JP4925157B2 - 歯周病治療用組成物 - Google Patents
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Description
Minabe M et al. J Periodontol Vol.62,No.3,p171-9(1991) Bartold PM et al. Periodontol Vol.24,No.1,p253-269(2000) Gestrelius S et al. Clin Oral Investig Vol.4,No.2,p120-5(2000) Murakami S et al.J Periodontal Res Vol.38,No.1,p97-103(2003) Hall NG et al. Matrix Biol. Nov;22(6):p501-10(2003) Hirohata S et al. J Biol Chem. Apr5;277(14):12182-9(2002)
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(c)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(c)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
(c)配列番号1または3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1または3に示される塩基配列、あるいは配列番号1または3に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
(c)配列番号1または3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1または3に示される塩基配列、あるいは配列番号1または3に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
(c)配列番号1または3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1または3に示される塩基配列、あるいは配列番号1または3に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明は、歯周病などによって崩壊した組織を修復するための歯周病治療用組成物を提供する。
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドについて説明する。
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み換え発現ベクターに挿入し、当該組み換え発現ベクターを導入することによって作製される。なお、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターについては、後述する。
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドについて説明する。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、
(c)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
であることが好ましい。ここで、配列番号1、配列番号3、配列番号5もしくは配列番号7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、それぞれヒトADAMTSL4αcDNA、ヒトADAMTSL4βcDNA、マウスADAMTSL4αcDNAおよびマウスADAMTSL4βcDNAである。
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられる組み換え発現ベクターについて説明する。
本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドまたは形質転換体を含むと同時に、生体吸収材料を併せて含むことが好ましい。以下に生体吸収材料について説明する。
本発明は、歯根膜誘導方法を提供する。本発明の歯根膜誘導方法は、上述した歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程、または上述した組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むものであればよい。
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上記歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことが好ましい。
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入した組み換え遺伝子発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことが好ましい。ここで用いる組み換え発現ベクターとしては、上述した組み換え発現ベクターを用いることができる。また、ベクターの導入方法に関しても特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
本発明者は、マウスADAMTSL4αcDNAおよびマウスADAMTSL4βcDNAと相同性の高いヒトcDNAをNCBIデータベースであるBLASTを用いて検索し、その配列に基づいて、ヒト歯根膜より精製したRNAを鋳型として用いたRT−PCRを行い、ヒトADAMTSL4αcDNAおよびヒトADAMTSL4βcDNAをクローニングした。上記ヒトADAMTSL4αcDNAおよびヒトADAMTSLβcDNAは、それぞれ配列番号1および配列番号3によって示される。また、ヒトADAMTSL4αタンパク質およびヒトADAMTSL4βタンパク質は、それぞれ配列番号2および配列番号4によって示される。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドであることが好ましい。
本発明は、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2または4に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
(c)配列番号1または3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1または3に示される塩基配列、あるいは配列番号1または3に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを提供する。本発明のベクターを用いれば、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を作製することができる。上記形質転換体は、本発明の歯周病治療用組成物中に含まれてもよいし、本発明のポリヌクレオチドの精製原料として用いることもできる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。上記形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されているので、本発明のポリペプチドを精製するための原材料として使用することができる。または、上記形質転換体を本発明の歯周病治療用組成物に混合し、当該歯周病治療用組成物を用いることによって、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。
米国national institute of the health(NIH)のNCBIデータベースであるBLASTを用いて、マウスADAMTSL4α遺伝子(配列番号5)およびマウスADAMTSL4β遺伝子(配列番号7)に相同性の高いヒトcDNAの検索を試みた。
5’−TGCGGCCGCCACCATGGTTTCCCATTTCATGGG−3’(配列番号15)に示される塩基配列を有するプライマー、および
5’−CGGGATCCTTATCTGCTCCCCAGGAAGCCCG−3’(配列番号16)に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
5’−TGCGGCCGCCACCATGTTTGTCAGCTACCTGAT−3’(配列番号17)に示される塩基配列を有するプライマー、および
5’−CGGGATCCTTATCTGCTCCCCAGGAAGCCCG−3’(配列番号18)に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
生後4週のマウス下顎臼歯を採取し、川本テープ法(Kawamoto T. J Histochem Cytochem, 38(12),1805-1814,1990参照)に従い凍結標本を作製後、Leica CM3050(Leica社製)を用いて厚さ5μmの非脱灰凍結切片を作製した。まず、凍結切片を、10%ヤギ血清を用いて1時間ブロッキングした後に抗ADAMTSL4抗体であるR1−1抗体と反応させた。
ヒト歯根膜組織は、神奈川歯科大学倫理委員会の定めたプロトコールに従い同意を得られた患者から抜歯した歯の歯根中央部分から採取した。ヒト歯根膜細胞の採取には、得られた歯根膜組織片を培養皿上でカバースリップで固定後、72時間後に組織片よりoutgrowthしてきた細胞を継代培養した。尚、培地はDulbecco's Modified Eagle's Medium に10%ウシ胎児血清を含むものを調整し使用した。
5’−ATGGAGCAGACGCGGCCCTG−3’(配列番号9)に示される塩基配列を有するプライマー、および
5’−TGGACGCTTGTAGGTGAACA−3’(配列番号10)に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
5’−ATGTTTGTCAGCTACCTGAT−3’(配列番号11)に示される塩基配列を有するプライマー、および
5’−TGGACGCTTGTAGGTGAACA−3’(配列番号12)に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
5’−GGAGCCACGAAAATCAACAT−3’(配列番号13)に示される塩基配列を有するプライマー、および
5’−TGGACGCTTGTAGGTGAACA−3’(配列番号14)に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
神奈川歯科大学の倫理委員会に承認されたプロトコールに従い、同意の得られた患者よりヒト智歯を抜歯後、川本テープ法に従いヒト智歯の凍結標本を作製した。その後、Leica CM3050を用いて、上記凍結標本から、厚さ5μmの非脱灰凍結切片を作製した。上記凍結切片に対して、10%ヤギ血清を用い、1時間のブロッキング処理を行った。ブロッキングの後、抗ADAMTSL4抗体であるR1−1抗体と反応させた。このとき、対照実験として、R1−1抗体の代わりに、正常ウサギ血清と反応させる凍結切片を用意した。
マウス歯小嚢細胞(将来歯根膜になる細胞)を生後1日齢のマウス切歯根尖部分より採取した。採取した細胞は、ウシ胎児血清(最終濃度10%)、アスコルビン酸(最終濃度50μg/ml)、ストレプトマイシン(最終濃度100units/ml)およびペニシリン(最終濃度100units/ml)を含むα−MEM培地(Sigma社製)中で、5%CO2、37℃の条件下で培養した。その後、上記マウス歯小嚢細胞を、ヒトパピローマウイルスE6のPDZドメイン欠失変異体を用いて形質転換し、その結果、安定した不死化細胞を得ることができた。なお、上記不死化細胞を作製するにあたっては、Kiyonoらの方法(Kiyono T et al, Nature. 1998 Nov 5;396(6706):84-88)に従った。
ヒトADAMTSL4αcDNAおよびヒトADAMTSL4βcDNAをそれぞれレトロウイルスベクターであるpCXSH(Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照)に組み込み、293FT細胞を用いてV SV−Gシュードタイプ組み換えレトロウイルスを作製した。ここで、V SV−Gシュードタイプ組み換えレトロウイルスとは、vesicular stomatitis virus由来のG proteinを有し、かつpseudotype virusのエンベロ−プを有する感染効率の高いレトロウイルスである。なお、上記ウイルスを作製するにあたっては、Saito等の方法(Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照)に従った。
各ウイルスをそれぞれ感染させ、遺伝子導入を行った。上記レトロウイルスベクターは、マーカー遺伝子としてハイグロマイシン遺伝子を備えているので、ハイグロマイシンを500μg/mlの濃度で含むDMEM培地中で、それぞれのレトロウイルスベクターが導入されたMG63細胞を選択した。
図5(a)から明らかなように、ヒトADAMTSL4α導入細胞を移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。また、図5(b)から明らかなように、ヒトADAMTSL4β組成物を移植した場合にも、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。一方、図5(c)および(d)から明らかなように、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイトのみを移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察されなかった。
Claims (7)
- 以下の(a)もしくは(b)に記載のポリペプチドを含む歯周病治療用組成物。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ歯根膜を誘導する能力を有するポリペプチド - 以下の(a)もしくは(b)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ歯根膜を誘導する能力を有するポリペプチド - 以下の(c)または(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
(c)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ歯根膜を誘導する能力を有するポリヌクレオチド - 生体吸収材料を含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の歯周病治療用組成物。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことを特徴とする非ヒト歯根膜誘導方法。
- 以下の(a)もしくは(b)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする非ヒト歯根膜誘導方法。
(a)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2、4、6もしくは8に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ歯根膜を誘導する能力を有するポリペプチド - 以下の(c)または(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする非ヒト歯根膜誘導方法。
(c)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)配列番号1、3、5もしくは7に示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ歯根膜を誘導する能力を有するポリヌクレオチド
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