JP4902958B2 - ｃＡＭＰによって直接活性化される交換タンパク質（Ｅｐａｃ）の活性をモジュレートするための新規な化合物 - Google Patents

ｃＡＭＰによって直接活性化される交換タンパク質（Ｅｐａｃ）の活性をモジュレートするための新規な化合物 Download PDF

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Description

本発明は、cAMPによって直接活性化される交換タンパク質(Epac)をモジュレートするための新規な化合物に関する。特に、本発明は、Epacの活性を特異的にモジュレートするcAMP類似体に関する。本発明はさらに、その新規な化合物を含む薬剤組成物、ならびにヒトおよび/または動物の治療におけるその化合物の使用に関する。
Epacは、Rasファミリーの低分子量GTPアーゼのためのグアニンヌクレオチド交換因子の1つのファミリーである。これらのタンパク質は、cAMPが直接に結合して活性化される。最初に同定され、十分に研究されたセカンドメッセンジャーである(1)cAMPは、広範な種類の細胞プロセスで役割を担う。
一般に、cAMPの作用は、プロテインキナーゼA(PKA)という、いたるところで発現されるcAMPの細胞内受容体により媒介されると考えられていたが、嗅覚およびペースメーカーのチャネルのような、さらなるcAMPターゲットの記載もある。
しかし、最近になって、cAMPによって直接に活性化されるRap1グアニンヌクレオチド交換因子[Epac1およびEpac2(cAMP-GEFIおよびcAMP-GEFIIとしても知られている)](2〜4)の1つのファミリーが同定された。これらの広範に発現されるタンパク質は、PKAの調節サブユニット中にあるcAMP結合ポケットに非常に類似したcAMP結合ポケットを含んでおり、cAMPは、Epac1およびEpac2が低分子量GTPアーゼRap1およびRap2に対して交換活性を発揮するのに決定的に必要である。
アデニル酸シクラーゼを活性化するフォルスコリンや、8-Br-cAMPのような、PKAの活性化に一般に使用される試薬は、PKA媒介シグナル伝達経路とEpac媒介シグナル伝達経路の両者を活性化する。
Robison,G.A.、Butcher,R.W.、およびSutherland,E.W.、Cyclic AMP.Annu Rev Biochem第37巻、149〜174ページ(1968年) de Rooij,J.ら、「Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP」、Nature第396巻、474〜477ページ(1998年) de Rooij,J.ら、「Mechanism of regulation of the Epac ファミリー of cAMP-dependent RapGEFs」、J Biol Chem第275巻、20829〜20836ページ(2000年) Kawasaki,H.ら、「A ファミリー of cAMP-binding proteins that directly activate Rap1」、Science第282巻、2275〜2279ページ(1998年) Su,Y.ら、「Regulatory subunit of protein kinase A:structure of deletion mutant with cAMP binding domains」、Science第269巻、807〜813ページ(1995年) Genieser,H.-G.、Butt,E.,Bottin,U.、Dostmann,W.、Jastorff,B.、「Synthesis of 3',5'-cyclic phosphates from unprotected nucleosides」、Synthesis第1巻、53〜54ページ(1989年) Kataoka,S.ら、「Studies on the synthesis of compounds related to adenosine-3',5'-cyclic phosphate」、VI.Synthesis and cardiac effects of N6,N6,2'-O-trialkyl-,N6,2'-O-dialkyl-,and 2'-O-alkyladenosine-3',5'-cyclic phosphates、Chem Pharm Bull(Tokyo)第38巻、1596〜1600ページ(1990年) Miller,J.P.、Boswell,K.H.、Muneyama,K.、Simon,L.N.、Robins,R.K.、およびShuman,D.A.、「Synthesis and Biochemical Studies of various 8-Substituted Derivatives of Guanosine 3',5'-Cyclic Phosphate,Inosine 3',5'-Cyclic Phosphate、およびXanthosine 3',5'-Cyclic Phosphate」、Biochemistry第12巻、5310〜5319ページ(1973年) Enserink,J.M.ら、「A novel Epac-specific cAMP analogue demonstrates independent regulation of Rap1 and ERK」、Nat Cell Biol第4巻、901〜906ページ(2002年) Buczek-Thomas,J.A.ら、「Integrin-mediated adhesion and signalling in ovarian cancer cells」、Cell Signal第10巻、55〜63ページ(1998年) Rangarajan,S.ら、「Cyclic AMP induces integrinmediated cell adhesion through Epac and Rap1 upon stimulation of the β2-adrenergic receptor」、J Cell Biol第160巻、487〜493ページ、2003年 Genieser,H.-G.、Dostmann,W.、Bottin,U.、Butt,E.、Jastorff,B.、「Synthesis of 3',5'-cyclic phosphorothioates by cyclothiophosphorylation of unprotected nucleosides」、Tetrahedron Lett第29巻、2803〜2804ページ(1988年) Furuta,T.、Torigai,H.、Osawa,T.、およびIwamura,M.、「Direct esterification of phosphates with various halides and its application to synthesis of cAMP alkyl triesters」、J Chem Soc,Perkin Trans第1巻、24、3139〜3142ページ(1993年) Kopperud,R.ら、「Formation of inactive cAMP-saturated holoenzyme of cAMP-dependent protein kinase under physiological conditions」、J Biol Chem第277巻、13443〜13448ページ(2002年) Franke,B.、Akkerman,J.W.、およびBos,J.L.、「Rapid Ca2+-mediated activation of Rap1 in human platelets」、EMBO J第16巻、252〜259ページ(1997年) de Rooij,J.およびBos,J.L.、「Minimal Ras-binding domain of Raf1 can be used as an activation-specific probe for Ras」、Oncogene第14巻、623〜625ページ(1997年) van Triest,M.、de Rooij,J.、およびBos,J.L.、「Measurement of GTP-bound Ras-like GTPases by activation-specific probes」、Methods Enzymol第333巻、343〜348ページ(2001年)
本発明の目的は、Epac-Rap1シグナル伝達経路を特異的にモジュレートする新規な化合物を提供することである。
この目的は、構造式(I)
Figure 0004902958
[式中、R1は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、アジド、アルキル、アリール、アミド-アルキル、アミド-アリール、OH、O-アルキル、O-アリール、SH、S-アルキル、S-アリール、SeH、Se-アルキル、Se-アリール、アミノ、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリール、シクロアルキルアミノでよく、
R2は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、アジド、O-アルキル、S-アルキル、Se-アルキル、NH-アルキル、N-ビスアルキル、アルキル-カルバモイル、シクロアルキルアミノ、シリルでよく、
R3は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、OH、アジド、アミド-アルキル、アミド-アリール、O-アルキル、O-アリール、SH、S-アルキル、S-アリール、アミノ、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリール、NH-アルキル-カルバモイル、シクロアルキルアミノでよく、
R4は、O(H)またはS(H)であり、
R5は、O(H)、S(H)、アミノ、H、アルキル、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリールであり、あるいは
R4は、O(H)、S(H)、アミノ、H、アルキル、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリールであり、
R5は、O(H)またはS(H)である]
を有する新規な化合物およびそのデアザ類似体、
ならびに薬剤として許容されるその塩、エステル、および/または溶媒和物を提供することによって達成され、
ただし、2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、N6-モノブチリル-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエート、2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロアニリダート、2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸メチルトリエステル、2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸エチルトリエステル、2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-O-エチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-O-n-プロピルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-O-n-ブチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-O-イソブチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸メチルトリエステル、2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸フェニルトリエステルを除く。
本発明をもたらした研究では、EpacのcAMP結合ドメインの少なくとも1個の重要なアミノ酸がPKAと異なることが見い出された。さらに、2'位のヒドロキシ(-OH)を除去すると、そうして得られた化合物が、EpacとプロテインキナーゼAを識別し得ることを見い出した。
本発明によれば、新規な化合物、特に、in vitroでEpacを特異的に結合しモジュレートするが、PKAではそうでない、8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pCPT-2'-O-Me-cAMP)などの、修飾された2'-O-リボース基を有するcAMP類似体がそうして同定され、合成された。
8-pCPT-2'-O-Me-cAMPなどの類似体をin vivoで使用すると、Rap1が効率よく活性化されるが、PKAを媒介とする応答は誘発されないことが発見された。8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、細胞外シグナルによって調節されるキナーゼ(ERK)の活性化にも不活性化にも影響を及ぼさなかった。それどころか、cAMPによって誘発されるERK活性化は、決定的にPKAおよびRas に依存しており、Rap1の活性は全く必要でなかった。これらの結果は、cAMP誘発型のRap1の活性化、ならびにcAMPによるERKの調節が独立した過程であることを明らかに証明している。
本発明の好ましい実施形態では、
R1は、H、ハロゲン、アジド、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、Se-アリールであり、より好ましくは、R1は、H、ハロゲン、アジド、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、Se-アリールである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、
R1は、H、Br、Cl、I、アジド、2-クロロフェニルチオ、3-クロロフェニルチオ、4-クロロフェニルチオ、2-ブロモフェニルチオ、3-ブロモフェニルチオ、4-ブロモフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオ、n-ブチルチオ、n-ペンチルチオ、n-ヘキシルチオ、2-フルオロフェニルチオ、3-フルオロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、3-アミノフェニルチオ、4-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、フェニルエチルアミノ、3-フェニル-プロピルアミノ、2-メトキシフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、2-メチルフェニルチオ、3-メチルフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、2-イソプロピルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、エトキシ、プロピオキシ、ブトキシ、ベンジルオキシ、4-メチルベンジルオキシ、4-メトキシベンジルオキシ、4-フルオロベンジルオキシ、4-クロロベンジルオキシ、4-ブロモベンジルオキシ、フェニルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノ、2,3-ジクロロフェニルチオ、2,5-ジクロロフェニルチオ、2,4-ジフルオロフェニルチオ、2,5-ジメトキシフェニルチオ、2,5-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジクロロフェニルチオである。
好ましくは、R1は、H、Br、Cl、アジド、2-クロロフェニルチオ、3-クロロフェニルチオ、4-クロロフェニルチオ、2-ブロモフェニルチオ、3-ブロモフェニルチオ、4-ブロモフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオ、n-ブチルチオ、n-フェニルチオ、n-ヘキシルチオ、2-フルオロフェニルチオ、3-フルオロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、3-アミノフェニルチオ、4-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、フェニルエチルアミノ、2-メトキシフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、2-メチルフェニルチオ、3-メチルフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、2-イソプロピルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、ベンジルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノ、2,3-ジクロロフェニルチオ、2,5-ジクロロフェニルチオ、2,4-ジフルオロフェニルチオ、2,5-ジメトキシフェニルチオ、2,5-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジクロロフェニルチオである。
本発明の好ましい実施形態では、R1は、H、Br、C1、アジド、4-クロロフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、n-ヘキシルチオ、フェニルエチルアミノ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、エチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、4-メチルフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、ベンジルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノである。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、R1は、Cl、Br、またはS-アリールであり、好ましくは、R1は、Cl、Br、4-クロロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、ピリジニル-2-チオ、4-メチルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、または2,4-ジクロロ-フェニルチオであり、より好ましくは、R1は、4-クロロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオである。
別の好ましい実施形態では、R2は、H、ハロゲン、アジド、O-アルキル、S-アルキルであり、好ましくは、R2は、H、C1、Br、I、O-アルキル、S-メチル、S-エチルであり、より好ましくは、R2は、H、Cl、Br、O-メチル、O-エチル、O-プロピル、O-ブチル、O-イソブチル、S-メチルであり、最も好ましくは、R2は、O-メチル、O-エチル、O-プロピル、O-ブチル、O-イソブチルである。
本発明の別の好ましい実施形態では、R2はO-メチルである。
R3は、アミノ、NH-アルキル、N-ビスアルキル、NH-アリール、NH-アルキル-カルバモイル、N-ビスアルキル-カルバモイル、アミド-アルキル、アミド-アリール、OHであることが好ましく、より好ましくは、R3は、アミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、NH-フェニルカルバモイル、NH-アセチル、NH-プロピオニル、NH-ブチリル、NH-ベンゾイル、NH-ベンジル、NH-フェニルエチル、NH-フェニルプロピル、N-ビスメチル、N-ビスエチル、OHであり、より好ましくは、R3は、アミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、NH-フェニルカルバモイル、NH-ブチリル、NH-ベンゾイル、NH-ベンジル、N-ビスメチル、N-ビスエチル、OHである。
別の好ましい実施形態によれば、R3は、アミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、NH-ベンゾイル、N-ビスメチル、OHであり、好ましくは、R3は、アミノ、NH-t-ブチルである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、R4およびR5は、それぞれ独立して、O(H)またはS(H)であり、好ましくは、R4およびR5はO(H)である。
本発明の好ましい化合物を表1および表2に列挙する。化合物は、8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-N6-フェニル-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-メチルアミノ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-メチルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-フルオロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-メチル-クマリニル-7-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(ナフチル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-フェニルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-ニトロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(2-アミノ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-ベンジルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-n-ヘキシルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-フェニルエチルアミノ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-メトキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-イソプロピルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(ベンズイミダゾリル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(2-ヒドロキシ-エチルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸
8-エチルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸
8-(2-アミノ-エチルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(ピリジニル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(ベンゾチアゾリル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-メチル-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(3-メトキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-イソプロピル-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-ヒドロキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(2,4-ジクロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-(N,N-ジメチル)-カルバモイル-アデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-メトキシ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-ベンジルオキシ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3'-5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、および
8-シクロヘキイルアミノ-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
8-クロロ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
N6-t-ブチル-8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-デオキシアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシル-2'-O-メチルベンズイミダゾール-3',5'-環状一リン酸からなる群から選択されることが好ましい。
Epacでは、アデニンヌクレオチド中の多くの修飾が許容される。したがって、本発明は、それだけに限らないが、1-デアザ-アデニン、3-デアザ-アデニン、7-デアザ-アデニン、ジデアザ-アデニン、ベンズイミダゾールなど、プリンが1個または複数の環状窒素原子を欠いている規定した化合物の類似体を指す、化合物のデアザ類似体も含む(図1)。
本発明の別の好ましい実施形態では、デアザ類似体は、構造式II
Figure 0004902958
[式中、R1〜R5は、上で記載したとおりであり、
R6およびR7は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、アルキル、ニトロ、アミノ、および/またはアルコキシである]
を有する化合物である。
好ましくは、R1〜R3は、上で記載したとおりであり、
R4およびR5は、それぞれ独立してOまたはSであり、
R6およびR7は、それぞれ独立して、F、Cl、Br、またはIであり、より好ましくは、R6およびR7はClである。
本発明の好ましい実施形態では、R2は0-アルキルである。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、
R1およびR3は水素であり、
R2はO-アルキルであり、
R6およびR7はClである。
本発明による好ましいデアザ類似体を図1に示す。デアザ類似体は、1-デアザ-アデニン類似体、3-デアザ-アデニン類似体、7-デアザ-アデニン類似体、1,3-ジデアザ-アデニン類似体、1,7-ジデアザ-アデノシン類似体、およびベンズイミダゾール類似体、好ましくは5,6-ジクロロベンズイミダゾールからなる群から選択されることが好ましい。
本発明はさらに、Epacsの活性をモジュレートし、かつ/またはEpacおよびPKAを媒介とする各シグナル伝達経路を識別するための上記化合物に関するものであるが、この化合物は、たとえば、ヒト生理学および病理学における両経路の機能の研究に有用となり得る。
本発明によれば、「モジュレートする」とは、Epac活性のどんな変更をも指し、すなわち、in vitroおよびin vivo両方でのEpacの活性化および阻害を指す。したがって、本発明による化合物は、(部分的)アゴニスト活性と(部分的)アンタゴニスト活性の両方をもち得る。
さらに、本発明は、本発明の化合物のうちの1種または複数と、１種以上の薬剤として許容される賦形剤とを含む薬剤組成物に関する。賦形剤とは、化合物の投与を容易にするために１種以上の活性化合物に配合することのできる実質的に不活性な物質である。賦形剤の例には、担体、希釈剤、および/または添加剤などが含まれる。
さらに、本発明は、構造式I
Figure 0004902958
[式中、R1〜R5は、上で記載したとおりである]
を有する化合物および/またはそのデアザ-類似体の医薬としての使用に関する。
さらに、本発明は、構造式II
Figure 0004902958
[式中、R1〜R7は上で記載したとおりである]
を有する化合物の医薬としての使用に関する。
本発明はさらに、ヒトの疾患の治療、詳細には、癌、慢性の炎症、血栓症、糖尿病、および精神障害の治療薬の製造における前記化合物の使用に関する。
当業者には明白であろうが、本発明による化合物は、周知の標識法に従ってさらに標識してもよい。たとえば、化合物に蛍光色素を結合させると、共焦点顕微鏡、またはEpacの蛍光相関分光測定、または標識Epacタンパク質の蛍光エネルギー転移研究、または生細胞中のEpac濃度の測定によって、生細胞中のEpacタンパク質の細胞内分布を突き止めることができる。蛍光色素は、本発明によればその位置の置換基がよく外れることがわかっているので、6および/または8位に、任意選択でスペーサーを介して結合させることが好ましい。
本発明によるスペーサーには、アミノアルキルアミノ部分、またはアミノアルキルチオ部分、またはチオアルキルチオ部分、またはチオアルキルカルボキシ部分、またはアミノアルキルカルボニル部分、またはチオウレイドアミノアルキルチオ部分、または1〜12個のエチレン単位を有するアミノポリエチレングリコールアミノ部分が該当するがこれに限らない。
適切な蛍光色素の例は、フルオレセイン、ローダミン、アントラニロイル、N-エチルアントラニロイル、ニトロ-ベンゾフラザニル(NBD)、テキサスレッド、Cy(商標)3、Cy(商標)5、Cy(商標)7(Cy(商標)-ファミリー)、EVOblue(商標)10、EVOblue(商標)30、EVOblue(商標)90、EVOblue(商標)100(EVOblue(商標)-ファミリー)、BODIPY(商標)-ファミリー、Alexa Fluor(商標)-ファミリーである。
本発明はまた、本発明による化合物を周知の技術に従って既知の官能部分に結合させてある、上で規定した化合物のプロドラッグに関する。このような構造が、膜への透過性および母体化合物の効力を10〜100倍に高め得ることはよく知られている。
たとえば、化合物を生理活性のあるプロドラッグに変換することができる。たとえば、生理活性のある保護基を環状リン酸エステル部分に結合させて、本発明の化合物の親油性および生物学的利用能をかなり増大させることができる。環状リン酸エステルの生理活性のある保護基の例は、アセトキシメチル、プロピオニルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセトキシエチル、アセトキシブチル、アセトキシイソブチルである。
本発明による化合物は、周知の技術に従って化学的に不安定なプロドラッグに変換することもできる。たとえば、環状リン酸エステル部分にアルキル基またはアリール基を結合させて、本発明の化合物の親油性および生物学的利用能をかなり増大させることができる。環状リン酸エステルの化学的に不安定な保護基の例は、メチル、エチル、プロピル、ベンジル、フェニルである。
本発明による適切な不安定プロドラッグの例は、8-Br-2'-O-Me-cAMP-ベンジルエステル(実施例14、図9A)および8pCPT-2'-O-Me-cAMP-ベンジルエステル(実施例15、図9B)である。このような化合物は、それ自体は不活性であるが、極度に膜透過性であり、細胞内濃度を強力に増大させる。ベンジルエステルが加水分解されると、母体化合物が放出され、Epacをモジュレートすることができる。
本発明による化合物は、周知の技術に従って光分解性(いわゆるかご型)に変換することもできる。たとえば、環状リン酸エステル部分にカゴ型の基を結合させて、親油性および生物学的利用能のかなり増大した化合物にすることができる。環状リン酸エステルのかご型の基の例は、o-ニトロ-ベンジル、1-(o-ニトロフェニル)-エチリデン、4,5-ジメトキシ-2-ニトロ-ベンジル、7-ジメチルアミノ-クマリン-4-イル、7-ジエチルアミノ-クマリン-4-イルである。
定義:
以下に挙げるものは、本発明の化合物の記述に使用する様々な用語および語句の定義である。このような定義は、本明細書中で使用する用語に当てはまる。
ハロゲンとは、F、Cl、Br、およびIを指す。
アルキルは、1〜20個の炭素原子を有する炭化水素部分を指し、これには、それに限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、s-ブチル、t-ブチル、ペンチルが含まれる。アルキル基は直鎖状、分枝状、または環状の飽和もしくは不飽和であってよい。アルキル基にヘテロ原子を含めるかまたは含めなくてよい。アルキル基を置換してよく、または非置換であってよい。置換基には、１種以上のハロゲン原子、ハロアルキル基、(非)置換アリール基、(非)置換ヘテロアリール基、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、ヒドロキシ、メルカプト、ケト、カルボキシ、メトキシが含まれるがこれに限らない。
アリールは、3〜8個の環状原子を有する1個または複数の芳香環からなる炭化水素部分を指す。アリールを置換してよく、又は非置換であってよい。アリール基にヘテロ原子を含めてよい。置換基には、１種以上のハロゲン原子、ハロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のヘテロアリール基、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、アジド、メトキシ、メチルチオが含まれるがこれに限らない。
O-アルキルとは、O-結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
O-アリールとは、O-結合によって結合されているアリール基を指し、アリール基は、上で定義したとおりである。
S-アルキルとは、S-結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
S-アリールとは、S-結合によって結合されているアリール基を指し、アリール基は、上で定義したとおりである。
Se-アルキルとは、Se-結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
Se-アリールとは、Se-結合によって結合されているアリール基を指し、アリール基は、上で定義したとおりである。
NH-アルキルおよびN-ビスアルキルとは、N-結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
NH-アリールおよびN-ビスアリールとは、N-結合によって結合されているアリール基を指し、アリール基は、上で定義したとおりである。
アミド-アルキルとは、NH-C(O)-アルキル結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
アミド-アリールとは、NH-C(O)-アリール結合によって結合されているアリール基を指し、アリール基は、上で定義したとおりである。
アルキル-カルバモイルとは、-O-C(O)-NH-アルキル結合によって結合されているアルキル基を指し、アルキル基は、上で定義したとおりである。
本発明によれば、文字「p」はベンゼン環の「パラ」(4位)を表し、「m」はベンゼン環の「メタ」(または3位)を表す。
いす型の飽和6員環では、環上原子への結合、ならびにその結合につながった実在分子を、環の周囲に向いて位置しているか(「エカトリアル」)、環のおおよその平面の上下に配向しているか(「アキシアル」)に従って「アキシアル」または「エカトリアル」と呼ぶ。環状リン酸エステルの環に与えられる立体化学のために、アキシアルな位置は、環のおおよその平面の上側をとることしかできない。
自然の分子の環状AMP(cAMP)では、R4もR5も酸素であり、二重結合は、両方の原子に「分配され、またはその原子間を転置(dislocate)する」。生理的pHの水中では、化合物は、両方の酸素間に負の電荷を帯び、H+やNa+などの対応するカチオンを有する。したがって、構造式はしばしば、酸素に対する1個の二重結合と、ヒドロキシル基に対する1個の単結合を添えて記され、二重結合がアキシアルな酸素(R4)'に向かうか、エカトリアルな酸素(R5)に向かうかは重要でない。これを、R4およびR5の規定ではO(H)およびS(H)と示す。このことは、R4およびR5が、二重結合の位置に応じて、OもしくはSにも、OHもしくはSHにもなり得ることを意味する。
しかし、酸素原子の一方が別の基、たとえば硫黄と交換される場合には、状況が変わる。リン原子は、その時点でキラルとなり、4個の異なる配位子を有し、その結果2種の立体異性の形、すなわちアキシアルおよびエカトリアルな異性体がもたらされる。硫黄がアキシアルな位置(R4)にある場合、異性体を「Sp」異性体(R/S命名法による、「p」はリンに対して)と命名してもよく、またエカトリアルな位置(R5)にある場合、異性体をRp異性体と命名してもよい。しかし、これは置換基の化学的性質に応じて決まるので、すべてのアキシアル(エカトリアル)異性体がR(S)立体配置をとるわけではない。
本発明には、本発明の化合物のすべての立体異性形態、すなわちアキシアルおよびエカトリアルな異性体、ならびにRpおよびSp異性体が含まれることを留意されたい。
本発明による化合物のリン酸エステル部分の適切な塩の例は、Li、Na、K、Ca、Mg、またはNH4、ならびにテトラアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、アルキルアンモニウム、たとえばテトラブチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、オクチルアンモニウム、およびセチルトリメチルアンモニウムである。あるいは、遊離の酸(H)の形のリン酸エステル部分が、本発明による化合物に適する形態となる。
化合物の溶媒和物(たとえば水和物)も本発明の範囲内にあることを理解されたい。溶媒和を起こす方法は、当業界で一般に知られている。
本発明の好ましい実施形態を述べる以下の実施例および図面によって本発明をさらに例示するが、実施形態は、決して本発明を限定するものではない。
EpacのcAMP結合ドメインのアミノ酸配列と、PKA、嗅覚チャネル、ペースメーカーチャネル、および細菌CAPタンパク質のcAMPドメインを含む、文献に記載されている他のcNMP結合ドメインとを比較することによって、cAMPのリボース基の 2'-OHと水素結合をつくる保存性の高いグルタミン酸(5)が、Epac1のcAMP結合ドメインおよびEpac2の高親和性cAMP結合ドメインBには存在しないことが判明した(図2)。
したがって、この2'-OH基は、cAMPがPKAのcAMP結合ドメインに高い親和性で結合するのには絶対的に必要であるが、Epacへの効率的な結合およびEpacの活性化には必要でないのではないかと仮定される。
それに応じて、多数の化合物が合成され、試験され(Genieserら(6)による合成)、あるいはKataokaら(7)またはMillerら(8)に従って改変された。
(実施例1)
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-Br-2'-O-Me-cAMP)
A.主としてGenieserら(6)によってすでに記載されているとおりに合成を実施する。簡潔に述べると、8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン1.8g(5ミリモル)を40mLのリン酸トリエチルに溶解させ、氷浴中で冷却する。穏やかに攪拌しながら、0〜5℃で915μL(10ミリモル)の塩化ホスホリルを加える。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、6%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムリン酸緩衝液)によってモニターする。出発ヌクレオチドが消失した後、反応混合物を60%のアセトニトリル/水と0.008Mの水酸化カリウムの溶液中に注いでから、塩酸で中和し、蒸発乾燥する。残渣を、シリカを主体とした逆相材料を使用するカラム液体クロマトグラフィー(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)によって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を2%のイソプロパノール/水での溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩671mg(1.51ミリモル)が、>98%の純度(収率:30%)で単離される。
B.8-Br-2'-O-メチル-cAMPの合成も、主としてKataokaら(7)によってすでに記載されているとおりに、8-Br-cAMPの変法直接アルキル化によって実施する。11g(26.96ミリモル)の8-Br-cAMP遊離酸(BIOLOG Life Science Institute、ドイツ国ブレーメン)および6.048g(108ミリモル)のKOHペレットを、室温の500mL容フラスコ中で攪拌することによって100mLの脱イオン水に溶解させる。その後、6.78g(108ミリモル)のCH3Iを100mLのジオキサンに溶かした溶液を加え、反応混合物を、出発材料が高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、6%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムリン酸緩衝液)によって検出できなくなるまで室温で攪拌する。繰り返し蒸発にかけて過剰のCH3Iを除去する。得られる粗製材料を水に溶解させ、1N HClで中和し、8-Br-2'-O-メチル-cAMPを、シリカを主体とした逆相材料を使用するカラム液体クロマトグラフィー(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)によって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を2%のイソプロパノール/水での溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。8-Br-2'-O-メチル-cAMP、ナトリウム塩5.019g(11.3ミリモル)が、>98%の純度(収率:42%)で単離される。
式:C11H12BrN5O6P・Na(MW:444.12)
式:C11H12BrN5O6P・H(MW:422.13)
1H-NMR(DMSO-d6)、δ3.39(s,3H,-CH3)、3.70〜4.10(m,3H,H4',H5'ax,H5'eq)、4.58〜4.65(m,1H,H3')、4.90〜5.20(m,1H,H2')、5.74(s,1H,H1')、7.51(広幅s,2H,-NH2)、8.17(s,1H,H2);31P-NMR(DMSO-d6)、δ-2.49(s);ESI-MS正モード:m/z 422/424(M+H)+、負モード:m/z 420/422(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 264nm(ε=17000)。
(実施例2)
8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pCPT-2'-O-Me-cAMP)
A.8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPの合成は、Millerら(8)によってすでに記載されているとおりに、8-Br-2'-O-メチル-cAMPの求核置換によって実施する。簡潔に述べれば、800mg(1.8ミリモル)の8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩および1.44g(10ミリモル)の4-クロロチオフェノールを250mL容フラスコに入った50%のアセトニトリル/水100mLに溶解させ、出発材料が完全に変換されるまで還流を行った。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、55%のメタノール/10mMのトリエチルアンモニウムギ酸緩衝液)によってモニターする。混合物を蒸発乾燥させ、10%のアセトニトリル/水に再度溶解させ、シリカを主体とした逆相材料を使用するカラム液体クロマトグラフィー(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)によって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を8%のイソプロパノール/水での溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。741mg(1.46ミリモル)の8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩が、>99%の純度(収率:81%)で単離される。
B.8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPの合成も、Kataokaら(7)によってすでに記載されているとおりに8-pCPT-cAMPの変法直接アルキル化によって実施する。300mg(0.608ミリモル)の8-pCPT-cAMP遊離酸(BIOLOG Life Science Institute、ドイツ国ブレーメン)および0.14g(2.5ミリモル)のKOHペレットを、室温の100mL容フラスコ中で攪拌することによって25mLの脱イオン水に溶解させる。その後、157mg(2.5ミリモル)のヨウ化メチルを25mLのジオキサンに溶かした溶液を加え、反応混合物を、出発材料が高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、55%のメタノール/10mMのトリエチルアンモニウムギ酸緩衝液)によって検出できなくなるまで室温で攪拌する。繰り返し蒸発にかけて過剰のCH3Iを除去する。得られる粗生成物を水に溶解させ、1N HC1で中和し、シリカを主体とした逆相材料を使用するカラム液体クロマトグラフィー(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)によって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を8%のイソプロパノール/水での溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。83mg(0.163ミリモル)の8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩が>99%の純度(収率:27%)で単離される。
式:C17H16ClN5O6PS・Na(MW:507.83)
式:C17H16ClN5O6PS・H(MW:585.85)
1H-NMR(DMSO-d6)、δ3.26(s,3H,-CH3)、3.65〜4.05(m,3H,H4',H5'ax,H5'eq)、4.51(d,1H,H2')、4.90〜5.0(m,1H,H3')、5.94(s,1H,H1')、7.30〜7.45(m,4H,フェニル環)、7.53(br s,2H,-NH2)、8.19(s,1H,H2);31P-NMR(DMSO-d6)、δ-2.45(s);ESI-MS正モード:m/z 486(M+H)+、508(M+Na)+、負モード:m/z 484(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 282nm(ε=16000)。
この新規な8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(図3)は、in vitroでEpac1の非常に効率のよい活性化因子のようである。2.2μMの8-pCPT-2'-O-MecAMPで、30μMのcAMPの半分のEpac1最大活性化が認められた(図4)。興味深いことに、Epac1に8-pCPT-2'-O-Me-cAMPが結合すると、cAMPの3倍の最大活性がもたらされ、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPが、cAMPよりもはるかに強力なEpac1のアロステリック調節因子であることが示される。対照的に、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPがPKAのI型およびII型ホロ酵素を活性化する能力は、cAMPよりも大幅に弱い(図5)。
これらin vitroでの結果から、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPが、in vivoでもEpacとPKAのシグナル伝達経路を識別する非常に強力な化合物であるかもしれないことが示唆された。したがって、Epacを活性化するかどうかではRap1を指標として用い、PKAでは一般的なPKA基質CREB 29のリン酸化を指標として用いて、NIH3T3-A14-Epac1細胞中で8-CPT-2'-O-Me-cAMPの試験を行った。重要な点として、8-Br-cAMPは、Rap1の活性化もCREBのリン酸化も誘発したが(図6、上方のパネル)、8-pCPT2'-O-Me-cAMPは、Rap1の活性化しか誘発しなかった。用量反応実験では、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、10μMの濃度ですでにRap1を活性化するが(図6、下方のパネル)、100μMもの高濃度でもCREBのリン酸化を誘発しなかったことが示されている。
したがって、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、特異性が高く、かつ効率的なRap1活性化因子であり、PKAおよびEpac-Rapを媒介とする双方のシグナル伝達経路を識別する非常に有用なツールであるという結論を下すことができる。これらの結果(図2、4、5、および6を含む)は、Enserinkら(9)によって発表されている。
機能アッセイでは、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、インテグリンを媒介とする細胞接着をEpacおよびRap1を通じて誘発するようであった。フィブロネクチンへの結合に関与するβ1インテグリン鎖を発現する、サイトメガロウイルスおよびルシフェラーゼをトランスフェクションした卵巣癌細胞(Ovcar3)を、トリプシンで分離し、細胞表面マーカーを再度発現させる。8-pCPT-2'-O-Me-cAMPの存在下または不在下で、フィブロネクチンでコートしたプレートに細胞を播き、一定期間経過後に接着した細胞の量を定量化した。8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、同等な濃度(EC50〜30μM、図7A)で細胞のフィブロネクチンへの接着を強化し、Rap1の活性化を誘発した。8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、200μMの濃度でさえ、CREBのリン酸化を誘発しなかった。経時的な分析では、Rap1が迅速かつ持続性に活性化されたことと関連して、30分後にはすでに接着の増大が認めらたことに注目した(図7B)。予想どおり、接着の誘発およびRap1の活性化は、PKA阻害剤H-89に対して非感受性であった(図7C)。しかし、Rap1GAPIIは低レベルででも、cAMPによって誘発されたOvcar3細胞のフィブロネクチン接着を完全に阻害した(図7D、左のプロット)。さらに、Rap1阻害タンパク質のRap1GAPI、およびRalグアニンヌクレオチドのRas結合ドメイン(RBD)解離刺激因子(RalGDS)も、フィブロネクチンへの接着を阻害した(図7D、左のプロット)。細胞にRap1GAP、またはRa1GDSのRBDをトランスフェクションしても、ルシフェラーゼの発現に影響を及ぼさなかった(図7D、右のプロット)。
8-pCPT-2'-O-Me-cAMPによって誘発される細胞接着がインテグリンを媒介とするものかどうか調査するために、Ovcar3細胞を、β1インテグリン結合性のアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)ペプチドで前処理した。RGDアミノ酸配列モチーフを含むペプチドは、β1インテグリンに結合するものであり、卵巣癌細胞中でフィブロネクチン結合をブロックすることがわかっている(10)。実際、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPによって誘発されるフィブロネクチンへの結合は、RGDペプチドの存在下で損なわれた(図8)。8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、インテグリンに依存的なOvcar3細胞のポリ-L-リシンへの接着を増大させなかった(図8)。これらの結果から、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPが、Epac-Rap1シグナル伝達経路を通じて、インテグリンを媒介とするフィブロネクチンへの細胞結合を誘発し得ることが結論付けられた。これらの結果(図7および8を含む)は、Rangarajanら(11)で発表されている。適切な細胞接着は、数多くの生理プロセスに必要であり、多くの病的状態、たとえば、癌、慢性の炎症、および血栓症では調節不能(deregulated)となり得る。
接着に対する作用を有することの他に、ヒト膵臓β細胞、およびINS-1インスリン分泌細胞中で、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPが、Epacを媒介とするCa2+誘起性Ca2+放出(CICR)による、細胞内貯蔵Ca2+からのCa2+の動員を引き起こし、それによってエキソサイトーシスを誘発し得ることも実証されている(12)。
要するに、これらの知見は、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPのようなEpacの活性を特異的にモジュレートするcAMP類似体の、癌、慢性の炎症、血栓症、および2型糖尿病の治療を含む多様な治療適用例を提唱するものである。
さらに、EpacおよびPKAに対して作用するか、他の新しい化合物を多数試験した(表1および2)。
環状ヌクレオチドがホスホロチオエートによって修飾されていると、環状ヌクレオチド応答性ホスホジエステラーゼ(PDE)による加水分解からかなり保護されることがわかっているので、たとえば長期間のインキュベート実験用のPDE抵抗性ツールを得るために、必要に応じて、その上に対応する類似体を調製した。
(実施例3)
8-クロロ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-Cl-2'-O-Me-cAMP)
主としてGenieserら(6)によってすでに記載されているとおりに合成を実施する。簡潔に述べれば、789mg(2.5ミリモル)の8-クロロ-2'-O-メチルアデノシン(BIOLOG Life Science Institute、ドイツ国ブレーメン)を20mLのリン酸トリエチルに溶解させ、氷浴に入れて0〜5℃に冷却する。穏やかに攪拌し、冷却しながら、457.5μL(5ミリモル)の塩化ホスホリルを0〜5℃で加える。次いで、出発材料が高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、6%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムリン酸緩衝液)によって検出できなくなるまで、反応混合物を0〜5℃に冷却した状態で攪拌する。出発ヌクレオシドが消失した後、反応混合物を60%のアセトニトリル/水および0.008Mの水酸化カリウムの溶液中に注いでから、塩酸で中和し、蒸発乾燥する。残渣を、シリカを主体とした逆相材料を使用するカラム液体クロマトグラフィー(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)によって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を2%のイソプロパノール/水での溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。8-Cl-2'-O-Me-cAMPナトリウム塩340mg(0.85ミリモル)が>98%の純度(収率:34%)で単離される。
式:C11H12ClN5O6P・Na(MW:399.69)
式:C11H12ClN5O6P・H(MW:377.67)
ESI-MS正モード:m/z 378(M+H)+、400(M+Na)+、負モード:m/z 376(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 262nm(ε=17000)。
(実施例4)
8-(4-フルオロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pFPT-2'-O-Me-cAMP)
8-pFPT-2'-O-Me-cAMPの合成は、主としてMillerら(8)によってすでに記載されているとおりに8-Br-2'-O-メチル-cAMPの求核置換によって実施する。30μモルの8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩および300μモルの4-フルオロチオフェノールを、1.5mL容ねじ口マイクロチューブに入った50%のアセトニトリル/水1mLに溶解させ、出発材料が完全に変換されるまで95℃で加熱した。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、6%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムギ酸緩衝液)によってモニターする。混合物を、油ポンプ真空中の減圧下、スピードバック遠心機中で蒸発乾燥し、10%のアセトニトリル/水0.5mLに溶解させ、シリカを主体とした逆相材料(YMC ODS-A 120-11、RP-18)を使用する半分取hplcによって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、生成物を100%の水から100%のアセトニトリルへと勾配をかけて溶離にかける。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。8-pFPT2'-O-Me-cAMPナトリウム塩14μモルが>97%の純度(収率:47%)で得られる。
式:C17H16FN5O6PS・Na(MW:491.40)
式:C17H16FN5O6PS・H(MW:469.39)
ESI-MS正モード:m/z 470(M+H)+、492(M+Na)+、負モード:m/z 468(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 283nm。
(実施例5)
8-(4-メトキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP)
8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMPの合成は、主としてMillerら(8)によってすでに記載されているとおりに8-Br-2'-O-メチル-cAMPの求核置換によって実施する。30μモルの8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩と300μモルの4-メトキシチオフェノールとを反応させ、本質的には実施例4に記載のとおりに生成物を精製した。8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMPナトリウム塩10μモルが>97%の純度(収率:33%)で単離される。
式:C18H19N5O7PS・Na(MW:503.41)
式:C18H19N5O7PS・H(MW:481.43)
ESI-MS正モード:m/z 482(M+H)+、504(M+Na)+、負モード:m/z 480(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 282nm。
(実施例6)
8-(4-メチル-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pMPT-2'-O-Me-cAMP)
8-pMPT-2'-O-Me-cAMPの合成については、30μモルの8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩と300μモルの4-メチルチオフェノールとを反応させ、本質的には実施例4に記載のとおりに生成物を精製した。8-pMPT2'-O-Me-cAMPナトリウム塩11μモルが>97%の純度(収率:37%)で単離される。
式:C18H19N5O6PS・Na(MW:487.41)
式:C18H19N5O6PS・H(MW:465.43)
ESI-MS正モード:m/z 466(M+H)+、負モード:m/z 464(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 284nm。
(実施例7)
8-(4-ヒドロキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-pHPT-2'-O-Me-cAMP)
8-pHPT-2'-O-Me-cAMPの合成では、30μモルの8-Br-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩と300μモルの4-ヒドロキシチオフェノールとを反応させ、本質的には実施例4に記載のとおりに生成物を精製した。8-pHPT2'-O-Me-cAMPナトリウム塩16μモルが>97%の純度(収率:53%)で単離される。
式:C17H17N5O7PS・Na(MW:489.39)
式:C17H17N5O7PS・H(MW:467.40)
ESI-MS正モード:m/z 468(M+H)+、負モード:m/z 466(M-H)-;UV-VIS(pH.7.0)λmax 283nm。
(実施例8)
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体(Rp-8-Br-2'-O-Me-cAMPS)、8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体(Sp-8-Br-2'-O-Me-cAMPS)
主としてGenieserら(13)によってすでに記載されているとおりに合成を実施する。簡潔に述べれば、0.9g(2.5ミリモル)の8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシンを20mLのリン酸トリエチルに溶解させる。穏やかに攪拌しながら、457μL(5ミリモル)の塩化チオホスホリルを加える。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、6%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムリン酸緩衝液)によってモニターする。出発ヌクレオシドが消失した後、反応混合物を還流させてある60%のアセトニトリル/水および0.008Mの水酸化カリウムの溶液中に注いでから、塩酸で中和し、蒸発乾燥する。残渣を、シリカを主体とした逆相材料(Merck LiChroprep(登録商標)RP-18)を使用するカラム液体クロマトグラフィーによって精製する。最初に100mMのNaH2PO4で溶離し、次いで100%の水で溶離する。最後に、ジアステレオ異性体(RpおよびSp)を0%〜5%のイソプロパノール/水で勾配をかけて溶離する。その後、分離したジアステレオ異性体のRp-およびSp-8-Br-2'-O-Me-cAMPSを、上述のものと同じクロマトグラフィー系を適用してさらに精製する。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。
Rp-8-Br-2'-O-Me-cAMPSナトリウム塩181μモルが>98%の純度(収率:7.2%)で単離される。
Sp-8-Br-2'-O-Me-CAMPSナトリウム塩197μモルが>98%の純度(収率:7.9%)で単離される。
Rp-8-Br-2'-O-Me-CAMPS
式:C11H12BrN5O5PS・Na(MW:460.19)
式:C11H12BrN5O5PS・H(MW:438.20)
ESI-MS正モード:m/z 438/440(M+H)+、460/462(M+Na)+、負モード:m/z 436/438(M-H)-;212/214(8-Br-Ade - H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 264nm(ε=17000)。
Sp-8-Br-2'-O-Me-CAMPS
式:C11H12BrN5O5PS・Na(MW:460.19)
式:C11H12BrN5O5PS・H(MW:438.20)
ESI-MS正モード:m/z 438/440(M+H)+、460/462(M+Na)+、負モード:m/z 436/438(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 264nm(ε=17000)。
(実施例9)
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体(Rp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPS)
Rp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPSの合成は、主としてMillerら(8)によってすでに記載されているとおりにRp-8-Br-2'-O-メチル-cAMPSの求核置換によって実施する。2mL容ねじ口マイクロチューブ中で、60μモルのRp-8-Br-2'-O-メチル-cAMPSナトリウム塩と600μモルの4-クロロチオフェノールとを反応させ、本質的には実施例4に記載のとおりに生成物を精製した。Rp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPSナトリウム塩17μモルが>98%の純度(収率:28%)で単離される。
式:C17H16ClN5O5PS2・Na(MW:523.90)
式:C17H16ClN5O5PS2・H(MW:501.92)
ESI-MS正モード:m/z 502(M+H)+、524(M+Na)+、負モード:m/z 500(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 282nm(ε=16000)。
(実施例10)
8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体(Sp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPS)
Sp-8-pCPT-2'-O-Me-CAMPSの合成については、60μモルのSp-8-Br-2'-O-メチル-cAMPSナトリウム塩と600μモルの4-クロロチオフェノールとを反応させ、本質的には実施例9に記載のとおりに生成物を精製した。Sp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPSナトリウム塩15μモルが>96%の純度(収率:25%)で単離される。
式:C17H16ClN5O5PS2・Na(MW:523.90)
式:C17H16ClN5O5PS2・H(MW:501.92)
ESI-MS正モード:m/z 502(M+H)+、524(M+Na)+、負モード:m/z 500(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 282nm(ε=16000)。
(実施例11)
N6-モノ-t-ブチル-8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチル-アデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエート(6-MTB-8-pCPT-2'-O-Me-cAMP)
70μモルの8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩を3mlのイソシアン酸t-ブチルに懸濁させ、500μlの無水DMSOを加える。フラスコを150℃の還流条件下で1.5時間加熱する。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、35%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムギ酸緩衝液)によってモニターする。未精製の生成物を少量の液体が残るまで蒸発にかけ、イオン対クロマトグラフィーを使用して逆相(RP8)シリカカラムで精製する。画分を含有する生成物をプールし、逆相シリカによって脱塩する。
6-MTB-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPナトリウム塩15μモルが>98%(収率:21.4%)で単離される。
式:C21H24ClN5O6PS・Na(MW:563.93)
式:C21H24ClN5O6PS・H(MW:541.95)
ESI-MS正モード:m/z 542(M+H)+、564(M+Na)+、負モード:m/z 540(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 290nm,sh 295nm(ε=25.000,計算値)。
(実施例12)
N6,N6-ジ-t-ブチル-8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエート(6-DTB-8-pCPT-2'-O-Me-cAMP)
実施例11の未精製生成物の後者の画分を含有する生成物をプールし、蒸発にかける。生成物がフラスコ壁面に析出するが、これをメタノールに溶解させ、その後溶媒を蒸発させて収集すると、5μモルの6-DTB-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPナトリウム塩を得ることができ、これは、96.5%の純度(収率:7%)で単離される。
式:C25H32ClN5O6PS・Na(MW:620.04)
式:C25H32ClN5O6PS・H(MW:598.05)
ESI-MS正モード:m/z 599(M+H)+、621(M+Na)+、負モード:m/z 597(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 295nm(ε=30.000(計算値)。
(実施例13)
N6-モノ-t-ブチルカルバモイル-8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチル-アデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエート(6-MBC-8-pCPT-2'-O-Me-cAMP)
50μモルの8-pCPT-2'-O-メチル-cAMPナトリウム塩を1mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させ、250μlのイソシアン酸t-ブチルを加える。フラスコを80℃の還流条件下で数時間加熱する。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、35%のイソプロパノール/10mMのトリエチルアンモニウムギ酸緩衝液)によってモニターする。2時間後、さらに250μlのイソシアン酸t-ブチルを加える。未精製生成物を少量の液体が残るまで蒸発にかけ、同じイオン対クロマトグラフィーシステムを使用して、半分取逆相(RP 8)シリカカラムによって精製する。画分を含有する生成物をプールし、逆相シリカによって脱塩する。
6-MBC-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPナトリウム塩10μモルが>98%の純度(収率:20%)で単離される。
式:C22H24ClN6O7PS・Na(MW:605.95)
式:C22H24ClN6O7PS・H(MW:583.97)
ESI-MS正モード:m/z 585(M+H)+、負モード:m/z 583(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 289nm,sh 295nm(ε=25.000,計算値)。
(実施例14)
8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸ベンジルエステル(8-Br-2'-O-Me-cAMP-Bn)
主としてFurutaら(14)によってすでに記載されているとおりに合成を実施する。簡潔に述べれば、93.8μモルの8-Br-2'-O-Me-cAMPを、900μLのアセトニトリルおよび100μLのDMFに溶解させる。188μモル(43.5mg)の酸化銀(I)および216μモル(25.7μL)の臭化ベンジルを加えた後、反応混合物を50℃で19時間攪拌する。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP-18、55%のメタノール/水)によってモニターする。酸化銀(I)を濾過によって除去する。濾液を、油ポンプ真空中の減圧下、スピードバック遠心機中で蒸発乾燥し、50%のメタノール/水0.5mLに溶解させ、シリカを主体とした逆相材料(YMC ODS-A 120-11、RP-18)を使用する半分取hplcによって精製する。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。35μモルの8-Br-2'-O-Me-cAMP-Bn(アキシアル異性体21μモルとエカトリアル異性体14μモル)が>97%の純度(収率:37%)で単離される。
式:C18H19BrN5O6P(MW:512.25)
ESI-MS正モード:m/z 512/514(M+H)+、負モード:m/z 510/512(M-H)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 264nm(ε=17000)。
(実施例15)
8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸ベンジルエステル(8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-Bn)
主としてFurutaら(14)によってすでに記載されているとおりに合成を実施する。114μモルの8-pCPT-2'-O-Me-cAMPを900μLのアセトニトリルおよび100μLのDMFに溶解させる。228μモル(52.8mg)の酸化銀(I)および216μモル(25.7μL)の臭化ベンジルを加えた後、反応混合物を50℃で22時間攪拌する。反応の進行を高圧液体クロマトグラフィー(RP18、45%のアセトニトリル/水)によってモニターする。酸化銀(I)を濾過によって除去し、得られる濾液を、油ポンプ真空中の減圧下、スピードバック遠心機中で蒸発乾燥し、50%のアセトニトリル/水0.5mLに溶解させ、シリカを主体とした逆相材料(YMC ODS-A 120-11、RP-18)を使用する半分取hplcによって精製する。画分を含有する生成物を収集し、蒸発にかける。9μモルの8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-Bn(アキシアル異性体5μモルおよびエカトリアル異性体4μモル)が>98.5%の純度(収率:8%)で単離される。
式:C24H23ClN5O6PS(MW:575.96)
ESI-MS正モード:m/z 576(M+H)+、負モード:m/z 574(MH)-;UV-VIS(pH7.0)λmax 282nm(ε=16000)。
Figure 0004902958
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実験手順
試薬
リン酸化されたCREBに対する抗体(リン酸化を受けたSer133に対するもの)は、Cell Signalling(米国マサチューセッツ州ベヴァリー)から入手し、K-Rev/Rap1に対する抗体およびポリクローナル抗HAは、Santa Cruz Biotechnology(米国カリフォルニア州サンタクルーズ)から入手した。以下の阻害剤および刺激物質は、別段の記載がない限り表示の濃度で使用した。RGDペプチド(100μM)およびH-89(10μM)は、Biomol Research Laboratories Inc.(米国ペンシルヴェニア州Plymouth Meeting)から入手した。8-Br-cAMP(1mM)は、BIOLOG Life Science Institute(ドイツ国ブレーメン)から入手した。TPA(12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート)は、シグマ(ドイツ国Steinheim)から入手し、100ng/mlの濃度で使用した。
細胞、プラスミド、トランスフェクタント
Epac1を安定に発現するNIH3T3-A14細胞を、10%のウシ胎児血清および2μg/mlのピューロマイシンを加えたDMEM中で増殖させた。NIH-OVCAR3(Ovcar3)細胞を、10%のウシ胎児血清を加えたRPMI中で維持した。CMV-ルシフェラーゼプラスミド(0.2μg)を含む6μgの総DNAを使用し、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics、ドイツ国マンハイム)を製造者の指示に従って使用して、Ovcar3細胞に一過性のトランスフェクションを施した。
cAMPに依存的なタンパク質キナーゼのin vitroでの活性化
すでに記載されているとおりに(15)、環状AMPに依存的なタンパク質キナーゼIおよびIIを単離されたサブユニットから再構成し、70mMのkemptideを基質として使用してキナーゼ活性があるか試験した。
Epac活性のin vitroでの測定
in vitro GEFアッセイを記載されているとおりに実施した(3、16)。より詳細には、蛍光ヌクレオチドmantGDPを載せた600nMのRap1bを100倍過剰のGTP存在下、かつ150nMのEpac1-ΔDEP1の不在下もしくは存在下でインキュベートした。徐々に増大する諸濃度のcAMPまたは8-pCPT-2'-O-Me-cAMPを加え、単一指数曲線をデータにフィットさせて、反応速度を算出した。緩衝液の条件は、50mMのトリスpH7.4、150mMのNaCl、5%のグリセロール、5mMのDTE、60μMのGTPとした。96ウェルプレート中で反応させ、Varian Inc.のCary Eclipseによって、製造者のソフトウェアを使用しながら測定した。
Rap1活性化アッセイ
以前に記載されているとおりにRap活性化アッセイを実施した(16〜18)。簡潔に述べれば、10%のグリセロール、1%のノニデットP-40、50mMのトリス-Cl pH7.5、200mMのNaCl、2mMのMgCl2、1μMのロイペプチン、0.1μMのアプロチニン、5mMのNaF、1mMのNaVO3を含有する溶解緩衝液に細胞を溶解させた。可溶化液を遠心分離によって清澄化し、グルタチオンビーズに予め結合させてある、GSTタグの付いたRalGDS-RBDと共にインキュベートして、GTPに結合した形のRap1を特異的に引っぱり出した(pull down)。サンプルを4℃で1時間、反転させながらインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液中で4回洗浄し、残っている液体を、インスリンシリンジを用いて除去した。タンパク質をLaemmliサンプル緩衝液で溶離し、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびRap1抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。対照として、全細胞可溶化液中のRap1レベルを定量した。
接着アッセイ
炭酸水素ナトリウム緩衝液(Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)中で、24穴プレートを一晩かけて2μg/mlのフィブロネクチン(Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)でコートした。室温で2時間かけてポリ-L-リシン(水中0.1% w/v)をコートし、水で2回洗浄し、終夜乾燥させた。プレートをTSM緩衝液(20mMのトリス-HC1 pH8、150mMのNaCl、1mMのCaCl2、2mMのMgCl2)中で洗浄し、37℃で30〜45分間、1%のBSA/TSMでブロックした。一過性にトランスフェクションを行ったOvcar3細胞を、接着アッセイ前の16時間は血清を与えずにおき、トリプシン処理によって分離した。細胞を遠心分離にかけ、25mMのHepes、0.5%のBSA、および1g/Lのグルコースを含有する、血清なしのRPMI中に再懸濁させ、懸濁液を穏やかに回転させながら、37℃で1.5〜2時間、細胞表面マーカーを回復させた。細胞を遠心分離にかけ、カウントし、0.5%のBSAを含有する血清なしのRPMI中に3×105細胞/mlで再懸濁させた。実験は、3通りに行い、各ウェルに対して、刺激物質を含むまたは含まない150μlの培地に150μlの細胞を加えた。H-89(10μM)での研究では、ウェルに播く前に細胞を阻害剤と共に37℃で30分間プレインキュベートするか(短い前処理)、あるいはトリプシン処理の前、回復期間の間、およびウェルに播く前にH-89を加えた(長い前処理)。細胞を37℃で1時間かけて接着させ、プレートを0.5%の温BSA/TSMで穏やかに3回洗浄して非接着細胞を除去した。接着細胞をルシフェラーゼ溶解緩衝液(15%のグリセロール、25mMのトリス-リン酸pH7.8、1%のTritonX-100、8mMのMgCl2、1mMのDTT)に4℃で30分間かけて溶解させ、等体積のルシフェラーゼ活性アッセイ緩衝液(25mMのトリス-リン酸pH7.8、8mMのMgCl2、1mMのDTT、1mMのATP pH7、1mMのルシフェリン)を加え、照度計(Lumat LB9507、Berthold Technologies、ベルギー)を使用して、ルシフェラーゼ活性の単位を定量化した。播いていない細胞(150μl)を別に溶解させて、総投入細胞中のルシフェラーゼカウントを測定した。特異的な接着(%)を求め(結合細胞数/総投入数×100)、直接に、またはHAベクターをトランスフェクションした細胞の基準(basal)接着と比較してプロットした。誤差バーは、諸実験の平均偏差(SD)を表し、代表となる実験を示す場合では、誤差バーは、各実験での平均SDを表す。トランスフェクションされた構築物の発現は、細胞可溶化液全部のイムノブロットによって確認した。
本発明の化合物の幾例かのデアザ類似体の式を示す図である。 PKA、Epac、嗅覚チャネル、ペースメーカーチャネル、および細菌CAPタンパク質のcAMP結合ドメインのアライメントを示す図である。 本発明の好ましい化合物である8-pCPT-2'-O-Me-cAMPの分子構造を示す図である。 Epac1のin vitroでの活性化を示すグラフである。100倍過剰のGTPの存在下で蛍光Mant-GDPを載せたRap1を、徐々に増大する諸濃度のcAMP(左パネル)または8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(中央パネル)の存在下で、Epac1-ΔDEPと共に、またはそれなしでインキュベートした。右のパネルは、cAMPおよび8-pCPT-2'-O-Me-cAMPに対するEpacのin vitro反応速度を示す。 徐々に増大させたcAMP濃度または8-pCPT-2'-O-Me-cAMP濃度での、I型ホロ酵素(PKAI)またはII型ホロ酵素(PKAII)のin vitro PKA活性を示すグラフである。 8-pCPT-2'-O-Me-cAMPがin vivoでRap1を活性化するがPKAは活性化しないことを示す図である。上方パネル:NIH3T3-A14-Epac1細胞を8-Br-cAMPで15分間かけて処理し、Rap1の活性化およびCREBのリン酸化について、細胞可溶化液の分析を行った。下方パネル:NIH3T3-A14-Epac1細胞を、2通りにして、徐々に増大する諸濃度の8-pCPT-2'-O-Me-cAMPで15分間処理した。細胞を溶解させ、同等量の細胞可溶化液を、予め結合させてあるGST-RalGDSRBDと共にインキュベートし、Rap1抗体を用いるイムノブロッティングによってRap1を試験した。細胞の溶解に対応するcAMP応答性エレメント結合タンパク質(CREB)のリン酸化を、ホスホ特異的CREB抗体を使用して分析した。 8-pCPT-2'-O-Me-cAMPによって、EpacおよびRap1を介する細胞接着が引き起こされたことを示すグラフである。A:8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、細胞の接着を刺激する。上方パネル:徐々に増大する諸濃度の8-pCPT-2'-O-Me-cAMPでの処理後、フィブロネクチンに接着するOvcar3細胞の定量化。下方パネル:Ovcar3細胞を、徐々に増大する諸濃度の8-pCPT-2'-O-Me-cAMPで15分間かけて処理し、細胞を溶解させ、Rap1(上方のブロット)およびCREB(下方のブロット)の活性化について分析を行った。総Rap1レベルを示す(中央のブロット)。B:8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、細胞接着の速度を増大させる。上方のパネル:フィブロネクチンに接着しているOvcar3細胞の様々な時点での定量化。下方のパネル:細胞を60μMの8-pCPT-2'-O-Me-cAMPで表示の時間のあいだ処理した。Rap1(上方のブロット)およびCREB(下方のブロット)の活性化について、細胞可溶化液の分析を行った。細胞可溶化液中の総Rap1レベルを示す(中央のブロット)。C:Ovcar3細胞を、ウェルに播く30分前にPKA阻害剤H-89(10μM)と共に37℃で30分間プレインキュベートし(「短」)、あるいはトリプシン処理の30分前および回収期間の間、Ovcar3細胞にH-89を加え(「長」)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(100μM)の存在下、または不在下でウェルに播いた。細胞を1時間かけて接着させた。D:cAMPによって誘発されたフィブロネクチンへの接着は、Rap1の阻害剤によってブロックされる。左のパネル:Ovcar3細胞に、それぞれ偽のDNA、徐々に増大する諸濃度のHA-Rap1GAPII(それぞれ0.5、1、2、または6μg)、HA-Rap1GAPI(6μg)、またはRalGDSのHA-RBD(6μg)を一過性にトランスフェクションした。細胞を8-Br-cAMPまたは8-pCPT-2'-O-Me-cAMPで処理し、フィブロネクチンへの接着状況を決定した。右上のパネル:上記実験での1ウェルあたりの総投入細胞のルシフェラーゼカウントを示す。右下のパネル:上記実験でのHA-Rap1GAPの発現を示す。 8-pCPT-2'-O-Me-cAMPによってフィブロネクチンへの接着が引き起こされることを示すグラフである。上方のパネル:(フィブロネクチン中に存在するRGD配列を含むβ1インテグリンブロックペプチドは、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP-によって誘発される細胞接着を阻害する。Ovcar3細胞を、表示のある場合ではRGDペプチド(100μM)で20分間かけて前処理し、8-pCPT-2'-O-Me-cAMPと共に、またはこれなしでウェルに播いた。細胞を1時間かけて接着させた。下方のパネル:8-pCPT-2'-O-Me-cAMPは、ポリ-L-リシンへの細胞接着速度を増大させない。Ovcar3細胞をポリ-L-リシンでコートしたプレートに播いた。様々な時点で、付着細胞を定量化した。 いわゆるプロドラッグ型の本発明の化合物の例を示す図である。A:8-Br-2'-O-Me-cAMP-ベンジルエステル、B:8pCPT-2'-O-Me-cAMP-ベンジルエステル。
[参考文献]
Figure 0004902958
Figure 0004902958

Claims (30)

  1. 8-ブロモアデノシン- 3’, 5’- 環状一リン酸, 2’- O- プロピルカーボネートを除く、構造式(I)
    Figure 0004902958
    [式中、R1は、それぞれ独立して、ハロゲン、アジド、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミド-アルキル、アミド-アリール、アミド-ヘテロアリール、OH、O-アルキル、O-アリール、O-ヘテロアリール、SH、S-アルキル、S-アリール、S-へテロアリール、SeH、Se-アルキル、Se-アリール、Se-ヘテロアリール、アミノ、NH-アルキル、NH-アリール、NH-へテロアリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリール、N-ビスへテロアリール、又はシクロアルキルアミノであり、
    R2は、それぞれ独立して、ハロゲン、アジド、O-アルキル、S-アルキル、Se-アルキル、NH-アルキル、N-ビスアルキル、アルキル-カルバモイル、シクロアルキルアミノ、又はシリルであり、
    R3は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、OH、アジド、アミド-アリール、O-アルキル、O-アリール、SH、S-アルキル、S-アリール、アミノ、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、N-ビスアリール、NH-アルキル-カルバモイル、又はシクロアルキルアミノであり、
    R4は、O(H)またはS(H)であり、
    R5は、O(H)、S(H)、アミノ、H、アルキル、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、又はN-ビスアリールであり、あるいは
    R4は、O(H)、S(H)、アミノ、H、アルキル、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、N-ビスアルキル、又はN-ビスアリールであり、
    R5は、O(H)またはS(H)であり、
    前記アルキル基又はアリール基は非置換であるか又は置換されており、前記アルキル基の置換基はハロゲン、ハロアルキル基、置換又は非置換のアリール基、ヘテロアリール基、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、ヒドロキシ、メルカプト、ケト、カルボキシ、及びメトキシからなる群から選択され、前記アリール基の置換基はハロゲン、ハロアルキル基、アルキル基、アルキルチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、及びアルコキシからなる群から選択され、
    ただし、R 4がO(H)である場合はR5はアルキルでなく、且つ、R5がO(H)である場合はR4はアルキルでない]
    を有する化合物、薬剤として許容されるその塩、または溶媒和物。
  2. R1 がハロゲン、アジド、O-アルキル、O-アリール、S-アルキル、S-アリール、NH-アルキル、NH-アリール、Se-アリールである、請求項1に記載の化合物。
  3. R1 がBr、Cl、I、アジド、2-クロロフェニルチオ、3-クロロフェニルチオ、4-クロロフェニルチオ、2-ブロモフェニルチオ、3-ブロモフェニルチオ、4-ブロモフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオ、n-ブチルチオ、n-ペンチルチオ、n-ヘキシルチオ、2-フルオロフェニルチオ、3-フルオロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、3-アミノフェニルチオ、4-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、フェニルエチルアミノ、3-フェニル-プロピルアミノ、2-メトキシフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、2-メチルフェニルチオ、3-メチルフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、2-イソプロピルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、エトキシ、プロピオキシ、ブトキシ、ベンジルオキシ、4-メチルベンジルオキシ、4-メトキシベンジルオキシ、4-フルオロベンジルオキシ、4-クロロベンジルオキシ、4-ブロモベンジルオキシ、フェニルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノ、2,3-ジクロロフェニルチオ、2,5-ジクロロフェニルチオ、2,4-ジフルオロフェニルチオ、2,5-ジメトキシフェニルチオ、2,5-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジクロロフェニルチオである、請求項1または2に記載の化合物。
  4. R1 がBr、Cl、アジド、2-クロロフェニルチオ、3-クロロフェニルチオ、4-クロロフェニルチオ、2-ブロモフェニルチオ、3-ブロモフェニルチオ、4-ブロモフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオ、n-ブチルチオ、n-フェニルチオ、n-ヘキシルチオ、2-フルオロフェニルチオ、3-フルオロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、3-アミノフェニルチオ、4-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、フェニルエチルアミノ、2-メトキシフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、2-メチルフェニルチオ、3-メチルフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、2-イソプロピルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、ベンジルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノ、2,3-ジクロロフェニルチオ、2,5-ジクロロフェニルチオ、2,4-ジフルオロフェニルチオ、2,5-ジメトキシフェニルチオ、2,5-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジメチルチオフェニルチオ、2,6-ジクロロフェニルチオである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. R1 がBr、C1、アジド、4-クロロフェニルチオ、メチルアミノ、メチルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メチルクマリニル、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、2-アミノフェニルチオ、ベンジルチオ、n-ヘキシルチオ、フェニルエチルアミノ、4-メトキシフェニルチオ、イソプロピルチオ、ベンズイミダゾリル-2-チオ、2-ヒドロキシエチルチオ、エチルチオ、2-アミノエチルチオ、ピリジニルチオ、ベンゾチアゾリルチオ、4-メチルフェニルチオ、3-メトキシフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、2,4-ジクロロフェニルチオ、メトキシ、ベンジルオキシ、シクロヘキシルアミノ、ベンジルアミノ、フェニルセレノ、4-イソプロピルオキシフェニルチオ、4-メチルチオフェニルチオ、6-アミノヘキシルアミノである、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. R1がCl、Br、またはS-アリールである、請求項1又は2に記載の化合物。
  7. R1がCl、Br、4-クロロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、ナフチル-2-チオ、フェニルチオ、4-ニトロフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、ピリジニル-2-チオ、4-メチルフェニルチオ、4-イソプロピルフェニルチオ、2,3,5,6-テトラフルオロフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオ、または2,4-ジクロロ-フェニルチオである、請求項6に記載の化合物。
  8. R1が4-クロロフェニルチオ、4-フルオロフェニルチオ、4-メトキシフェニルチオ、4-メチルフェニルチオ、4-ヒドロキシフェニルチオである、請求項6または7に記載の化合物。
  9. R2がハロゲン、アジド、O-アルキル、S-アルキルである、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. R2がCl、Br、I、O-アルキル、S-メチル、S-エチルである、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
  11. R2がCl、Br、O-メチル、O-エチル、O-プロピル、O-ブチル、O-イソブチル、S-メチルである、請求項1から10のいずれかに記載の化合物。
  12. R2がO-メチル、O-エチル、O-プロピル、O-ブチル、O-イソブチルである、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物。
  13. R2がO-メチルである、請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物。
  14. R3がアミノ、NH-アルキル、N-ビスアルキル、NH-アリール、NH-アルキル-カルバモイル、アミド-アリール、OHである、請求項1から13のいずれか一項に記載の化合物。
  15. R3がアミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、NH-ベンジル、NH-フェニルエチル、NH-フェニルプロピル、N-ビスメチル、N-ビスエチル、OHである、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物。
  16. R3がアミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、NH-ベンジル、N-ビスメチル、N-ビスエチル、OHである、請求項1から15のいずれかに記載の化合物。
  17. R3がアミノ、NH-フェニル、NH-t-ブチル、NH-t-ブチルカルバモイル、N-ビスメチル、OHである、請求項1から16のいずれか一項に記載の化合物。
  18. R3がアミノ、NH-t-ブチルである、請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物。
  19. R4およびR5が、それぞれ独立してO(H)またはS(H)である、請求項1から18のいずれか一項に記載の化合物。
  20. R4およびR5がO(H)である、請求項1から19のいずれか一項に記載の化合物。
  21. 前記化合物が、8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-メチルアミノ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-メチルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-フルオロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-メチル-クマリニル-7-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(ナフチル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-フェニルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-ニトロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(2-アミノ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-ベンジルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-n-ヘキシルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-フェニルエチルアミノ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-メトキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-イソプロピルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(ベンズイミダゾリル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(2-ヒドロキシ-エチルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸
    8-エチルチオ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸
    8-(2-アミノ-エチルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(ピリジニル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(ベンゾチアゾリル-2-チオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-メチル-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(3-メトキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-イソプロピル-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(4-ヒドロキシ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-(2,4-ジクロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-メトキシ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-ベンジルオキシ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸、
    8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、
    8-ブロモ-2'-O-メチルアデノシン-3'-5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
    8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートSp異性体、
    8-(4-クロロ-フェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状モノホスホロチオエートRp異性体、
    8-クロロ-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸
    からなる群から選択される、請求項1から7、9から11、15から18、及び20のいずれか一項に記載の化合物。
  22. cAMPによって直接に活性化される交換タンパク質(Epac)の活性をモジュレートするための、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
  23. Epac媒介シグナル伝達経路とPKA媒介シグナル伝達経路とを識別するための、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
  24. 医薬として使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の化合物。
  25. 請求項1から24のいずれか一項に記載の１種以上の化合物と、１種以上の薬剤として許容される賦形剤とを含む薬剤組成物。
  26. 請求項1から24のいずれか一項に記載の化合物、薬剤として許容されるその塩、または溶媒和物を含む医薬。
  27. 癌治療のための、請求項26に記載の医薬。
  28. 慢性炎症治療のための、請求項26に記載の医薬。
  29. 血栓症治療のための、請求項26に記載の医薬。
  30. 2型糖尿病治療のための、請求項26に記載の医薬。
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