JP4885727B2 - 植物における改善された標的に向けたｄｎａ挿入 - Google Patents
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Description
本発明は、分子の植物生物学の分野、より具体的には植物ゲノムエンジニアリングの分野に関する。外来性ＤＮＡ断片の、植物ゲノム中のあらかじめ選ばれた挿入部位への特異的導入のための方法を提供する。特定の部位に挿入された外来性ＤＮＡを含む植物を、現在利用可能な標的に向けたＤＮＡ挿入法で可能なよりも、より高い頻度でおよびより高い精度で、今や得ることができる。さらに、結果として得られる大部分の植物においては、外来性ＤＮＡはあらかじめ選択された挿入部位のみに挿入されており、植物ゲノムの他の位置に無秩序に外来性ＤＮＡが挿入されてはいない。本発明の方法はこのように、先行技術の方法に対して定量的および定性的の両面での進歩である。さらに、キメラ遺伝子、プラスミド、ベクター、および本発明の方法中で用いられる他の手段も提供する。
前世紀８０年代初めのAgrobacteriumを介する形質転換技術による遺伝子組換え植物の第一世代により、対象の外来性ＤＮＡまたは導入遺伝子を植物のゲノムへ導入する他の方法、例えばＰＥＧを介するプロトプラストへのＤＮＡ取込、マイクロプロジェクタイル撃ち込み、シリコンホイスカーを介する形質転換その他、の開発に拍車がかけられた。
しかし、すべての植物の形質転換法では共通して、植物ゲノムに組み入れられる導入遺伝子は、無作為な方式でまた予測できないコピー数だけ組み込まれる。しばしば、導入遺伝子は、導入遺伝子全体が、またはそれの部分が、リピートの形で組込まれる場合がある。そのような複雑な組込みパターンは、導入遺伝子の発現レベルに、例えば転写後遺伝子サイレンシング機構により転写されたＲＮＡを破壊して、または導入されたＤＮＡのメチル化を引き起こして、導入遺伝子の転写活性を下方制御することにより、影響を及ぼす可能性がある。さらに、組込み部位自体が、導入遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす場合がある。これらの因子の組合せが、導入遺伝子または対象の外来性ＤＮＡの発現レベルの広汎な変化を、種々の遺伝子組換え植物細胞および植物系統中にもたらす。さらに、対象の外来性ＤＮＡの組込みが、組込みが生じるゲノム領域に破壊的な効果を有する可能性があり、その標的領域の正常な機能に影響を及ぼすかまたは妨害する場合があって、そのためにしばしば望ましくない副作用が生ずる。
したがって、植物への特定の外来性ＤＮＡ導入の影響を研究する場合は常に、有効な結果を得るために多数の遺伝子組換え植物系統を生成し分析することを必要とする。同様に、遺伝子組換え植物に所望の既知の表現型を与えるために、植物に対象の特定のＤＮＡが導入される遺伝子組換え農作物の生成においては、多数の独立に形成された遺伝子組換え植物系統、即ちいわゆるイベントが形成されて、導入遺伝子が最適に発現しておりまた遺伝子組換え植物の表現型全体に亘って副作用が最小であるかまたは無い植物系統の選択が可能となる。特にこの分野で、望ましくない遺伝子組換えイベントの排除に必要な圃場試験の繰返しに伴う厄介な制御のための必要条件および高いコストを考慮すれば、この試行錯誤プロセスをより指向性のあるプロセスと置き換えることができれば有利であろう。更に、標的指向のＤＮＡ挿入が可能であることが、いわゆる導入遺伝子スタッキングのプロセスでさらに有益であることが明らかであろう。
植物中への導入遺伝子組込みを制御する必要性が早い時期から認識されており、またいくつかの方法がこの必要を満たす努力の中で発展されてきた（総説としてKumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, ppl55-159 を参照のこと）。これらの方法はほとんど、原核生物および下等真核生物に成功裡に適用されてきた戦略である相同組換えに基づいた導入遺伝子組込みに依存している（例えば、ＥＰ０３１７５０９または対応したPaszkowski et al., 1988, EMBO J., 7，pp 4021-4026による文献を参照のこと）。しかし、植物については、導入遺伝子組込みの主な機構は、組換えをするＤＮＡ鎖間の相同性がほとんどない非正統的組換に基づいている。この領域における主な挑戦課題は、したがって、非正統的組換を介して導入される外来性ＤＮＡのはるかに効率的な組込みによって隠されている、レア相同組換えイベントの検出である。
この問題を解決する１つの方法は、ＷＯ９４／１７１７６に例示されているような、非正統的組換によって生じた組込みイベント以外を選別することによる。
この問題を解決する別の方法は、Ｉ−ＳｃｅＩなどのレア切断を起こすエンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡ切断の誘導による、標的座位の活性化および／またはドナーＤＮＡの修復による。この技術はAgrobacteriumを用いて植物細胞に修復ＤＮＡを配送した場合に、相同組換え頻度を少なくとも二桁増加させることが示された（Puchta et 1996, Proc. Natl. Acad. U.S.A., 93, pp5055-5060; Chilton and Que, Plant Physiol., 2003）。
ＷＯ９６／１４４０８が、酵素Ｉ−ＳｃｅＩをコードする単離されたＤＮＡについて記述している。このＤＮＡ配列を、クローニングにより、発現ベクター、形質転換細胞系統、および遺伝子組換え動物、に組み入れることができる。このベクターは、遺伝子の遺伝子地図作製および部位特異的挿入に役立つ。
ＷＯ００／４６３８６が、Ｉ−Ｓｃｅｌ二重鎖切断を通じて遺伝子または細胞の他の染色体ＤＮＡを修飾し、修復し、減少させ、不活性化する方法について記述している。さらに、それが必要とされる個体中の遺伝病の治療または予防の方法を開示する。さらに、キメラの制限エンドヌクレアーゼを開示する。
しかし、真核細胞のゲノム、特に植物細胞ゲノム中への外来性ＤＮＡの標的指向挿入の頻度を改善する必要性がいまだに残存している。これらの問題および他の問題が、以下に本発明の様々の詳細な実施態様ならびに請求項に記述するように、解決される。
発明の開示
実施態様の１つにおいて本発明は、対象の外来性ＤＮＡであって、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域と少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ領域と隣接している可能性のあるＤＮＡを、トウモロコシ細胞のような植物細胞のゲノムの、Ｉ−ＳｃｅＩ部位などのあらかじめ選択された部位へ導入する方法であって
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に、例えばＩ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子を導入することによって引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、外来性ＤＮＡが、対象の外来性ＤＮＡでコートされたマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより遂行される直接ＤＮＡ移入により送達されることを特徴とする方法を提供する。
Ｉ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、前記ヌクレオチド配列は、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有し、以下を条件とする。
i） ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii） ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii） ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択される配列を含まず；
iv） ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v） ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi） ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない。そのようなＩ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子の一例は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
植物細胞を工程（ａ）に先立って植物フェノール化合物中でインキュベーションしてもよい。
実施態様の１つにおいて本発明は、対象の外来性ＤＮＡであって、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域と少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ領域と隣接している可能性のあるＤＮＡを、トウモロコシ細胞のような植物細胞のゲノムの、Ｉ−ＳｃｅＩ部位などのあらかじめ選択された部位へ導入する方法であって
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に、例えばＩ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子を導入することによって引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、外来性ＤＮＡが、対象の外来性ＤＮＡでコートされたマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより遂行される直接ＤＮＡ移入により送達されることを特徴とする方法を提供する。
Ｉ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、前記ヌクレオチド配列は、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有し、以下を条件とする。
i） ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii） ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii） ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択される配列を含まず；
iv） ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v） ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi） ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない。そのようなＩ−ＳｃｅＩをコードする遺伝子の一例は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
植物細胞を工程（ａ）に先立って植物フェノール化合物中でインキュベーションしてもよい。
別の実施態様において、本発明は、対象の外来性ＤＮＡを植物細胞ゲノムのあらかじめ選択された部位へ導入するための、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程：
を含み、二本鎖ＤＮＡ切断が、ヌクレオチド配列によってコードされるレア切断エンドヌクレアーゼによって導入され、前記ヌクレオチド配列が、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有し、
ｉ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iv）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣからなる群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴからなる群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi）ヌクレオチド配列が、コドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない、
ことを条件とすることを特徴とする。
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程：
を含み、二本鎖ＤＮＡ切断が、ヌクレオチド配列によってコードされるレア切断エンドヌクレアーゼによって導入され、前記ヌクレオチド配列が、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有し、
ｉ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iv）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣからなる群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴからなる群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi）ヌクレオチド配列が、コドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない、
ことを条件とすることを特徴とする。
さらに別の実施態様において、本発明は、対象の外来性ＤＮＡを植物細胞のゲノムのあらかじめ選ばれた部位へ導入するための方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、工程（ａ）に先立って植物細胞を、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシアセトフェノン）、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリング酸（４−ヒドロキシ−３，５ジメトキシ安息香酸）、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロキシ安息香酸）、β−レソルシル酸（２，４ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロ没食子酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、の群より選択される植物フェノール化合物中でインキュベーションすることを特徴とする方法に関する。
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、工程（ａ）に先立って植物細胞を、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシアセトフェノン）、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリング酸（４−ヒドロキシ−３，５ジメトキシ安息香酸）、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロキシ安息香酸）、β−レソルシル酸（２，４ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロ没食子酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、の群より選択される植物フェノール化合物中でインキュベーションすることを特徴とする方法に関する。
本発明は、さらに配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ断片であって、そのヌクレオチド配列が約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有し、以下を条件とする、ＤＮＡ断片を提供する：
ｉ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ，ＡＡＧＧＴ，ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択される配列を含まず；
iv）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi）前記ヌクレオチド配列の、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）をコードするコドンが、前記コドンの位置２および３にＴＡまたはＧＣという二連コードを含まない。
ｉ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
ii）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まず；
iii）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ，ＡＡＧＧＴ，ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択される配列を含まず；
iv）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；
v）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まず；および
vi）前記ヌクレオチド配列の、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）をコードするコドンが、前記コドンの位置２および３にＴＡまたはＧＣという二連コードを含まない。
本発明は、さらに配列番号４のヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ配列、および植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結された本発明による単離されたＤＮＡ断片を含むキメラ遺伝子、ならびに植物ゲノム中のＩ−ＳｃｅＩ認識部位に外来性ＤＮＡを挿入するための、そのようなキメラ遺伝子の使用、を提供する。
本発明のさらに別の実施態様において、対象の外来性ＤＮＡを、植物細胞のゲノムのあらかじめ選ばれた部位へ導入するための方法であって、
ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を、細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に、レア切断エンドヌクレアーゼにより引き起こす工程；
ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程、
を含み、前記エンドヌクレアーゼが核移行シグナルを含むことを特徴とする方法を提供する。
ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を、細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に、レア切断エンドヌクレアーゼにより引き起こす工程；
ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程、
を含み、前記エンドヌクレアーゼが核移行シグナルを含むことを特徴とする方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は次の発見に基づく：
ａ） 植物細胞中への、直接のＤＮＡ移入、特にマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより挿入される外来性ＤＮＡの導入が、標的指向挿入イベントの頻度を予想外に増加させた。すべての得られた挿入イベントが標的指向ＤＮＡ挿入イベントであって、二本鎖ＤＮＡ切断が引き起こされた部位で生じた。さらに、すべてのこれらの標的指向挿入イベントは、二本鎖ＤＮＡ切断に隣接する与えられた配列相同性の間の正確な組換えイベントであるように見えた。これらのイベントの約半分のみが、二本鎖ＤＮＡ切断が引き起こされた部位とは異なる部位に、さらに追加の外来性ＤＮＡ挿入を持っていた。
ｂ）あらかじめ選択された一組の規則によって設計されたＩ−ＳｃｅＩなどの、レア切断エンドヌクレアーゼ用の合成コード領域を含むキメラ遺伝子によってコードされたＩ−ＳｃｅＩなどの、レア切断をする二重鎖切断誘導エンドヌクレアーゼの一時的発現による二本鎖ＤＮＡ切断の誘導が、結果として生じる標的指向ＤＮＡ挿入イベントの質（すなわち完全に標的指向ＤＮＡ挿入イベントである頻度を）を驚くほど高めた。更に、エンドヌクレアーゼは核移行シグナルを備えていた。
ｃ）アセトシリンゴンなどの植物フェノール化合物中で標的細胞をプレインキュベーションすることにより、さらに、植物細胞のゲノムに誘導された二本鎖ＤＮＡ切断における標的指向挿入の頻度が増加した。
本発明は次の発見に基づく：
ａ） 植物細胞中への、直接のＤＮＡ移入、特にマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより挿入される外来性ＤＮＡの導入が、標的指向挿入イベントの頻度を予想外に増加させた。すべての得られた挿入イベントが標的指向ＤＮＡ挿入イベントであって、二本鎖ＤＮＡ切断が引き起こされた部位で生じた。さらに、すべてのこれらの標的指向挿入イベントは、二本鎖ＤＮＡ切断に隣接する与えられた配列相同性の間の正確な組換えイベントであるように見えた。これらのイベントの約半分のみが、二本鎖ＤＮＡ切断が引き起こされた部位とは異なる部位に、さらに追加の外来性ＤＮＡ挿入を持っていた。
ｂ）あらかじめ選択された一組の規則によって設計されたＩ−ＳｃｅＩなどの、レア切断エンドヌクレアーゼ用の合成コード領域を含むキメラ遺伝子によってコードされたＩ−ＳｃｅＩなどの、レア切断をする二重鎖切断誘導エンドヌクレアーゼの一時的発現による二本鎖ＤＮＡ切断の誘導が、結果として生じる標的指向ＤＮＡ挿入イベントの質（すなわち完全に標的指向ＤＮＡ挿入イベントである頻度を）を驚くほど高めた。更に、エンドヌクレアーゼは核移行シグナルを備えていた。
ｃ）アセトシリンゴンなどの植物フェノール化合物中で標的細胞をプレインキュベーションすることにより、さらに、植物細胞のゲノムに誘導された二本鎖ＤＮＡ切断における標的指向挿入の頻度が増加した。
上記の発見のいずれも、単独でまたは組合せて、相同組換えに基づいた標的指向挿入イベントが得られる頻度、ならびに回収されるイベントの質を改善する。
このようにして、ある局面では本発明は、対象の外来性ＤＮＡを植物細胞のゲノムのあらかじめ選ばれた部位へ導入する方法であって
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程；
を含み、外来性ＤＮＡが直接ＤＮＡ移入により送達されることを特徴とする方法に関する。
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程；
を含み、外来性ＤＮＡが直接ＤＮＡ移入により送達されることを特徴とする方法に関する。
本明細書に用いられる「直接ＤＮＡ移入」とは、植物細胞へＤＮＡを導入することができる自然のAgrobacterium種の使用を含まない、植物細胞へのＤＮＡ導入の任意の方法である。これには、ＤＮＡのエレクトロポレーションによるプロトプラスト中への導入、ＤＮＡのエレクトロポレーションによるインタクトな植物細胞中への、または部分的に分解された組織または植物細胞への導入、ＤＮＡのＰＥＧその他などの薬剤の作用によるプロトプラストへの導入、および特にＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイル撃ち込みなどの、従来技術において周知の方法が含まれる。ＤＮＡの直接移入による植物細胞への導入は、Agrobacteriumが媒介するＤＮＡ導入とは、少なくとも二本鎖ＤＮＡが植物細胞に入るという点で、入るＤＮＡはいかなるタンパク質によってもコートされていないという点で、また植物細胞に入るＤＮＡの量が相当に、より大きい可能性があるという点で異なる。さらに、二本鎖ＤＮＡ切断誘導エンドヌクレアーゼをコードする導入されたキメラ遺伝子などの、直接移入法によって導入されたＤＮＡは、転写により適していて、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導するタイミングがより良くなる可能性がある。本発明を特定の作用機序に制限するつもりはないが、効率的な相同性組換えに基づいた修復ＤＮＡまたは外来性ＤＮＡの植物細胞のゲノムへの挿入は、これらのパラメーターのうちのいずれかの組合せによるものと考えられる。
都合よく、二本鎖ＤＮＡ切断は、あらかじめ選ばれた部位で、レア切断を起こす二重鎖ＤＮＡ切断導入酵素をコードする植物で発現可能な遺伝子の導入の後の一時的発現により引き起こすことができる。この文書の他の場所で述べるように、Ｉ−ＳｃｅＩを、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位に外来性ＤＮＡを導入する目的で用いてもよい。しかし、他の二重鎖切断導入酵素もまた、外来性ＤＮＡをそれぞれの認識部位に挿入するために用いることができることは、当業者には直ちに明らかであろう。レア切断を起こすＤＳＢ誘導酵素およびそれぞれの認識部位のリストがＷＯ ０３／００４６５９（１７〜２０ページ）（参照により本明細書に組み入れられる）の表Ｉに、提供されている。更に、選択した原則として任意の標的ヌクレオチド配列を認識する特別仕立てのレア切断を起こすエンドヌクレアーゼを設計するための方法を利用することができる。そのような方法については、例えばＷＯ ０３／０８０８０９、WO９４／１８３１３またはＷ０９５／０９２３３に、およびIsalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19，656-660; Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530に記載されている。
したがって、本明細書で用いられる「あらかじめ選択された部位」とは、その座位に外来性ＤＮＡを挿入することが望まれる、植物の核ゲノム中の特定のヌクレオチド配列を表す。当業者は完全に、選択された標的ヌクレオチド配列を認識する二本鎖ＤＮＡ切断誘導（「ＤＳＢＩ」）酵素を選ぶことができるか、またはそのようなＤＳＢＩエンドヌクレアーゼをエンジニアリングすることができるであろう。あるいは、任意の従来の形質転換法を用いて、またはゲノムにＤＳＢＩエンドヌクレアーゼ認識部位を有する植物系統を用いた従来の品種改良によって、植物ゲノムへＤＳＢＩエンドヌクレアーゼ認識部位を導入してもよく、また任意の所望の外来性ＤＮＡを後で、以前に導入されたあらかじめ選択された標的部位に導入してもよい。
二重鎖切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域に作動可能に連結された植物発現可能プロモーター領域を含む植物発現可能なキメラ遺伝子を一過性に導入することにより、都合よく二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことができる。二重鎖切断誘導酵素をコードするＤＮＡ領域は合成ＤＮＡ領域、例えば、コドンを本出願に別記するＩ−ＳｃｅＩコード領域の設計案に従って選択する合成ＤＮＡ領域など、でもよい、しかしそれに限られない。
二重鎖切断誘導酵素は、核移行シグナル（ＮＬＳ）[Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) およびその中の参照文献]、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳ[Kalderon et al., Cell 39: 499-509 (1984)]など、を含んでもよい（しかし含む必要はない）。核移行シグナルはタンパク質の任意の場所に位置してよいが、タンパク質のＮ末端に置くのが好都合である。核移行シグナルが、二重鎖切断誘導酵素のアミノ酸の１つ以上と置き換わってもよい。
本明細書で用いる「対象の外来性ＤＮＡ」とは、あらかじめ選択された部位への導入が望まれる任意のＤＮＡ断片を表す。厳密に必要とするわけではないが、対象の外来性ＤＮＡは、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域に対して相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列領域と隣接してもよい。対象の外来性ＤＮＡは、あらかじめ選択された部位に隣接する両方のＤＮＡ領域に相同性を有するＤＮＡ領域により部位の両側を挟まれてもよい。したがって、植物細胞へ導入される修復ＤＮＡ分子は、それぞれあらかじめ選択された部位の上流にまたは下流のＤＮＡ領域に対して相同性を有する１つまたは２つのフランキング配列によって隣接された外来性ＤＮＡを含んでもよい。これによって、外来性ＤＮＡの挿入をよりよく制御することが可能になる。確かに、相同組換えによる組込みが、外来性ＤＮＡ断片を植物の核ゲノムへヌクレオチドレベルまで正確に接続することを可能にすることになる。
隣接するヌクレオチド配列は、種々な長さでよいが、長さで少なくとも約１０個のヌクレオチドでなければならい。しかしながら、フランキング領域は実際に可能な程度まで（例えば、完全なバクテリア人工染色体（ＢＡＣｓ）のように約１００〜１５０ｋｂまで）長くてもよい。好ましくは、フランキング領域は約５０ｂｐ〜約２０００ｂｐになるであろう。さらに、対象の外来性ＤＮＡに隣接する領域は、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域と同一である必要はない。そして、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域に、約８０％〜約１００％の配列同一性を、好ましくは約９５％〜約１００％の配列同一性を有していればよい。フランキング領域が長いほど、相同性の要求は、より厳格でない。さらに配列同一性は、外来性ＤＮＡの正確な挿入の位置の近くにおいて実際に可能な限度まで高いことが好ましい。
さらに、対象の外来性ＤＮＡに隣接する領域は、あらかじめ選択された部位に直接隣接する領域に対して相同性を有する必要はなく、あらかじめ選択された部位からさらに遠い核ゲノムのＤＮＡ領域へ相同性があればよい。外来性ＤＮＡの挿入によって次に、あらかじめ選択された挿入部位と相同ＤＮＡ領域の間の標的ＤＮＡが除去される結果になるであろう。言いかえれば、相同性領域間に位置した標的ＤＮＡは、対象の外来性ＤＮＡに置換されることになる。
本発明の目的のためには、パーセンテージで表した２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」とは、２つの最も良くアラインメントされた配列の、同一の残基を有する位置の数（×１００）を比較した位置数で割ったものを指す。ギャップ、即ち残基が１つの配列中にはあり他方にはないアラインメント中の位置は、同一でない残基の位置と見なす。２つの配列のアラインメントは、ニードルマンとブンシュのアルゴリズム（Needleman and Wunsch 1970）によって、行なう。コンピューター支援配列アラインメントを Wisconsin Package 第10.1版（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA）の一部であるＧＡＰなどの標準ソフトウェアプログラムを用い、ギャップ生成ペナルティーを５０、およびギャップ伸展ペナルティーを３とするデフォルトの得点マトリックスを用いて、便利に行なうことができる。
別の局面では、本発明が、修飾されたＩ−ＳｃｅＩをコードするＤＮＡ断片、およびそれの、対象の外来性ＤＮＡを効率的に植物細胞ゲノムのあらかじめ選択された部位へ導入するための使用、に関する。この場合、修飾されたＩ−ＳｃｅＩをコードするＤＮＡ断片は、次の基準を満たすように設計されたヌクレオチド配列を有する：
ａ） ヌクレオチド配列が、配列番号１で与えられるアミノ酸配列を有するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼなどの、機能的なＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする；
ｂ）ヌクレオチド配列が、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有する；
ｃ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｄ）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｅ）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｆ）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まない；
ｇ）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まない；および
ｈ）ヌクレオチド配列が、位置２および３にＴＡまたはＣＧという二連コードを含むＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａｌａをコードするコドン、を含まない（即ち、ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない）。
ａ） ヌクレオチド配列が、配列番号１で与えられるアミノ酸配列を有するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼなどの、機能的なＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする；
ｂ）ヌクレオチド配列が、約５０％〜約６０％のＧＣ含量を有する；
ｃ）ヌクレオチド配列が、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｄ）ヌクレオチドが、ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｅ）ヌクレオチド配列が、ＡＴＴＴＡ、ＡＡＧＧＴ、ＡＧＧＴＡ、ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｆ）ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まない；
ｇ）ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まない；および
ｈ）ヌクレオチド配列が、位置２および３にＴＡまたはＣＧという二連コードを含むＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａｌａをコードするコドン、を含まない（即ち、ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない）。
Ｉ−ＳｃｅＩは、Saccharomyces cerevisea のミトコンドリア中のイントロン移動の原因となっている部位特異的なエンドヌクレアーゼである。酵素は、２１Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のオプショナルイントロンＳｃＬＳＵ．１によってコードされ、イントロン挿入部位で二本鎖ＤＮＡ切断を開始し、３’ＯＨ張出しを有する４ｂｐの互い違いの切断を生成する。Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの認識部位は、１８ｂｐの非対称配列上に伸展している（Colleaux et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:: 6022-6026）。Ｉ−ＳｃｅＩのアミノ酸配列およびミトコンドリアのＩ−ＳｃｅＩ遺伝子のユニバーサルコード等価物が、例えばＷＯ ９６／１４４０８によって提供されている。
ＷＯ９６／１４４０８は、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質の次の変異体がまだ機能的であることを開示している：
●位置１〜１０を欠失させることができる。
●位置３６：Ｇｌｙ（Ｇ）を許容する。
●位置４０：Ｍｅｔ（Ｍ）またはＶａｌ（Ｖ）を許容する。
●位置４１：Ｓｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）を許容する。
●位置４３：Ａｌａ（Ａ）を許容する。
●位置４６：Ｖａｌ（Ｖ）またはＮ（Ａｓｎ）を許容する。
●位置９１：Ａｌａ（Ａ）を許容する。
●位置１２３および１５６：Ｌｅｕ（Ｌ）を許容する。
●位置２２３：Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）を許容する。
また、そのような変異体Ｉ−ＳｃｅＩ酵素をコードする合成ヌクレオチド配列を本発明に従って設計し用いることができる。
●位置１〜１０を欠失させることができる。
●位置３６：Ｇｌｙ（Ｇ）を許容する。
●位置４０：Ｍｅｔ（Ｍ）またはＶａｌ（Ｖ）を許容する。
●位置４１：Ｓｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）を許容する。
●位置４３：Ａｌａ（Ａ）を許容する。
●位置４６：Ｖａｌ（Ｖ）またはＮ（Ａｓｎ）を許容する。
●位置９１：Ａｌａ（Ａ）を許容する。
●位置１２３および１５６：Ｌｅｕ（Ｌ）を許容する。
●位置２２３：Ａｌａ（Ａ）およびＳｅｒ（Ｓ）を許容する。
また、そのような変異体Ｉ−ＳｃｅＩ酵素をコードする合成ヌクレオチド配列を本発明に従って設計し用いることができる。
アミノ末端に位置する４つのアミノ酸が核移行シグナルによって置換されたＩ−ＳｃｅＩのアミノ酸配列（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列は、したがって、Ｒ１〜Ｒ２４４で表わすことのできる２４４のトリヌクレオチドから成る。これらの各位置に対して、同一のアミノ酸をコードするトリヌクレオチドの１〜６の可能な選択枝を選ぶことができる。表１は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするトリヌクレオチドに対して可能な選択枝を記載し、また上に述べた「禁制ヌクレオチド配列」が合成ＤＮＡ配列へ取り込まれるのを回避することを可能にする、構造上の必要条件（条件付きの、または絶対的な）を提供する。さらに、ＵＩＰＡＣコードによる隣接するトリヌクレオチドのヌクレオチド配列を提供する。
本明細書で用いられるＵＩＰＡＣコードの記号は、それらの通常の意味を有している、即ち：Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ（Ａではない）；Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ（Ｔではない）；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ（Ｃではない）；Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ（Ｇではない）；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｓ＝ＧまたはＣ；Ｗ＝ＡまたはＴ。
したがって本発明の実施態様の１つでは、配列番号２に記載されているヌクレオチド配列を含む単離された合成ＤＮＡ断片を提供する。この場合、コドンを、与えられた選択枝の中から約５０％〜約６０％の、好ましくは約５４％〜５５％の全ＧＣ含量を有するヌクレオチド配列を得るように選ぶ。ただし以下を条件とする：位置２８〜位置３０のヌクレオチド配列がＡＡＧでなく；もし位置３４〜位置３６のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置３７〜位置３９のヌクレオチド配列がＡＴＴまたはＡＴＡでなく；もし位置３４〜位置３６のヌクレオチド配列がＡＡＣである場合は、位置３７〜位置３９のヌクレオチド配列がＡＴＴでなく、同時に位置４０〜位置４２のヌクレオチド配列がＡＡＡであり；もし位置３４〜位置３６のヌクレオチド配列がＡＡＣである場合は、位置３７〜位置３９のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置３７〜位置３９のヌクレオチド配列がＡＴＴまたはＡＴＡである場合は、位置４０〜位置４２のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；位置４９〜位置５１のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；位置５２〜位置５４のヌクレオチド配列がＧＴＡでなく；位置５８〜位置６３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６７〜位置６９のヌクレオチド配列がＣＣＣである場合は、位置７０〜位置７２のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置７６〜位置７８のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置７９〜位置８１のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく、同時に位置８２〜位置８４のヌクレオチド配列がＣＴＮであり；もし位置７９〜位置８１のヌクレオチド配列がＴＴＡまたはＣＴＡである場合は、位置８２〜位置８４のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；位置８８〜位置９０のヌクレオチド配列がＧＡＡではなく；もし位置９１〜位置９３のヌクレオチド配列がＴＡＴである場合は、位置９４〜位置９６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置９７〜位置９９のヌクレオチド配列がＴＣＣまたはＴＣＧまたはＡＧＣである場合は、位置１００〜位置１０２のヌクレオチド配列がＣＣＡでなく、同時に位置１０３〜位置１０５のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；もし位置１００〜位置１０２のヌクレオチド配列がＣＡＡである場合は、位置１０３〜位置１０５のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；もし位置１０９〜位置１１１のヌクレオチド配列がＧＡＡである場合は、位置１１２〜位置１１４のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；もし位置１１５〜位置１１７のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置１１８〜位置１２０のヌクレオチド配列がＡＴＴまたはＡＴＡでなく；位置１２１〜１２３のヌクレオチド配列がＧＡＧである場合、位置１２４〜位置１２６のヌクレオチド配列は；位置１３３〜１３５のヌクレオチド配列がＧＣＡでなく；位置１３９〜位置１４１のヌクレオチド配列がＡＴＴでなく；もし位置１４２〜位置１４４のヌクレオチド配列がＧＧＡである場合は、位置１４５〜位置１４７のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；もし位置１４５〜位置１４７のヌクレオチド配列がＴＴＡである場合は、位置１４８〜位置１５０のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく、同時に位置１５１〜位置１５３のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；もし位置１４５〜位置１４７のヌクレオチド配列がＣＴＡである場合は、位置１４８〜位置１５０のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく、同時に位置１５１〜位置１５３のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；もし位置１４８〜位置１５０のヌクレオチド配列がＡＴＡである場合は、位置１５１〜位置１５３のヌクレオチド配列がＣＴＡまたはＴＴＧでなく；もし位置１６０〜位置１６２のヌクレオチド配列がＧＣＡである場合は、位置１６３〜位置１６５のヌクレオチド配列がＴＡＣでなく；もし位置１６３〜位置１６５のヌクレオチド配列がＴＡＴである場合は、位置１６６〜位置１６８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく、同時に位置１６９〜位置１７１のヌクレオチド配列がＡＧＲであり；位置１７２〜位置１７７のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＧＣＡＧＧを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置１７８〜位置１８６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＧＧＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置１９３〜位置１９５のヌクレオチド配列がＴＡＴである場合は、位置１９６〜位置１９８のヌクレオチド配列がＴＧＣでなく；位置２０２〜位置２０４のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；位置２１７〜位置２１９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置２２０〜位置２２２のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置２２３〜位置２２５のヌクレオチド配列がＧＣＡでなく；もし位置２２３〜位置２２５のヌクレオチド配列がＧＣＡである場合は、位置２２６〜位置２２８のヌクレオチド配列がＴＡＣでなく；もし位置２５３〜位置２５５のヌクレオチド配列がＧＡＣである場合は、位置２５６〜位置２５８のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；もし位置２７７〜位置２７９のヌクレオチド配列がＣＡＴである場合は、位置２８０〜位置２８２のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；位置２９８〜位置３０３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置３０４〜位置３０６のヌクレオチド配列がＧＧＣである場合は、位置３０７〜位置３０９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置３０７〜位置３１２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置３３４〜位置３４２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置３４０〜位置３４２のヌクレオチド配列がＡＡＧである場合は、位置３４３〜位置３４５のヌクレオチド配列がＣＡＴでなく；もし位置３４６〜位置３４８のヌクレオチド配列がＣＡＡである場合は、位置３４９〜位置３５１のヌクレオチド配列がＧＣＡでなく；位置３４９〜位置３５７のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置３５５〜位置３５７のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；
もし位置３５８〜位置３６０のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置３６１〜位置３６３のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；もし位置３６４〜位置３６６のヌクレオチド配列がＧＣＣである場合は、位置３６７〜位置３６９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置３６７〜位置３７８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置３８２〜位置３８４のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置３８５〜位置３８７のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置３８５〜位置３８７のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４００〜位置４０２のヌクレオチド配列がＣＣＣである場合は、位置４０３〜位置４０５のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４０３〜位置４０５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置４０６〜位置４０８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置４０６〜位置４１１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４２１〜位置４２６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４３０〜位置４３２のヌクレオチド配列がＣＣＡでなく；もし位置４３６〜位置４３８のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４３９〜位置４４１のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；位置４４５〜位置４４７のヌクレオチド配列がＴＡＴでなく；位置４８１〜４８３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４８４〜位置４８６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置４８７〜位置４８９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく、同時に位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＡＧＹであり；もし位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４９３〜位置４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣでなく、同時に位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＹであり；もし位置４９３〜位置４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣである場合は、位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４９９〜位置５０１のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置５０２〜位置５０４のヌクレオチド配列がＴＣＡまたはＡＧＣでなく；もし位置５０８〜位置５１０のヌクレオチド配列がＧＴＡである場合は、位置５１１〜位置５１３のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；もし位置５１４〜位置５１６のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＡでなく；もし位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＣまたはＡＣＧである場合は、位置５２０〜位置５２２のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５２３〜位置５２５のヌクレオチド配列がＴＣＮであり；位置５２３〜位置５３１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置５４４〜位置５４６のヌクレオチド配列がＧＡＡである場合は、位置５４７〜位置５４９のヌクレオチド配列がＴＡＴでなく、同時に位置５５０〜位置５５２のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；位置５４７〜位置５５２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置５５９〜位置５６１のヌクレオチド配列がＧＧＡである場合は、位置５６２〜位置５６４のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく、同時に位置５６５〜位置５６７のヌクレオチド配列がＣＧＮであり；もし位置５６５〜位置５６７のヌクレオチド配列がＣＧＣである場合は、位置５６８〜位置５７０のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置５６８〜位置５７０のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置５７４〜位置５７６のヌクレオチド配列がＴＴＣである場合は、位置５７７〜位置５７９のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５８０〜位置５８２のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；もし位置５７７〜位置５７９のヌクレオチド配列がＣＡＡである場合は、位置５８０〜位置５８２のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；
もし位置５８３〜位置５８５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置５８６〜位置５８８のヌクレオチド配列がＴＧＣでなく；位置５９５〜位置５９７のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置５９８〜位置６００のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６０１〜位置６０３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置５９８〜位置６００のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；位置６０１〜位置６０３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置６０４〜位置６０６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置６０７〜位置６０９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置６０７〜位置６０９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置６１３〜位置６１５のヌクレオチド配列がＣＣＡでなく；もし位置６１３〜位置６１５のヌクレオチド配列がＣＣＧである場合は、位置６１６〜位置６１８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６１６〜位置６１８のヌクレオチド配列がＡＴＡである場合は、位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＡである場合は、位置６２２〜位置６２４のヌクレオチド配列がＴＡＣでなく；位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＴでなく；位置６４０〜位置６４５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６４３〜位置６４５のヌクレオチド配列がＴＴＡである場合は、位置６４６〜位置６４８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６４３〜位置６４５のヌクレオチド配列がＣＴＡである場合は、位置６４６〜位置６４８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；位置６５５〜位置６６０のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６５８〜位置６６０のヌクレオチド配列がＴＴＡまたはＣＴＡである場合は、位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴまたはＡＴＣでなく；位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６６４〜位置６６６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；位置６７０〜位置６７５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６９１〜位置６９３のヌクレオチド配列がＴＡＴである場合は、位置６９４〜位置６９６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置６９４〜位置６９６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置６９７〜位置６９９のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；もし位置７００〜位置７０２のヌクレオチド配列がＣＣＣである場合は、位置７０３〜位置７０５のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置７０３〜位置７０５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置７０６〜位置７０８のヌクレオチド配列がＡＣＡまたはＡＣＴでなく；もし位置７０６〜位置７０８のヌクレオチド配列がＡＣＡである場合は、位置７０９〜位置７１１のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく、同時に位置７１２〜位置７１４のヌクレオチド配列がＡＧＹであり；ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧ、およびＧＣＧを含まず；前記ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；および前記ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まない。
もし位置３５８〜位置３６０のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置３６１〜位置３６３のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；もし位置３６４〜位置３６６のヌクレオチド配列がＧＣＣである場合は、位置３６７〜位置３６９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置３６７〜位置３７８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置３８２〜位置３８４のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置３８５〜位置３８７のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置３８５〜位置３８７のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４００〜位置４０２のヌクレオチド配列がＣＣＣである場合は、位置４０３〜位置４０５のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４０３〜位置４０５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置４０６〜位置４０８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置４０６〜位置４１１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４２１〜位置４２６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４３０〜位置４３２のヌクレオチド配列がＣＣＡでなく；もし位置４３６〜位置４３８のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４３９〜位置４４１のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；位置４４５〜位置４４７のヌクレオチド配列がＴＡＴでなく；位置４８１〜４８３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４８４〜位置４８６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置４８７〜位置４８９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく、同時に位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＡＧＹであり；もし位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４９３〜位置４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣでなく、同時に位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＹであり；もし位置４９３〜位置４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣである場合は、位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置４９６〜位置４９８のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置４９９〜位置５０１のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置５０２〜位置５０４のヌクレオチド配列がＴＣＡまたはＡＧＣでなく；もし位置５０８〜位置５１０のヌクレオチド配列がＧＴＡである場合は、位置５１１〜位置５１３のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；もし位置５１４〜位置５１６のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＡでなく；もし位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＣまたはＡＣＧである場合は、位置５２０〜位置５２２のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５２３〜位置５２５のヌクレオチド配列がＴＣＮであり；位置５２３〜位置５３１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置５４４〜位置５４６のヌクレオチド配列がＧＡＡである場合は、位置５４７〜位置５４９のヌクレオチド配列がＴＡＴでなく、同時に位置５５０〜位置５５２のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；位置５４７〜位置５５２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置５５９〜位置５６１のヌクレオチド配列がＧＧＡである場合は、位置５６２〜位置５６４のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく、同時に位置５６５〜位置５６７のヌクレオチド配列がＣＧＮであり；もし位置５６５〜位置５６７のヌクレオチド配列がＣＧＣである場合は、位置５６８〜位置５７０のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置５６８〜位置５７０のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置５７４〜位置５７６のヌクレオチド配列がＴＴＣである場合は、位置５７７〜位置５７９のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５８０〜位置５８２のヌクレオチド配列がＴＴＲであり；もし位置５７７〜位置５７９のヌクレオチド配列がＣＡＡである場合は、位置５８０〜位置５８２のヌクレオチド配列がＴＴＡでなく；
もし位置５８３〜位置５８５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置５８６〜位置５８８のヌクレオチド配列がＴＧＣでなく；位置５９５〜位置５９７のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置５９８〜位置６００のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６０１〜位置６０３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置５９８〜位置６００のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；位置６０１〜位置６０３のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置６０４〜位置６０６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置６０７〜位置６０９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置６０７〜位置６０９のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；位置６１３〜位置６１５のヌクレオチド配列がＣＣＡでなく；もし位置６１３〜位置６１５のヌクレオチド配列がＣＣＧである場合は、位置６１６〜位置６１８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６１６〜位置６１８のヌクレオチド配列がＡＴＡである場合は、位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＡである場合は、位置６２２〜位置６２４のヌクレオチド配列がＴＡＣでなく；位置６１９〜位置６２１のヌクレオチド配列がＡＴＴでなく；位置６４０〜位置６４５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６４３〜位置６４５のヌクレオチド配列がＴＴＡである場合は、位置６４６〜位置６４８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６４３〜位置６４５のヌクレオチド配列がＣＴＡである場合は、位置６４６〜位置６４８のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；位置６５５〜位置６６０のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６５８〜位置６６０のヌクレオチド配列がＴＴＡまたはＣＴＡである場合は、位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴまたはＡＴＣでなく；位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく；もし位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６６４〜位置６６６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；位置６７０〜位置６７５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果のヌクレオチド配列がＡＴＴＴＡを含まないようになる選択に従って選ばれ；もし位置６９１〜位置６９３のヌクレオチド配列がＴＡＴである場合は、位置６９４〜位置６９６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置６９４〜位置６９６のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置６９７〜位置６９９のヌクレオチド配列がＴＴＧでなく；もし位置７００〜位置７０２のヌクレオチド配列がＣＣＣである場合は、位置７０３〜位置７０５のヌクレオチド配列がＡＡＴでなく；もし位置７０３〜位置７０５のヌクレオチド配列がＡＡＴである場合は、位置７０６〜位置７０８のヌクレオチド配列がＡＣＡまたはＡＣＴでなく；もし位置７０６〜位置７０８のヌクレオチド配列がＡＣＡである場合は、位置７０９〜位置７１１のヌクレオチド配列がＡＴＡでなく、同時に位置７１２〜位置７１４のヌクレオチド配列がＡＧＹであり；ヌクレオチド配列がコドンＴＴＡ、ＣＴＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＴＣＧ、ＣＣＧ、ＡＣＧ、およびＧＣＧを含まず；前記ヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群より選択される連続する７個のヌクレオチドから成るＧＣストレッチを含まず；および前記ヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群より選択される連続する５個のヌクレオチドから成るＡＴストレッチを含まない。
合成ヌクレオチド配列の好ましい群を表２に記載する。そのヌクレオチド配列は配列番号３に記載されているヌクレオチド配列を含むように与えられる単離した合成ＤＮＡ断片に対応する。この場合、コドンは、約５０％〜約６０％の、好ましくは約５４％〜５５％の全体ＧＣ含量を有するヌクレオチド配列を得る、かつ以下の条件を満たす選択肢の中から選択される：もし位置１２１〜位置１２３のヌクレオチド配列がＧＡＧである場合は、位置１２４〜１２６のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；もし位置２５３〜位置２５５のヌクレオチド配列がＧＡＣである場合は、位置２５６〜２５８のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；もし位置２７７〜位置２７９のヌクレオチド配列がＣＡＴである場合は、位置２８０〜２８２のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；もし位置３４０〜位置３４２のヌクレオチド配列がＡＡＧである場合は、位置３４３〜３４５のヌクレオチド配列がＣＡＴでなく；もし位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４９３〜４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣでなく；もし位置４９９〜位置５０１のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置５０２〜５０４のヌクレオチド配列がＴＣＡまたはＡＧＣでなく；位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＣである場合は、位置５２０〜５２２のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５２３〜５２５のヌクレオチド配列がＴＣＮであり；もし位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６６４〜６６６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；位置７〜位置１５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置６１〜位置６９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置１３０〜位置１３８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置２６８〜位置２７９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置３２２〜位置３３３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４６０〜位置４６８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置１３〜位置２７のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置３７〜位置４８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置１８４〜位置１９２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置２１４〜位置２１９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置２７７〜位置２８５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置３８８〜位置３９６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４６６〜位置４７４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置４８４〜位置４８９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置５７１〜位置５７６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置５９８〜位置６０３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置６０４〜位置６０９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置６１３〜位置６２１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置６４６〜位置６５１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；位置６６１〜位置６６６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；および位置７０６〜位置７１４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選択される。
配列番号４のヌクレオチド配列は、もはや回避するべきヌクレオチド配列またはコドンのどれも含んでいないＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする合成ヌクレオチド配列の例である。しかしながら、当業者が、選択されるヌクレオチドの１つ以上を（２〜２０を）配列番号３のヌクレオチド配列の中で提供される選択肢のいずれかに置換（前の段落に記述した禁止組合せのいずれも除外して）することにより、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする同様の配列を容易に得ることができ、かつ使用して同様の効果を得ることができることは明らかであろう。
植物細胞中の発現のために、Ｉ−ＳｃｅＩをコードする合成ＤＮＡ断片を、植物で発現できるキメラ遺伝子を得るために、植物発現可能なプロモーターに作動可能に連結させてもよい。
当業者は、本発明のこの局面については、修復ＤＮＡおよび／または、ＤＳＢＩエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを直接のＤＮＡ移入法によって植物細胞へ導入することは必要でなく、従来技術において利用可能なAgrobacteriumを媒介とする形質転換法によって、ＤＮＡを植物細胞へこのように導入できることを直ちに認識するであろう。
さらに別の局面では本発明は、対象の外来性ＤＮＡを植物細胞のゲノムのあらかじめ選択された部位へ導入する方法であって、
（ａ）二重鎖切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、工程（ａ）に先立って植物細胞を植物フェノール化合物中でインキュベーションすることを特徴とする方法に関する。
（ａ）二重鎖切断を細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞へ導入する工程；
を含み、工程（ａ）に先立って植物細胞を植物フェノール化合物中でインキュベーションすることを特徴とする方法に関する。
本発明に好適な「植物フェノール化合物」あるいは、「植物フェノール類」とは、正の走化性応答を引き起こすことができる置換フェノール分子、特にＴｉプラスミドを含むAgrobacterium種中で、特にＴｉプラスミドを含むAgrobacterium tumefaciens中で、ｖｉｒ遺伝子発現の増加を引き起こすことのできる分子である。植物フェノール化合物への走化性応答を測定する方法については、Ashby et al. (1988 J. Bacteriol. 170: 4181-4187）に記述されており、またｖｉｒ遺伝子発現の誘導を測定する方法も周知である（Stachel et al., 1985 Nature 318: 624-629; Bolton et al.1986 Science 232: 983-98）。好ましい植物フェノール化合物は植物細胞の創傷滲出液で見出されるものである。最もよく知られている植物フェノール化合物の１つがアセトシリンゴンであり、それは様々な植物の多数の傷ついた細胞または完全な細胞に、様々な濃度とはいえ、存在する。しかしながら、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシアセトフェノン）が、ｖｉｒ遺伝子の発現を引き起こすことができるただ一つの植物フェノールではない。他の例は、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリング酸（４−ヒドロキシ−３，５ジメトキシ安息香酸）、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸酸（４−ヒドロキシ安息香酸酸）、β−レソルシル酸（２，４ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロ没食子酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）である。本明細書で用いられ、言及された分子を植物フェノール化合物と呼ぶ。植物フェノール化合物を、植物栽培培地に単独でまたは他の植物フェノール化合物と組み合わせて加えることができる。本発明を特定の作用機序に制限する意図はないが、これらの植物フェノール類の細胞分裂に対する（したがってゲノム複製に対しても）明らかな促進効果は、外来性ＤＮＡの標的指向挿入を促進している可能性があると思われる。
植物細胞を、植物フェノール化合物中でまたはその上で、約１日または２日間インキュベーションすることで十分であろうと予想されるが、好ましくは約１週間植物フェノール化合物中でインキュベーションする。植物細胞を細胞分裂を促進するために十分な時間だけインキュベーションするべきである。Guivarc'h et al., (1993, Protoplasma 174: 10-18)によれば、植物細胞のほんの１０分間ほどのインキュベーションによって、既にそのような効力を得ることができる。
上述の相同組換えに基づく標的指向ＤＮＡ挿入のための改善された方法は、直接ＤＮＡ移入法により、特にマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより得られる遺伝子組換え植物細胞および植物の、質を改善するためにも適用できる。マイクロプロジェクタイル撃ち込みによるＤＮＡの導入により、しばしば導入されるＤＮＡの複雑な組込みパターン（完全なまたは部分的な対象外来性ＤＮＡの複数のコピーの組込み、繰り返し構造の生成）がもたらされることは、従来技術において周知である。それにもかかわらず、いくつかの植物の遺伝子型または変種は、マイクロプロジェクタイル撃ち込みを用いる形質転換の方が、例えば Agrobacterium tumefaciens を使用する形質転換よりも、適している可能性がある。マイクロプロジェクタイル撃ち込みを通じて得られる遺伝子組換え植物細胞または植物の、質を改善することができれば、即ち外来性ＤＮＡ組込みのパターンがより単純になるような影響を受ければ、有利であろう。
上に述べた発見、即ち核ゲノム中に誘導された二本鎖ＤＮＡ切断の存在下でマイクロプロジェクタイル撃ち込みにより外来性ＤＮＡを導入し、その際、外来性ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ切断に隣接する配列に対して相同性を有している場合は、しばしば（得られるイベントの約５０％が）単純な組込みパターン（予測可能な方式による単一コピーの挿入があり、外来性ＤＮＡの追加の断片の挿入がない）となる結果をもたらす、という発見は、植物細胞の核ゲノム中の外来性ＤＮＡの挿入の複雑さを単純化する方法の基礎を与える。
したがって、本発明はまた、次の工程を含むマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって遺伝子組換え植物を生成する方法に関する：
（ａ）本明細書に別記する方法または従来技術において利用可能な方法に従って、二本鎖ＤＮＡ切断を、植物細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡをマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物細胞へ導入する工程（ここで前記対象の外来性ＤＮＡは、植物ゲノム中のあらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域へ少なくとも８０％の配列同一性を有する２つのＤＮＡ領域に挟まれている）。
このように得られる遺伝子組換え植物の個体数の多くの部分が、植物細胞のゲノム中に外来性ＤＮＡの単純な組込みパターンを有し、より詳しくいえば、遺伝子組換え植物のかなりの部分は、１コピーの外来性ＤＮＡ挿入のみを、植物ゲノム中のあらかじめ選択された部位に隣接する２つのＤＮＡ領域の間に正確に有することになる。この部分は、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことなしに、および外来性ＤＮＡにあらかじめ選択された部位に隣接するゲノム領域との相同性を与えることなしに、単純なマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物が得られる場合における単純な組込みパターンを有する遺伝子組換え植物の個体数よりも高い。
（ａ）本明細書に別記する方法または従来技術において利用可能な方法に従って、二本鎖ＤＮＡ切断を、植物細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡをマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物細胞へ導入する工程（ここで前記対象の外来性ＤＮＡは、植物ゲノム中のあらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域へ少なくとも８０％の配列同一性を有する２つのＤＮＡ領域に挟まれている）。
このように得られる遺伝子組換え植物の個体数の多くの部分が、植物細胞のゲノム中に外来性ＤＮＡの単純な組込みパターンを有し、より詳しくいえば、遺伝子組換え植物のかなりの部分は、１コピーの外来性ＤＮＡ挿入のみを、植物ゲノム中のあらかじめ選択された部位に隣接する２つのＤＮＡ領域の間に正確に有することになる。この部分は、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことなしに、および外来性ＤＮＡにあらかじめ選択された部位に隣接するゲノム領域との相同性を与えることなしに、単純なマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物が得られる場合における単純な組込みパターンを有する遺伝子組換え植物の個体数よりも高い。
本発明の好都合の実施態様では、標的となる植物細胞が、そのゲノム中に、レア切断を起こす二本鎖ＤＮＡ切断誘起エンドヌクレアーゼの２つの認識部位が各側に１つずつ隣接するマーカー遺伝子を含む。このマーカーＤＮＡは、対象の植物細胞のゲノムに、形質転換の任意の方法を用いて導入してもよいし、または既に別の植物系統または変異種（形質転換が容易な植物系統または変異種など）の植物細胞のゲノムへ導入されていて、それを古典的育種技術により対象の植物細胞へ導入してもよい。好ましくは、レア切断を起こす二重鎖切断誘導エンドヌクレアーゼの２つの認識部位を両側面に有するマーカー遺伝子を含む遺伝子組換え植物または植物細胞の集団は、マ−カー遺伝子の発現パターン（高い発現、時間的または空間的に調節された発現など）についてすでに分析されており、望みの発現パターンを有する植物系統が同定されている。
（ａ）本明細書に別記する方法または従来技術において利用可能な方法に従って、植物細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡをマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物細胞へ導入する工程（ここで前記対象の外来性ＤＮＡは、植物ゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に隣接するＤＮＡ領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する２つのＤＮＡ領域に挟まれている）、
を含むマイクロプロジェクタイル撃ち込みによる遺伝子組換え植物の産生が、マーカー遺伝子が対象の外来性ＤＮＡによって置換された遺伝子組換え植物細胞および植物をもたらすことになる。
（ａ）本明細書に別記する方法または従来技術において利用可能な方法に従って、植物細胞のゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす工程；および
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡをマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって植物細胞へ導入する工程（ここで前記対象の外来性ＤＮＡは、植物ゲノム中のあらかじめ選ばれた部位に隣接するＤＮＡ領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する２つのＤＮＡ領域に挟まれている）、
を含むマイクロプロジェクタイル撃ち込みによる遺伝子組換え植物の産生が、マーカー遺伝子が対象の外来性ＤＮＡによって置換された遺伝子組換え植物細胞および植物をもたらすことになる。
マーカー遺伝子は、選択可能なまたはスクリーニング可能な植物で発現可能なマーカー遺伝子でよく、それには従来のキメラのマーカー遺伝子が好適である。キメラのマーカー遺伝子は、プロモーター、好ましくはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどの植物で発現可能な構成的プロモーター、またはルビスコの小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーターなどの光誘導可能なプロモーターの制御下にある、またはそのプロモーターの５’末端に動作可能なように連結され；またその３’末端で、適当な植物転写終了およびポリアデニル化シグナルに動作可能なように連結された、マーカーＤＮＡを含むことができる。マーカーＤＮＡは、植物の細胞中で発現された時、マーカーＤＮＡを発現していない細胞から容易にそのような細胞を分離することを可能にするＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードすることが好ましい。マーカーＤＮＡの選択は決定的に重要ではなく、周知の方式で任意の適当なマーカーＤＮＡを選択することができる。例えば、マーカーＤＮＡは、Ａ１遺伝子（Meyer et al., (1987), Nature 330:677）のように形質転換された植物細胞に識別可能な色彩を与えるタンパク質をコードすることができ、蛍光タンパク質［Chalfie et al., Science 263: 802-805 (1994); Crameri et al., Nature Biotechnology 14:315-319 (1996)]をコードすることができ、ホスフィノトリシンに対する耐性を与えるＰＡＴをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ ０２４２２４６）のように、形質転換された植物細胞へ除草剤耐性を与えるタンパク質をコードすることができ、またはゲンタマイシンに対する耐性を与えるＧＡＴをコードするａａｃ（６’）遺伝子（ＷＯ９４／０１５６０）のように、形質転換細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードすることができる。そのような選択可能なマーカー遺伝子は一般に、細胞には普通有毒な抗生物質または他の化合物に対する細胞耐性を与えるタンパク質をコードする。植物では、選択可能なマーカー遺伝子がこのように、さらに有効成分としてグルタミン合成酵素阻害剤（例えば、ホスフィノトリシン）を含む除草剤などの、除草剤に対する耐性を与えるタンパク質をコードしてもよい。そのような遺伝子の例は、ｓｆｒまたはｓｆｒｖ遺伝子（EP 242236; EP 242246; De Block et al., 1987 EMBO J． 6: 2513-2518）などの、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
導入された修復ＤＮＡはさらに、あらかじめ選ばれた部位での相同組換えによる組込みと、ゲノムの他の場所への組込みとを識別することを可能にするマーカー遺伝子を含んでもよい。そのようなマーカー遺伝子が従来技術において利用可能であり、それには、選択的な条件下でマーカー遺伝子の不存在を積極的に選択できるマーカー遺伝子（例えば、ｃｏｄＡ、５−フルオロシトシンに対する感受性を与える E. coli から得られるシトシンデアミナーゼ、Perera et al., 1993 Plant Mol. Biol. 23, 793; Stougaard (1993) Plant J: 755）が含まれる。修復ＤＮＡは、核ゲノム中へ修復ＤＮＡがランダムに組込まれると、マーカー遺伝子が存在する結果となり、一方で相同組換えによって修復ＤＮＡが組込まれると、マーカー遺伝子が存在しない結果となるような方式で、マーカー遺伝子を含む必要がある。
マーカー遺伝子中またはその近くに位置する二重鎖切断を引き起こすただ１つのあらかじめ選択された部位を用いて、同じ結果を得ることができることは直ちに明らかであろう。その場合、相同性のフランキング領域を、マーカー遺伝子を不活性化するかまたはマーカー遺伝子を欠失させて、挿入される外来性ＤＮＡによって置き換えるような方式で選択することが好ましい。
本発明の手段および方法は、特にトウモロコシに役立つが、他の植物に、特に小麦、オート麦、大麦、ライ麦、米、ターフグラス、ソルガム、アワ類またはサトウキビ植物を含む穀類植物に用いてもよく、同様の効果が得られることを認識することになろう。本発明の方法を、綿、タバコ、キャノーラ、アブラナ、ダイズ、蔬菜類、ジャガイモ、ウキクサ種、ハナタバコ種、アラビドプシス、アルファルファ、オオムギ、豆、トウモロコシ、綿、アマ、エンドウ、アブラナ、コメ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、小麦、アスパラガス、ビート、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ハツカダイコン、ホウレンソウ、セイヨウカボチャ、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、クロイチゴ、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キウイ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ピーナツ、セイヨウナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミ、およびスイカを含み、しかしこれらに限らない任意の植物にもまた、適用することができる。
本発明の方法に従ってあらかじめ選択された部位に挿入された外来性ＤＮＡ分子を含む植物細胞および植物を提供することもまた、本発明の目的である。標的指向ＤＮＡ挿入イベントを含む、従来の育種方法によって産生される植物の配偶子、種子、胚、接合子または体細胞である子孫またはハイブリッドもまた、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書に記述した方法によって得られた植物をさらに従来の育種技術によって他の植物と交配して、本発明により得られた標的指向ＤＮＡ挿入イベントを含む子孫植物を得ることができる。
次の制限されない実施例は、修飾されたＩ−ＳｃｅＩをコードするキメラ遺伝子の設計、および、その植物ゲノムのあらかじめ選択された部位に外来性ＤＮＡを挿入するための使用について記述する。
もし実施例において異なるように記述しない場合は、組換ＤＮＡ技術をすべて、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、および Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA の第1および第２巻に記載されている標準プロトコルにより実施する。植物の分子的研究の標準材料および方法は、R.D.D. CroyによるBIOS Scientific Publications Ltd (UK) および Blackwell Scientific Publications, UK の共同出版の Plant Molecular Biology Labfax (1993)に記述されている。標準的分子生物学技術のための他の参考文献には、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK) のの第Iおよび第II巻が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応の標準材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, および McPherson et al., (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany の中に見出すことができる。
明細書および実施例の全体にわたって、次の配列を参照する：
配列番号１：Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質に連結された核移行シグナルを含み、４個のアミノ末端のアミノ酸を欠くキメラＩ−ＳｃｅＩのアミノ酸配列。
配列番号２：Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列（ＵＩＰＡＣコード）。
配列番号３：合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列（ＵＩＰＡＣコード）。
配列番号４：合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列。
配列番号５：ｐＴＴＡＭ７８のＴ−ＤＮＡ（標的座位）のヌクレオチド配列。
配列番号６：ｐＴＴＡ８２のＴ−ＤＮＡ（修復ＤＮＡ）のヌクレオチド配列。
配列番号７：ｐＣＶ７８のヌクレオチド配列。
配列番号２：Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列（ＵＩＰＡＣコード）。
配列番号３：合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列（ＵＩＰＡＣコード）。
配列番号４：合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域のヌクレオチド配列。
配列番号５：ｐＴＴＡＭ７８のＴ−ＤＮＡ（標的座位）のヌクレオチド配列。
配列番号６：ｐＴＴＡ８２のＴ−ＤＮＡ（修復ＤＮＡ）のヌクレオチド配列。
配列番号７：ｐＣＶ７８のヌクレオチド配列。
Ｉ−ＳｃｅＩをコードする、植物で発現可能なキメラ遺伝子の設計、合成および解析
４個のアミノ末端アミノ酸が核移行シグナルで置換されたＩ−ＳｃｅＩのコード領域を、次のプロセスを用いて最適化した：
１．Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質のアミノ酸配列を変更せずに、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｇｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）を用いて、トウモロコシに対して最も好ましいコドン使用にコドンを変換するプロセス；
２．特異的な制限部位を作成または除去するために配列を調節して、合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域をユニバーサルコードのＩ−ＳｃｅＩ遺伝子で交換するプロセス；
３．前躯体ｍＲＮＡスプライシングに影響する可能性のあるＲＮＡの二次構造形成を回避するために、６ｂｐより長いＧＣストレッチおよび４ｂｐより長いＡＴストレッチをすべて除去するプロセス；
４．コドンの中の２と３の位置のＣＧおよびＴＡという二連コードを回避するプロセス；
５．他の調節要素、例えば未成熟のポリアデニル化シグナルの候補
隠れたイントロンスプライシング部位（ＡＡＧＧＴＡＡＧＴおよびＴＧＣＡＧＧ）、ＡＴＴＴＡ五量体、およびＣＣＡＡＴボックス配列（ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＣＧＡＡＴ、およびＡＴＴＣＧ）を回避するプロセス；
６．適合されたコード領域が上に述べた基準をすべて満たすかどうかを再確認するプロセス。
４個のアミノ末端アミノ酸が核移行シグナルで置換されたＩ−ＳｃｅＩのコード領域を、次のプロセスを用いて最適化した：
１．Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質のアミノ酸配列を変更せずに、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｇｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）を用いて、トウモロコシに対して最も好ましいコドン使用にコドンを変換するプロセス；
２．特異的な制限部位を作成または除去するために配列を調節して、合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域をユニバーサルコードのＩ−ＳｃｅＩ遺伝子で交換するプロセス；
３．前躯体ｍＲＮＡスプライシングに影響する可能性のあるＲＮＡの二次構造形成を回避するために、６ｂｐより長いＧＣストレッチおよび４ｂｐより長いＡＴストレッチをすべて除去するプロセス；
４．コドンの中の２と３の位置のＣＧおよびＴＡという二連コードを回避するプロセス；
５．他の調節要素、例えば未成熟のポリアデニル化シグナルの候補
隠れたイントロンスプライシング部位（ＡＡＧＧＴＡＡＧＴおよびＴＧＣＡＧＧ）、ＡＴＴＴＡ五量体、およびＣＣＡＡＴボックス配列（ＣＣＡＡＴ、ＡＴＴＧＧ、ＣＧＡＡＴ、およびＡＴＴＣＧ）を回避するプロセス；
６．適合されたコード領域が上に述べた基準をすべて満たすかどうかを再確認するプロセス。
そのようなヌクレオチド配列の可能な一例を、配列番号４に示す。配列番号４のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ断片を合成し、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓ３’終了およびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結させた（プラスミドｐＣＶ７８；配列番号７を生成した）。
合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域をバクテリアの発現ベクター中に（アミロースビーズ上でのタンパク質濃縮を可能にする融合タンパク質として）クローニングした。半精製されたＩ−ＳｃｅＩタンパク質の、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を含むプラスミドをインビトロで切断する能力を確認した。
Ｉ−ＳｃｅＩ部位が先行しプロモーターを欠くｂａｒ遺伝子を含むトウモロコシ細胞系統の単離
二本鎖ＤＮＡ切断が誘導する相同性を介する組換えの分析を発展させるために、核ゲノム中に単一コピーで組み込まれた、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位が先行しプロモーターを欠くｂａｒ遺伝子を含むトウモロコシ細胞の懸濁液を分離した。Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする植物で発現可能なキメラ遺伝子の送達、およびｂａｒ遺伝子の５’末端に作動可能に連結されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む修復ＤＮＡの共同送達、による二本鎖ＤＮＡ切断誘導によって、３５Ｓプロモーターが相同性を介する標的指向ＤＮＡ挿入により挿入され、その結果ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する耐性を与える機能的なｂａｒ遺伝子が得られる。分析を模式的に図１に表わす。
二本鎖ＤＮＡ切断が誘導する相同性を介する組換えの分析を発展させるために、核ゲノム中に単一コピーで組み込まれた、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位が先行しプロモーターを欠くｂａｒ遺伝子を含むトウモロコシ細胞の懸濁液を分離した。Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする植物で発現可能なキメラ遺伝子の送達、およびｂａｒ遺伝子の５’末端に作動可能に連結されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む修復ＤＮＡの共同送達、による二本鎖ＤＮＡ切断誘導によって、３５Ｓプロモーターが相同性を介する標的指向ＤＮＡ挿入により挿入され、その結果ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する耐性を与える機能的なｂａｒ遺伝子が得られる。分析を模式的に図１に表わす。
標的座位を、従来のクローニング技術によって作動可能に次のＤＮＡ領域を連結することにより構成した：
ａ）ノパリン合成酵素遺伝子からの３’末端終止シグナルおよびポリアデニル化シグナル、
ｂ）プロモーターを欠くｂａｒをコードするＤＮＡ領域、
ｃ）Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を含むＤＮＡ領域、
ｄ）A. tumefaciens 遺伝子７からの３’末端終止およびポリアデニル化シグナル（３’ｇ７）、
ｅ）ノパリン合成酵素プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および３’ｏｃｓシグナルを含む植物で発現可能なネオマイシン耐性遺伝子。
このＤＮＡ領域を、Ｔ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間に挿入した。Ｔ−ＤＮＡベクターをｐＴＴＡＭ７８と名付けた（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド配列については配列番号５を参照のこと）。
ａ）ノパリン合成酵素遺伝子からの３’末端終止シグナルおよびポリアデニル化シグナル、
ｂ）プロモーターを欠くｂａｒをコードするＤＮＡ領域、
ｃ）Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を含むＤＮＡ領域、
ｄ）A. tumefaciens 遺伝子７からの３’末端終止およびポリアデニル化シグナル（３’ｇ７）、
ｅ）ノパリン合成酵素プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および３’ｏｃｓシグナルを含む植物で発現可能なネオマイシン耐性遺伝子。
このＤＮＡ領域を、Ｔ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間に挿入した。Ｔ−ＤＮＡベクターをｐＴＴＡＭ７８と名付けた（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド配列については配列番号５を参照のこと）。
Ｔ−ＤＮＡベクターを直接用いて、ＥＰ０ ４６９ ２７３に記述された方法によりＨｅ８９由来のトウモロコシ細胞懸濁液を用いてトウモロコシのプロトプラストを形質転換した。Ｔ−ＤＮＡベクターをまた Agrobacterium tumefaciens C58ClRif (pEHA101) へも導入して、得られたAgrobacteriumをＨｅ８９由来の細胞系統を形質転換するために用いた。Ｔ２４（プロトプラストの形質転換により得られる）および、１４−１および１−２０系統（Agrobacteriumを介する形質転換により得られる）などの標的座位コンストラクトｐＴＴＡＭ７８の単一コピーを含む多数の標的系統を同定した。
Ｎ６Ｍ細胞懸濁培地中のこれらの標的系統から細胞懸濁液を確立し、振盪機（１２０ rpm）で光を当て２５℃で増殖させた。懸濁液を毎週継代培養した。
相同性に基づく標的指向挿入
修復ＤＮＡ、ｐＴＴＡ８２は、Ｔ−ＤＮＡ境界間に作動可能に連結された下記のＤＮＡ領域を含むＴ−ＤＮＡベクターである：
ａ）ｂａｒ遺伝子のアミノ末端部分のみをコードするＤＮＡ領域；
ｂ）部分的なＩ−ＳｃｅＩ認識部位（認識部位の５’末端に位置する１３個のヌクレオチド）を含むＤＮＡ領域；
ｃ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域；
ｄ）部分的なＩ−ＳｃｅＩ認識部位（認識部位の３’末端に位置する９個のヌクレオチド）を含むＤＮＡ領域；
ｅ）A. tumefaciens 遺伝子７由来の３’末端終止およびポリアデニル化シグナル（３’ｇ７）；
ｆ）キメラの植物発現可能なネオマイシン耐性遺伝子；
ｇ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下の欠落を有するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子。
修復ＤＮＡ、ｐＴＴＡ８２は、Ｔ−ＤＮＡ境界間に作動可能に連結された下記のＤＮＡ領域を含むＴ−ＤＮＡベクターである：
ａ）ｂａｒ遺伝子のアミノ末端部分のみをコードするＤＮＡ領域；
ｂ）部分的なＩ−ＳｃｅＩ認識部位（認識部位の５’末端に位置する１３個のヌクレオチド）を含むＤＮＡ領域；
ｃ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域；
ｄ）部分的なＩ−ＳｃｅＩ認識部位（認識部位の３’末端に位置する９個のヌクレオチド）を含むＤＮＡ領域；
ｅ）A. tumefaciens 遺伝子７由来の３’末端終止およびポリアデニル化シグナル（３’ｇ７）；
ｆ）キメラの植物発現可能なネオマイシン耐性遺伝子；
ｇ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下の欠落を有するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子。
ｐＴＴＡ８２のＴ−ＤＮＡヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
この修復ＤＮＡを、ろ紙上に薄層として塗布した懸濁液由来の細胞中へ粒子を撃ち込むことによって、ｐＣＶ７８（実施例１を参照のこと）と共同送達した。ろ紙をＭａｈｑｌ VII基質上にプレートした。
ＤＮＡを細胞へ、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を用いて撃ち込んだ。マイクロキャリアの調製およびその上へのＤＮＡのコーティングは、ほとんどSanford et al., 1992 記載の通りに行った。粒子撃ち込みパラメーターは次の通りであった：標的距離９cm、撃ち込み圧力１３５０psi、ギャップ距離１／４”、およびマイクロキャリア飛行距離１１cm。撃ち込み直後に組織を、選択的でないＭｈｉｌVII基質上に移した。粒子撃ち込みによる成功したＤＮＡ送達の対照として、３つの標的系統にも、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下のキメラｂａｒ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＲＶＡ５２）でコートされたマイクロキャリアによって撃ち込みを行った。
撃ち込み４日後に、フィルタを、２５mg/Ｌ ＰＰＴを補ったＭｈｌVII基質上に、または５０mg/Ｌ ＰＰＴを補ったＡｈｘ１．５VIIｉｎｏ１０００基質上に移した。
１４日後に、フィルタを、標的系統Ｔ２４および１４−１用の１０mg/Ｌ のＰＰＴを有する新鮮なＭｈｌVII培地、および標的系統１−２０用の２５mg/ＬのＰＰＴを有するＭｈｌVII基質の上に移した。
２週間後に、標的指向挿入である可能性のあるイベントを、ＰＰＴに対するそれらの耐性に基づいて評価した。これらのＰＰＴ耐性イベントは、Ｌｉｂｅｒｌｙ Ｌｉｎｋ Ｃｏｒｎ Ｌｅａｆ／Ｓｅｅｄテスト（Strategic Diagnostics Inc.）においても陽性であった。
撃ち込み３８日後のＰＰＴ耐性カルスの数：
ＰＰＴ耐性イベントを、さらに１０mg/ＬのＰＰＴを含むＭｈｌVII基質上で継代培養し、またカルス材料を分子分析に用いた。２０の独立のＴＳＩ候補を、サザン解析によって、３５Sプロモーターならびにノパリン合成酵素遺伝子由来の３’末端終止およびポリアデニル化シグナルをプローブとして用いて解析した。予期された断片のサイズに基づいて、イベントはすべて完全な標的指向配列挿入イベントであるように見えた。その上、標的指向配列挿入イベントの約半分についてのさらに詳しい解析は、修復ＤＮＡまたはＩ−ＳｃｅＩをコードするＤＮＡのいずれについても追加の非標的指向組込みを示さなかった。
標的指向挿入イベントのうちの８つから増幅されたＤＮＡの配列分析が、これらのイベントが確かに完全な相同組換えに基づいたＴＳＩイベントであることを実証した。
これらのデータに基づくと、相同組換えに基づいたＤＮＡ挿入対「正常な」非正統的組換の比率は、１−２０に対する約３０％から、１４−１に対する１７％、および２４に対する約１％まで変化する。
Puchta et al., 1996 (上掲）に記述された、Ｉ−ＳｃｅＩ誘導二本鎖ＤＮＡ切断存在下でエレクトロポレーションによってタバコプロトプラストに送達されたベクターと同様のベクターを用いた場合は、相同組換えに基づいたＤＮＡ挿入対正常な挿入の比率は、約１５％であった。しかし、３３の特徴決定したイベントのうちの１だけが、相同組換えが二重鎖切断の両側で完全な相同性仲介標的指向配列挿入イベントであった。
実施例２から得たベクター、しかし核移行シグナルを含む「ユニバーサルコードＩ−ＳｃｅＩコンストラクト」を備えたベクターを用いると、相同組換えに基づいたＤＮＡ挿入対正常な挿入の比率が、様々な標的系統について、エレクトロポレーションまたは Agrobacteriumを介するＤＮＡ送達を用いた両方の場合で、０．０３２％〜１６％の間で変化した。完全な標的指向挿入イベントの相対度数は、種々の標的系統間で異なり、エレクトロポレーションを介するＤＮＡ送達に対して８〜７０％の間で、また Agrobacteriumを介するＤＮＡ送達に対して７３〜９０％の間で変化した。
アセトシリンゴンによるプレインキュベーションが、標的指向挿入イベントの回収頻度を改善する。
実施例３に記述した撃ち込みの１週間前に、細胞懸濁液を、２００μM アセトシリンゴンを補ったＮ６Ｍ培地またはＬＳＩＤｈｙ１．５培地で希釈した。他の点では、実施例３に記述した方法を用いた。次の表に要約された結果からわかるように、形質転換される細胞のアセトシリンゴンとのプレインキュベーションは、標的指向ＰＰＴ耐性挿入イベントの回収に有益な効果を有した。
実施例３に記述した撃ち込みの１週間前に、細胞懸濁液を、２００μM アセトシリンゴンを補ったＮ６Ｍ培地またはＬＳＩＤｈｙ１．５培地で希釈した。他の点では、実施例３に記述した方法を用いた。次の表に要約された結果からわかるように、形質転換される細胞のアセトシリンゴンとのプレインキュベーションは、標的指向ＰＰＴ耐性挿入イベントの回収に有益な効果を有した。
Agrobacteriumを媒介とした修復ＤＮＡの送達による、ＤＳＢを介するトウモロコシへの標的指向配列挿入
修復ＤＮＡがAgrobacteriumに媒介される形質転換により送達される、トウモロコシ中へのＤＳＢを介する標的指向配列挿入を解析するために、欠陥Ｉ−ＳｃｅＩを実施例１の合成Ｉ−ＳｃｅＩコード遺伝子と置換したＴ−ＤＮＡベクターをｐＴＴＡ８２（実施例３を参照のこと）と同様に構成した。Ｔ−ＤＮＡベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ境界の外側に、Agrobacterium tumefaciens のｖｉｒＧおよびｖｉｒＣ（ｐＴＣＶ８３）、または、ｖｉｒＧ、ｖｉｒＣ、およびｖｉｒＢ（ｐＴＣＶ８７）の１コピ−を含んでいた。これらのＴ−ＤＮＡベクターを、ヘルパーＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４を含むＬＢＡ４４０４に挿入し、それによってAgrobacterium 菌株Ａ４９９５およびＡ４９９６がそれぞれ生み出された。
修復ＤＮＡがAgrobacteriumに媒介される形質転換により送達される、トウモロコシ中へのＤＳＢを介する標的指向配列挿入を解析するために、欠陥Ｉ−ＳｃｅＩを実施例１の合成Ｉ−ＳｃｅＩコード遺伝子と置換したＴ−ＤＮＡベクターをｐＴＴＡ８２（実施例３を参照のこと）と同様に構成した。Ｔ−ＤＮＡベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ境界の外側に、Agrobacterium tumefaciens のｖｉｒＧおよびｖｉｒＣ（ｐＴＣＶ８３）、または、ｖｉｒＧ、ｖｉｒＣ、およびｖｉｒＢ（ｐＴＣＶ８７）の１コピ−を含んでいた。これらのＴ−ＤＮＡベクターを、ヘルパーＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４を含むＬＢＡ４４０４に挿入し、それによってAgrobacterium 菌株Ａ４９９５およびＡ４９９６がそれぞれ生み出された。
実施例２の標的細胞系統の浮遊培養、ならびに実施例２に記述したと同様の方法で得られた他の標的細胞系統を、Agrobacterium 菌株と共栽培し、その後多数のプレートに平板培養した。プレートする数を、細胞懸濁液の密度により決定した。形質転換効率用の対照として、細胞懸濁液を、並行して行った実験で、ヘルパーＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４およびＣａＭＶ３５Ｓベクターの制御下のキメラのホスフィノトリシン耐性遺伝子（ｂａｒ遺伝子）を有するＴ−ＤＮＡベクターを含むAgrobacterium strain LBA4404 と共培養した。Ｔ−ＤＮＡベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ境界の外に、Agrobacterium tumeficans のｖｉｒＧ、ｖｉｒＣ、およびｖｉｒＢ遺伝子の１コピーを含んでいた。４つの異なる独立した実験の結果を下の表に要約する：
このように、Agrobacteriumに媒介された修復ＤＮＡ送達は明白に実現可能であるが、標的指向配列挿入（ＴＳＩ）イベントの頻度が粒子撃ち込みを媒介とした修復ＤＮＡ送達と比較して、より低いことが明らかである。２３の推定ＴＳＩイベントで行なわれたサザン解析により、２０のＴＳＩのイベントが完全であることが、断片のサイズに基づいて示された。しかしながら、実施例３におけるマイクロプロジェクタイル撃ち込みによって得られたイベントと対照的に、２０のイベントのうちの６のみが、修復ＤＮＡの追加の挿入断片を含んでいなかった。９つのイベントが、修復ＤＮＡの１〜３の追加の挿入を含んでいた。また５つのイベントが、修復ＤＮＡの多くの追加の挿入を含んでいた。
粒子撃ち込みを介する修復ＤＮＡの送達はまた、Agrobacteriumによる修復ＤＮＡの送達に比較して、ＤＳＢを介するＴＳＩイベントのよりよい質をもたらす。これは、粒子撃ち込みを介する「正常な形質転換ＤＮＡ」の送達（Agrobacteriumを介する形質転換と比較した場合に、形質転換体のより劣った質（複雑な組込みパターン）によって特徴づけられる）とは対照的である。
これは、粒子撃ち込みまたは他の直接ＤＮＡ送達法によって得られる形質転換体の質を、ＤＳＢを介した配列の挿入によって改善することができることを表している。この結果は次の実験によっても確認される：修復ＤＮＡ中に標的座位と相同性を有するフランキング配列がない状態で、ＤＳＢを介する３５Ｓプロモーターの標的指向配列挿入を行ったときに、我々は、修復ＤＮＡのエレクトロポレーションを介した送達に際して、ＴＳＩイベントの少数だけが付加的な３５Ｓプロモーターの非標的指向挿入を含むこと（１６の解析されたＴＳＩイベントのうちの２つのＴＳＩイベントが付加的なランダムな３５Ｓプロモーター挿入を示す）を観察した。対照的に、３５Ｓプロモーターのランダム挿入が、Agrobacteriumを介する３５Ｓプロモーターの送達によって得られたＴＳＩイベントでは相当より高かった（２２の解析されたＴＳＩイベントのうち１７が付加されたランダムな３５Ｓプロモーターの挿入を示した）。
培地の組成
Ｍａｈｑ１VII：１００mg/L カゼイン加水分解物、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/L ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２M マニトール、０．２M ソルビトール、２％ 蔗糖、ｌmg/L ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、を補ったＮ６培地 (Chu et al., 1975)、ｐＨ５．８に調節し、２．５g/L Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）で凝固させた。
Ｍａｈｑ１VII：１００mg/L カゼイン加水分解物、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/L ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２M マニトール、０．２M ソルビトール、２％ 蔗糖、ｌmg/L ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、を補ったＮ６培地 (Chu et al., 1975)、ｐＨ５．８に調節し、２．５g/L Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）で凝固させた。
Ｍｈｉ１VII：０．５g/L ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２M マニトール、２％ 蔗糖、ｌmg/L ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、を補ったＮ６培地 (Chu et al., 1975)、ｐＨ５．８に調節し、２．５g/L Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）で凝固させた。
Ｍｈ１ＶII：０．２M マニトールを含まない以外は、Ｍｈｉ１VII基質に同じ。
Ａｈｘｌ．５VIIｉｎｏ１０００：１０００mg/L ミオ−イノシトール、０．１mg/L チアミン−ＨＣｌ、０．５mg/L ニコチン酸、０．５mg/L ピリドキシン−ＨＣｌ、０．５g/L ＭＥＳ、３０g/L 蔗糖、１０g/L グルコース、１．５mg/L ２，４−Ｄ、を補ったＭＳ塩類、ｐＨ５．８に調節し、２．５g/L Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）で凝固させた。
ＬＳＩＤｈｙｌ．５：０．５mg/L ニコチン酸、０．５mg/L ピリドキシン−ＨＣｌ、１mg/L チアミン−ＨＣｌ、１００mg/L ミオ−イノシトール、６mM プロリン、０．５g/L ＭＥＳ、２０g/L 蔗糖、１０g/L グルコース、１．５mg/L ２，４−Ｄ、を補ったＭＳ塩類、ｐＨ５．２に調節した。
Ｎ６Ｍ：マクロ要素：２８３０mg/L ＫＮＯ３、４３３mg/L（ＮＨ４)２ＳＯ４；１６６mg/L ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ；２５０mg/L ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；４００mg/L ＫＨ２ＰＯ４；３７．３mg/L Ｎａ２ＥＤＴＡ；２７．３mg/L ＦｅＳＯ４．７Ｈ２O、 ＭＳミクロ要素：５００mg/L バクトトリプトン、０．５g/L ＭＥＳ、ｌmg/L チアミン−ＨＣｌ、０．５mg/L ニコチン酸、０．５mg/L ピリドキシン−ＨＣｌ、２mg/L グリシン、１００mg/L ミオ−イノシトール、３％蔗糖、０．５mg/L ２，４−Ｄ、ｐＨ５．８に調節した。
表１は、合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域に対する可能なトリヌクレオチド（コドン）の選択を表わす（配列番号２中のヌクレオチド配列も参照のこと）。
表２は、合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域に対する好ましい可能なトリヌクレオチドの選択を表わす（配列番号３中のヌクレオチド配列も参照のこと）。
表２は、合成Ｉ−ＳｃｅＩコード領域に対する好ましい可能なトリヌクレオチドの選択を表わす（配列番号３中のヌクレオチド配列も参照のこと）。
Claims (17)
- 対象の外来性ＤＮＡを、植物細胞の核ゲノムのあらかじめ選択された部位へ導入する方
法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ切断を細胞の核ゲノム中のあらかじめ選択された部位に引き起こす工程；
（ｂ）対象の外来性ＤＮＡを植物細胞中へ導入する工程；
を含み、二本鎖ＤＮＡ切断が、ヌクレオチド配列によってコードされるＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする、植物で発現可能な遺伝子の該植物細胞への導入によって導入され、前記ヌクレオチド配列が、配列番号４のヌクレオチド配列、または、ヌクレオチド配列のGC含量が約５０％〜約６０％であるように、配列番号４の１〜２０個のヌクレチドを配列番号３のヌクレオチド配列の中で提供される選択肢のいずれかに置換することにより得られるヌクレオチド配列を含み、ただし、
ａ）位置１２１〜位置１２３のヌクレオチド配列がＧＡＧである場合は、位置１２４〜１２６のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；
ｂ）位置２５３〜位置２５５のヌクレオチド配列がＧＡＣである場合は、位置２５６〜２５８のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；
ｃ）位置２７７〜位置２７９のヌクレオチド配列がＣＡＴである場合は、位置２８０〜２８２のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；
ｄ）位置３４０〜位置３４２のヌクレオチド配列がＡＡＧである場合は、位置３４３〜３４５のヌクレオチド配列がＣＡＴでなく；
ｅ）位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４９３〜４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣでなく；
ｆ）位置４９９〜位置５０１のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置５０２〜５０４のヌクレオチド配列がＴＣＡまたはＡＧＣでなく；
ｇ）位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＣである場合は、位置５２０〜５２２のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５２３〜５２５のヌクレオチド配列がＴＣＮであり；
ｈ）位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６６４〜６６６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；
ｉ）位置７〜位置１５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｊ）位置６１〜位置６９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｋ）位置１３０〜位置１３８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｌ）位置２６８〜位置２７９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのドストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｍ）位置３２２〜位置３３３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｎ）位置４６０〜位置４６８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｏ）位置１３〜位置２７のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｐ）位置３７〜位置４８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｑ）位置１８４〜位置１９２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｒ）位置２１４〜位置２１９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｓ）位置２７７〜位置２８５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｔ）位置３８８〜位置３９６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｕ）位置４６６〜位置４７４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｖ）位置４８４〜位置４８９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｗ）位置５７１〜位置５７６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｘ）位置５９８〜位置６０３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｙ）位置６０４〜位置６０９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｚ）位置６１３〜位置６２１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ａａ）位置６４６〜位置６５１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｂｂ）位置６６１〜位置６６６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；および
ｃｃ）位置７０６〜位置７１４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれる、
ことを条件とすることを特徴とする方法。 - ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
- 対象の外来性ＤＮＡが、直接のＤＮＡ移入によって前記植物細胞中へ導入される、請求
項１または２記載の方法。 - 前記直接のＤＮＡ移入が、対象の外来性ＤＮＡでコートされたマイクロプロジェクタイ
ルの撃ち込みにより遂行される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 前記対象の外来性ＤＮＡが、あらかじめ選択された部位に隣接するＤＮＡ領域と少なく
とも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ領域と隣接している、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 - 植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
- トウモロコシ細胞が細胞懸濁液中に含まれる、請求項６記載の方法。
- 前記植物細胞を、工程（ａ）に先立って植物フェノール化合物中でインキュベーション
する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 前記植物フェノール化合物が、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキ
シアセトフェノン）、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリング酸（４−ヒドロキシ−３，５ジメトキシ安息香酸）、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロキシ安息香酸）、β−レソルシル酸（２，４ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロ没食子酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、の群より選択される、請求項８記載の方法。 - 前記植物フェノール化合物がアセトシリンゴンである、請求項９記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが核移行シグナルを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ
断片であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号４のヌクレオチド配列、または、ヌクレオチド配列のGC含量が約５０％〜約６０％であるように、配列番号４の１〜２０個のヌクレオチドを配列番号３のヌクレオチド配列の中で提供される選択肢のいずれかに置換することにより得られるヌクレオチド配列を含み、ただし
ａ）位置１２１〜位置１２３のヌクレオチド配列がＧＡＧである場合は、位置１２４〜１２６のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；
ｂ）位置２５３〜位置２５５のヌクレオチド配列がＧＡＣである場合は、位置２５６〜２５８のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく；
ｃ）位置２７７〜位置２７９のヌクレオチド配列がＣＡＴである場合は、位置２８０〜２８２のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；
ｄ）位置３４０〜位置３４２のヌクレオチド配列がＡＡＧである場合は、位置３４３〜３４５のヌクレオチド配列がＣＡＴでなく；
ｅ）位置４９０〜位置４９２のヌクレオチド配列がＴＣＡである場合は、位置４９３〜４９５のヌクレオチド配列がＡＣＣでなく；
ｆ）位置４９９〜位置５０１のヌクレオチド配列がＡＡＡである場合は、位置５０２〜５０４のヌクレオチド配列がＴＣＡまたはＡＧＣでなく；
ｇ）位置５１７〜位置５１９のヌクレオチド配列がＡＣＣである場合は、位置５２０〜５２２のヌクレオチド配列がＣＡＡでなく、同時に位置５２３〜５２５のヌクレオチド配列がＴＣＮであり；
ｈ）位置６６１〜位置６６３のヌクレオチド配列がＡＴＴである場合は、位置６６４〜６６６のヌクレオチド配列がＡＡＡでなく；
ｉ）位置７〜位置１５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｊ）位置６１〜位置６９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｋ）位置１３０〜位置１３８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｌ）位置２６８〜位置２７９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのドストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｍ）位置３２２〜位置３３３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｎ）位置４６０〜位置４６８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＧまたはＣの群からの連続する７個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｏ）位置１３〜位置２７のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｐ）位置３７〜位置４８のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｑ）位置１８４〜位置１９２のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｒ）位置２１４〜位置２１９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｓ）位置２７７〜位置２８５のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｔ）位置３８８〜位置３９６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｕ）位置４６６〜位置４７４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｖ）位置４８４〜位置４８９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｗ）位置５７１〜位置５７６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｘ）位置５９８〜位置６０３のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｙ）位置６０４〜位置６０９のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｚ）位置６１３〜位置６２１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ａａ）位置６４６〜位置６５１のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；
ｂｂ）位置６６１〜位置６６６のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれ；および
ｃｃ）位置７０６〜位置７１４のヌクレオチド配列のコドンが、その結果生じるヌクレオチド配列が、ＡまたはＴの群からの連続する５個のヌクレオチドのストレッチを含まないようになる選択に従って選ばれる、
ことを条件とする、ＤＮＡ断片。 - １の位置のみが配列番号４のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含むことを
特徴とする、請求項１２記載の単離されたＤＮＡ断片。 - １０の位置のみが配列番号４のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含むこと
を特徴とする、請求項１２記載の単離されたＤＮＡ断片。 - 配列番号４のヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ断片。
- 植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結された請求項１２〜１５のいずれか１項記載の単離されたＤＮＡ断片を含む、キメラ遺伝子。
- 外来性ＤＮＡを、植物ゲノムのＩ−ＳｃｅＩ認識部位に挿入するための、請求項１６記載のキメラ遺伝子の使用。
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