CN109613200B - 一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法,其特征在于,包括利用放射性同位素示踪法测定纳米氧化锌至少在两种不同消化方式的海水鱼的同化效率,并在体外进行解离能力测定,具体是利用人工消化液测定纳米氧化锌在酸消化和碱消化过程中的解离程度。本发明通过测定两种不同消化方式的海水鱼对纳米氧化锌的同化效率,证实纳米氧化锌较传统无机氯化锌对日本青鳉鱼(无胃)有更高的生物可利用性,且在正常饵料添加浓度下(80 mg Zn/kg)能够显著提高日本青鳉鱼的抗氧化性能。

Description

一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法
技术领域
本发明涉及一种海水鱼同化效率技术,具体涉及一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法。
背景技术
锌元素是海水鱼类生长的必需微量元素,作为体内多达300种酶的辅助因子或活性中心。传统饵料对锌元素的添加主要是以无机锌源(例如:硫酸锌、氧化锌和氯化锌)等形式添加。然而,Wang等研究发现海水鱼类对无机锌元素的同化效率较低,例如海水黑鲷鱼对氯化锌的同化效率仅为35%,大部分锌未被同化排放到水体中。随着养殖活动的加剧,过量未同化的锌会在水体中累积,从而对当地的水生生态系统造成胁迫。
部分研究表明,纳米氧化锌可被用于畜牧水产养殖行业,相同浓度较无机锌源能够显著提高机体的生长效能,其可能原因是纳米氧化锌提供了高生物可利用性的锌离子。然而,亦有部分研究显示,纳米氧化锌较传统无机锌源对一些生物(例如,猪和羊)无明显作用差异。对于纳米氧化锌是否可提高生物体对锌元素的利用效率目前仍然存在争议,并且其作用机理仍有待研究。
发明内容
有鉴于此,本发明的主要目的是提供了一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法。
本发明采用的技术方案为:
一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法,包括利用放射性同位素示踪法测定纳米氧化锌至少在两种不同消化方式的海水鱼的同化效率,并在体外进行解离能力测定,具体是利用人工消化液测定纳米氧化锌在酸消化和碱消化过程中的解离程度。
进一步地,还包括利用放射性同位素示踪法测定纳米氧化锌至少在两种不同消化方式的海水鱼的同化效率,然后进行纳米氧化锌生长效能测定,具体方法为:在人工饵料中添加80~300mg/kg的纳米氧化锌,对海水鱼进行为期四周的水产实验测试。
进一步地,所述酸消化过程中的解离程度的具体步骤为:
人工配置所需的消化液,酸消化的pH被调整至2;
1mg/L的纳米氧化锌加入到15ml酸消化液中,放置于摇床上并以180转 /分钟持续旋转;
在10,30,60和120分钟分别取样1mL,取样后立即放置于含有3kDa 滤膜的超滤管中,进行离心分离,取滤液,测定其中锌离子浓度,以确定纳米氧化锌的解离程度。
进一步地,所述纳米氧化锌生长效能测定的具体方法为:采用4周龄日本青鳉鱼,规格4.9±1.27mm,24.9±2.47mg,在5L的塑料测试缸中饲养;
加有纳米氧化锌或者氯化锌的饵料每日饲喂3次,每次饲喂时缓慢给食,直至幼体停止进食;每日换水量为水体总量的3/4-4/5,以确保体系的氨氮浓度低于0.1mg/L.对于每个浓度,测定鱼的生长各项参数,大量和微量元素以及抗氧化反应。
本发明所具有的有益效果为:本发明通过测定两种不同消化方式的海水鱼对纳米氧化锌的同化效率,证实纳米氧化锌较传统无机氯化锌对日本青鳉鱼(无胃)有更高的生物可利用性,且在正常饵料添加浓度下(80mg Zn/kg) 能够显著提高日本青鳉鱼的抗氧化性能。然而,对于有酸消化过程的海水鱼 (有胃),由于酸消化会使纳米氧化锌逐渐溶解从而丧失纳米效应,使得纳米氧化锌的同化效率与氯化锌相同。
附图说明
图1A、图1B为纳米氧化锌的材料表征,(A)纳米氧化锌的透射电镜图 (图中标尺为20纳米),(B)纳米氧化锌的X射线元素能谱图。
图2A和图2B为日本青鳉鱼(Medaka)和美国红鼓鱼(Red drum)对纳米不同浓度(80和300mg/kg)纳米氧化锌和氯化锌的同化效率。
图3为纳米氧化锌在体外酸消化和碱消化过程中的解离曲线,氯化锌为对照处理组。
图4A、图4B、图4C、图4D为饲喂纳米氧化锌或氯化锌四周后日本青鳉鱼抗氧化能力的变化,其中GSH为谷胱甘肽,SOD为超氧化物歧化酶,CAT 为过氧化氢酶,MDA为丙二醛。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明,在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
参照图1至图4
1.1实验材料
3月龄日本青鳉鱼(Oryzias melastigma)饲养于自然循环海水中(盐度31ppt, pH8.03,溶氧>6mg/L),每天饲喂丰年虾幼虫两次,饲喂量按每日体重5%计。每天利用虹吸收取青鳉鱼鱼卵,并将鱼卵放置于灭菌海水中。在恒温25度的条件下,青鳉鱼幼鱼需花10天左右孵出。刚孵出的稚鱼用轮虫饲喂,并随着鱼个体长大,逐渐过渡到用丰年虾幼虫饲喂。
3月龄美国红鼓鱼(Sciaenops ocellatus;约2g)买自广东省深圳市南澳镇。鲜鱼经陆运3小时内运达香港科技大学海洋实验室,并在自然循环海水中饲养一周后再进行相关实验。起先使用冻虾进行饲喂,随后慢慢过渡到人工实验饵料进行驯化。
实验所用的放射性和稳定纳米氧化锌,按Li and Wang(2013)的方法合成。该法合成的纳米氧化锌粒径约为5-30纳米(图1A),且纯度较好,基本无杂质(图1B)。
1.2实验设计
为了全面探索纳米氧化锌作为人工饵料的新型锌源材料的潜能以及潜在毒性,该实验同时结合短期实验和长期实验进行综合评估。在短期实验中,放射性同位素示踪法被用于精准测定纳米氧化锌对两种不同消化方式鱼类 (日本青鳉鱼和美国红鼓鱼)的生物可利用性。同时,配置人工消化液,测定纳米氧化锌在酸消化和碱消化过程中的解离能力。由于在短期试验中,纳米氧化锌对于美国红鼓鱼未表现出较氯化锌高的生物可利用性,故长期实验中仅选取日本青鳉鱼。在长期实验中,饲喂日本青鳉鱼含有80mg/kg和 300mg/kg的纳米氧化锌的人工饵料四周,四周后测定各种指标,并对比氯化锌处理组综合评判纳米氧化锌的效能。
1.3人工饵料配制
半纯化的人工饵料的实验配方采用Wang和Wang,(2015,2016)。饵料中粗蛋白,脂肪和灰分的质量分别为3.09%,14.3%和4.4%。实验设置了两个锌浓度,分别为80和300mg/kg。对于纳米氧化锌添加组,合成的纳米氧化锌母液使用前先利用超声波驱散2分钟。添加时,纳米氧化锌或氯化锌母液,缓慢滴落到饵料表面,饵料在玻棒的搅拌下快速混匀。混匀好的饵料在室温条件下干燥3天后,粉碎并存于4度条件下直到使用。
1.4同化效率测定
纳米氧化锌和氯化锌的同化效率均利用放射性同位素示踪法测定,具体方法参见(Wang et al.,1996)。
1.5体外消化实验
人工消化液的根据Oomen et al.(2003)的方法配制,但是考虑到生物蛋白分子对纳米颗粒的吸附作用,其中酶组分被去除。酸消化的pH被调整至2,以代表大多数鱼胃中的情况。在酸消化实验中,1mg/L的纳米氧化锌加入到 15ml酸消化液中,放置于摇床上并以180转/分钟持续旋转。碱消化步骤与酸消化相同。对于每种消化处理,设3个平行已经一个方法控制组(利用氯化锌)。消化过程中,在10,30,60和120分钟分别取样1mL,取样后立即放置于含有3kDa滤膜的超滤管中,进行离心分离。取滤液,测定其中锌离子浓度,以确定纳米氧化锌的解离程度。
1.6长期实验
长期实验采用4周龄日本青鳉鱼(14.9±1.27mm,24.9±2.47mg),在5L 的塑料测试缸中饲养。加有纳米氧化锌或者氯化锌的饵料每日饲喂3次,每次饲喂时缓慢给食,直至幼体停止进食。每日换水量为水体总量的3/4-4/5,以确保体系的氨氮浓度低于0.1mg/L.对于每个浓度,设三个平行。实验结束时,测定鱼的生长各项参数,大量和微量元素以及抗氧化反应。
1.7元素分析
对于固体样品(例如鱼),采用硝酸消化法,即添加70%浓硝酸加热(80 摄氏度)消化过夜。对于液体样品,在液体样品中添加浓硝酸至最终浓度为 2%后停止。所有样品在分析前稀释到仪器工作曲线范围。对于Cu,Zn,Mn,Co 和Se采用ICP-MS,NexION 300X测定,而K,Ca,Mg,Fe and P采用ICP-OES 测定。
1.8抗氧化反应测定
利用Tris-HCl缓冲液提取鱼体内粗酶液。粗酶液中的蛋白采用考马斯亮蓝法测定Bradford(1976)。超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢,丙二醛和谷胱甘肽均采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物有限公司。91.9数据分析
实验数据经Excel初步统计后,利用SPSS18.0软件进行单因子方差分析,所有数据结果以平均数±标准差表示。
结果
2.1不同锌源材料的同化效率
在正常饵料锌添加浓度下(80mg/kg),日本青鳉鱼对纳米氧化锌的同化效率要比氯化锌高40%(图2),而对美国红鼓鱼两种锌源材料无明显差异。当饵料中锌的浓度提升到300mg/kg时,两种锌源材料的同化效率都有所降低,并且之间不存在显著差异(p>0.05)。然而,对于美国红鼓鱼,高浓度的纳米氧化锌的同化效率要高出氯化锌,并且接近于低浓度的同化效率值(46.4%)。
2.2体外消化实验
约50%的纳米氧化锌在酸消化和碱消化过程发生快速解离(10分钟内) (图3)。纳米氧化锌在酸消化条件下,持续解离,至实验结束时(120分钟) 约有85%的纳米氧化锌解离。然而,碱消化条件下,10分钟后,纳米氧化锌几乎不发生解离,各时间点间无显著差异。
2.3长期实验
2.3.1鱼的生长
四周水产实验后,未添加锌源材料处理组各项生长指标最差(表1),尤其是饵料系数(0.46)要显著低于其他处理组。在正常锌添加浓度下(80mg/kg),纳米氧化锌处理组合氯化锌组间无显著差异(p>0.05)。然而,当饵料中锌浓度提高到300mg/kg时,纳米氧化锌处理组的体型指数要显著高于氯化锌处理组。
参照表1,表1饲喂不同剂量不同锌源材料四周后日本青鳉鱼各项生长参数的变化,其中Basal代表不添加任何锌源材料组,80-nano代表食物中添加80mg/kg的纳米氧化锌,80-ion代表食物中添加80mg/kg的氯化锌,300-nano 代表食物中添加300mg/kg的纳米氧化锌,300-ion代表食物中添加300mg/kg 的氯化锌,同一列标有形态字母的数值之间无显著差异(p>0.05)。
表1
Figure BDA0001863149090000051
Figure BDA0001863149090000061
2.3.2鱼体内元素平衡
对于测定的大部分元素(K,Ca,P,Mg,Fe,Cu,Co和Se),各处理组间无显著差异(p>0.05)(表2)。同时,在添加锌源材料的处理组内,各组间锌元素的浓度也无显著差异(p>0.05)。然而,纳米氧化锌处理组的鱼体内Mn含量要高于氯化锌处理组。
参照表2,表2饲喂不同剂量不同锌源材料四周后日本青鳉鱼体内各种元素的变化,其中Basal代表不添加任何锌源材料组,80-nano代表食物中添加80mg/kg的纳米氧化锌,80-ion代表食物中添加80mg/kg的氯化锌,300-nano 代表食物中添加300mg/kg的纳米氧化锌,300-ion代表食物中添加300mg/kg 的氯化锌,同一列标有形态字母的数值之间无显著差异(p>0.05)。
Figure BDA0001863149090000062
2.3.3抗氧化反应
四周水产实验后,未添加锌源材料处理组抗氧化反应最弱,具体体现在谷胱甘肽浓度最低,过氧化氢酶活性最低以及膜脂氧化物丙二醛浓度最高(图 3)。然而,饲喂80mg/kg纳米氧化锌处理组的鱼具有最优的抗氧化反应,相对氯化锌处理组,纳米氧化锌处理组有着1.5-2倍谷胱甘肽含量,0.5倍的丙二醛含量。
结论
在正常饵料添加浓度下,纳米氧化锌作为一种新型锌源材料可显著提高锌元素在无胃海水鱼中的同化效率。而对于有胃海水鱼,由于酸消化会加速纳米氧化锌的解离,从而无法显现出优越性。
以上对本发明实施例所公开的技术方案进行了详细介绍,本文中应用了具体实施例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明实施例,在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种测定纳米锌在不同消化方式海水鱼同化效率的方法,其特征在于,包括利用放射性同位素示踪法测定纳米氧化锌至少在两种不同消化方式的海水鱼的同化效率,并在体外进行解离能力测定,具体是利用人工消化液测定纳米氧化锌在酸消化和碱消化过程中的解离程度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括利用放射性同位素示踪法测定纳米氧化锌至少在两种不同消化方式的海水鱼的同化效率,然后进行纳米氧化锌生长效能测定,具体方法为:在人工饵料中添加80~300mg/kg的纳米氧化锌,对海水鱼进行为期四周的水产实验测试。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酸消化过程中的解离程度的具体步骤为:
人工配置所需的消化液,酸消化的pH被调整至2;
1mg/L的纳米氧化锌加入到15ml酸消化液中,放置于摇床上并以180转/分钟持续旋转;
在10, 30, 60 和120分钟分别取样1mL,取样后立即放置于含有3kDa滤膜的超滤管中,进行离心分离,取滤液,测定其中锌离子浓度,以确定纳米氧化锌的解离程度。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述纳米氧化锌生长效能测定的具体方法为:采用4周龄日本青鳉鱼,规格14.9±1.27 mm, 24.9±2.47 mg,在5L的塑料测试缸中饲养;
加有纳米氧化锌或者氯化锌的饵料每日饲喂3次,每次饲喂时缓慢给食,直至幼体停止进食;每日换水量为水体总量的3/4-4/5,以确保体系的氨氮浓度低于0.1mg/L,对于每个浓度,测定鱼的生长各项参数,大量和微量元素以及抗氧化反应。
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