JP4914684B2

JP4914684B2 - 蛍光観察方法および蛍光観察装置

Info

Publication number: JP4914684B2
Application number: JP2006255375A
Authority: JP
Inventors: 正治富岡; 浩佐々木; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2026-09-21
Also published as: JP2008076715A

Description

本発明は、蛍光観察方法および蛍光観察装置に関するものである。

従来、蛍光観察装置として、複数の波長のレーザ光を同時に標本に照射するレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ顕微鏡は、細胞に遺伝子発現させる蛍光物質として、例えば、ＧＦＰ（緑色の蛍光を発するタンパク：GREEN FLUORESCENT
PROTEIN）等の蛍光タンパクを投与し、ＧＦＰの励起効率が最大となる波長（４８８ｎｍ）のレーザ光を照射して、発生する蛍光を検出し観察することとしている。
このようにすることで、ＧＦＰから最大限の蛍光を発生させることができ、明るい観察画像を得ることができるという利点がある。
特開２００２−１３９６７５号公報

ＧＦＰから発生される蛍光の波長帯域は、約４６０〜６００ｎｍであり、その波長帯域の中に前記レーザ光の波長（４８８ｎｍ）が含まれている。そして、レーザ顕微鏡においては、強度の高いレーザ光が蛍光用の検出器あるいは接眼レンズに入射されることを防止するために、検出器あるいは接眼レンズの前段に励起光カットフィルタを配置するのが一般的である。

励起光カットフィルタは、励起光の波長を含む所定の幅の波長帯域の光の通過を阻止するので、レーザ光の検出器あるいは接眼レンズへの入射を防止することができる。しかしながら、励起光カットフィルタは、その波長帯域の蛍光の通過をも阻止するため、観察に供される蛍光量が低下してしまう不都合がある。
特に、励起光の励起効率が最大となる波長でＧＦＰを励起する場合には、ＧＦＰに最大限のエネルギが吸収されることとなるため、ＧＦＰが早期に褪色してしまうという不都合もある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光物質の褪色を防止しつつ、観察に供し得る蛍光を増大させて明るい観察画像を得ることができる蛍光観察方法および蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起により発せられる蛍光の波長帯域に励起光の励起効率が最大となる波長を含む蛍光物質と、励起光の波長を含む所定の波長帯域の光の通過を遮断する励起光カットフィルタとを使用し、励起効率が最大となる波長よりも短波長側の波長の励起光であって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が、励起効率が最大となる波長の励起光を照射したときに前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量以上となり、かつ、励起効率が最大となる波長から短波長側に向かって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が極大となる波長以下の波長の励起光を照射し、該励起光により前記蛍光物質が励起されることにより発生し前記励起光カットフィルタを通過した蛍光を観察する蛍光観察方法を提供する。

本発明によれば、励起光の波長を励起効率が最大となる波長よりも短波長側に設定することにより、励起効率を低下させ、励起されて発生する蛍光量を減少させる一方で、励起光カットフィルタにより遮断される波長帯域を短波長側にずらすことで、励起光カットフィルタを通過する蛍光の波長帯域を短波長側に延長することができる。その結果、励起効率を低下させても、全体として観察に供される蛍光量を増加させることができる励起光の波長帯域が存在する。そして、その波長帯域内の励起光を蛍光物質に照射することで、励起効率が最大となる波長の励起光を照射して得られる観察用の蛍光画像と同等以上の明るさの蛍光画像を取得することができるとともに、蛍光物質に吸収されるエネルギを低減して、蛍光物質の褪色を防止することができる。

励起波長を励起効率が最大となる波長から短波長側にずらしていくと、励起光カットフィルタを通過する蛍光量が増加していき、ある励起波長で極大値をとり、さらに短波長側に向かうに従って低下していく。その結果、同じ蛍光量を観察に供し得る２つの励起波長が存在するので、より短波長側の励起光を選択することにより、蛍光物質の褪色をより効果的に防止することができる。

また、上記発明においては、前記蛍光物質は、励起光の励起効率が最大となる波長が４８８ｎｍであるＧＦＰであり、前記励起光の波長が、約４７３ｎｍであり、前記励起光カットフィルタが、励起光の波長に対して長波長側に、１５ｎｍ〜２０ｎｍの帯域幅の遮断帯域を備えることとしてもよい。

また、本発明は、標本に向けて照射する励起光を出射する励起光源と、該励起光源から出射された励起光が標本に照射されることにより、標本内の蛍光物質が励起されて発生する蛍光を検出する光検出器と、前記標本と前記光検出器との間に配置され、前記励起光の波長を含む所定の波長帯域の光の通過を遮断する励起光カットフィルタとを備え、前記励起光源は、励起効率が最大となる波長よりも短波長側の波長の励起光であって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が、励起効率が最大となる波長の励起光を照射したときに前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量以上となり、かつ、励起効率が最大となる波長から短波長側に向かって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が極大となる波長以下の波長の励起光を出射する蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、励起光源から発せられた励起光が標本に照射されると、標本内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光の内、励起光カットフィルタを通過した蛍光が光検出器により検出され観察に供される。励起光の波長が、励起効率が最大となる波長よりも短波長側に設定されているので、蛍光物質の褪色を防止することができる。
また、その上で、全体として観察に供される蛍光量を増加させる励起波長に設定されているので、励起効率が最大となる波長の励起光を照射して得られる観察用の蛍光画像と同等以上の明るさの蛍光画像を取得することができる。
また、励起波長を励起効率が最大となる波長から短波長側にずらしていくと、励起光カットフィルタを通過する蛍光量が増加していき、ある励起波長で極大値をとり、さらに短波長側に向かうに従って低下していく。その結果、同じ蛍光量を観察に供し得る２つの励起波長が存在するので、より短波長側の励起光を選択することにより、蛍光物質の褪色をより効果的に防止することができる。

本発明によれば、蛍光物質の褪色を防止しつつ、観察に供し得る蛍光を増大させて明るい観察画像を得ることができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察方法および蛍光観察装置について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、レーザ顕微鏡であって、レーザ光を出射するレーザ光源（励起光源）２と、該レーザ光源２から発せられたレーザ光を走査するスキャナ３と、該スキャナ３により走査されたレーザ光を標本Ａに集光する一方、標本Ａに含まれる蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光を集光する対物レンズ４と、対物レンズ４により集光された蛍光を通過させ、標本Ａにおいて反射して戻るレーザ光を遮断する励起光カットフィルタ５と、該励起光カットフィルタ５を通過した蛍光を検出する光検出器６とを備えている。

レーザ光源２は、波長約４７３ｎｍのレーザ光を発振する固体あるいは半導体レーザ光源２Ａと、波長約５５９ｎｍのレーザ光を発振する固体あるいは半導体レーザ光源２Ｂと、これらの光源２Ａ，２Ｂから発せられるレーザ光を同一の光路に合波させるミラー７およびダイクロイックミラー８を備えている。
前記スキャナ３は、例えば、ガルバノミラーであって、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査することができるようになっている。

前記励起光カットフィルタ５は、それぞれ励起波長４７３ｎｍ＋１７ｎｍまでの波長帯域および励起波長５５９ｎｍ±１７ｎｍの波長帯域の光を遮断し、その他の波長帯域の光を通過させるように設定されている。

蛍光物質としては、励起波長４７３ｎｍで励起されるＧＦＰおよび、励起波長５５９ｎｍで励起されるＲＦＰ（赤色の蛍光を発するタンパク：RED FLUORESCENT
PROTEIN）が用いられる。ここでは、特に、ＧＦＰに着目する。

図２に、ＧＦＰによるレーザ光の吸収特性およびＧＦＰの発生する蛍光の波長特性を示す。図２によれば、ＧＦＰによるレーザ光の吸収特性において、励起効率が最大となる波長は４８８ｎｍであり、その他の波長で励起された場合には、破線で示される吸収特性に従って励起効率が低下している。

また、ＧＦＰの蛍光波長帯域は、約４６０〜６００ｎｍであり、その中に励起効率が最大となる波長４８８ｎｍが含まれている。
励起波長４８８ｎｍでＧＦＰを励起して、発生した蛍光全てを検出することができれば、最も明るい蛍光画像を効率よく取得することができる。しかしながら、波長４８８ｎｍのレーザ光を使用する場合には、４８８ｎｍ＋１７ｎｍまでの波長帯域の蛍光がレーザ光とともに遮断されるため、４８８＋１７＝５０５ｎｍ以下の波長帯域の蛍光は検出されることなく廃棄される。

なお、ＧＦＰの蛍光波長帯域の長波長側には、ＲＦＰの励起用の波長５５９ｎｍのレーザ光を遮断する波長帯域５５９±１７ｎｍが存在するので、ＧＦＰの蛍光波長帯域は長波長側においては、５５９−１７＝５４２ｎｍまでに制限されている。

図３は、励起波長４８８ｎｍでＧＦＰを励起したときの蛍光量および励起効率を１００として、励起波長を４８８ｎｍから短波長側にシフトしたときの励起光カットフィルタ５を通過する蛍光量比率の変化および励起効率の変化をそれぞれ示している。
図３によれば、励起波長を４８８ｎｍから短波長側にシフトしていくと、ＧＦＰの励起効率は単純に低下していくが、励起光カットフィルタ５を通過する蛍光量は一旦増加しその後減少していく。

これは、励起波長の短波長側へのシフトによる励起効率の低下による蛍光量の低下を、励起光カットフィルタ５の遮断帯域が全体的に短波長側へシフトして通過帯域が拡大することによる蛍光量の増加が上回る波長帯域Ｂが存在するためである。
したがって、この波長帯域Ｂ内に配される励起波長のレーザ光を使用することにより、励起効率が最大となる波長４８８ｎｍを使用する場合よりも明るい蛍光画像を取得することができる。しかも、この波長帯域Ｂ内に配される励起波長のレーザ光を使用する場合には、波長４８８ｎｍのレーザ光を使用した場合よりも励起効率が低いので、蛍光物質に吸収されるエネルギが少なく、蛍光物質が早期に退職してしまう不都合の発生を防止することができるという利点がある。

また、図３に示されるように、励起波長を４８８ｎｍから短波長側にシフトしていくと、励起光カットフィルタ５を通過する蛍光量は極大値Ｃをとる。したがって、その極大値Ｃの励起波長のレーザ光を照射することにより、最も明るい蛍光画像を取得することができ、その場合においても、波長４８８ｎｍのレーザ光を照射した場合よりもＧＦＰの褪色を防止することができる。

さらに、上記波長帯域Ｂの内、前記極大値Ｃよりも短波長側の波長帯域Ｄに含まれる励起波長のレーザ光を使用することにより、極大値Ｃよりも長波長側の励起波長のレーザ光を使用する場合よりも褪色防止効果を向上することができる。
すなわち、本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いた蛍光観察方法によれば、上記極大値Ｃよりも短波長側の励起波長４７３ｎｍのレーザ光を照射するので、励起波長４８８ｎｍのレーザ光を照射する場合よりも十分に明るい蛍光画像を取得することができるとともに、ＧＦＰの早期褪色を効果的に防止することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、励起光カットフィルタ５の遮断帯域幅として、短波長側の励起波長＋１７ｎｍの波長帯域および長波長側の励起波長を中心とした±１７ｎｍの波長帯域を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、適宜設定することができる。例えば、図４に示されるように、遮断帯域幅として±１０ｎｍ，±１５ｎｍ，±２０ｎｍに設定すると、励起カットフィルタ５を通過して検出される蛍光量が、励起効率最大の励起波長のレーザ光を照射した場合の蛍光量と比較して大きくなる波長帯域Ｂ，Ｄは、遮断帯域幅が大きいほど短波長側に広がり、遮断帯域幅が小さいほど長波長側に短縮されていく。

ここで、図４における遮断帯域幅±１０ｎｍ，±１５ｎｍ，±２０ｎｍは、それぞれ短波長側の励起波長＋１０ｎｍ，＋１５ｎｍ，＋２０ｎｍまでの波長帯域および長波長側の励起波長を中心とした±１０ｎｍ，±１５ｎｍ，±２０ｎｍの波長帯域が遮断帯域であることを便宜上表示している。

励起光カットフィルタ５の遮断帯域幅を小さくすることは困難であり、励起光カットフィルタ５のコストの増大に繋がるので、ある程度の遮断帯域幅が必要である。本実施形態によれば、コストを低減しつつ、上記効果を達成することができるという利点もある。

また、本実施形態においては、光検出器６により検出されるＧＦＰの蛍光波長帯域が、ＲＦＰを励起するためのレーザ光を遮断する励起カットフィルタ５により制限される場合について説明したが、これに限定されるものではなく、長波長側が全ての通過されることにしてもよい。この場合には、図５に示されるように、上記波長帯域Ｂは、全ての遮断帯域幅の励起カットフィルタ５に対して、図３および図４の場合よりも縮小するが、この場合においても、励起波長４７３ｎｍ±１ｎｍに対して長波長側に、１５ｎｍ〜２０ｎｍの遮断帯域を備える励起カットフィルタ５を用いて、上記波長帯域Ｂ内においてＧＦＰを励起し、褪色を低減しつつ明るい蛍光画像を取得することができる。

また、本実施形態においては、ＲＦＰを励起するためのレーザ光の励起波長を５５９ｎｍとして説明したが、５４３ｎｍに設定してもよい。
しかしながら、図６に示されるように、５５９ｎｍの方が、５４３ｎｍの場合よりも蛍光効率が高く、かつ、ＧＦＰの蛍光をより高い波長範囲まで取得できるので、明るい画像を取得することができる点で好ましい。

図６は、ＧＦＰ励起用のレーザ光の波長＋１５ｎｍからＲＦＰ励起用のレーザ光の波長−１５ｎｍの範囲で、ＧＦＰの蛍光を取得する場合の蛍光効率を示すグラフであり、ＧＦＰ励起用のレーザ光の波長＝４８８ｎｍ、ＲＦＰ励起用のレーザ光の波長＝５４３ｎｍの場合を１００％としている。
また、蛍光物質としてＧＦＰを例示して説明したが、これに代えて、励起波長が蛍光波長に近接しあるいは含まれる任意の蛍光物質に適用してもよい。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。本発明の一実施形態に係る蛍光観察方法において使用されるＧＦＰの励起効率特性および蛍光波長特性を示すグラフである。図１の蛍光観察装置の光検出器により検出される蛍光量および励起効率の励起波長に対する変化を示すグラフである。図１の蛍光観察装置の変形例であって、励起カットフィルタの遮断帯域を±１０ｎｍ、±１５ｎｍおよび±２０ｎｍに設定した場合の図３と同様のグラフである。図１の蛍光観察装置の変形例であって、長波長側に遮断帯域を有しない場合に、励起カットフィルタの遮断帯域を±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±１５ｎｍおよび±２０ｎｍに設定した場合の図３と同様のグラフである。ＧＦＰ励起用のレーザ光の波長＋１５ｎｍからＲＦＰ励起用のレーザ光の波長−１５ｎｍの範囲で、ＧＦＰの蛍光を取得する場合の蛍光効率を示すグラフである。

符号の説明

Ａ標本
１蛍光観察装置
２Ａ，２Ｂレーザ光源（励起光源）
５励起光カットフィルタ
６光検出器

Claims

励起により発せられる蛍光の波長帯域に励起光の励起効率が最大となる波長を含む蛍光物質と、励起光の波長を含む所定の波長帯域の光の通過を遮断する励起光カットフィルタとを使用し、
励起効率が最大となる波長よりも短波長側の波長の励起光であって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が、励起効率が最大となる波長の励起光を照射したときに前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量以上となり、かつ、励起効率が最大となる波長から短波長側に向かって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が極大となる波長以下の波長の励起光を照射し、
該励起光により前記蛍光物質が励起されることにより発生し前記励起光カットフィルタを通過した蛍光を観察する蛍光観察方法。
前記蛍光物質は、励起光の励起効率が最大となる波長が４８８ｎｍであるＧＦＰであり、
前記励起光の波長が、約４７３ｎｍであり、
前記励起光カットフィルタが、励起光の波長に対して長波長側に、１５ｎｍ〜２０ｎｍの帯域幅の遮断帯域を備える請求項１に記載の蛍光観察方法。
標本に向けて照射する励起光を出射する励起光源と、
該励起光源から出射された励起光が標本に照射されることにより、標本内の蛍光物質が励起されて発生する蛍光を検出する光検出器と、
前記標本と前記光検出器との間に配置され、前記励起光の波長を含む所定の波長帯域の光の通過を遮断する励起光カットフィルタとを備え、
前記励起光源は、励起効率が最大となる波長よりも短波長側の波長の励起光であって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が、励起効率が最大となる波長の励起光を照射したときに前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量以上となり、かつ、励起効率が最大となる波長から短波長側に向かって、前記励起光カットフィルタを通過する蛍光量が極大となる波長以下の波長の励起光を出射する蛍光観察装置。