JP4873576B2 - 蛍光標識剤および蛍光標識方法 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、蛍光標識剤および蛍光標識方法に関し、特に、生体にとって毒性のない材料を用いた蛍光標識剤および蛍光標識方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生体細胞を有機蛍光色素により標識し、励起光を照射して蛍光を検出することにより、腫瘍細胞など特定の標的細胞のみを可視化させる技術が知られている。しかし、一般に、有機蛍光色素は光励起により活性状態となると劣化し、蛍光特性がなくなってしまう。従って、この退色性のため、有機蛍光色素は長時間の測定や繰り返し再現性を調べる測定には不向きであるという問題点があった。一方で、退色性を少なくするために退色防止剤を用いることもできるが、退色防止剤は一般に毒性があるため、今度は、in vivoにおける使用には適さないという別の問題が生じる。
【0003】
また、有機蛍光色素は、励起光の強度を強くすると吸収遷移が飽和し、一定以上の蛍光強度が得られないこと、特定の波長で励起する必要があること、励起光の波長と蛍光の波長が近く励起光と蛍光の分離が難しいこと、等の欠点をもっている。
【0004】
近年、有機蛍光色素の代替としてCdSeの量子ドットを用いた蛍光標識剤が研究されている。量子ドットは、粒径を調整することにより所望の色にて標的細胞を蛍光標識できるほか、光励起による退色がほとんどないこと、エネルギー状態が量子化されることにより光吸収の飽和が少なく、スペクトルがシャープで強い蛍光が得られること、励起の波長は蛍光波長より短ければ特定の波長である必要がなく、励起光と蛍光の分離が容易であること、等の利点をもつ。加えて、量子ドットは、生体細胞への標識が容易であるため、生体検査、その他の診断に有望であり注目されている。
【0005】
【特許文献1】
特開2005−283254公報
【特許文献2】
特開2006−137682公報
【特許文献3】
特開2005−60145公報
【特許文献4】
特開2007−23058公報
特許文献5:特開2004−292282公報
特許文献6:特表2003−524147公報
発明の開示
発明が解決しようとする課題
[0006]
しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。
現在、生体用に研究されている量子ドットはCdSeであり、構成元素のカドミウム(Cd)が毒性をもつためin vivoでの使用ができないことが懸念されている。
[0007]
また、特許文献4には、酸化亜鉛を用いる技術が開示されているが、欠陥発光に基づく低輝度かつブロードな緑色発光であるため、検出効率が劣り、その結果、標識剤としては量子ドットに遙かに劣るという問題点があった。
[0008]
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、生体にとって毒性のない材料を用い、励起光による退色がなく、スペクトルがシャープで強い蛍光が得られ、生体細胞への標識が容易な蛍光標識剤および蛍光標識方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009]
上記の目的を達成するために、請求項1に記載の発明は、in vivoまたはin vitroにおける蛍光標識に際しての、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光源としての使用である。
[0010]
すなわち、請求項1に係る発明は、毒性のない酸化亜鉛を用い、その励起子光(波長約380nm)により細胞等を蛍光標識することが可能となる。なお、酸化亜鉛ナノ粒子とは、酸化亜鉛のナノ結晶ということができる。酸化亜鉛は、結晶性がよくないと励起子発光が弱く、また、結晶性がよくないと水中で不安定であり結晶自体が溶解してしまうため、本発明の酸化亜鉛ナノ粒子は結晶性のよいものであるとする。また、酸化亜鉛の励起子を主体とした発光となるのであれば、微量元素が存在した結晶もここにいう酸化亜鉛のナノ結晶に含まれるものとする。例えば、結晶としては、微量のMgが存在する場合も含まれる。
[0011]
また、請求項2に記載の発明は、in vivoまたはin vitroにおいて使用する酸化亜鉛ナノ粒子を含んだ標識剤であって、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光を利用することを特徴とする蛍光標識剤である。
[0012]
すなわち、請求項2に係る発明は、水中で安定であり分解しない酸化亜鉛ナノ粒子を用い、その励起子光(波長約380nm)により細胞等を蛍光標識することが可能となる。
[0013]
また、請求項3に記載の発明は、酸化亜鉛ナノ粒子に、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合したことを特徴とする請求項2に記載の蛍光標識剤である。
[0014]
すなわち、請求項3に係る発明は、励起子光により生体の特定の対象を蛍光標識することが可能となる。なお、少なくとも一つの結合剤とは、酸化亜鉛ナノ粒子と、標的に対して選択的に結合可能な物質と、の両方を直接結合する物質であってもよく、複数種類の結合剤を介して結合するものでもよいことを意味する。複数種類の結合剤を介するとは、酸化亜鉛ナノ粒子に一端が結合した結合剤Aの他端と、標的に対して選択的に結合可能な物質に一端が結合した結合剤Bの他端と、が結合する態様を挙げることができる。また、更に結合剤Aと結合剤Bとを結合する結合剤Cが介在していてもよいものとする。in vivoまたはin vitroにおける標的とは、正常細胞のほか、正常細胞でない腫瘍細胞等を含み、蛍光標識をおこなう者が対象とする細胞、その他の生体物質を意味する。また、これらの細胞ないし生体物質等に前処理が施され、蛍光標識剤が選択的に結合するようにされたものも本願にいう標的に含まれるものとする。
[0015]
また、請求項4に記載の発明は、酸化亜鉛ナノ粒子表面を、ZnS、MgxZn1−xO(但し0<x≦1)、および、SiO2の中から選ばれた被膜で覆い、少なくとも二つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合したことを特徴とする請求項2に記載の蛍光標識剤である。
[0016]
すなわち、請求項4に係る発明は、酸化亜鉛の表面を酸化亜鉛よりバンドギャップの大きな材料で覆うことにより、発光に必要な電子や正孔が酸化亜鉛ナノ粒子内に閉じ込められる結果、生体の特定の対象を効果的ないし効率的に蛍光標識することが可能となる。なお、ZnS、MgxZn1−xO、SiO2が複数組み合わされてコーティングされていてもよい。
[0017]
なお、少なくとも一つの結合剤とは、被膜と、標的に対して選択的に結合可能な物質と、の両方を直接結合する物質であってもよく、複数種類の結合剤を介して結合するものであってもよいことを意味する。複数種類の結合剤を介するとは、被膜に一端が結合した結合剤Aの他端と、標的に対して選択的に結合可能な物質に一端が結合した結合剤Bの他端と、が結合する態様を挙げることができる。また、更に結合剤Aと結合剤Bとを結合する結合剤Cが介在していてもよいものとする。
【0018】
なお、請求項3または請求項4において、結合剤Aと結合剤Bとを用いる場合は、安定性の観点からそれらが脱水縮合によるアミド結合により結合するものであることが好ましい。
【0019】
また、請求項5に記載の発明は、前記結合剤が、粒子側に官能基としてアミノ基またはカルボキシル基を修飾する物質であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤である。
【0020】
すなわち、請求項5に係る発明は、凝集せず分散性のよい水溶性の蛍光標識剤を提供可能となる。結合剤としては、カルボン酸(ポリカルボン酸を含む)を挙げることができる。
【0021】
また、請求項6に記載の発明は、前記結合剤が、標的に選択的に結合可能な物質側に結合させる、
AEDP(3-[(2-Aminoethyl)Dithio]Propionic
Acid)、
ASBA(4-(p-Azidosalicylamido) Butylamine)、
EDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]
carbodiimide Hydrochloride)、または、
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)を加えたEDC、
であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤である。
【0022】
すなわち、請求項6に係る発明は、標的に対して選択的に結合可能な物質に好適に結合し、かつ、粒子側との結合性を高める。Sulfo-NHSは安定剤として加えるものである。なお、請求項5に記載の結合剤と請求項6に記載の結合剤は、前述したようにアミド結合を形成する組合せであることが好ましい。
【0023】
また、請求項7に記載の発明は、標的に対して選択的に結合可能な物質が、抗体、酵素、レクチン、または、核酸であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤である。
【0024】
すなわち、請求項7に係る発明は、生体検査等において、目的の疾病等を容易に認識可能となる。核酸は、DNAやRNAを当然に含む。標的に対して選択的に結合可能な物質としては、このほか、生理活性物質(ホルモン、サイトカイン、成長因子など)、受容体、糖質(炭水化物)、脂質等を挙げることができる。
【0025】
また、請求項8に記載の発明は、標的が、腫瘍細胞、白血病細胞、ウイルス感染細胞、若しくは、正常細胞、タンパク質、酵素、または、核酸であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤である。
【0026】
すなわち、請求項8に係る発明は、腫瘍等を簡便に認識可能となる。腫瘍細胞は良性と悪性とのいずれをも含むものとする。また、請求項8に係る発明は、細胞表面のみならず、細胞質内の種々の生体物質も簡便に認識可能となる。
【0027】
また、請求項9に記載の発明は、in vivoまたはin vitroにおいて、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光を利用することを特徴とする蛍光標識方法である。
【0028】
すなわち、請求項9に係る発明は、毒性のない酸化亜鉛を用い、その励起子光(波長約380nm)により細胞等を蛍光標識することが可能となる。
【0029】
また、請求項10に記載の発明は、酸化亜鉛ナノ粒子に、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合し、これを標的と結合させた後、励起光として紫外光を照射し、標的部分を酸化亜鉛の励起子発光により光らせることを特徴とする蛍光標識方法である。
【0030】
すなわち、請求項10に係る発明は、励起子光により生体の特定の対象を蛍光標識することが可能となる。励起光は、励起子光の波長(約380nm)より短い波長で、生体に特に影響を及ぼさない領域であればどの波長の光を用いてもよい。例えば、連続発振するヘリウムカドミウムレーザ(325nm)や窒素レーザ(波長337nm)等のパルスレーザ、水銀ランプ等の紫外線ランプ光源を挙げることができる。
【0031】
また、請求項11に記載の発明は、酸化亜鉛ナノ粒子表面を、ZnS、MgxZn1-xO(但し0<x≦1)、および、SiO2の中から選ばれた被膜で覆い、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合し、これを標的と結合させた後、励起光として紫外光を照射し、標的部分を酸化亜鉛の励起子発光により光らせることを特徴とする蛍光標識方法である。
【0032】
すなわち、請求項11に係る発明は、酸化亜鉛の表面を酸化亜鉛よりバンドギャップの大きな材料で覆うことにより、発光に必要な電子や正孔が酸化亜鉛ナノ粒子内に閉じ込められる結果、生体の特定の対象を効果的ないし効率的に蛍光標識することが可能となる。なお、ZnS、MgxZn1-xO、SiO2が複数組み合わされてコーティングされていてもよい。
【0033】
なお、請求項9〜請求項11に記載の蛍光標識方法に関しては、請求項5〜請求項8に記載の技術を適用可能であることはいうまでもない。
【発明の効果】
【0034】
本発明によれば、生体に必須の元素である亜鉛を用い、また、化合物としても毒性のない酸化亜鉛を用いるので、安全性が高く、in vivoまたはin vitroで利用できる蛍光標識剤および蛍光標識方法を提供可能となる。また、本発明では、酸化亜鉛の励起子光を利用するため、量子ドットと同様に退色がほとんどない強い発光が得られるため、蛍光測定が簡便になるというメリットも有する。更に、酸化亜鉛ナノ粒子の周囲をバンドギャップの大きな物質で被覆することにより励起子発光が安定化する。また、本発明の蛍光標識剤は結合剤を介して酸化亜鉛ナノ粒子を標的に結合させるものであるため、種々の生体物質の蛍光標識が容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0035】
酸化亜鉛のバルク「結晶」は、結晶性がよい場合、電子と正孔が互いに束縛した状態であるところの励起子が室温でも解離せず存在できることが知られている。このような酸化亜鉛に380nm以下の波長の光を照射すると、光を吸収し励起子が形成され、約380nmの波長をピークとする、励起子に由来する高効率な発光が生じる。励起子のエネルギー準位は、陽子と電子とで構成される水素原子のように特定のエネルギーに集中するため、この励起子発光は、量子ドットと同様にスペクトルがシャープで強いものとなる。
【0036】
一方、酸化亜鉛「微粒子」は、古くから亜鉛を酸素雰囲気で蒸発させることにより作製され、人体に関する分野でも、ベビーパウダー、薬剤、化粧品等に用いられてきた毒性のない材料である。しかしながら、上記方法により作製された酸化亜鉛微粒子は、通常は結晶性が悪い。このため、(1)緑色の欠陥発光が強く、励起子発光が弱くなる、(2)凝集性が強く白色の粉末塊となり、水中における分散が困難となる、(3)水中で不安定であり、結晶自体が溶解する、といった欠点があった。
【0037】
すなわち、酸化亜鉛はその欠陥発光によるブロードな緑色の蛍光体としてある程度知られているものの、励起子発光についてはもっぱら物性物理分野に限定された研究対象であり、方向性の全く異なる医療分野において励起子発光させるための光源材料として利用するという着想はそもそも生じ得ず、ましてや、in vivoまたはin vitroにおける蛍光標識剤として使用することなどは全く想起されないものであった。
【0038】
一方、本願発明者らは、酸素を含むガス中でアーク放電により亜鉛を蒸発させるガス中蒸発法を用いて、励起子発光が主体の、結晶性に優れた酸化亜鉛ナノ粒子の生成に成功した(特許文献3参照)。実際、この方法により製造した酸化亜鉛ナノ粒子を波長325nmのHe-Cdレーザを用いて室温にて励起し、分光器で測定したところ、図1に示したように約380nmにピークをもつ励起子光が簡便に観測された。半値幅もおおよそ25nm以下であり、この素材の励起子光はシャープなスペクトルを示した。
【0039】
また、得られた酸化亜鉛ナノ粒子の励起子光の蛍光スペクトルを、evident社のZnS被覆されたCdSe量子ドットの蛍光スペクトルと比較した結果を図2に示す。発光強度は分散濃度や検出感度が波長により異なるため比較できないが、図示したように、結晶性のよい本酸化亜鉛ナノ粒子は、量子ドットと同等以上のシャープな蛍光を示すことが確認できた。
【0040】
また、一般に、励起子光の強度は入射光の強度に従って大きくなる特徴があり、強度が飽和する蛍光色素のような発光と異なり、本酸化亜鉛ナノ粒子は利便性が高い。更に、量子ドットの場合には粒子径をナノサイズに調整ないし制御する必要があるが、本願発明者らにより生成された酸化亜鉛ナノ粒子は、粒径を調整ないし制御しなくともその励起子光が量子ドットと同等のシャープで輝度の高いものであったため、製造効率にも優れるといえる。
【0041】
本願発明者らは、上記の知見に加え、得られた結晶性のよい酸化亜鉛ナノ粒子が水中(室温)で安定であり、結晶自体がナノ粒子の状態で分散できることも確認した。図3は、得られた酸化亜鉛ナノ粒子を水に分散させた際の吸収スペクトルを分光光度計により測定した結果である。約375nmに励起子の吸収が見られ、分散性が良好であることがわかる。本願発明者らは、更に、図4に示したように、得られた酸化亜鉛ナノ粒子が、イソプロピルアルコールの中でも、純水中でも、凝集せずに安定的に分散し、励起子発光することをも確認した(光源は、波長325nmのHe-Cdレーザである)。
【0042】
本願発明者らはこれら知見を契機として、本発明を完成させるに至った。
酸化亜鉛ナノ粒子の製法は特に限定されないが、特許文献3の方法によれば、粒径が概ね50nm〜200nmの範囲に分布し、平均粒径がおおよそ100nm程度である、結晶性のよい粒子を安価に製造できる。
【0043】
粒径がより小さな結晶は、例えば、エタノール中に融解した酢酸亜鉛と水酸化ナトリウムを混合し、室温で90分間攪拌することにより生成できる。図5は、この方法により生成された酸化亜鉛ナノ粒子を溶液から遠心分離し、乾燥させたもののX線回折パターンである。この図のピーク位置から酸化亜鉛結晶が生成されていることが確認できる。また、回折ピークの広がりから平均粒径が約30nmであることが推定できた。このほか、酢酸亜鉛と無水エタノールと水酸化リチウムとを用いて、ゾルゲル法によっても数nm程度の粒径の酸化亜鉛量子ドットが製造できる。なお、本発明においては、粒径は特に限定されず用途により選ぶことができる。例えば、血管に導入することを考慮すれば数十nm以下の粒径であることが好ましい。
【0044】
なお、酸化亜鉛ナノ粒子の表面にZnS、MgxZn1-xO(但し0<x≦1)、または、SiO2をコーティングすれば、光照射により励起したキャリアの散逸を効率的に防止でき、周囲の物質による消光が起こらず、安定した蛍光を示す。以降では、上記の化合物によりコーティングされた酸化亜鉛ナノ粒子を、シェル化酸化亜鉛ナノ粒子と適宜称することとする。図6は、酸化亜鉛ナノ粒子(a)とシェル化酸化亜鉛ナノ粒子(b)の模式図である。
【0045】
酸化亜鉛ナノ粒子またはシェル化酸化亜鉛ナノ粒子と、抗体、酵素、レクチン、または、核酸(以降では、これらを抗体等と適宜称することとする。)とは、結合剤を介して結合させることができる(図7参照)。このとき、酸化亜鉛ナノ粒子またはシェル化酸化亜鉛ナノ粒子は、カルボン酸(ポリカルボン酸を含む)を用いて表面処理することが好ましい。これにより、粒子の可溶性ないし分散性を高めることができ、かつ、抗体等の側との結合性を高めることができる。
【0046】
表面処理は、まず、ナノ粒子とカルボン酸とを、例えば、ハロゲン炭化水素(クロロホルム、メチレンクロリドなど)、アルコール(メタノール、エタノールなど)、エステル(酢酸エステル、フタル酸エステルなど)、その他の有機溶媒(酢酸、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなど)の存在下に、室温で12時間程度反応させておこなう。その後、溶媒を留去し、未反応の試薬を限外濾過法により除去する。これにより、水溶性の酸化亜鉛ナノ粒子を得ることができる。なお、カルボン酸の例としては、メルカプトコハク酸、2,3−ジメルカプトコハク酸、DL−システインなどが好ましい。このほか、アミノ基により修飾してもよい。
【0047】
一方、抗体等は、縮合剤に結合させる。抗体等は、この縮合剤に基づく脱水縮合により粒子側と結合する。縮合剤の例としては、AEDP、ASBA、または、EDCを挙げることができる。特にEDCが使用実績もあり好適である。EDCを用いる場合には、Sulfo-NHSを補助剤として加えることが好ましい。
【0048】
結合剤としては、EDCとメルカプトコハク酸、EDCと2,3−ジメルカプトコハク酸、または、EDCとDL−システインの組合せが好適である。なお、適宜Sulfo-NHSを補助剤として用いることができる。
【0049】
すなわち、一例として、蛍光標識剤は、酸化亜鉛ナノ粒子またはシェル化酸化亜鉛ナノ粒子をアルコール、エステル、エーテルその他の溶媒下でカルボン酸と反応させ、その後溶媒を留去し、最後にペプチド合成に用いる縮合剤を用いて、粒子側のカルボキシル基と抗体等の側のアミノ基とを脱水縮合させることにより得ることができる。このとき縮合剤には抗体等が予め結合されているものとする。
【0050】
なお、予め脱水縮合させた結合剤を作出してから、酸化亜鉛ナノ粒子と抗体等とを順次結合して蛍光標識剤を得る態様であってもよい。例えば、Sulfo-NHSを補助剤として用いてEDCとメルカプトコハク酸とをはじめに反応させ、その後、これに酸化亜鉛を反応させ、最後に抗体等を反応させて目的の蛍光標識剤を得ることもできる。この方法は、特にシェルのない酸化亜鉛を用いる場合に有効であることを確認している。
【0051】
具体的な製法例を紹介する。まず、本願発明者らが開示した特許文献3(特開2005−60145公報)の方法により酸化亜鉛ナノ粒子を製造した。これをクロロホルム溶液に分散させ、濃度を20mg/mlに調整した。この溶液10mlに、メタノールに溶解した2mlのメルカプトコハク酸溶液(25mg/ml、シグマ社製)を添加し、室温で12時間反応させた。反応液を4℃で30分間遠心分離し(12,000×g)、残存しているクロロホルムとメタノールをエバポレータにより吸引除去して、水溶性の酸化亜鉛ナノ粒子の乾燥粉末を得た。5mlのPBS(−)溶液(pH7.3)を加えて、この乾燥粉末を溶解した。当該溶液を4℃で30分間遠心分離し(12,000×g)、沈殿物(不溶物)を除去した。得られた酸化亜鉛ナノ粒子を含む上澄み液から、Microcon(分画分子量:3000MW、ミリポア社製)を用いた限外濾過によって、未反応試薬を含む分子量3000以下の分子を除いた。これにより、カルボン酸により表面処理された分散性のよい酸化亜鉛ナノ粒子が得られた。
【0052】
この溶液に、蒸留水で5mg/mlの濃度に調整したEDC溶液を加えて、2時間室温で反応させた。未反応の酸化亜鉛ナノ粒子、試薬、反応副産物はMicrocon(分画分子量:3000MW、ミリポア社製)を用いた限外濾過で除去した。次いで、得られた蛍光標識剤(1.5ml)とPBS溶液を用いて調整した200μlの抗体溶液(2mg)とを混合し、目的とする水溶性の蛍光標識剤を得た。抗体は、マクロファージ系癌細胞(Raw264.7)を認識する抗Cd11b抗体とした。
【0053】
上記の製法により得られた蛍光標識剤を実際に抗体反応させ、レーザ光(波長325nm)を照射した。すると、マウス・マクロファージ系癌細胞株 (Raw 264.7) の表面、すなわち、抗体反応部分が発光していることが確認できた。また、この製法により得られた蛍光標識剤は、4℃下で1週間保存しても沈殿物を生じず、安定であることを確認した。
【0054】
なお、上記の製法例の類型として、以下を挙げることができる。まず、2mlのメルカプトコハク酸溶液(25mg/ml、シグマ社製)にかえ、2,3−ジメルカプトコハク酸溶液(25mg/ml、シグマ社製)やDL−システイン溶液(25mg/ml、シグマ社製)を用いることができる。また、反応時間は、室温で12時間としたが、1時間であっても、蛍光標識剤を作出できることも確認した。更に、その後、第一回目の遠心分離をおこなうが、このとき、1000×g,5分間,4℃の条件でもよいことも確認した。
【0055】
また、縮合剤をsulfo-NHSを添加したEDCとし、これを蒸留水とMES緩衝液とで濃度調整したものを用いることができることも確認した。
【0056】
他の蛍光標識剤の製法例を説明する。ここでは、ストレプトアビジンを用いる例について説明する。まず、カルボン酸(メルカプトコハク酸またはDL−システイン)により表面処理した酸化亜鉛ナノ粒子(2mg)を0.1MのMES緩衝液(1ml)に溶解する。この溶液にEDC(0.5mg)およびsulfo-NHS(1mg)を加えて室温で15分間反応させる。次いで、1.7μlの2−メルカプトエタノールを用いてEDCを不活化した後、PBSで平衡化した脱塩カラム(Zeta Desalting column、Pierce社製)を用いて未反応のEDCを分離する。最後に、この酸化亜鉛ナノ粒子含有溶液1mlに、ストレプトアビジン1mgを加えて室温で2時間架橋結合させれば、目的とする水溶性の蛍光標識剤を得られる。
【0057】
標識および観察に際しては、まず、市販のビオチン標識された抗Cd11b抗体(Biolegend社製)をマウス・マクロファージRaw264.7に予め反応させておく。これに、上記の方法によって得られた蛍光標識剤含有液50μg/mlを加えて室温で2時間反応させる。未反応の蛍光標識剤をPBSを用いて3回程度洗浄する。洗浄後、照射光をあてれば、励起子発光に基づく蛍光を落射型蛍光顕微鏡により検出できる。
【0058】
なお、以上それぞれの蛍光標識剤は、酸化亜鉛ナノ粒子を用いた例であるが、シェル化酸化亜鉛ナノ粒子を用いても同様に蛍光標識剤を作出することができる。また、抗体のほかにも、レクチン、酵素、または、核酸を酸化亜鉛ナノ粒子と結合させ、蛍光標識剤を作出することができる。なお、蛍光標識剤を得るための最終段階において、抗体を結合させる場合にはプロテインAを用いることにより、レクチンを結合させる場合には糖を固定したクロマト樹脂(メリビオースーアガロースなど)を用いることにより、蛍光標識剤を高純度に精製することが可能となる。
【0059】
次に、具体的な標識結果を示す。
<標識結果1>
抗Cd11b抗体を含む本蛍光標識剤を標的細胞マウス・マクロファージRaw264.7と室温で2時間反応させ、未反応の抗体をPBSで3回洗浄した後、落射型蛍光顕微鏡により蛍光の観察をおこなった。観察にはexciter 340、beam splitter 365、emitter 380 のフィルタを使用した。図8は、観察結果を示した写真である。左はコントロールであり、右は標識結果である。図示したように、酸化亜鉛ナノ粒子に基づく蛍光(λmax≒380nm)が標的細胞膜の表面で明瞭に観察できた。
【0060】
なお、蛍光標識剤は、結合剤の一材料としてメルカプトコハク酸を用い、室温で12時間反応させた後、一回目の遠心分離の条件を12000×g,30分間,4℃として沈殿物を除去したものを用いている。なお、結合剤の一材料としてsulfo-NHSも添加したEDCを用いた。
【0061】
<標識結果2>
標識結果1と同様の方法で、exciter 335、beam splitter 365、emitter 380 のフィルタを使用して蛍光を観察した。図9は、観察結果を示した写真である。左はコントロールであり、中央は標識結果であり、右は拡大写真ある。図示したように、標的細胞の膜表面の蛍光が明瞭である。
【0062】
なお、蛍光標識剤は、結合剤の一材料としてメルカプトコハク酸を用い、室温で1時間反応させた後、一回目の遠心分離の条件を1000×g,5分間,4℃として沈殿物を除去し、二回目の遠心分離の条件を12000×g,20分間,4℃として上澄みを除去したものを用いている。なお、結合剤の一材料としてsulfo-NHSも添加したEDCを用いた。
【0063】
<標識結果3>
マウス・マクロファージRaw264.7のライセート(細胞抽出液)をメチルアルコールで処理したニトロセルロース膜にドットブロットし、抗Cd11b抗体を含む本蛍光標識剤を室温で2時間反応させた。未反応の抗体はPBSで3回洗浄し、蛍光を落射型蛍光顕微鏡で観測した。図10は、観察結果を示した写真である。左はコントロールであり、右は標識結果である。図示したように、標識対象は全体として発光しており、ドット(斑点)が明瞭である。なお、図中の濃淡は紙の表面の影響である。ここで用いた蛍光標識剤は、前記した標識結果2と同一のものである。
【0064】
以上示したように、本蛍光標識剤を用いて標的細胞の蛍光標識による検出が可能となる。更に本蛍光標識剤は毒性がないために、in vitro のみならずin vivo環境下における使用を可能とするものである。
【産業上の利用可能性】
【0065】
以上のように、本発明の蛍光標識剤を構成する酸化亜鉛ナノ粒子は毒性のない材料であり、量子ドットと同様に強い蛍光が得られ、退色はほとんどなく、標的を容易に蛍光標識できるという特徴を有するため、様々な用途に利用することができる。本発明の活用例として、生体検査を挙げることができる。例えば、手術中に組織を一部採取して、蛍光標識剤を添加し、レーザ光を照射し380nm付近の発光の有無を観察することにより、即時にその組織が陽性であるか陰性であるか確認可能となる。また、本発明の蛍光標識剤が毒性のない材料であるため、皮膚癌や内視鏡を用いた腫瘍等の臨床検査も可能となる。
【0066】
また、量子ドットと併用して多重標識も可能となる。また、本発明の蛍光標識剤は、図1に示したように、ナローかつシャープなスペクトルをもつため、他の蛍光と明瞭に区別でき、標識精度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1】ガス中蒸発法により生成した酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光スペクトルである。
【図2】本発明で用いる酸化亜鉛ナノ粒子の励起子光の蛍光スペクトルを、evident社のZnS被覆されたCdSe量子ドットの蛍光スペクトルと比較したグラフである。
【図3】得られた酸化亜鉛ナノ粒子を水に分散させた際の吸収スペクトルを分光光度計により測定した結果を示したグラフである。
【図4】得られた酸化亜鉛ナノ粒子からの発光を示す写真である。左はイソプロピルアルコールに分散させた場合であり、右は純水に分散させた場合である。
【図5】平均粒径30nmの酸化亜鉛ナノ粒子のX線回折パターンである。
【図6】酸化亜鉛ナノ粒子(a)とシェル化酸化亜鉛ナノ粒子(b)の模式図である。
【図7】本発明の蛍光標識剤の一構成例であって、官能基を用いて表面修飾したシェル化酸化亜鉛ナノ粒子と結合剤を介した抗体の結合の様子を示した模式図である。
【図8】標的細胞の標識結果の一例である。
【図9】標的細胞の標識結果の一例である。
【図10】ライセートの標識結果を示した顕微鏡写真である。
Claims (11)
- in vivoまたはin vitroにおける蛍光標識に際しての、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光源としての使用。
- in vivoまたはin vitroにおいて使用する酸化亜鉛ナノ粒子を含んだ標識剤であって、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光を利用することを特徴とする蛍光標識剤。
- 酸化亜鉛ナノ粒子に、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合したことを特徴とする請求項2に記載の蛍光標識剤。
- 酸化亜鉛ナノ粒子表面を、ZnS、MgxZn1−xO(但し0<x≦1)、および、SiO2の中から選ばれた被膜で覆い、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合したことを特徴とする請求項2に記載の蛍光標識剤。
- 前記結合剤が、粒子側に官能基としてアミノ基またはカルボキシル基を修飾する物質であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤。
- 前記結合剤が、標的に選択的に結合可能な物質側に結合させる、
AEDP(3−[(2−Aminoethyl)Dithio]Propionic Acid)、
ASBA(4−(p−Azidosalicylamido)Butylamine)、
EDC(1−Ethyl−3−[3−Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)、または、
Sulfo−NHS(N−hydroxysulfosuccinimide)を加えたEDC、
であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤。 - 標的に対して選択的に結合可能な物質が、抗体、酵素、レクチン、または、核酸であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤。
- 標的が、
腫瘍細胞、白血病細胞、ウイルス感染細胞、若しくは、正常細胞、
タンパク質、
酵素、または、
核酸であることを特徴とする請求項3または4に記載の蛍光標識剤。 - in vivoまたはin vitroにおいて、酸化亜鉛ナノ粒子の励起子発光を利用することを特徴とする蛍光標識方法。
- 酸化亜鉛ナノ粒子に、少なくとも一つの結合剤を介して、in vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合し、これを標的と結合させた後、励起光として紫外光を照射し、標的部分を酸化亜鉛の励起子発光により光らせることを特徴とする蛍光標識方法。
- 酸化亜鉛ナノ粒子表面を、ZnS、MgxZn1−xO(但し0<x≦1)、および、SiO2の中から選ばれた被膜で覆い、少なくとも一つの結合剤を介して、in
vivoまたはin vitroにおける標的に対して選択的に結合可能な物質を結合し、これを標的と結合させた後、励起光として紫外光を照射し、標的部分を酸化亜鉛の励起子発光により光らせることを特徴とする蛍光標識方法。
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