ６「カセットベクター」の作製を示す。特に、図３ＡはｐＵＣＮｏｔＩの作製を示す。図３Ｂは、ｐＵＣＷＡＰ５の作製とｍＷＡＰ３’ＵＴＲに隣接するｐＵＣＮｏｔＩベクター配列を含む断片の作製を示す。図３ＣはｐＵＣＷＡＰ６の作製を示す。 図３Ａ−３ＣはｐＵＣＷＡＰ６「カセットベクター」の作製を示す。特に、図３ＡはｐＵＣＮｏｔＩの作製を示す。図３Ｂは、ｐＵＣＷＡＰ５の作製とｍＷＡＰ３’ＵＴＲに隣接するｐＵＣＮｏｔＩベクター配列を含む断片の作製を示す。図３ＣはｐＵＣＷＡＰ６の作製を示す。 図３Ａ−３ＣはｐＵＣＷＡＰ６「カセットベクター」の作製を示す。特に、図３ＡはｐＵＣＮｏｔＩの作製を示す。図３Ｂは、ｐＵＣＷＡＰ５の作製とｍＷＡＰ３’ＵＴＲに隣接するｐＵＣＮｏｔＩベクター配列を含む断片の作製を示す。図３ＣはｐＵＣＷＡＰ６の作製を示す。 図４はプラスミドｐＵＣＷＡＰ６ＦＩＸの作製を示す。

詳細な説明
１．概要
上述したように、トランスジェニック動物において重要な量の第ＩＸ因子を産生するための方法は難解であった。Ｙｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１０８９９（１９９５）は、陰性（ｃｒｙｐｔｉｃ）ＲＮＡスプライシング部位を矯正するとトランスジェニック動物によって合成される第ＩＸ因子の量が増加することを示した。これらの試験では、ひとつのトランスジェニックマウス系統は乳１ミリリットル当り約２７μｇの生物学的に活性な第ＩＸ因子を産生したが、前記系統の個々のマウスの第ＩＸ因子レベルには変動があった。Ｙｕｌｌらは、この変動はおそらく発生的不安定性によるものであろうと推測した。

これに対し、本明細書に記載する研究は、トランスジェニックブタが高いレベルの（１００−２００μｇ／ｍｌ乳）生物学的に活性な組換えヒト第ＩＸ因子を合成し、乳中に分泌できることを示している。還元および非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥに基づくと、組換えヒト第ＩＸ因子の大部分は、ヒト第ＩＸ因子に類似する翻訳後修飾された構造を持つ一本鎖ポリペプチドであるようである。ブタ乳中に分泌される組換えヒト第ＩＸ因子は生物学的に活性であり、第ＩＸ因子欠損ヒト血漿において凝固を開始させることができる。これは、トランスジェニック家畜の乳における、十分に活性で十分にγ−カルボキシル化された組換えヒト第ＩＸ因子の高いレベルの産生についての最初の報告である。

２．トランスジェニック動物を製造するための方法
これまでいくつかの異なる発現系において適切な高い活性を持った組換えヒト第ＩＸ因子を発現することは失敗に終わってきたが、本発明は、トランスジェニック動物の乳から活性タンパク質の高いパーセンテージを特徴とする組換え第ＩＸ因子を得るための方法を提供する。本文中で使用するとき、「動物」の語はヒトを除くすべての哺乳動物を意味する。また、胚および胎児段階を含めて、すべての発生段階にある個々の動物も包含する。「トランスジェニック」動物は、組換えウイルスのマイクロインジェクションあるいは組換えウイルスによる感染などのように、細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作によって直接あるいは間接に受け取られる遺伝情報を含む細胞を持った動物である。

動物に導入される遺伝情報は、好ましくはレシピエントが属する動物種に対して外来性（すなわち「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」）であるが、前記情報はまた、特定個体レシピエントにとってのみ、あるいはレシピエントが既に持っている遺伝情報に対してのみ外来性であってもよい。前述した最後の場合、導入された遺伝子は天然に生じる、あるいは「未変性（ｎａｔｉｖｅ）」遺伝子とは異なって発現されることもある。

「生殖細胞系トランスジェニック動物」の語は、外来性ＤＮＡが生殖細胞系の細胞に組み込まれており、従って子に情報を伝達する能力を与えるトランスジェニック動物を指す。そのような子が実際にその情報の一部あるいは全部を有していれば、それらもまたトランスジェニック動物である。

本発明のトランスジェニック動物は、家畜（ブタ、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ウサギ等）、げっ歯類（マウスなど）、および家庭愛玩動物（たとえばネコやイヌ）を含むがこれらに限定されないヒト以外である。ブタ、ヒツジ、ヤギおよび雌ウシのような家畜が特に好ましい。

好ましくは、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト第ＩＸ因子をコードする単細胞胚の適切なポリヌクレオチド、あるいはその断片または修飾産物を、それらのポリヌクレオチドが成熟動物の生殖細胞系細胞のＤＮＡに安定に組み込まれ、正常なメンデル遺伝方式で遺伝されるように導入することによって製造される。

本発明に従えば、様々な手段によってＤＮＡ分子を胚に導入し、トランスジェニック動物を作製することができる。たとえば、全能あるいは多能性幹細胞をマイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈降反応、リポソーム融合、レトロウイルス感染あるいは他の手段によって形質転換することができる。次に形質転換した細胞を胚に導入し、その中に組み込んでトランスジェニック動物を形成することができる。好ましい方法では、発生中の胚をレトロウイルスベクターに感染させ、感染した胚からトランスジェニック動物を形成することができる。しかし最も好ましい方法では、本発明のＤＮＡ分子を好ましくは単細胞段階で胚に注入し、それを成熟トランスジェニック動物に発生させる。しかし、本発明はこの好ましい方法に限定されるわけではなく、たとえばＬ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７に述べられているような、トランスジェニック動物を作製する他の方法も使用できる。トランスジェニック動物はまた、たとえばＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）やＷｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に述べられているような、胚あるいは成熟細胞系を用いた核転移あるいはクローニングの方法を用いて生成することもできる。さらに米国特許第５，５２３，２２２号に述べられているようなＤＮＡの細胞質注入を用いる手法も使用できる。

第ＩＸ因子を産生するトランスジェニック動物は、第ＩＸ因子コード化配列を含むキメラ構築物を導入することによって得られる。トランスジェニック動物を作製する代替方法は、第ＩＸ因子構築物だけを使用して認められるものよりも高い発現率を提供しうる第２の構築物を持った第ＩＸ因子キメラ構築物を導入することである。本文中で述べるとき、そのような二重トランスジェニック、あるいは「バイジェニック」動物は、付加的フランク配列としてインビボで標的第ＩＸ因子ｃＤＮＡ構築物に連結される別個の構築物として注入される、天然ＷＡＰゲノム配列を持つ。

トランスジェニック動物を得るための方法は公知である。たとえば、引用によりここに援用される、Ｈｏｇａｎら、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８６）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８８（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ ４１：３４３（１９８５）；Ｋｒａｅｍｅｒら、ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＴＨＥ ＥＡＲＬＹ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＥＭＢＲＹＯ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒら、米国特許第５，１７５，３８５号；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、米国特許第５，１７５，３８４号；Ｊａｎｎｅら、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２４：２７３（１９９２）、Ｂｒｅｍら、Ｃｈｉｍ．Ｏｇｇｉ．１１：２１（１９９３）、Ｃｌａｒｋら、米国特許第５，４７６，９９５号参照。

３．キメラ遺伝子の構築
トランスジェニック動物を作製するために使用する適当な第ＩＸ因子コード化ＤＮＡは、ヒト肝組織をヒト第ＩＸ因子遺伝子をクローニングするためのソースとして用いて入手することができる。第ＩＸ因子遺伝子をコードするＤＮＡを、適切な読み取り枠において以下に詳述するような適当な調節シグナルと融合してキメラ構築物を生成し、次にそれを、たとえば従来の慣例に従って細菌ベクターで繁殖させることにより増幅する。

その後増幅した構築物をベクターから切り出し、マイクロインジェクションに使用するために精製する。精製は好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実施する。これは、細菌ベクターや、従来のアガロース電気溶出のような他の手法を使用したときに代表的に存在する多糖類から汚染を取り除くことができる。好ましいＨＰＬＣ法は、構築物を陰イオン交換ＨＰＬＣ支持体上に吸着させ、好ましくは塩化ナトリウム水溶液で支持体から構築物を選択的に溶出し、それによってベクターから汚染を除去することを含む。溶出はｐＨ勾配のような他の手段によっても実施できる。

その代わりに、切り出した構築物を水性スクロースあるいは塩化ナトリウム勾配を通しての限外濾過、ゲル電気溶出とそれに続くアガロース処理およびエタノール沈降反応、あるいは低圧クロマトグラフィーによって精製することもできる。

構築物ができるだけ夾雑物を含まないことが望ましいので、ＨＰＬＣあるいは他の精製法を１回以上の周期で行うことが有益である。特に、上述したように、マイクロインジェクションのためにＨＰＬＣ精製ＤＮＡを使用すると、たとえばマウスおよびブタにおいて約２０％以上の非常に高い形質転換頻度が可能になる。

本発明において有用なＤＮＡ構築物は、第ＩＸ因子の乳腺組織特異的発現、第ＩＸ因子の翻訳後修飾、乳中への第ＩＸ因子の分泌、ならびに第ＩＸ因子の十分な生物学的活性のために必要なすべてのシス作用性シグナルに機能可能に連結された第ＩＸ因子、好ましくはヒト第ＩＸ因子をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明は、好ましくは、所望するあるいは天然のヒト第ＩＸ因子それ自体を生成するＤＮＡ構築物の使用を含むが、所望するタンパク質を、もうひとつ別のタンパク質を含む融合タンパク質として生成することもできる。たとえば、所望する本発明の組換えタンパク質は、所望タンパク質を安定化するためあるいは乳からの精製をより速やか且つ容易にするために、より大きな組換えタンパク質の一部として生成することができる。その後融合のパートナーを化学的あるいは酵素的に分離し、所望タンパク質を単離する。

ヒト第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ分子およびヒト第ＩＸ因子遺伝子とｃＤＮＡのヌクレオチド配列を得るための方法は、たとえば、Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４６１（１９８２）、Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８（１９８２）、Ａｎｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．３：１０５３（１９８４）、Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、国際特許願公開番号第ＷＯ８４／００５６０号、Ｙｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０８９９（１９９５）、Ｃｌａｒｋ、国際特許願公開番号第ＷＯ９５／３００００号、ならびにＭｅｕｌｉｅｎ、米国特許第５，５２１，０７０号（１９９６）によって提供される。ヒト第ＩＸ因子プローブもＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手することができる（たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ．６１３８５、７９５８８、７９６０２、あるいは７９６１０）。

その代わりに、第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ分子は、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドを持った遺伝子を合成することによっても入手できる。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、ｐ．８．２．８−８．２．１３；Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ ６０：１１５（１９８７）参照。さらには、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて長さ１．８ｋｂという大きさのＤＮＡ断片を合成することもできる。Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２６６（１９９３）。

適当な第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ分子は、天然に生じる第ＩＸ因子をコードするゲノムあるいは相補的ＤＮＡ分子を含む。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ分子を含めて、ヒト第ＩＸ因子をコードするＤＮＡ分子を用いる。しかし本発明は、本文中で述べるようなｃＤＮＡに基づく構築物が、ヒト第ＩＸ因子を商業的に有用なレベルで発現させるために成功裡に使用できることを開示する。特に、プロモーターを含む乳腺特異的遺伝子の５’調節配列、本文中で述べるような第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ配列、ならびに乳腺特異的遺伝子からの３’調節配列あるいは乳腺において活性な３’調節配列を含むｃＤＮＡベースの構築物が好ましい。ラット、ブタ、ヒツジ、雌ウシおよびチンパンジーによってコード化される第ＩＸ因子のような、他の種からの第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ分子も使用できる。

本文中で述べる第ＩＸ因子ｃＤＮＡ断片を組換えＤＮＡ手法を用いて修飾し、機能的に等しい分子を得ることも認識されるであろう。たとえば、第ＩＸ因子遺伝子の３’あるいは５’部分を付加する、あるいは完全に欠失させる、あるいはどちらかの末端の一部の塩基を除去することができる。イントロンを除去あるいは付加したり、ひとつまたはそれ以上のイントロンの一部を欠失させることもできる。付加的なヌクレオチド配列を挿入することもできる。イントロンの配列を変えることもできる。以下に述べる修飾第ＩＸ因子についての考察に従ってエクソンを修飾することもできる。好ましい第ＩＸ因子ｃＤＮＡ断片の修飾形態の大部分は、トランスジェニック動物が乳由来の第ＩＸ因子の産生を生じさせる能力を有意に変化させないであろう。ひとつの実施形態では、前記遺伝子の第ＩＸ因子コード化部分は、天然の第ＩＸ因子遺伝子の完全な５’非翻訳および３’非翻訳領域が欠如している。従って、これらの実質的に同様の断片は、本発明においては個々に開示される第ＩＸ因子ｃＤＮＡ断片に等しい。

第ＩＸ因子遺伝子の５’非翻訳領域ではない５’非翻訳領域、特にマウスＷＡＰ遺伝子の５’非翻訳領域は本発明のＤＮＡ第ＩＸ因子構築物に含まれうる。第ＩＸ因子遺伝子の３’非翻訳領域ではない３’非翻訳領域、特にマウスＷＡＰ遺伝子の３’非翻訳領域も同様である。

さらに、第ＩＸ因子コード化ＤＮＡ分子はシグナル配列ＤＮＡの５’に位置する５’非翻訳領域、および第ＩＸ因子コード化配列の３’に位置する３’非翻訳領域も含みうる。

第ＩＸ因子のさらなる有用な修飾は、翻訳後修飾やサイズあるいは活性部位を変化させる修飾、あるいはこのタンパク質またはその部分をもうひとつ別のタンパク質に融合する修飾を含む。そのような修飾は、オーバーラップオリゴヌクレオチドのライゲーションによって修飾遺伝子を合成すること、あるいはたとえばオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発によってクローニングした遺伝子に突然変異を導入することなどの、前記技術において公知の手法によってタンパク質に導入することができる。一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐ．８．０．３−８．５．９（１９９０）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編集）、ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）参照。

本文中で述べる実施例は、乳腺組織において十分にγ−カルボキシル化された生物学的に活性な第ＩＸ因子を合成するトランスジェニック動物を作製できることを明らかにする。従って、本出願の基本的な方法は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子のような他のビタミンＫ依存性血液凝固因子、あるいは抗凝固タンパク質、プロテインＳを産生するトランスジェニック動物を得るために用いることができる。これらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子は標準的な方法によって入手できる。たとえば、第Ｘ因子のちょうど２．８ｋｂ塩基対５’側の染色体１３に位置する第ＶＩＩ遺伝子の特徴づけを述べた、Ｐｏｌｌａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７３８（１９９６）参照。

本発明において有用なシス作用性調節領域は、第ＩＸ遺伝子の発現を推進するプロモーターを含む。本発明において特に有用なプロモーターは、かかるプロモーターが、乳が合成される生理的条件下で乳腺組織において他の組織におけるよりも活性であるという意味で、乳腺組織において「活性」である。最も好ましいのは、乳腺組織に特異的であり、且つ乳腺組織において効率的なプロモーターである。「効率的」とは、プロモーターが、乳中に分泌されるための大量のタンパク質の合成を支えることができる強力なプロモーターであることを意味する。そのようなプロモーターの中で、極めて好ましいのは、短および長乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター、短および長α、βおよびκ−カゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーターおよびβ−ラクトグロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターである。

プロモーターは、様々な種からの乳のタンパク質組成に基づいて選択されうる。たとえば、ＷＡＰおよびＢＬＧプロモーターはトランスジェニックげっ歯類、ブタおよびヒツジに関して特に有用である。げっ歯類ＷＡＰの短および長プロモーターは、ラットＷＡＰ遺伝子、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子およびＣＤ４遺伝子を発現するために使用されてきたが、ヒツジのＢＬＧプロモーターは、ヒツジＢＬＧ遺伝子、ヒトα−１−抗トリプシン遺伝子およびヒト第ＩＸ因子遺伝子を発現するために用いられてきた。たとえば、Ｐａｌｅｙａｎｄａら、１９９１、前出およびＣｌａｒｋら、ＴＩＢＴＥＣＨ ５：２０（１９８７）参照。好ましいプロモーターは、げっ歯類のカゼインおよびＷＡＰプロモーター、ならびにブタ、ウシ、ウマおよびヒツジ類（ブタ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ウマ）、ウサギ、げっ歯類および家庭愛玩動物（イヌおよびネコ）からのカゼイン、α−ラクトアルブミンおよびＢＬＧプロモーターを含む。これらのプロモーターに関する遺伝子は分離されており、そのヌクレオチド配列は公表されている。たとえば、Ｃｌａｒｋら（１９８７）、前出およびＨｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１：３（１９９０）参照。

従来の制限エンドヌクレアーゼおよびサブクローニングステップを実施することにより有用なプロモーターを分離することができる。ＷＡＰシグナル配列のすぐ５’側の２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片として分離されるマウスＷＡＰプロモーターが好ましいが、「長い」ＷＡＰプロモーター（マウスＷＡＰ遺伝子の５’側４．２ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−ＫｐｎＩプロモーターあるいはその断片）も本発明を実施するのに適する。たとえばＰａｌｅｙａｎｄａらの公表文献、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：３３５（１９９４）は、適当な短いマウスＷＡＰプロモーター（「２．５ｋｂ ｍＷＡＰプロモーター」）と長いマウスＷＡＰプロモーター（「４．１ｋｂ ｍＷＡＰプロモーター」）の例を提供している。かかるＰａｌｅｙａｎｄａの公表文献のｐ．３３６−３３９は引用によりここに援用する。また、たとえば、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８３（１９８７）；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、“Ｔｈｅ Ｗｈｅｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ”ｉｎ ＧＥＮＥＳ，ＯＮＣＯＧＥＮＥＳ，ＡＮＤ ＨＯＲＭＯＮＥＳ：ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＲＥＡＳＴ ＣＡＮＣＥＲ、Ｄｉｃｋｓｏｎら、（編集）、ｐ．３９９−４１２（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９１）も参照のこと。

付加的な調節配列は、トランスジェニック動物の乳および／あるいは他の体液中へのタンパク質の分泌を指令する。これに関しては、同種および異種調節配列の両方が本発明において有用である。一般に、乳からのシグナルペプチドあるいは新生標的ポリペプチドのような乳タンパク質の分泌を指令することが既知である調節配列が使用できるが、発現されたタンパク質を他の体液中、特に血液や尿中に分泌することを指令するシグナル配列も、本発明に従って使用することができる。そのような配列の例は、第ＩＸ因子、プロテインＣ、および組織型プラスミノーゲン活性化因子のシグナルペプチドを含めて、分泌される凝固因子のシグナルペプチドを含む。

上に論じたプロモーターに加えて、転写を調節する有用な配列には、エンハンサー、スプライシングシグナル、転写終止シグナル、ポリアデニル化部位、緩衝配列、ＲＮＡプロセシング配列およびトランスジーンの発現を調節する他の配列がある。これに関して特に有用なのは、上に列挙したトランスジェニック動物の乳腺あるいは他の細胞における第ＩＸ因子の遺伝子の転写効率を高める配列である。好ましいのは、乳腺細胞において高度に発現されるタンパク質についての転写調節配列である。

好ましくは、本発明の発現系あるいは構築物はまた、所望する組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流の３’非翻訳領域、あるいは乳タンパク質遺伝子の３’非翻訳領域またはその３’非翻訳領域を有する乳タンパク質遺伝子も包含し、これらのいずれもが調節に使用されうる。この領域はトランスジーンの発現を高めることができる。この領域は明らかに前記発現系のＲＮＡ転写産物を安定化し、従って所望するタンパク質の収率を上昇させる。これに関して有用な３’非翻訳領域には、ポリＡシグナルを提供する配列がある。

第ＩＸ因子の発現のためには、３’非翻訳領域が天然のヒト第ＩＸ因子遺伝子から得られるものではないことが好ましい。適当な異種３’非翻訳配列は、たとえばＳＶ４０スモールｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域、あるいは前記技術において公知の他の３’非翻訳配列から誘導できる。好ましくは、３’非翻訳領域はＷＡＰタンパク質のような乳特異的タンパク質から誘導できる。この領域のポリＡ転写産物の安定化作用は、発現配列のｍＲＮＡを安定化する上で重要である。リボソーム結合部位も第ＩＸ因子の発現効率を高める上で重要である。同様に、第ＩＸ因子の翻訳後修飾を調節する配列は本発明において有用である。

特に好ましい実施形態では、本発明のトランスジーンは一般に、第ＩＸ因子ｃＤＮＡ／シグナルペプチド配列に隣接する上流および下流フランクのＷＡＰ乳タンパク質調節配列からなる。ＡＴＧコドンあるいはその直前のアクセス可能な制限部位で終了する天然５’−ＷＡＰ調節配列を、ヒト第ＩＸ因子の鎖から誘導されたリンカー配列を持たない翻訳可能配列のＡＴＧにおいて生じる制限部位に連結することができる。次に、特定制限部位で終了する５’調節配列と第ＩＸ因子翻訳可能配列の結合配列を、ＷＡＰおよび隣接するＷＡＰ３’フランク領域の３’非翻訳領域の開始部位において生じる、対応する制限部位に連結することができる。この構築モチーフは、乳タンパク質遺伝子の天然５’調節領域および３’非翻訳領域を、配列に干渉することなく直接並置させることを可能にする。構築物を動物ゲノム内の単一領域に連結することを容易にするために、すべての構築物の末端の特定制限部位を選択することができる。

それ故、本発明に従って第ＩＸ因子をコードするＤＮＡ分子を、乳中での第ＩＸ因子の効率的な発現を可能にするシス作用性調節配列に機能可能に連結する。生じるキメラＤＮＡを哺乳動物の胚に導入すると、そこでキメラＤＮＡは胚ゲノムに組み込まれ、胚から発生する成人の、生殖細胞系を含めたすべての細胞の遺伝性の遺伝学的素質の一部となる。このようにして得られたトランスジェニック哺乳動物の乳腺組織において発現され、乳中に分泌される第ＩＸ因子は、ＥＬＩＳＡ、色素形成作用アッセイおよび凝固阻害アッセイのような、第ＩＸ因子活性を検出するために従来から用いられる酵素的および凝固阻害アッセイによって測定したとき、活性タンパク質の驚くほど高いパーセンテージを示す。

４．トランスジェニック動物の乳からの第ＩＸ因子の単離
本発明に従ってトランスジェニック動物から乳を採取することは従来の手段によって実現される。たとえば、ＭｃＢｕｒｎｅｙら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６４：４８５（１９６４）；Ｖｅｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１２００３（１９９２）参照。第ＩＸ因子あるいはその断片は、有害な影響を及ぼす作用を伴わずに従来の手段によって乳あるいは尿から分離し、精製することができる。乳からの分離の好ましい方法は、陰イオン交換と免疫クロマトグラフィーの組合せ、低温沈降反応、全乳あるいは乳漿（脱脂乳）タンパク質の亜鉛イオン誘導沈降反応からなる。たとえば、Ｂｒｉｎｇｅら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．５６：５４３（１９８９）参照。

乳は、異種タンパク質を分解する潜在能を持った数多くのプロテアーゼを含むことが既知である。これらは、トリプシンおよびキモトリプシン活性を持つアルカリプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様の酵素であるアミノペプチダーゼおよび酸性プロテアーゼを含む。Ｃｌａｒｋら（１９８７）前出。それ故、新たに分泌される第ＩＸ因子あるいはその断片をタンパク質分解から保護することが望ましいと考えられる。そのような予防策は、採取後の乳を速やかにプロセシングすること、ならびにＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．ＣＡＴＡＬＯＧ（１９９３年版）のｐ．８５０に列挙されているようなタンパク質分解の公知の阻害因子を乳に加えることを含む。

従って、ひとつの実施形態では、本発明のトランスジェニック哺乳動物は活性なヒト第ＩＸ因子を産生する。たとえば、前記哺乳動物がブタであるひとつの実施形態では、ブタは乳１ミリリットル当り約１００−約２２０μｇの活性ヒト第ＩＸ因子を分泌する。もうひとつの実施形態では、以下に述べるように、ブタは乳１ミリリットル当り約１００−約１８５μｇの活性ヒト第ＩＸ因子、あるいは乳１ミリリットル当り約１００−約１７０μｇの活性ヒト第ＩＸ因子、あるいは乳１ミリリットル当り約１３５−約２２０μｇの活性ヒト第ＩＸ因子、乳１ミリリットル当り約１４５−約２２０μｇの活性ヒト第ＩＸ因子を分泌する。

本発明に従ってトランスジェニック哺乳動物から産生される第ＩＸ因子は、活性化部分トロンボプラスチン凝固時間アッセイによって測定したとき、ヒト血漿から分離したヒト第ＩＸ因子の比活性より少なくとも約５−２００パーセント大きい比活性を持つ。もうひとつの実施形態では、本発明のトランスジェニック哺乳動物によって産生される第ＩＸ因子の比活性は、ヒト血漿から分離したヒト第ＩＸ因子の比活性より少なくとも約１０−１００パーセント大きい、あるいは少なくとも約１５−５０パーセント大きい、あるいは少なくとも約１５−約４６パーセント大きい比活性を持つ。

もうひとつの実施形態では、本発明は、本発明のトランスジェニック哺乳動物から外植した乳腺細胞のインビトロ培養物に関する。そのような細胞は、当業者には公知の方法に従ってインビトロで移植され、培養される。たとえば、米国特許第５，５８０，７８１号参照。もうひとつの実施形態では、当業者には公知の方法に従って、インビトロ細胞培養物から第ＩＸ因子を分離し、精製する。

５．治療方法
もう１つの実施形態において、本発明は、この発明のトランスジェニック哺乳動物によって産生された第ＩＸ因子を用いた血友病Ｂの治療方法に関する。特定すれば、治療には、血友病Ｂ患者における血友病Ｂの症状の予防又は改善が含まれる。血友病Ｂの症状には、外傷を受けた時の過剰な出血、特に体重がかかる関節、柔組織、及び粘膜への自然発生的出血が含まれる。関節への出血が繰返されると、結果として関節血症が生じ、これにより痛みを伴なう肢体不自由性（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）関節症が引起こされ、これは関節の取替を必要とする。柔組織における血腫は、壊死性凝血から成る「擬似」腫瘍を結果として生じることがある。このような血液は、隣接器官を遮断するか、圧縮するか、あるいは破壊することがあり、感染に至ることがある。胃腸管、中枢神経系、頭蓋内、あるいは気道／腹膜後空間への出血は、検知されなければ死に至ることもある。本発明によるこの治療には、血友病Ｂ患者において見られる出血及びこれに関連する副作用の予防又は改善が含まれる。この方法は、本発明のトランスジェニック哺乳動物によって産生された第ＩＸ因子の血友病Ｂ症状予防量又は改善量を、血友病Ｂ症状を有する患者に投与することを含んでいる。投与は当業者に既知のあらゆる方法で実施することができる。例えば前記症状の治療は、第ＩＸ因子濃縮物での静脈内置換治療から成っていてもよい。主要出血エピソードの治療は、濃縮物の丸塊注入によるものであってもよい。しかしながら前記のように、組織の損傷は迅速な検知及び治療後でさえも残ることがある。痛みと衰弱を防ぐために、予防治療が推奨される。注入時に、本発明による第ＩＸ因子の５０％は、即座に血管内皮細胞に結合されるか、及び／又は血管外空間中に拡散する。残りの５０％は、約２４時間の循環中に半減期を有する。これらの注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）動力学の結果、血漿中に最小限の治療レベルを維持するためには１週間につき約１〜２回の注入が必要である。

本発明のもう１つの実施形態は、本発明の第ＩＸ因子を含む製薬組成物に関する。このような製薬組成物は、好ましくは前記トランスジェニック動物によって産生された第ＩＸ因子及び製薬的に許容しうる担体である。例えばこのような製薬組成物は、一定の循環レベルの凝固因子を供給するために、連続注入によって投与しうる本発明の第ＩＸ因子の安定液体配合物であってもよい。

本発明のトランスジェニック動物によって産生された第ＩＸ因子は、当業者に公知の方法によって濃縮され、凍結乾燥形態で販売されうる。例えば凍結乾燥された本発明の第ＩＸ因子は、注射用滅菌水（ＷＦＩ）で再構成され、次のような組成物として送出されてもよい。すなわち、０．０１モル／リットルのヒスチジン、ｐＨ７．０５；０．０６６モル／リットルの塩化ナトリウム；３％マンニトールである。もう１つの実施形態において、凍結乾燥第ＩＸ因子は、滅菌ＷＦＩ中で再構成され、次のものを含む組成物として送出されてもよい。すなわち、０．０４単位のヘパリン／１単位のＦＩＸ；１ミリグラムのデキストロース／１単位のＦＩＸを含む組成物である。現在行なわれている予防用治療に見られるように、反復侵襲性治療を避けるために、３７℃で少なくとも３０日、及び４℃で少なくとも３６５日の安定性が好ましい。本発明は、これらの再構成された調製物の安定性よりも優れた有意な安定性を提供する。

当業者なら、本発明の第ＩＸ因子に適したその他の配合物について知っているであろう。例えばカリフォルニア州ロスアンジェルスのＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＡｌｐｈａＮｉｎｅ、及びオーストリア国ウイーンのＩｍｍｕｎｏ社によるＢｅｂｕｌｉｎ ＶＨ参照。当然ながら本発明によるどの配合物も高度に精製されており、ウイルス、プリオン、血液型抗体、免疫複合体、及びリン脂質を含まない。

血友病Ｂの症状を防ぐか又は改善する投与量又は用量は、この疾病の臨床及び重症度によって必然的に決定される。患者とその臨床的状態との間には非常に多くの可変性があるので、本発明の第ＩＸ因子を用いた治療の間は、凝固機能の監視が必須である。一般的には初期治療の際、体重１ｋｇあたり第ＩＸ因子１単位によって、第ＩＸ因子活性における約０．５〜１％の平均的上昇が与えられ、連続治療の場合、この平均的上昇は約１〜１．５％である。血友病Ｂの症状の長期予防のための投与量の例は、約１８〜３０ＩＵ／ｋｇ（週一回）又は約９〜１５ＩＵ／ｋｇ（週二回）である。投与量はまた、治療目的に応じて様々なものであろう。例えば血友病Ｂ患者が外科手術を受けた場合、手術の週の後３０〜５０％だけこのような患者の第ＩＸ因子レベルを上げることが望ましいであろう。抜歯の場合、第ＩＸ因子レベルはこの処置の直前に５０％まで上昇させる必要があろう。軽〜中程度の出血は、第ＩＸ因子レベルを２０〜３０％まで上昇させるために本発明の第ＩＸ因子の単回投与で治療してもよい。これと同程度又はこれより重大な出血の場合、第ＩＸ因子レベルを３０〜５０％まで上昇させることが望ましく、注入は毎日必要であろう。さらには当業者なら、患者及び臨床的環境に応じて、本発明の第ＩＸ因子の量及び投与頻度を調節する方法が分るであろう。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は本発明のトランスジェニック哺乳動物から移植された第ＩＸ因子産生細胞を用いた血友病Ｂの治療方法に関する。このような哺乳動物腺細胞は、インビボで第ＩＸ因子を発現し、これによって血友病Ｂの症状を防ぐか又は改善する。この方法は、遺伝子治療に関して既知の技術を用いて実施される。例えば、Ｄｅｂｓ、Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ’ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）、８９：１１２７７−１１２８１（１９９２）、Ｌｅｇｅｎｄｒｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．、９：１２３５−４２（１９９２）参照。１つの実施形態において、本発明によるトランスジェニック哺乳動物から除去された第ＩＸ因子産生細胞は、ヒトへの移植前に試験管内インビトロで培養される。このような培養系は、当業者には公知である。例えば米国特許第５，５８０，７８１号参照。これらの細胞は処理され、ついで受容体による拒絶反応を避けるような方法で患者に移植される。このような方法は当業者には既知である。例えば米国特許第５，５７３，９３４号参照。この特許は、インビボでの使用のための生物学的物質をカプセル化する方法を教示している。当業者に既知のその他の技術には、この生物学的物質を免疫隔離装置室に入れること、及び免疫調節剤を用いて、移植された物質のために血管支持体を強化することが含まれる。米国特許第５，５６９，４６２号参照。

本発明はこのように一般的に記載されているが、下記実施例を参照すればより理解しやすいであろう。これらの実施例は、例証のために示されているものであって本発明を限定するものではない。

トランスジェニックブタの生産のためのヒト第ＩＸ因子発現ベクターの調製
一般に、２．５ｋｂの５’非翻訳配列及び３’ 非翻訳領域を含むネズミＷＡＰ遺伝子全体を、標準的方法によってクローンした。Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１２：８６８５（１９８４）参照。ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡ断片が得られ、３’非翻訳領域が欠失された。標準的方法を用いて、ＷＡＰシグナル配列のすぐ隣の５’の２．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片として単離されたマウスＷＡＰプロモーター、３’非翻訳領域を欠くヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ配列、及びＷＡＰ遺伝子の３’非翻訳領域の１．６ｋｂ断片を含む発現ベクターを構築した。第２発現ベクターは、７．２ｋｂマウスＷＡＰ遺伝子（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）断片を含んでいた。発現ベクターは細菌形質転換によって増幅され、標準的方法を用いた細菌培養から精製された。通常の組換えＤＮＡ技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第１〜３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８９年）に見られる。

より特定すれば、キメラ第ＩＸ因子構造物は次のように調製された。

１．キメラ第ＩＸ因子構造物の調製
ｐＷＡＰ４「カセットベクター」の産生
マウスＷＡＰ遺伝子の調節５’及び３’フランク配列を、哺乳動物特異的発現に用いた。特定すれば、ＷＡＰシグナル配列のすぐ隣の５’の２．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片及びＷＡＰ遺伝子の３’非翻訳領域の１．５ｋｂ断片として規定された、マウスＷＡＰプロモーターを含むカセットベクターが調製された。これらの調節配列は、ＷＡＰ遺伝子のコーディング及び遺伝子内非翻訳配列（イントロン）を含まない。

ｐＷＡＰ４として示されているベクターは、ｐＷＡＰＰＣ３から誘導され（Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌの学位論文“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｉｌｋ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｍｍａｌ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ”、Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ（１９９３年１２月））、次のように開発された。すなわち、鋳型としてＷＡＰＰＣ３を用いて、ＰＣＲプライマーＷＡＰ３’Ｓ２（これは５’ＫｐｎＩ部位を含んでおり、停止シグナルのすぐ後の内生ＷＡＰと相同である）及び下記表１に示されているようなＷＡＰ３’Ａ１を用いて、両端にＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ部位のあるセグメントを産生した。このセグメントは、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで消化され、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＷＡＰＰＣ３から生じる断片を含むベクターとライゲーションされた。エレクトロポーテーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｔａｔｉｏｎ）によってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換するために、このライゲーション混合物が用いられた。結果として生じたコロニーを、ＬＢアンピシリンプレート上で成長させた。採集されたコロニーを、ＴＢアンピシリン肉汁中で成長させ、プラスミドを単離し、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、又はその両方で切断し、ゲル電気泳動に付した。シークエンシングは、ＷＡＰ３’Ａ１プライマーを用いて実施され、正しいと判定された。図１Ａ参照。

修飾（ＫｐｎＩ）ＦＩＸ ｃＤＮＡの産生
ＦＩＸ ｃＤＮＡ（開始配列のすぐ前及び停止配列の後に位置するＫｐｎＩ部位を含むもの）が、ＰＣＲ断片として発生された。断片産生プロトコルは、次のとおりである。すなわち、２００μＭｄＮＴＰ’ｓ、０．５μＭの各プライマー（表１に示されているようなｈｕｍＦＩＸ５’ＫｐｎＩ及びｈｕｍＦＩＸ３’ＫｐｎＩ）、２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ、及び３０ｎｇのプラスミド鋳型（米国ノースカロライナ州チャペルヒル（Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）のノースカロライナ大学生物学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）のＰｒｏｆ．Ｄａｒｒｙｌ Ｓｔａｆｆｏｒｄから入手したｐＭＣＤＳＦＩＸ）を含む１００μｌの総容積の反応混合物を、９５℃における２０秒間の変性、５０℃における１分間のアニール、及び７５℃における５分４５秒間の伸長の３０サイクルに付した。サイクル後、反応混合物は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでの１０分間のブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）に付され、ＥＤＴＡ濃度が２５ｍＭにされ、１５分間６５℃まで加熱され、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出され、等容積の９５％エタノールで沈殿させられ、吸引され、Ｈ_２Ｏ中に懸濁された。

ライゲーション、形質転換、及びシークエンシング
図１Ｂに示されているように、修飾（ＫｐｎＩ末端）ＦＩＸ ｃＤＮＡを含むｐＵＣＦＩＸとして示されているプラスミドは、ｐＵＣ１８と修飾ｃＤＮＡとの両方のＫｐｎＩでの消化（カリフォルニア州ラジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の製造業者の指示による）、消化産生物のＣＨＣｌ_３：フェノール（１：１）抽出による精製、等容積の９５％エタノールでの沈殿、吸引、及びＨ_２Ｏ中での懸濁によって産生された。プラスミド及びｃＤＮＡのライゲーションは、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の指示により、１２５ｎｇのＫｐｎＩ消化ｐＵＣ１８及び１２５ｎｇのＫｐｎＩ消化修飾ｃＤＮＡを用いて行なわれた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、ライゲーション混合物を用いたエレクトロポーテーションによって形質転換され、ＬＢアンピシリンプレート上で培養された。選択されたコロニーを、ＴＢアンピシリン肉汁中で成長させた。これらのコロニーから生じたプラスミド調製物を、制限酵素消化（ＫｐｎＩ）及びゲル電気泳動によって分析した。ｃＤＮＡのセンス鎖全体がシークエンシングされたが、これは遺伝子バンクにあるＦＩＸＡ配列と比較して正しいことが分かった。

ｐＷＡＰＦＩＸを産生するためのＦＩＸ ｃＤＮＡのｐＷＡＰ４「カセットベクター」への導入
図１Ｃに見られるように、ｐＷＡＰ４とｐＵＣＦＩＸとの両方が、別々の反応においてＫｐｎＩで消化され、ゲル電気泳動に付され、適切なプラスミド断片がゲルから除去され、ライゲーションされた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、ライゲーション混合物を用いたエレクトロポーテーションによって形質転換され、ＬＢアンピシリンプレート上で培養された。選択されたコロニーを、ＴＢアンピシリン肉汁中で成長させた。これらのコロニーから生じたプラスミド調製物を、制限酵素消化（ＫｐｎＩ）ついでゲル電気泳動によって分析した。インサートの正確な配向を決定するために、インサートに積極的なクローンを、プライマーＦＩＸＳ１及びＷＡＰ３’Ａ１を用いたＰＣＲ分析に付した。

ｐＵＣＷＡＰＦＩＸの産生
図１Ｄに示されているように、ＷＡＰプロモーター、ｃＤＮＡ、及び３’ＷＡＰ ＵＴＲを含むインサートが、ＥｃｏＲＩ消化によってｐＷＡＰＦＩＸから放出され、ゲル電気泳動に付され、このゲルから除去され、精製された。この断片は、ＫｐｎＩ消化ｐＵＣ１８でライゲーションされ、この反応混合物は、エレクトロポーテーションによってＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換するために用いられた。エレクトロポーテーション後、細胞がＬＢアンピシリンプレート上で培養された。採集されたコロニーを、ＴＢアンピシリン肉汁中で成長させた。採集されたコロニーから生じたプラスミドが精製され、ＥｃｏＲＩ酵素消化及び電気泳動に付された。インサートの確認後、当業者に公知の方法に従って大規模な精製が行なわれた。

２．マイクロインジェクション用ＩＸ因子コードＤＮＡの調製
７．２ｋｂのマウスＷＡＰ遺伝子を含むか、ＷＡＰプロモーターを含むキメラ構築物、ヒトＩＸ因子遺伝子および３’ＷＡＰ配列をＥｃｏＲＩ制限酵素消化によりｐＵＣＷＡＰＦＩＸから切り出し、低融点アガロース電気泳動を用いてマイクロインジェクション用に精製した。ＤＮＡ：アガロースバンドをゲルスラブから切り出した。次にアガロースバンドをアガラーゼで処理して分解し、アガロース汚染を除いた。

消化後、ｃＤＮＡを含有する溶液を１０ｍＭＭｇ２＋、２０ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳの組成とし、次いでフェノール／クロロホルムで抽出した。一夜−２０℃で０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下２．５容のエタノールを用いて水層からＤＮＡを析出させた。遠心分離後、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、構築物各々を再懸濁し、１．４または７μｇ／ｍｌ（マウス用）、１４μｇ／ｍｌ（ブタ用）の濃度となるようにＢｒｉｎｓｔｅｒｓマイクロインジェクション緩衝液に溶解した。

別の試験法に従って抽出ＤＮＡを以下の通りＨＰＬＣで精製した。キメラ遺伝子をそのベクターから切断し、溶液を１０ｍＭマグネシウム、２０ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳの組成とし、次にフェノール／クロロホルムで抽出した。一夜−２０℃で０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下２．５容のエタノールを用いて水層からＤＮＡを析出させた。遠心分離後、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌蒸留水に再懸濁した。

消化したＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、次にＴＥ緩衝液中０．３μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＷａｔｅｒｓのＧＥＮ ＦＡＸ ＰＡＣ ＨＰＬＣカラムを用いてＨＰＬＣによりフラグメントを精製した。２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、および０．６３Ｍ ＮａＣｌの組成の緩衝液を用いてカラムをアイソクラティックに溶離した。一回につき約１５μｇの消化ＤＮＡをカラムに適用した。次に全てのクロマトグラフィー溶離で得られたＤＮＡ試料を合わせ、再沈殿し、２回目のカラム溶離を行った。

ＤＮＡ濃度は、臭化エチジウムで染色後、ＤＮＡ試料の蛍光強度を標準物質の強度と比較することにより、アガロースゲル電気泳動で求めた。次に試料を１０μｇ／ｍｌの濃度とし、マイクロインジェクションに供するまで−２０℃で保存した。

ヒトＩＸ因子遺伝子を発現するトランスジェニックブタの製造
ブタ胚を卵管から採取し、約０．５ｍｌの胚転移培地（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）の入った１．５ｍｌ容のマイクロ遠沈管に入れた。胚をマイクロ遠心分離機（Ｈｅｒｍｌｅ、Ｚ２３１型）中１６，０００×ｇ ＲＣＦ （１３，４５０ＲＰＭ）で１２分間遠心分離した。次に胚をマイクロ遠沈管から延伸研磨パスツールピペットを用いて回収し、検査用の３５ｍｍペトリ皿にいれた。原形質がなお前核が見えないほど脂質で不透明であった場合は、胚を再度１５分間遠心分離した。次に胚を１００ｍＭペトリ皿の蓋の中央の培地（約１００μｌ）の微小液滴内に入れ、シリコーン油で微小液滴を被覆し、蓋を満たすことにより培地の蒸発を防止した。胚の入ったペトリ皿を、加熱載物台とＨｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ 光学系（２００×最終倍率）をともに搭載した逆転顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）上に搭載した。細密に延伸（Ｋｏｐｆ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｐｕｌｌｅｒ、７２０型）し研磨（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ マイクロ鍛造器、ＭＦ−３５型）したマイクロピペットを用いて胚を安定化し、一方、２種のキメラ構築物の混合物のコピー約２００〜５００個を含むＨＰＬＣ精製ＤＮＡ溶液約１〜２ピコリットルを別の細密延伸マイクロピペットを用いて雄性前核内に供給した。形態学的観察に基づき、マイクロインジェクション過程で死滅しなかった胚を移植先のブタへの転移用のポリプロピレンチューブ（直径２ｍｍ）に投入した。

ｐＵＣＷＡＰ６「カセットベクター」およびプラスミドｐＵＣＷＡＰ６ＦＩＸの調製
ｐＵＣＷＡＰ６「カセットベクター」の調製
概ね、ネズミＷＡＰ遺伝子全体を実施例１に記載の情報によりクローニングし、マウスＷＡＰ遺伝子の調節５’および３’フランク配列を用いて哺乳類特異的発現を行った。特に、ＷＡＰシグナル配列に５’で隣接する４．１ｋｂのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントおよびＷＡＰ遺伝子の３’非翻訳領域の１．６ｋｂフラグメントとして定義されるマウスＷＡＰプロモーターを含むカセットベクターを調製した。これらの調節配列はＷＡＰ遺伝子のコード配列および遺伝子内の非翻訳配列（イントロン）を含んでいない。

ｐＵＣＷＡＰ６と命名されたベクターは出発物質であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから入手したプラスミドｐＵＣ１８，ｐＷＡＰ４およびｐ２２７．６を用いて、遺伝子成分から誘導した。ｐＵＣＷＡＰ６を得るに当たっては、ｐＵＣ１８ベクターをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で切断し、ベクターのマルチクローニングサイトを除去し、エンドヌクレアーゼでブラント末端とし、ＮｏｔＩリンカーで連結した。次に線状プラスミドをＮｏｔＩで切断し、連結した。連結混合物を用いてＬＢアンピシリンプレート上でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、採取したコロニーをＴＢアンピシリンブロス上で生育させ、プラスミドを単離し、ＮｏｔＩで切断し、次に、ゲル電気泳動に付した。プラスミドは妥当なものであると判断され、ｐＵＣＮｏｔＩと命名した（図３Ａ参照）。ベクターｐＷＡＰ４をＥｃｏＲＩで切断し、ＷＡＰの５’側２．６ｋｂｐと３’側遺伝子要素を含むフラグメントをゲル電気泳動で分離し、精製した。フラグメントの末端をエンドヌクレアーゼでブラント化することにより処理し、ＮｏｔＩリンカーを連結した。フラグメントをＮｏｔＩで切断し、ｐＵＣＮｏｔＩのＮｏｔＩ制限酵素切断部入内に連結し、次にこれを用いてアンピシリンプレート上でＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌体を形質転換し、採取したコロニーをＴＢアンピシリンブロス上で生育させた。ＮｏｔＩ消化により単離したプラスミドは妥当であるものと確認され、このプラスミドをｐＵＣＷＡＰ５と命名した。ｐＵＣＷＡＰ５プラスミドをＫｐｎＩ消化と部分ＮｏｔＩ消化に付し、ｍＷＡＰ ３’ＵＴＲによりフランク処理されたｐＵＣＮｏｔＩベクター配列を含むフラグメントを得た（図３Ｂ参照）。このフラグメントを、ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐ２２７．６を消化することにより得た４．１ｋｂの５’ＷＡＰプロモーターと連結した。次に連結混合物を用いてＬＢアンピシリンプレート上で生育させたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、採取したコロニーをＴＢアンピシリンブロス上で生育させ、単離したプラスミドをＮｏｔＩで切断し、ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩは妥当なものであると判断された。次にこのプラスミドをｐＵＣＷＡＰ６と命名した（図３Ｃ参照）。

ｐＵＣＷＡＰ６ＦＩＸの調製
図４に示す通り、ｐＵＣＷＡＰＦＩＸをＫｐｎＩで消化し、ゲル電気泳動でＦＩＸｃＤＮＡを単離することによりプラスミドｐＵＣＷＡＰ６ＦＩＸを調製した。このフラグメントをＫｐｎＩ消化後にｐＵＣＷＡＰ６のＫｐｎＩ部位に挿入し、次に両フラグメントを連結させた。次に連結混合物を用いてＬＢアンピシリンプレート上でプレート培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。採取したコロニーをＴＢアンピシリンブロス上で生育させ、プラスミドを単離した。単離したプラスミドをＮｓｉＩで消化し、ｃＤＮＡインサートの方向を確認した。正しい方向にインサートを含んでいたプラスミドをｐＵＣＷＡＰ６ＦＩＸと命名した。インサート確認の後、当該分野で既知の方法に従って大規模精製を行った。ＤＮＡは上記したマイクロインジェクション用に調製した。

ヒトＩＸ因子遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの調製
トランスジェニックマウスは本質的にＨｏｇａｎら（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、引用してここに援用する）の記載に従って調製した。即ち、マイクロインジェクション用のガラス針をマイクロピペット伸展器とマイクロ鍛造器を用いて調製した。インジェクションに際しては、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ 光学系を搭載したＮｉｋｏｎ顕微鏡を用い、Ｎａｒａｓｈｉｇｉのマイクロ操作装置とＮ２駆動式ピコインジェクター（Ｎａｒａｓｈｉｇｉ）を使用した。

繁殖後のマウス胚を過剰排卵させた雌性ＣＤ−１マウスの卵管から外科的に採取し、Ｍ２培地に播種した。３００μｇ／ｍｌの濃度のヒアルロニダーゼを用いて胚から卵丘細胞を除去した。次に胚を新しいＭ２培地で洗浄し、Ｍ１５培地に移し、インジェクションまで３７℃で保存した。

約１．４μｇ／ｍｌの上記ＤＮＡを含有する保存溶液を調製し、マウス１細胞胚の前核にマイクロインジェクションした。更に、約７μｇ／ｍｌの総ＤＮＡを含有する保存溶液を調製し、マウス胚の前核内にマイクロインジェクションした。

雄性前核内にＤＮＡ溶液をインジェクションした後、精管切除した雄と交配することにより擬似妊娠させたアベルチン麻酔ＣＤ−１移植先雌に移植した。移植先動物当たり約２５〜３０個のマイクロインジェクションマウス胚を擬似妊娠雌に移した。胚を分娩日まで生育させ、新生仔のマウスにトランスジーンが存在するかどうか、以下に示す表１に記載したプライマーＦＩＸＳ１およびＦＩＸＡ１を用いたＰＣＲにより調べた。

トランスジーン動物からのＤＮＡの調製
マウスに関する以下に例示する方法により何れかの種のトランスジェニック動物の組織よりＤＮＡを調製できる（Ｍａｒｍｕｒ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２０８（１９６１）引用してここに援用する）。

５ｍｍのマウス尾部片を離乳期（３週鈴）の潜在的トランスジェニック幼若マウスから採取し、液体窒素中凍結した。凍結した組織に８４０μｌのライジング溶液（８ｍＭ ＥＤＴＡ−０．８％ ２−メルカプトエタノール−８０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ−１Ｍ塩素酸ナトリウム、４０ｍＭトリス緩衝液中）ｐＨ８．０および１２０ｍＭ ＮａＣｌを添加し、混合物を５０℃でインキュベートした。次に混合物を１０〜１５秒間フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）２５０μｌで抽出し、次に１０分間遠心分離した。上澄み液（約８３０μｌ）を新しい試験管に移し、イソプロパノール６容量を用いて溶液を攪拌することによりＤＮＡ凝結物を調製した。母液を傾斜し、ＤＮＡ凝結物を８０％エタノールで２回洗浄した。５分間遠心分離、上澄み吸引、そして、凝結物を１０分間気流中風乾することによりＤＮＡ凝結物を単離した。

ＤＮＡ凝結物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．０−１ｍＭ ＥＤＴＡ）２５０μｌに溶解し、溶液を３７℃で１時間ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡおよび４０，０００単位／ｍｌ ＲＮＡｓｅＴ１）１０μｌで処理した。この混合物を５〜１０秒間クロロホルム−イソアミルアルコールの２４：１（ｖ／ｖ）溶液５０μｌとともに振とうし、遠心分離し、上澄みを新しい試験管に移した。

回収した上記上澄み液を順次３Ｍ酢酸ナトリウム２５μＬおよび９５％エタノール０．５ｍｌと混合した。上記上澄み液を順次３Ｍ酢酸ナトリウム２５μＬおよび９５％エタノール０．５ｍｌと混合した。上澄み液を傾瀉して沈殿ＤＮＡと分離し、沈殿を８０％エタノールで洗浄した。精製したＤＮＡを遠心分離により単離し、風乾し、次いでＴＥ１５０μＬに溶解した。

本質的に同じ手法を用いてブタよりＤＮＡを調製し、同じかまたは類似の手法を用いて他の動物からもＤＮＡを調製できる。このようなＤＮＡを分析することによりトランスジェニック動物が組み換え構造を有しているかどうか判断できる。

組織由来ＤＮＡの分析
被験動物が組み換え構造を有するかどうかを調べるために、組織試料をトランスジェニック動物から採取し、一夜３７℃でプロテイナーゼＫおよびＳＤＳで処理した。次に混合物をＤＮａｓｅ非含有ＲＮａｓｅとともに３７℃で１〜２時間インキュベートした。一夜−２０℃で酢酸ナトリウムとエタノールを用いて混合物からＤＮＡを析出させ、遠心分離して回収し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。乾燥したＤＮＡ沈殿物を直接ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。場合により、混合物をフェノール／クロロホルムで十分抽出した後に、エタノール析出に付した。

オリゴヌクレオチド対を用いて、トランスジェニック動物中のＷＡＰ遺伝子またはＩＸ因子の存在を検出するポリメラーゼ連鎖反応をプライミングした。下記の表１を参照されたい。反応を行う際には、アニーリング温度を５８℃とし、変性温度を９４℃とし、伸長温度を７２℃とし、オリゴプライマー１００ｎｇおよび（ゲノム）鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを反応当たり使用し、自動温度循環装置（Ｍ．Ｊ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて４０回各温度間を循環させた。反応生成物の２０％をアガロースゲル上で泳動させ、マーカーＤＮＡフラグメントとの比較によりフラグメントの大きさを確認することにより、ＰＣＲ反応を分析した。

２匹の元トランスジェニックブタ（雄１匹雌１匹）は７．２ｋｂマウスＷＡＰ遺伝子（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）フラグメントと同時インジェクションした２．６ｋｂのマウスＷＡＰプロモーター−第ＩＸ因子 ｃＤＮＡ−１．６ｋｂ ＷＡＰ遺伝子３’−末端構造物を有していた。表２に示す通り、雄動物５７−７はトランスジーンを伝達していなかった。一方、元動物５８−１は第ＩＸ因子のｃＤＮＡトランスジーンを有する雌性新生仔１匹を設けていた。元動物５８−１はそれ以外に第２の同腹仔として６匹の新生仔、即ち雌３匹雄３匹を設けていた。雌３匹はトランスジェニックではなかった。第２の同腹仔の雄のうち２匹は第ＩＸ因子トランスジーン陽性であった。

トランスジェニックブタ乳中のヒト第ＩＸ因子の発現
トランスジェニックブタ５８−１の乳中の組み換えヒト第ＩＸ因子の一日当たり発現濃度を以下の通り測定した。授乳中の雌性ブタにオキシトシン（Ｖｅｄｃｏ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＯ）３０〜６０ＩＵを筋肉内注射し、乳分泌低下を促進した。乳分泌低下は注射後２〜５分に起こった。本試験の過程を通じてブタからは手操作により搾乳した。採取直後に乳を２００ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０で１：１希釈し、カゼインを可溶化した後に、凍結した。乳／ＥＤＴＡ混合物のうち少量（約１ミリリットル）を採取し、４℃で１６０００×ｇで約３０分間遠心分離した。脂肪の層を希釈乳精画分から分離し、希釈乳精画分をその後の全てのアッセイで使用した。この試験では、乳に関して報告されている全ての濃度値は、ＥＤＴＡ希釈とその後の乳脂肪の除去に対応してファクター１．９を掛けた希釈乳精試料より得たものである。

乳中の第ＩＸ因子の量はポリクローナルＥＬＩＳＡで測定した。即ち、イムロンＩＩマイクロプレート（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）を、４℃で０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ９．６中、１：１０００のウサギ抗ヒト第ＩＸ因子（Ｄａｋｏ）１００μｌ／ウエルで一夜コーティングした。ウエルをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ，２５ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで、室温でＴＢＳ／０．１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。試料とＴＢＳ−ＢＳＡ希釈緩衝液中のヒト第ＩＸ因子標準物質（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓより入手）をウエルに３連で添加し（１００μＬ／ウエル）、３０分間３７℃でインキュベートした。次にウエルを洗浄し、室温で更に１０分間ブロッキングした。次にＴＢＳ−ＢＳＡ中１：１０００のヤギ抗ヒト第ＩＸ因子（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）を３７℃で３０分間ウエル中でインキュベートし、その後抗ヤギＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を添加した。結合した発色団は、ＥＬ３０８ Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダを用いて４９０ｎｍでＯＰＤ基質（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ）で検出した。

表３に示すとおり、１０日間の授乳期間中を通じて一日当たり１００〜２２０μｇ／ｍｌの発現濃度が維持された。

トランスジェニックブタの生産したヒト第ＩＸ因子のウエスタン分析
組み換えヒト第ＩＸ因子をまたウエスタン分析によっても調べた。動物５８−１のＥＤＴＡ希釈乳精の日毎の試料を８〜１６％ＳＤＳゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上で電気泳動に付した。組み換えヒト第ＩＸ因子（ポリクローナルＥＬＩＳＡで確認）約１２５ｎｇおよびヒト第ＩＸ因子標準物質（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）を各レーンに適用した。非トランスジェニック（ＮＴＧ）乳精を合わせたものから得た総タンパク質合計２５μｇをゲル上に適用した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ Ｒａｄ）に一夜かけて移行させた。膜をＴＢＳＴで３０分間洗浄し、ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％カゼイン（ＴＢＳＴ−カゼイン）でブロッキングした。膜をウサギ抗第ＩＸ因子（Ｄａｋｏ）（ＴＢＳＴ−カゼイン中１：１０００、４５分間３７℃）、次いで、抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（ＴＢＳＴ−カゼイン中１：１０００、４５分間３７℃）とともに展開し、ＤＡＢ金属強化染色を行った（Ｐｉｅｒｃｅ）。分子量マーカーはＢｉｏＲａｄから購入した。

Ｗｅｓｔｅｒｎ分析によれば３サブ集団の組み換えヒト第ＩＸ因子が存在することがわかり、最大の集団は約６０〜６５ｋＤａのＭ_ｒで移行し、これはヒト第ＩＸ因子より僅かに低値のＭ_ｒであり、これより少ないサブ集団は約４０〜４５ｋＤａおよび約２５ｋＤａで移行していた。血漿中ヒト第ＩＸ因子もまた約４５〜５０ｋＤａにサブ集団を有していた。

更に別の試験では、トランスジェニックブタ５８−１の全乳を２００ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０で１：１希釈することによりカゼインミセルを解離させた。乳を２℃で３０分間４０００×ｇで遠心分離することにより脱脂した。乳タンパク質１００μｇｓを４％／１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン当たりに適用し、１時間１５ｍＡ／ｈｒで、そして、２時間３０ｍＡ／ｈｒで分割した。タンパク質を４℃２４Ｖ／ｈでニトロセルロース紙（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移行させ、０．９μｇ／ｍｌの濃度でＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ＦＩＸ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いてウエスタンブロットを行うことにより、乳中のｒＦＩＸを検出した。この試験の結果を示す図１において、レーン１〜８は授乳日３、４、５、６、７、９、１０、１１日の乳を示し、レーン９は精製組み換えＦＩＸ、１．０μｇを示し、レーン１０は血漿から精製したヒトＦＩＸ０．５μｇを示す。ブロードな範囲の分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ）の位置は左に示す。

トランスジェニックブタの乳からのヒト第ＩＸ因子の精製
イオン交換クロマトグラフィー、次いで金属依存性免疫親和性クロマトグラフィー（ＭＡｂ １Ｈ５）を用いて、５８−１の乳の初回授乳プールから組み換えヒト第ＩＸ因子を精製した。これらの試験において、全てのカラムと緩衝液は４℃に維持した。日毎のＥＤＴＡ−希釈乳精試料のプールをＯＤ ２８０ｎｍが５．０となるまでＴＢＳ、ｐＨ７．２で希釈し、次いでＤＥＡＥ ＦＦセファロース上に１ｃｍ／分で適用した。カラムをＴＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄し、次にＴＢＳ中０．２５ＭのＮａＣｌで溶離した。この画分をＴＢＳ中４０ｍＭのＭｇＣｌ_２で１：１希釈し、最終濃度を２０ｍＭ ＭｇＣｌ２とし、１Ｈ５ ＭＡｂカラムに適用した。カラムを２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有ＴＢＳで洗浄し、生成物を２０ｍＭクエン酸塩、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８で溶離した。生成物を１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２に対して一夜透析した。

陰イオン交換と免疫親和性の工程で得られた収量は定量的であり、ポリクローナルＥＬＩＳＡによるフロースルークロマトグラフィー画分において組み換えヒト第ＩＸ因子は検出されなかった。この２段階工程により組み換えヒト第ＩＸ因子は約８０〜９０％の純度で単離された。

精製組み換えヒト第ＩＸ因子の生物学的活性
動物５８−１の精製組み換えヒト第ＩＸ因子の生物学的活性をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ血漿誘導体研究室により作成されたプロトコールに従って１段階活性化部分トロンボプラスチン凝固時間アッセイ（ＡＰＴＴ）凝固アッセイを用いて測定した（第ＩＸ因子凝固試験操作法、１９９２年３月）。即ち、プラスチックのＣｏａｇ−ａ−ｍａｔｅトレーの各ウエルに９０μｌの第ＩＸ因子欠損血漿および１０μｌの第ＩＸ因子標準物質または試料をトリス／生殖／ＢＳＡで希釈して添加した。次にトレーを自動分析器（ＡＰＴＴモード、２４０秒活
ＡＰＴＴ試薬と１００μＬの０．０２５Ｍ ＣａＣｌ_２が添加された。第ＩＸ因子の標品を用いて得られたデータをｙ＝凝固時間、ｘ＝第ＩＸ因子とした式ｙ＝ａｘ＋ｂに当てはめ、次にこれを用いて、試料中の第ＩＸ因子の量を測定した。正常血漿参考試料プールの標準物質（Ｓｉｇｍａ）とヒト第ＩＸ因子（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ血漿誘導体研究室）をアッセイに用いた。５８−１の組み換えヒト第ＩＸ因子、ヒト第ＩＸ因子および正常血漿参考試料プールを各希釈度につき２連で供試した。

表４に示すとおり、免疫精製組み換えヒト第ＩＸ因子は比活性３３７Ｕ／ｍｇであり、これは比活性２３０Ｕ／ｍｇを有していた血漿由来免疫精製ヒト第ＩＸ因子および２５０Ｕ／ｍｇの正常血漿参考試料プール活性と同等であった。

上記は特定の好ましい実施形態を示しており、本発明を限定する意図はない。当該分野の技術者は開示した実施形態に様々な変更を施すことができるであろうが、そのような変更は本発明の範囲内に含まれるものであり、これは以下の請求項により定義されるものである。

本明細書中に示した全ての文献や特許出願は本発明が関わる技術の水準を示すものである。全ての文献や特許出願は、各文献や特許出願がその全体において参考のために組み込まれるべく特に、そして、個々に示された場合と同様の範囲において参考のために本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (16)

1. そのゲノム内に安定に組み込まれた外因性ＤＮＡ分子を含有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、該外因性ＤＮＡ分子は：
   （ａ）プロモーターを含む乳腺特異的遺伝子の５′調節配列；
   （ｂ）シグナル配列、第ＩＸ因子プロ配列および第ＩＸ因子配列を５′から３′の方向でコードするヒト第ＩＸ因子コードＤＮＡ配列（但し、該シグナル配列は生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子を該トランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌させるのに有効であり、該第ＩＸ因子配列は第ＩＸ因子遺伝子の５′非翻訳領域および３′非翻訳領域の全体を欠いている）；および
   （ｃ）乳腺特異的遺伝子に由来する３′調節配列または乳腺で活性な３′調節配列；
   を含んでおり、
   該５′調節配列および３′調節配列は該ヒト第ＩＸ因子コードＤＮＡ配列と機能可能に連結されていることを特徴とし、
   該トランスジェニック哺乳動物はブタである、非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
2. 前記プロモーターは、短乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター、長ＷＡＰプロモーター、短α−カゼインプロモーター、短β−カゼインプロモーター、短κ−カゼインプロモーター、長α−カゼインプロモーター、長β−カゼインプロモーター、長κ−カゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、およびβ−ラクトグロブリンプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
3. 前記短ＷＡＰプロモーターは、マウスＷＡＰ遺伝子の２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩプロモーターであり、前記長ＷＡＰプロモーターは、マウスＷＡＰ遺伝子の４．１ｋｂのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩプロモーターまたは４．２ｋｂのＳａｕ３Ａ−ＫｐｎＩプロモーターである、請求項２に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
4. 前記トランスジェニック哺乳動物は、１ミリリットルの乳あたり、１００μｇ〜２２０μｇの活性なヒト第ＩＸ因子を分泌する、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
5. トランスジェニック哺乳動物の乳から精製されたとき、活性化部分トロンボプラスチン血液凝固時間アッセイによって測定された場合、ヒト血漿から単離されたヒト第ＩＸ因子の比活性よりも５％〜４７％大きい比活性を有する活性なヒト第ＩＸ因子を分泌する、請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
6. トランスジェニック哺乳動物の乳から精製されたとき、少なくとも３３７Ｕ／ｍｇの比活性を有する活性なヒト第ＩＸ因子を分泌する、請求項１〜５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
7. ヒト第ＩＸ因子を製造するための方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供し、当該第ＩＸ因子をコードするＤＮＡ配列を発現させ、当該ヒト第ＩＸ因子を当該非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌させ、当該哺乳動物から乳を採取し、当該乳からヒト第ＩＸ因子を単離することを含む前記方法。
8. 血友病Ｂの治療またはその症状の予防もしくは改善のための医薬の製造における請求項１〜６のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物によって産生された生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子の使用。
9. 生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子を産生する、請求項１〜６のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物から得られた乳腺細胞。
10. 生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子を製造する方法であって、請求項９に記載の培養された乳腺細胞から該第ＩＸ因子を単離する工程を含む方法。
11. 血友病Ｂの治療またはその症状の予防もしくは改善のための医薬の製造における請求項９に記載の乳腺細胞の使用。
12. 生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物から得られた乳。
13. 乳中に生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子を分泌する請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック哺乳動物において産生された生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子。
14. 乳から単離または精製された請求項１３に記載の生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子。
15. 十分にγ−カルボキシル化された生物学的に活性な第ＩＸ因子を含む、請求項１３または１４に記載の生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子。
16. 医薬上許容される担体を更に含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の生物学的に活性なヒト第ＩＸ因子。

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