JP4889904B2 - 低アレルゲン性食餌組成物および愛玩動物における食物アレルギーの診断方法 - Google Patents
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Description
本発明は、イヌおよびネコなどの愛玩動物における食物アレルギーを診断し、また管理するための食餌組成物(dietary composition)に関し、さらに特に単独タンパク質源として加水分解されたタンパク質を用いる低アレルゲン性組成物に関する。
【0002】
動物医療社会では、イヌおよびネコなどの愛玩動物における食物アレルギーの診断および管理に対する挑戦が進行している。食物アレルギーはしばしば、イヌにおける皮膚病および胃腸病をもたらし、この食物アレルギーは生後2ヶ月から12歳にわたり食物過敏症を発症させることができる。イヌにおける食物アレルギーが付随するその他の症状は、慢性下痢症、栄養物質吸収不良、体重減少、腹痛および嗜眠を包含する。
主要食物アレルゲンは、10,000〜60,000ダルトンの分子量範囲を有する水溶性糖タンパク質である。イヌにおける食物過敏症の主要原因は、乳製品、牛肉および植物タンパク質であるのに対して、ネコは独占的に、魚および乳製品に対して食物過敏症を発症する。
【0003】
動物における食物アレルギーの診断は、例えば食物アレルゲンを用いる皮内皮膚試験またはラスト法(radioallergossorbent)(RAST)または酵素結合免疫検定法(ELISA)などの血清学的試験などの方法を包含する。しかしながら、このような方法は信頼できるものではないことが見出されている。現時点では、食物アレルギーの診断は代表的に、時間を消費し、また不便である傾向を有する家庭調理した排除食餌(elimination diet)下に動物を置く必要がある。一例として、動物は3〜10週間の範囲の期間にわたり排除食餌下に管理しなければならない。
【0004】
食物過敏症に対する通常の処置は、厳重な回避である。しかしながら、家庭調理食餌は調製が簡単ではなく、羊肉などのタンパク質源は入手が困難であることがあり、また市販の食餌は隠された抗原を有することがあることから、この回避を愛玩動物で達成することは困難であることがある。さらに、1種または2種以上の新しいタンパク質源の延長された期間にわたる授与は、当該タンパク質に対する過敏症の発現をもたらすことがある。コルチコステロイド類は臨床的兆候を減少させることができるが、慢性的使用はイヌおよびネコに対して長期間の有害作用を有することがある。
【0005】
タンパク質をペプチドに酵素により加水分解することによって、タンパク質のアレルゲン性物性を減少させることができることが見出された。研究によって、加水分解されたタンパク質を用いて組成された食餌が抗原重荷を減少させ、食物アレルギーモデルにおけるアレルギー反応を減少させることが示唆されている。部分的に加水分解された食餌が危険度の高い幼児用に、またイヌおよびネコにおける食物過敏症の臨床的兆候の防止に使用されている。これらの食餌の大部分は加水分解された乳製品(カゼイン)または植物タンパク質(大豆タンパク質)を使用している。しかしながら、これらの研究は、動物におけるアレルギー反応の防止に要する加水分解の程度を示していない。従来の研究の中で、愛玩動物の食餌に使用するのに適するタンパク質源を指示するものはない。
【0006】
愛玩動物用の低アレルギー性食餌の開発において考慮されなければならないもう一つの因子は、いずれのアレルギーの可能性も回避しながら、許容される糞生成が得られる繊維源を含有させるべきであることにある。一例として、ビートパルプは、タンパク質を含有する動物食餌において、繊維源として常用されているが、アレルギー反応を生じさせる可能性がある。
従って、イヌおよびネコなどの愛玩動物における食物アレルギーの診断および管理を可能にすると同時に、許容される糞生成をもたらす食餌組成物に対する要求が依然として存在する。
【0007】
本発明は、食物アレルギーの診断および管理に使用することができるイヌおよびネコなどの愛玩動物用の低アレルゲン性食餌組成物を提供することによって、この要求に適応する。この食餌組成物は、食餌中の単独タンパク質源として加水分解されたタンパク質と許容される糞生成をもたらす繊維源を含有し、これにより抗原産生は減少され、付随するアレルギー反応が減少される。
本発明の一態様に従い、愛玩動物用の低アレルゲン性食餌組成物が提供され、この組成物は、乾燥物質に基づき、タンパク質源、脂肪源および炭水化物源を含有し、このタンパク質源が加水分解されたタンパク質を乾燥物質に基づき約20〜30重量%の量で含有する。加水分解されたタンパク質は好ましくは、加水分解されたニワトリ肝臓を包含する。好ましくは、タンパク質の少なくとも99%は、1.5kDaよりも小さい分子量を有する。
【0008】
炭水化物源は好ましくは、カッサバであり、これは組成物の乾燥物質に基づき約50〜60%を構成する。
組成物は好ましくは、リンゴ繊維、ナシ繊維、カルボキシメチルセルロース(CMC)と耐性デンプン(resistant starch)との配合物、およびそれらの混合物から選択される繊維源を、乾燥物質に基づき約1〜5重量%の量で含有する。
【0009】
本発明の組成物を、動物の栄養上の必要性に適応する量および頻度で愛玩動物に与える場合、動物は減少された抗原産生を示すことが見出された。本発明の組成物はまた、愛玩動物における食物アレルギーの診断方法を提供するために使用することができる。一例として、アレルギー症状を体験している動物を、本発明による食餌下に数週間にわたり置くことができ、これらの症状が軽減された場合、食物アレルギーの存在が確認される。動物に次いで、種々のタンパク質源を与え、特定のアレルギー源を決定することができる。
【0010】
従って、本発明の特徴は、低アレルゲン性食餌組成物および愛玩動物における食物アレルギーの診断方法を提供することにある。本発明によるその他の特徴および利点は、下記の説明、添付図面および特許請求の範囲から明白にされるものと見なされる。
本発明による低アレルゲン食餌組成物は、当該組成物が単独タンパク質源として加水分解されたタンパク質を使用することによって、現在入手することができる食餌組成物に優る利点を提供し、また愛玩動物における食物アレルギーの効果的な診断方法を提供する。さらにまた、本組成物はアレルギー反応の可能性を誘発せず、また許容される糞生成が得られる繊維源を含有することができる。
【0011】
本発明者等は、本発明による食餌組成物が動物における抗原産生を減少させ、また反応の顕示または反応の程度について、市販の別種の低アレルギー性食餌に比較して、良好、またはさらに良好な性能を有することを見出した。
本発明による食餌組成物は、乾燥物質に基づき好適濃度で加水分解されたタンパク質を含有するかぎり、すべての適当な形態で提供することができる。一例として、本組成物は押出し、缶詰にすることができ、またはビスケットの形状で提供することができる。
【0012】
本組成物は好ましくは、脂肪約9重量%〜30重量%、炭水化物50〜60重量%、および加水分解されたタンパク質源約20〜30重量%(全部が乾燥物質に基づく)を含有する。さらに、本組成物は好ましくは、リンゴ繊維、ナシ繊維、カルボキシメチルセルロースと耐性デンプンとの配合物、およびそれらの混合物から選択される繊維源を、乾燥物質に基づき約1〜5重量%の量で含有する。
本組成物中の加水分解されたタンパク質源は、好ましくは加水分解されたニワトリ肝臓を包含する。本組成物は、タンパク質源の少なくとも99%を、アレルギー反応が防止される程度にまで加水分解を確実に生じさせる1.5kDaよりも小さい分子量を有するように組成すると好ましい。
【0013】
炭水化物源は好ましくは、カッサバであるが、また粉末状ジャガイモ、オーツ麦および小麦などの別種の供給源を包含することができる。
脂肪源は好ましくは、動物脂肪を包含するが、また家禽脂肪、魚油、およびルリヂサ(borage)油を包含することができる。
本発明をさらに容易に理解できるように、下記例を引用する。これらの例は本発明を説明しようとするものであって、その範囲を制限しようとするものではない。
【0014】
例1
タンパク質源として加水分解されたニワトリ肝臓および炭水化物源としてカッサバを用いる、ネコ用食餌を組成した。この食餌は、下記表1に示されているように、1.4キロダルトン(kDa)以下の分子量を有するタンパク質を99.8%の量で用いて組成した。
【0015】
表1.加水分解された家禽肝臓の分子量分布。全部のデータは各分子量範囲内に見出される総タンパク質のパーセンテージ(%)として表わすa 。
a試料1は粗製タンパク質65.75%を含有し、また試料2は粗製タンパク質65.76%を含有する。
【0016】
これらの食餌の組成を表2に示す。
表2.加水分解されたタンパク質食餌。繊維を含有していない食餌
【0017】
嗜好試験を開始し、糞生成を検査した。嗜好試験の3日目の糞の評価は、黒色の粘膜生成の報告とともに、3′sおよび2′sの範囲にあった(下記表3参照)。この評価系において、理想的糞は、4の評価を有する。
【0018】
表3.嗜好試験からの糞評価値a
【0019】
a所見:糞の80%は非常に黒色に見えた。粘膜が糞中に明白に見られた。
b糞評価値:0=泥水様、糞形成はない;1=糞形成することができる水状液体;2=軟らかく、定形がない泥水様;3=軟らかく、定形を有し、湿っており、形状を保有する;4=堅く、定形を有し、乾燥した糞、堅さを維持する;5=堅く、乾燥したペレット状、小型の堅い塊。
en/s=糞なし。
【0020】
最初の嗜好試験から、繊維源は、イヌの胃腸管において中程度の発酵能力を有するが、アレルギー反応を生じさせず、また許容される糞生成を生じさせるものである必要があることが証明された。この臨界条件に適合する繊維源は、リンゴ繊維、ナシ繊維およびCMC/耐性デンプンの組合せであった。これらの繊維を食餌に配合し(表4参照)、次いで生物学的検定で糞生成について試験した。この生物学的検定には、全部で12匹のイヌを使用した(1処置あたりイヌ4匹)。イヌには、彼等の各食事を12日間与え、糞評価値を毎日記録した。これらの結果を表5にまとめて示す。アップル ポマセ(Apple Pomace)を用いて調製された食餌は、最良の定形を有する糞をもたらした。
【0021】
表4.加水分解されたタンパク質食餌。任意の繊維
*耐性デンプンは、National Starch and Chemical Company,Inc.から市販されている。
【0022】
表5.繊維選択生物学的検定からの糞評価値
a糞中の粘膜形成の報告。アップル ポマセ=1;ナシ繊維=6;CMC/ノベロース(Novelose)=5
b糞評価値:1=糞形成することができる水状液体;2=軟らかく、定形がない泥水様;3=軟らかく、定形を有し、湿っており、形状を保有する;4=堅く、定形を有し、乾燥した糞、堅さを維持する;および5=堅く、乾燥したペレット状、小型の堅い塊。
【0023】
例2
例1の食餌を試験し、その効力を測定した。使用した食餌を下記表6に示す。
表6.加水分解されたタンパク質食餌
【0024】
家禽類肝臓、カゼインおよび大豆タンパク質に対するアレルギーを実験的に誘発させたイヌにおいて、食餌を試験した。食餌は、低アレルギー組成物であるエックスクルード(Exclude)(登録商品名)(DVM Pharmaceuticals)およびHA−ホーミュラー(HA-Formula)(登録商品名)(Ralston Purina)とともに試験した。方法および結果を以下にまとめて説明する。
【0025】
方法:これらの試験は、NIHガイド フォア ザ ケア アンド ユウス オブ ラボラトリイ アニマルス(NIH Guide for the Care and Use of laboratory Animals)およびザ カナディアン カウンシル オン アニマル ケア ガイド フォア ザ ケア アンド ユウス オブ エクスペリメンタル アニマルス(The Canadian Council on Animal Care and Use of Experimental Animals)に従い行った。この試験には、雑種のそりイヌ(n=14)を使用し、またこれらの動物は3匹の同腹仔から得た。これらの動物を生後24時間以内に2処置群に無作為に配分した。グループ1のイヌ(n=11)は、カゼイン、ニワトリ肝臓および大豆タンパク質に対して感作し、またグループ2のイヌ(n=3)は対照として使用し、いずれの食物抗原に対しても感作しなかった。
【0026】
これらのイヌには、最初の6ヶ月間、仔イヌ用食餌(The lamps Company,Dayton,OH)を与え、次いで残りの試験期間、成犬用食餌(The lamps Company,Dayton,OH)を与えた。これらの食餌は乳タンパク質、大豆タンパク質、またはニワトリ肝臓を含有していなかった。これらのイヌには、11週齢の時点で4週間、乳タンパク質、大豆タンパク質、またはニワトリ肝臓を含有する食餌を与えた。食物は製造業者の指示に従い与え、また新鮮な水を自由に与えた。これらの動物を毎日観察し、いずれかの臨床的兆候を記録した。
【0027】
食物抗原/分析:感作用抗原は、カゼイン、大豆タンパク質およびニワトリ肝臓を含有していた(重量に基づき、1:1:1)。過敏反応は、下記の加水分解された完全食餌に対して生じさせた:カゼイン(Sigma)、1%加水分解カゼイン(lams)、2%加水分解カゼイン(lams)、5%加水分解カゼイン(lams)、10%加水分解カゼイン(lams)、20%加水分解カゼイン(lams)、50%加水分解カゼイン(lams)、ニワトリ肝臓、加水分解されたニワトリ肝臓(lams)、大豆タンパク質、エクスクルード(登録商品名)(加水分解カゼインおよび肝臓、16.5%タンパク質、DVM Phamaceuticals,Miami,Florida)、HF−フォーミュラ(登録商品名)(加水分解された大豆、18%タンパク質、Ralston Purina,St.Louis,Missouri)、および加水分解されたニワトリ肝臓食餌(被験食餌:19%タンパク質、The lams Company,Lewisburg,OH)。カゼインおよびニワトリ肝臓加水分解は、lams社(Lewisburg,OH)によって行われた。加水分解の程度は、パーセントとして表わし、遊離アミノ酸への加水分解反応の割合で表わす。
【0028】
被験食餌および感作抗原の分子量を測定するために、SDS−PAGE電気泳動を行った。各抗原は、蒸留水を用いて10重量/重量%懸濁液または溶液を調製し、次いで1時間かけて撹拌した。タンパク質濃度は、BioRad分析系(BioRad,Missisauga,Ontario)を用いて測定した。これらの溶液は、タンパク質2mg/mlを含有するように調整した。SDS−PAGE電気泳動は、20%分離ゲルおよび4%接着ゲルに対して200Vで5.5時間かけて行った。タンパク質10マイクログラムを各ゲル列に添加した。
SDS−PAGEゲルは、5〜80kDaのタンパク質を分離した。各試料からの検出可能な最大分子量および最低分子量を表7に示す。
【0029】
表7.SDS−PAGEゲルにおけるタンパク質の分子量範囲
【0030】
高分子量タンパク質の最低加水分解を、1%、2%および5%加水分解カゼイン試料で生じさせた。これらの加水分解された試料はカゼイン単独のものとは有意に相違していなかった。高分子量タンパク質の有意の加水分解は、10%および20%試料で達成されたが、若干の高分子量タンパク質の証拠が依然として存在していた。α−ラクトアルブミン(14.2kDa)などの特定のカゼインタンパク質は、1〜10%加水分解カゼイン試料で同定することができる。高分子量タンパク質の完全加水分解は、50%加水分解カゼイン試料で達成されたものと見なされる。未加水分解カゼインは、豊富な高分子量タンパク質を含有していた。ニワトリ肝臓および加水分解されたニワトリ肝臓は両方ともに、高分子量バンドを有する。タンパク質の有意の加水分解は、エクスクルード、HF−フォーミュラおよび被験食餌で達成されたが、弱い高分子量バンドが依然として確認できた。
【0031】
感作方法:グループ1のイヌに対する感作方法は、仔犬に対する生きているウイルスワクチン(ジステンパー、肝炎、パルボウイルス、パラインフルエンザ、Fort Dodge Ayerst,Guelph,Ontario)の皮下注射、引き続くアルム(alum)アジュバント10中の食物抗原の皮下注射を包含した。1〜85日間、グループ1のイヌは、カゼイン、大豆タンパク質およびニワトリ肝臓1mgの7回の注射により感作した。対照動物にはアジュバントのみを与えた。
【0032】
皮膚試験:皮膚試験は、生後約6ヶ月の時点で感作用抗原に対する感作処置を完了した後のイヌで行った。被験食餌(カゼイン、1%加水分解カゼイン、2%加水分解カゼイン、5%加水分解カゼイン、10%加水分解カゼイン、20%加水分解カゼイン、50%加水分解カゼイン、ニワトリ肝臓、加水分解ニワトリ肝臓、大豆タンパク質、エクスクルード、HF−フォーミュラ、被験食餌)に対する皮膚過敏試験は、生後約10ヶ月の時点で行った。各仔犬の皮膚試験には、腹部の腹側を使用した。4種の濃度(2,000、200、20および0.02μg/ml)の食物アレルゲンを、腹腔内注射した(0.05ml)。抗原として同一濃度のヒスタミンを陽性対照として使用し、他方、無菌塩類溶液を陰性対照として使用した。腹腔内注射後、5〜10分間の間隔でエバンズブルー(Evans blue)染料(0.5%、0.2ml/kg)を静脈投与した。腹腔内注射後の約20分の時点で、各アレルゲンの膨疹および発赤反応の直径を測定した。
【0033】
胃内視鏡食物過敏症試験:仔犬が生後約6ヶ月になった時点(感作後)および10ヶ月になった時点(被験食餌)で、これらの仔犬において胃内視鏡検査を行った。イヌはアセプロマジン(acepromazine)による鎮静化後、2〜3%ハロタン(halothane)により麻酔させた。注入用の操作チャンネルを備えた小児用上部G1内視鏡を用いる内視鏡検査を行った。試験抗原(皮膚試験と同一、1:1塩類溶液/グリセリン中1mg/ml、0.5ml)を、硬化療法用針を用いて胃粘膜中に注入した。対照は、塩類溶液/グリセリンからなる。エバンスブルー染料(0.5%、0.2ml/kg)を、胃注入に先立ちIV5〜10分間で投与した。胃粘膜は各抗原に応答し、対照は注入後5分の時点で、下記評価系を用いて膨潤、紅斑、および青色斑の程度に従い評価した:0=正常胃粘膜;1=僅かな紅斑;2=僅かな紅斑および浮腫;3=中程度の紅斑および浮腫;僅かな青色斑;4=重篤な紅斑および浮腫;青色斑。
【0034】
血清IgE:感作処置の終了時点で(生後6ヶ月)、対照のイヌおよび感作されたイヌから血清を採取した。特異IgE血清抗体の濃度を、市販診断検査室(Biomedical Services,Austin,Texas)でELISAを用いて測定した。血清IgE力価を、正常イヌおよび確立された食物過敏症イヌについて比較した。IgEレベルは、正常、限界、陽性および高度の陽性として評価した。
イヌの感作:イヌに感作処置を受けさせた後、感作抗原に対する皮膚感受性および胃反応を、生後6ヶ月の時点で測定した。全部のイヌが、カゼイン、粉末状大豆およびニワトリ肝臓抗原に対して充分に感作されたことが測定された。対照動物は感作されなかった。
【0035】
臨床上の評価:生後11ヶ月の時点で、イヌに大豆、カゼイン、およびニワトリ肝臓からなる食餌を与えた場合、全部の感作されたイヌが中程度〜重篤な下痢および体重損失を発現した(データは示されていない)。さらにまた、感作されたイヌ11匹のうちの8匹は、毛の喪失および腹部のかゆみを包含する皮膚学的反応を示した。対照イヌには、皮膚学的反応は見出されなかった。感作性食餌を与えて1週間以内に臨床上の兆候が発現し、この食餌が与えられているかぎり持続した。
【0036】
被験食餌に対する皮膚および胃内視鏡反応:14種類の相違する食物抗原の4種の濃度に対する皮膚反応を、対照イヌおよび感作イヌで測定した。全部のイヌが全濃度の陽性対照(ヒスタミン)に対して反応し、陰性対照(塩類溶液)刺激に対して応答したイヌは存在しなかった。対照イヌ(#1、#2および#3)は、高濃度でのみ抗原に対して反応した。12匹のイヌを除いて(粉末状大豆に反応しない)、全部の感作されたイヌが3種の感作抗原に反応した。最も際立った反応を生じさせる最高抗原濃度と反応との用量依存度が存在した。1%加水分解カゼイン、2%加水分解カゼイン、5%加水分解カゼイン、10%加水分解カゼインおよび20%加水分解カゼインの皮膚反応は、カゼイン単独の場合と有意に相違しておらず、実際に、かなりのイヌは元のタンパク質に比較して、加水分解物に対してさらに重篤に反応した(例えば、イヌ6、11、14)。
【0037】
数匹のイヌは、カゼイン単独よりも50%加水分解カゼインに対して反応したが、発赤反応の直径はほとんど際立っていなかった。低試験濃度において(2mg/mlおよび0.02mg/ml)、加水分解されたカゼインおよび加水分解されたニワトリ肝臓はそれぞれ、カゼインおよびニワトリ肝臓に比較して、少ない数の動物で小さい反応を誘発させた(図1)。エクスクルード、HF−フォーミュラ、および加水分解されたニワトリ肝臓は、加水分解されたカゼインに比較して、より小さい反応を生じさせたのに対して、被験食餌は最少反応性であった(図1)。
【0038】
被験食餌に対する胃粘膜反応の様相は、皮膚注入後に見られるものに類似していた。感作されたイヌにおいて、50%加水分解カゼイン、HF−フォーミュラ、エクスクルードおよび被験食餌は、未加水分解抗原に比較して、有意に低い胃内視鏡評価値を有していた(図2)。被験食餌は全部のチャレンジ抗原に対して最低の反応性を有していた。対照イヌの胃内視鏡評価値は全部の抗原に対して正常であるか、または僅かであった(図2)。
【0039】
結果:これらの試験からの結果は、過敏反応を最低にするためには、高度のタンパク質加水分解(完全加水分解の50%まで)が必要であることを示している。加水分解度が低いと、タンパク質の三元構造内の抗原エピトープが免疫学的プロセスにさらされることから、アレルギー反応は増強される。
イヌは、それぞれ乳製品/肝臓ベースの製品および大豆ベースの製品である市販低アレルギー性加水分解食餌(エクスクルードまたはHF−フォーミュラ)に対して応答しなかった。被験食餌は、3種の感作された食餌の中で最低の皮膚および粘膜反応を呈示した。
【0040】
或る代表的態様および詳細を本発明の説明目的で示したが、本明細書に記載されている方法および装置における種々の変更を本発明の範囲から逸脱することなくなしうることは、当業者にとって明白であると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本発明による低アレルゲン食餌を包含する種々の加水分解された食餌を与えられたイヌの皮膚反応を示す棒グラフである。
【図2】 図2は、図1に示されている加水分解食餌を与えられたイヌの胃粘膜反応を示す棒グラフである。
Claims (8)
- タンパク質源、脂肪源、および炭水化物源、並びに繊維源を含有する愛玩動物用の低アレルゲン性食餌組成物であって、前記食餌組成物は乾燥物質基準で20〜30重量%のタンパク質源を含有し、前記タンパク質源は加水分解されたタンパク質であり、少なくとも99%が1.5kDaよりも小さい分子量を有することを特徴とする低アレルゲン性食餌組成物。
- 上記タンパク質が加水分解されたニワトリ肝臓を含有する、請求項1に記載の組成物。
- 繊維源を1〜5重量%の量で含有する、請求項1に記載の組成物。
- 上記繊維源が、リンゴ繊維、ナシ繊維、カルボキシメチルセルロースと耐性デンプンとの配合物、およびそれら混合物からなる群から選択される、請求項3に記載の組成物。
- 上記炭水化物源が、上記組成物の50〜60重量%を構成する、請求項1に記載の組成物。
- 上記炭水化物源が、カッサバを含有する、請求項5に記載の組成物。
- 愛玩動物における食物アレルギーの診断方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の低アレルゲン性食餌組成物を或る量でアレルギー症状を示す動物に、当該アレルギー症状を軽減させるのに充分な期間にわたり投与し;次いで
上記動物に、種々のタンパク質源を投与し、食物アレルギーの原因源を測定する;
工程を含む上記診断方法。 - 愛玩動物における食物アレルギーを管理し、また抗原産生を減少させる方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の低アレルゲン性食餌組成物を或る量で投与することを含む上記方法。
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