JP4856471B2 - テトラヒドロビオプテリン産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、高フェニルアラニン血症等のテトラヒドロビオプテリン量低下に起因する疾患の予防治療剤として有用なテトラヒドロビオプテリン産生促進剤に関する。

テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ₄）は、フェニルアラニン水酸化酵素、チロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素など芳香族アミノ酸モノオキゲナーゼの補酵素であり、カテコールアミンやセロトニン合成に重要な役割を果たしている。ＢＨ₄の生体内濃度が低下すると、高フェニルアラニン血症、パーキンソン病、うつ病等の疾患が生じることが知られている。実際に、テトラヒドロビオプテリン自体は、先天性代謝異常の一つである高フェニルアラニン血症の治療薬として広く用いられている。

ＢＨ₄自体を投与するのでなく、生体内でＢＨ₄の産生を促進させてＢＨ₄の低下に起因する疾患を治療しようとする試みもされている（特許文献１及び２）。
特公平６−９２３０２号公報 特開昭６１−１６８８号公報

しかしこれらのＢＨ₄産生促進剤は、いずれもＢＨ₄誘導体又はその類縁化合物であり、合成が極めて困難であるとともに安全性の点でも十分満足できるものではない。
従って、本発明の目的は、容易に入手可能であって、安全性も高い、ＢＨ₄産生促進剤を提供することにある。

そこで本発明者は、植物由来の成分からＢＨ₄産生促進剤を見出すべく種々検索した結果、コーヒー等に含まれるクロロゲン酸類に有意なＢＨ₄産生促進作用があることを見出した。

すなわち、本発明はクロロゲン酸類又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＢＨ₄産生促進剤及びＢＨ₄低下に基づく疾患の予防治療剤を提供するものである。

また、本発明は、クロロゲン酸類又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、テトラヒドロビオプテリンを産生促進する効果を有することを特徴とし、テトラヒドロビオプテリンの低下に伴う疾患の予防または改善をする為に用いるものである旨の表示をした食品又は飲料を提供するものである。

クロロゲン酸類は、優れたＢＨ₄産生促進作用を有し、安全性も高く、入手も容易である。従って、本発明のＢＨ₄産生促進剤は、長期摂取可能であり、ＢＨ₄低下に基づく疾患、例えば高フェニルアラニン血症、パーキンソン病、うつ病、うつ状態等の症状の改善、治療に有用である。

本発明で用いるクロロゲン酸類は、これを含有する天然物、特に植物から抽出することもでき、化学合成により工業的に製造することもできる。

本発明におけるクロロゲン酸類には、立体異性体が存在し、本発明では、純粋な立体異性体又はそれらの混合物を用いることができる。本発明におけるクロロゲン酸類には、具体的には、３−カフェイルキナ酸、４−カフェイルキナ酸、５−カフェイルキナ酸、３，４−ジカフェイルキナ酸、３，５−ジカフェイルキナ酸、４，５−ジカフェイルキナ酸、３−フェルリルキナ酸、４−フェルリルキナ酸、５−フェルリルキナ酸及び３−フェルリル−４−カフェイルキナ酸等が含まれる（中林ら，コーヒー焙煎の化学と技術，弘学出版株式会社，ｐ１６６−１６７）。

クロロゲン酸類は、塩にすることにより水溶性を向上させ、生理学的有効性を増大させることができる。これらの塩としては、薬学的に許容される塩であればよい。このような塩形成用の塩基物質としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；水酸化アンモニウム等の無機塩基、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が用いられるが、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物が好ましい。本発明においては、これらの塩を調製してから、その他の成分からなる組成物中に添加したものでもよいし、クロロゲン酸類等と塩形成成分とを別々に該組成物中に添加して、この中で塩を形成せしめたものでもよい。

クロロゲン酸類を含有する天然物抽出物としては、例えば、コーヒー、キャベツ、レタス、アーチチョーク、トマト、ナス、ジャガイモ、ニンジン、リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アプリコット、チェリー、ヒマワリ、モロヘイヤ、カンショ、南天の葉、ブルーベリー、小麦などの植物から抽出したものが好ましい。

クロロゲン酸類は、コーヒー生豆、南天の葉、リンゴ未熟果等の植物体から抽出したものが好ましく、さらにアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅｅ ａｒａｂｉｃａ ＬＩＮＮＥ）の種子より、温時アスコルビン酸、クエン酸酸性水溶液又は熱水で抽出して得たものがより好ましい。具体的には、生コーヒー豆抽出物としては、長谷川香料（株）「フレーバーフォールダー」、リンゴ抽出物としては、ニッカウヰスキー（株）「アップルフェノン」、ヒマワリ種抽出物としては、大日本インキ化学工業（株）「ヘリアント」などが挙げられる。

後記実施例に示すように、クロロゲン酸類は、血中ビオプテリン濃度が低下した状態を回復させる効果を有し、かつＢＨ₄の産生に関与する酵素の発現を増強させる効果を有することから、ＢＨ₄産生促進剤として有用である。従って、クロロゲン酸類は、ＢＨ₄低下に基づく疾患、例えば高フェニルアラニン血症、パーキンソン病、うつ病、うつ状態等の予防及び治療用医薬、食品および飲料として使用することができる。また、本発明のＢＨ₄産生促進剤は高フェニルアラニン血症、パーキンソン病、うつ病、うつ状態等の予防及び治療用医薬、食品および飲料の製造のために使用することができる。

本発明のＢＨ₄産生促進剤の有効成分であるクロロゲン酸類等は、そのまま服用してもよいが、好ましくは薬学的に許容されうる塩、例えば塩酸塩の形で、賦形剤、担体等の薬品及び食品分野で慣用の補助成分、例えば乳糖、ショ糖、液糖、蜂蜜、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、各種ビタミン類、クエン酸、リンゴ酸、香料、無機塩などとともに、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、点滴剤等にすることができる。

ドリンク剤及び食品の場合、必要に応じ、他の生理活性成分、ミネラル、ビタミン、ホルモン、栄養成分、香味剤等を混合することも可能である。また、緑茶系飲料、烏龍茶系飲料、紅茶系飲料、コーヒー系飲料、アイソトニック系飲料とすることもできる。

本発明の食品及び飲料は、ＢＨ₄が低下している方へ、ＢＨ₄の低下に伴う疾患をお持ちの方へ、ＢＨ₄の低下に伴う疾患を予防又は改善したい方へ等と表示して使用することができる。

本発明のＢＨ₄産生促進剤の服用量は成人１日あたりクロロゲン酸類又はその薬学的に許容される塩として３０〜１４０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは２００〜７６００ｍｇ、特に２５０〜３０００ｍｇが好ましい。効果をより有効に発現させるためには、毎日継続して服用することが好ましいと考えられる。

実施例１（クロロゲン酸（ＣＱＡ）摂取時における血漿中総ビオプテリン（ＢＰ）量の比較）
Ｗｉｓｔｅｒ系ラット（ＳＨＲ：１２週齢、♂；日本ＳＬＣより購入）を用いた。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間の明暗サイクル（明期；ＡＭ７：００〜ＰＭ７：００）下で飼育した。
食餌として標準粉末飼料（ＣＥ−２）、及び、１％ＣＱＡ（Ｃａｙｍａｎ社）含有標準粉末飼料（ＣＥ−２）を１０週間、自由摂食させ、飲料は、水道水を自動給水により自由飲水させた。摂取終了後、ラットにペントバルビタール注射液（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与し、深麻酔状態を確認後、腹部大動脈から全採血した。全血は抗凝固剤（終濃度２ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む採血管に採取し、４℃で、２０００ｘｇで２０分遠心して得られた上清を血漿とした。採血後、ラットから、腎臓組織を摘出し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）に浸漬した。血漿及び組織は、使用時まで−８０℃に保存した。

（１）血漿中総ＢＰ量の測定
ＢＨ₄濃度の測定は、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ＆ Ｎｉｘｏｎの方法（１）に準じて行った。
詳しくは、２００μＬの採取した血漿に、４０μＬ １Ｎ ＨＣｌ、及び、１００μＬヨウ素酸化液（１％ Ｉ₂、２％ ＫＩ）を添加後、混合し、室温、暗所にて１時間静置した。静置後、２０μＬ ５％アスコルビン酸、及び、４０μＬ蒸留水を加え、攪拌し、限外ろ過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０ＮＭＷＬミリポア社使用）後、ヨウ素酸化物を含むろ液を、ＨＰＬＣを用い解析した。得られた解析結果は、全て平均値（Ａｖｅ）±標準誤差（ＳＥ）を用いてグラフにし、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。

（２）ＨＰＬＣ分析条件
分析機器はＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＣＬ−１０Ａｖｐ）を使用した。
装置の構成ユニットは、次の通りである。
ディテクター：分光蛍光検出器（ＲＦ−１０ＡｘＬ）
カラムオーブン：ＣＴＯ−１０ＡＣｖｐ
ポンプ：ＬＣ１０ＡＤｖｐ
オートサンプラー：ＳＩＬ−１０ＡＤｖｐ
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（Ｃ１８）内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒径５μｍ（カラム温度；３５℃）

分析条件は次の通りである。サンプル注入量：５０μＬ、流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、溶離は１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）：ｍｅｔｈａｎｏｌ（９２％：８％）で行い、検出は蛍光検出器（蛍光波長：４５０ｎｍ、励起波長：３５０ｎｍ）を用いた。

（３）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの採取
凍結した組織を、室温にて溶解後、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社）中で、ホモジナイザーを用い破砕した。破砕液にクロロホルムを添加し、混合後、４℃、２００００ｘｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収した。次に、上清に含まれるｔｏｔａｌ ＲＮＡをイソプロパノールを用い沈殿させ（４℃、２００００ｘｇで１５分間遠心分離）、沈殿物を７０％エタノールを用い洗浄後、滅菌蒸留水に溶解させ、ＲＮＡサンプルとした。

（４）ｃＤＮＡの合成
熱変性（６５℃、１０分間）させた１μｇのＲＮＡサンプルを用い、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ^TM Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）により、以下の条件で逆転写反応を行いｃＤＮＡサンプルを合成した。
反応は３７℃で６０分間行い、その後９３℃で５分間処理し、酵素反応を停止した。そ
の後、４℃で急冷した。

（５）遺伝子量の定量（Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ）
ＴａｑＭａｎ^TM １０００ ＲＸＮ Ｇｏｌｄ ｗｉｔｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ Ｐａｃｋ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、ｃＤＮＡサンプルにおける、ＢＨ₄合成酵素遺伝子の定量的ＰＣＲを行った。詳細を以下に記す。
解析にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。
定量的ＰＣＲに使用したプライマー・プローブは表１に示した。反応液組成は下に記す。

今回、解析を行った遺伝子は、３６Ｂ４、ＧＴＰ ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ １（ＧＣＨ １：ＢＨ₄の産生に作用する酵素）、ｑｕｉｎｏｉｄ ｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｉｄｉｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＱＤＰＲ：Ｑ−ＢＨ₂からＢＨ₄を産生する酵素）である。
尚、今回のＰＣＲに用いたＰＣＲプライマーとプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．００を用いて設計した。また、ＰＣＲプライマーとプローブの塩基配列の遺伝子特異性は、Ｗｅｂｓｉｔｅ のＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔで確認した。なお、蛍光標識プローブは、表３のプローブの５’側にＦＡＭ（レポーター色素）を、３’側にＴＡＭＲＡ（クエンチャー色素）を結合させて用いた。

得られた解析結果は内部標準として３６Ｂ４の発現量を用い補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。得られた解析結果は、全て平均値（Ａｖｅ）±標準誤差（ＳＥ）を用いてグラフにし、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。

（６）結果１
ＣＱＡ摂取群及び対照群の血漿中総ＢＰ量を測定した結果、ＣＱＡ摂取群の血漿中総ＢＰ量（２４．２±１．５ｎｇ）は、対照群の血漿中総ＢＰ量（１８．７±１．２ｎｇ）に比較し、統計学的有意（ｐ＜０．０５）に多かった（図１）。

（７）結果２
ＣＱＡ摂取群及び対照群のＧＣＨ１遺伝子発現量を測定した結果、ＣＱＡ摂取群のＧＣＨ１遺伝子発現量（１２１±９．２％）は、対照群（１００±８．８％）のＧＣＨ１遺伝子発現量と比較し、統計学的有意（ｐ＜０．０５）に増加していた（図２）。
また、ＣＱＡ摂取群及び対照群のＱＤＰＲ遺伝子発現量を測定した結果、ＣＱＡ摂取群のＱＤＰＲ遺伝子発現量（１５５±８．７％）は、対照群のＱＤＰＲ遺伝子発現量（１００±１２％）と比較し、統計学的有意（ｐ＜０．０５）に増加していた（図２）。
配合例
製剤例
（１）果汁飲料
クロロゲン酸 ３００ｍｇ
ビタミンＣ ３００ｍｇ
葡萄果汁 ３００ｍＬ
水 ２００ｍＬ
香料 若干量
ブドウ糖 ２ｇ
（２）錠剤
クロロゲン酸 １０（質量％）
乳糖 １０
麦芽糖 １０
ブドウ糖 ２０
グルタミン １０
ビタミンＣ １５
セルロース １０
カフェイン ４
キシリトール ９
ビタミンＥ １
香料 １

クロロゲン酸（ＣＱＡ）摂取時における血漿中総ＢＰ量を示す図である。 クロロゲン酸（ＣＱＡ）摂取時における、ＢＨ₄産生酵素（ＧＣＨ１及びＱＤＰＲ）遺伝子発現量を示す図である。

Claims (2)

1. クロロゲン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする高フェニルアラニン血症の予防又は治療に用いられるテトラヒドロビオプテリン産生促進剤。
2. クロロゲン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする高フェニルアラニン血症の予防治療剤。