JP4847323B2

JP4847323B2 - 栄養失調及び高血漿グルコース状態を治療するためのアルファ−ケトグルタル酸の使用

Info

Publication number: JP4847323B2
Application number: JP2006517059A
Authority: JP
Inventors: ゲー．ピエルシノブスキー，ステファン; ブリン，ダグラス
Original assignee: エッセンティスアクティエボラーグ
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2004-07-01
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2024-07-01
Also published as: CN1822827B; CN1822827A; JP2007529408A; CN101301285A; SE0301947D0

Description

本発明は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるアミノ酸吸収を改善する方法、並びにグルコース吸収を低減する方法に関する。また、前記脊椎動物におけるアミノ酸吸収を改善するための組成物を製造することも検討される。

糖尿病は、慢性的に上昇する血漿グルコース・レベルの存在によって定義される深刻な代謝疾患である。成人における糖尿病の古典的症状は、血漿グルコース・レベルの上昇に伴う、多尿、煩渇多飲、ケトン尿、急速な体重減少である。

正常な空腹時血漿グルコース濃度は、1デシリットル当たり115ミリグラム未満である。糖尿病患者の場合、空腹時濃度は、1デシリットル当たり140ミリグラムを上回ることが判っている。一般には、糖尿病は、膵臓のベータ細胞に対する損傷に応答して発生する。この損傷は、ベータ細胞が自己免疫系によって破壊される一次糖尿病に起因して生じることがあり、或いは、他の原発性疾患、例えば膵臓疾患、インスリン作用の欠乏以外のホルモン以上、薬物又は化学的誘発、インスリン受容体異常、遺伝的症候群又はその他のものに対する二次糖尿病性応答として生じることもある。

一次糖尿病は、I型糖尿病(インスリン依存性糖尿病又はIDDMとも呼ばれる)、及びII型糖尿病(インスリン非依存性糖尿病又はNIDDMとも呼ばれる)として分類することができる。

I型の若年発症糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、良く知られたホルモン欠乏状態であり、このような状態において、膵臓ベータ細胞は、身体固有の免疫防御システムによって破壊されているように見える。I型糖尿病患者は内生的なインスリン分泌能力をほとんど又は全く有さない。これらの患者は極端な高血糖を発生させる。I型糖尿病は、インスリン補充療法が約70年前に導入されるまでは、致命的であった。インスリン補充療法は最初は、動物由来のインスリンを使用していたが、最近では、組換えDNA技術によって形成されたヒト・インスリンを使用する。I型糖尿病におけるベータ細胞の破壊が、2種のホルモン、つまりインスリン及びアミリンの複合的な不足を招くことが現在明らかである。膵臓細胞が破壊されると、インスリン及びアミリンを分泌する能力が失われる。

II型糖尿病における膵臓ベータ細胞の病変の性質は、明らかではない。I型糖尿病における膵臓ベータ細胞とは異なり、II型糖尿病のベータ細胞は、インスリン及びアミリンを合成して分泌する能力を維持する。II型糖尿病は、インスリン及び抵抗性、すなわち、インスリンの作用に対して周囲組織が正常に代謝応答しないことによって特徴付けられる。換言すれば、インスリン抵抗性は、循環するインスリンが正常以下の生体応答を生成する状態である。臨床的に見ると、インスリン抵抗性は、正常な又は高い血漿グルコース・レベルが、正常な又は高いインスリン・レベルに直面し続けるときに存在する。II型糖尿病に関連する高血糖は、インスリンに対する周囲組織の感受性を修復するのに十分な食事又は減量によって逆転又は改善できることもある。事実、II型糖尿病は、正常な血漿インスリン・レベルよりも高いレベルの存在における高血糖によってしばしば特徴付けられる。II型糖尿病の進行は、血漿グルコース濃度の上昇を伴い、グルコース誘発型インスリン分泌の速度の相対的な減少に結びつく。従って例えば、後期II型糖尿病において、インスリン不足が生じることがある。

糖尿病の周知の治療及び予防
糖尿病の全ての形態における治療の主要な目的は同じであり、つまり、血漿グルコース濃度をできる限り正常近くに低減し、これにより、疾患の短期及び長期双方の合併症を最小限にすることである(Tchobroutsky, Diabetologia 15:143-152(1978))。

糖尿病における高血糖の程度と、これに続く長期合併症との関連は、National Institutes of Healthによって企画された、最近完成されたDiabetes Control and Complications Trial(DCCT)においてさらに確認された(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, N. Eng. J. Med. 329:977(1993))。DCCTは、米国及びカナダ国周辺の29件の臨床センターで10年間にわたって行われ、I型糖尿病における平均血漿グルコース濃度を低下させると、このことが末端器官合併症を低減することを示した。網膜症は76%低減され、網膜症の進行は54%低減され、そして腎臓病のマーカー(タンパク尿、アルブミン尿)が改善された。顕著な神経障害性変化の発生も低減された。

I型糖尿病の治療は、非経口ルートによって補充用量のインスリンを投与することに必然的に関与する。正しい食事及び血漿グルコース自己モニタリングと組み合わせて、I型糖尿病患者の大部分は、或る程度の血漿グルコース・コントロール・レベルに達することができる。

I型糖尿病とは異なり、II型糖尿病の治療は多くの場合、インスリンの使用を必要としない。II型糖尿病の治療の実施は通常、典型的には先ず第一に6〜12週間にわたる食事療法及び生活様式改善の試みに関与する。

糖尿病用食の特徴は、規則正しい食事、飽和脂肪含量の制限、これに伴う多価不飽和脂肪酸含量の増大、及び食物繊維の摂取量の増大とともに、十分なしかし過剰でない総カロリー摂取を含む。

生活様式の改善は、体重コントロール及びインスリン抵抗度の低減の双方を補助するものとして、規則正しい運動の維持を含む。

食事及び生活様式の改善を十分に試みたあとで、空腹時高血糖が続く場合には、「一次ダイエット失敗(primary diet failure)」と診断されることがあり、血漿グルコースをコントロールし、これによりこの疾患の合併症を最小限に抑えるために、経口血糖低下治療を試行するか、又はインスリン治療を直接的に実施することが必要となる。食事及び体重減少に対して応答しないII型糖尿病患者は、経口血糖低下治療薬、例えばスルホニル尿素又はビグアニドによる治療に対して応答することがある。しかし他のII型糖尿病治療、特に一次ダイエットに失敗した肥満でない患者、又は一次ダイエットに失敗し二次経口血糖低下治療にも失敗した患者を治療するためには、インスリン治療が用いられる。

糖尿病の治療においてアミリン・アゴニストを使用することが、米国特許第5,124,314号明細書及び同第5,175,145号明細書に記載されている。過剰のアミリン作用はII型糖尿病の主要な特徴を模倣し、新規の治療法としてアミリン遮断が提案されている。

既知の治療薬は、例えばスルホニル尿素を基剤とする糖尿病用錠剤である。スルホニル尿素は、膵臓がより多くのインスリンを形成するのを助け、そして身体がインスリンをより良好に利用するのを助ける。生じ得る副作用：低血糖、胃のむかつき、皮膚発疹又はかゆみ、及び体重増加。

他の錠剤は、肝臓によって産生されるグルコースを制限し、そしてまた体内のインスリン量を低下させ、血中脂肪及びコレステロールを改善するビグアニドを基剤とする。生じ得る副作用は、アルコールとの組み合わせにおける疾患、腎臓の既存の問題及び弱さの悪化、めまい、呼吸困難、吐き気、及び下痢である。

他の錠剤は、澱粉を消化する酵素を遮断するアルファ-グルコシダーゼ・インヒビターを基剤とする。

他の錠剤は、インスリンに対する細胞の感受性を高くするのを助けるチアゾリジンジオンを基剤とする。生じ得る副作用は、肝臓病との組み合わせで使用できないこと(規則的な検査)、低血糖、及び他の治療薬との組み合わせでのみ使用されること、ピルによる避妊効果の低下、体重増加、貧血のリスク、腫脹(浮腫)である。

他の錠剤は、食事後に膵臓がより多くのインスリンを形成するのを助けるメグリチニドを基剤とする。生じ得る副作用は、低血糖、及び体重増加である。

さらに、例えばグリブリド(スルホニルウレアーゼ)及びメトホルミン(ビグアニド)を基剤とする、例えば「グルコバンス(Glucovance)」と称される複合経口薬が存在する。生じ得る副作用は低血糖であり、この薬剤は、腎臓疾患と一緒に使用することはできず、また、アルコールとの組み合わせで使用するべきではない。

米国特許第5,234,906号明細書には、グルカゴン及びアミリン・アゴニストを含む組成物、及び、高血糖状態をコントロール又は治療するためのこれらの使用が開示されている。

国際公開第93/10146号パンフレットには、アミリン・アゴニスト、及びインスリンを必要とする状況、例えば糖尿病を含む低血糖状態を治療又は防止するためのこれらの使用が開示されている。

腎不全及び栄養失調
腎不全及び栄養失調は、腎臓が老廃物を血液から取り除くことができないときの状況である。腎不全は、血中に毒性老廃物を蓄積させる。腎臓は通常、余剰の浄化能力を有しており、腎臓の能力は、発症前の正常値の50%となるおそれがある。症状は、かゆみ、疲労、吐き気、嘔吐、食欲減退による栄養失調である。腎不全はしばしば、糖尿病及び高血圧に関連する。上記症状、すなわち嘔吐及び食欲減退は、腎不全患者の栄養失調をもたらす。

透析処置は、腎臓上の老廃物から圧力を低減する。それでもなお透析は時間のかかる処置であり、患者は週に何度かこれを実施する必要がある。透析処置を受ける患者は医学的な注意を必要とし、この処置には費用も時間も多くかかる。

グルタメート酸化
Windmueller及びSpaeth(1)のin situ ラット研究以来、グルタメート及びグルタミンが、小腸にとって重要な代謝燃料であることが判った。Windmueller及びSpaethは、吸収中の腸管によるグルタメート(〜95%)及びグルタミン(〜70%)の大型分別代謝を最初に報告した。その後、これらの結果は子豚(2)及びヒト(3)の双方においてin vivoで確認された。

グルタメート酸化中、第1のステップは、任意の数の酵素によるアミノ基転移、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)による脱アミノ化であり、GDHの多くは、胃腸管内で発現される(4,5)。GDHによる脱アミノ化はAKGと遊離アンモニアとを産出する。分枝鎖アミノ・トランスフェラーゼ(BCAT)によるアミノ基転移中、グルタメートはアミノ部分を分枝鎖α-ケト酸に付与し、AKG及び対応分枝鎖アミノ酸を形成する。

アルファ-ケトグルタル酸
グルタミン及びその誘導体、例えばアルファ-ケトグルタル酸(AKG)は、クレブス回路を介した全身性及び腸の代謝において中心的な役割を有する。しかしそのメカニズムはまだ完全には理解されていない(Pierzynowski, S.G.及びSjodin, A(1998) J. Anim. a. Feed Sci. 7:79-91；及びPierzynowski, S.G.他編：KBK Knutsen及びJ-E Lindberg., Uppsala 19-21 2001年6月)。

AKG(2-オキソ-ペンタン二酸、2-オキソグルタル酸、アルファ-オキソグルタル酸、アルファ-オキソペンタン二酸、2-ケトグルタル酸、2-オキソ-1,5-ペンタン二酸、2-オキソペンタン二酸、2-オキソ-グルタル酸)は、理論上は、身体の代謝におけるグルタミン、グルタメート、グルタミン酸の分解生成物でありうる。AKGはまたグルタミン及びアルギニンの前駆体としてだけでなく、いくつかの他のアミノ酸の前駆体としても役立つことができ、こうしてタンパク質異化防御体とみなされる。Olin他(1992)は、AKGを魚の餌に添加すると、尿素放出量が低減されることを示した。同様に、ヒトにおいても、他のアミノ酸と混合された完全非経口栄養(TPN)溶液にAKGを添加すると、手術後の窒素損失の良好な防御が観察される(Pierzynowski, S.G.及びSjodin, A(1998) J. Anim. a. Feed Sci. 7:79-91)。ヒトの場合、AKGは筋肉タンパク質分解と一体化されることにより、いわゆる手術後ストレス、例えば異化、飢餓などの期間中の腸管の要求を満たすと思われる。

グルタミン群に関連する代謝物の、良好な機能を果たすための要件は、Reeds他によって最近明らかにされ(1996, Am. J. of Physiol. -Endocrinology and Metabolism 270:413-418)、子豚小腸の初回通過におけるほとんど100%のグルタメート/グルタミン利用率が報告された。

AKGは、オルニチン及びプトレッシンを介してGABA又はスクシネートに至る数少ない変換経路を経由する重要なエネルギー供与体であることができる。AKGは、場合によってはグルタメート/グルタミンへの変換を介して、アンモニウムイオン・スカベンジャーとして働くこともできる。

発表はされていないが、腸細胞がアンモニアからの成長に依存することが認識されている。

このように、上述の問題点に照らして、哺乳動物、例えば猫、犬又はヒトにおける、低血糖(hypoglycemic)状態、例えば糖尿病、並びに糖尿病及び例えば腎不全にしばしば付随する栄養失調を治療・予防する手段及び方法を開発し、しかも従来の手段及び方法に付随する問題点又は副作用を回避することが強く望まれる。また、腎臓病患者並びに糖尿病患者における栄養状態に加えて、健康状態も高める必要がある。この点において、本発明はこれらの必要性及び重要性に対処する。

発明の概要
糖尿病並びにその他の低血糖(hypoglycemic)関連疾患を予防、治療及び/又は改善する際に生じる当業者に知られた前記欠点、及びこのような予防、治療及び/又は改善のための高い医療コストを考慮して、そして例えば糖尿病及び腎不全に付随する栄養失調を直すために、本発明は、糖尿病及び栄養失調を予防、治療及び/又は改善するための新しい改善された方法及び組成物を提供する。

本発明の目的は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるアミノ酸吸収を改善する方法を提供することである。この方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、アミノ酸吸収に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。

本発明の1実施態様の場合、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物が、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸及びアミノ酸誘導体とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、例えばCaAKG、Ca(AKG)₂、及びNaAKGから成る群から選択される。

別の実施態様の場合、脊椎動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット、モルモット又はウサギ；鳥類、例えば七面鳥、メンドリ、鶏又はその他のブロイラー;家畜、例えば牛、馬、豚、子豚又は放し飼いの家畜；あるいはペット、例えば犬又は猫である。

別の実施態様の場合、脊椎動物はヒトである。

さらに別の実施態様の場合、アミノ酸は任意の必須アミノ酸である。

別の実施態様の場合、必須アミノ酸はイソロイシン、ロイシン、リシン及びプロリンである。

本発明はさらに、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるグルコース吸収を低減する方法を含む。この方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、グルコース吸収に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。

本発明はさらに、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物における高血漿グルコース状態を予防、阻害又は軽減する方法を含む。この方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、前記状態に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。

1実施態様の場合、高グルコース状態はI型又はII型糖尿病である。

本発明はさらに、高血漿グルコース状態の予防、軽減又は治療のための組成物を製造するための、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の使用を含む。

1実施態様の場合、高グルコース状態は、I型又はII型糖尿病である。

本発明はまた、栄養失調の予防、軽減又は治療のための組成物を製造するための、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の使用に関する。

使用の1実施態様の場合、組成物は、任意には医薬として許容されるキャリヤ及び/又は添加剤を有する医薬組成物である。

使用の別の実施態様の場合、組成物は食品又は飼料補足物である。

さらに別の実施態様の場合、食品又は飼料補足物は、固形食品及び/又は飲料の形態を成す食事補足物及び/又は成分である。

別の1実施態様の場合、製造された組成物中の、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物は、治療上有効な量で存在する。

別の1実施態様の場合、治療上有効な量は、1日当たり、0.01〜0.2 g/kg体重である。

発明の詳細な説明
定義
本出願及び本発明との関連において、下記定義が当てはまる：

本明細書中に使用される「医薬組成物」は、本発明による治療上有効な組成物を意味する。

本明細書中に使用される「治療上有効な量」又は「有効量」又は「治療上有効な」は、所与の状態及び投与計画に治療上の効果を提供する量を意味する。これは、所要の添加剤及び希釈剤；すなわちキャリヤ又は投与ビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性材料の所定の量である。さらに宿主の活性、機能及び応答の臨床上顕著な欠損を低減し、最も好ましくは予防するのに十分な量を意味するものとする。或いは、治療上有効な量は、宿主における臨床上顕著な状態に改善をもたらすのに十分な量である。当業者には明らかなように、化合物の量はその比活性に応じて変化することができる。好適な投与量は、所要の希釈剤；すなわちキャリヤ又は添加剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性材料の所定の量を含有することができる。本発明の組成物の製造方法及び使用において、治療上有効な量の活性成分が提供される。治療上有効な量は、当業者によく知られているように、患者の特徴、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などに応じて、医療従事者又は獣医学関係者によって決定することができる。

「誘導体」という用語は、本明細書においては、母物質から直接的に、或いは改質又は部分置換によって誘導された化学物質を意味するものとする。

「類似体」という用語は、本明細書においては、別の化合物と構造的に類似してはいるが、必ずしも異性体ではない化合物を意味する。類似体は同様の機能を有するが、しかし構造又は進化上の起源が異なっている。

本明細書中に使用される「治療」は、治癒を目的として治療することを意味し、治癒は状態の完全又は部分的な治癒であってよい。

「軽減」という用語は、本明細書においては、状態又は兆候の強さの低減だけでなく、状態又は兆候の開始を遅らせることをも意味するものとする。

「予防」という用語は、本明細書においては、何かが生じないこと、例えば未熟GITに関連する状態又は兆候が生じないことを保証することを意味するものとする。或る状態又は兆候を予防することにより、このような状態又は兆候の開始が遅らされる。

「アミノ酸吸収の増大」という用語は、本明細書においては、本発明による治療又は投与を受けていない脊椎動物と比較して、脊椎動物におけるアミノ酸の正味吸収が変化することを意味する。前記治療を受けていない同じ種の脊椎動物と比較して、前記脊椎動物において正味吸収が量的に大きい場合には、これらの変化は、増大したと見なされる。

「動態」という用語は、本明細書においては、脊椎動物におけるアミノ酸並びにグルコースの吸収測定値を連続的又は頻繁にモニタリング又は測定することにより、その吸収速度を見極めることを意味するものとする。

本明細書に使用される「ナトリウム-AKG」という用語は、「AKG-Na」、「Na-AKG」、「AKGのNa塩」、「AKG(Na塩)」と相互に置き換え可能に使用される。

本明細書に使用される「キトサン-AKG」という用語は、「AKG-キトサン」、「AKG(キトサン塩)」と相互に置き換え可能に使用される。

I型及びII型糖尿病の診断
I型及びII型糖尿病患者の診断は、当業者の能力及び知識の範囲内で十分に行われる。例えば、高い血漿グルコース濃度に伴う煩渇多飲、多尿、多食(体重減少を伴う又は伴わない)の症状を有する、ケトアシドーシスの病歴を有さない35歳を超える個体は、一般にII型糖尿病の診断範囲に入ると考えられる。肥満、II型糖尿病の陽性家族暦、及び正常な又は高い空腹時血漿インスリン及びc-ペプチド濃度の存在は、大抵のII型糖尿病患者の付加的な特性である。「治療上有効な量」とは、単回又は複数回投与において、II型糖尿病患者の血漿グルコース濃度を有益に低減させる量を意味する。

発明者は今や驚くべきことに、注入部位がAKG吸着に対して効果を有することを見いだした。AKGを十二指腸に注入したあと、アミノ酸吸収が増大し、グルコース吸収が減少することが意外にも観察された。

こうして本発明によって、インスリンを摂取しないII型糖尿病患者において、血漿グルコースを低下させることができる。

栄養失調の診断
栄養失調、すなわち不完全又は不十分な栄養摂取又は栄養不良の患者の診断は、当業者の能力及び知識の範囲内で十分に行われる。通常、個体の全身的な健康状態は、栄養失調を判断するために行われる。

腎不全の診断
腎不全の患者の診断は、当業者の能力及び知識の範囲内で十分に行われる。

腎不全には、急性腎不全及び慢性腎不全(ACF及びCRF)という2つの形態がある。急性腎不全は通常逆転することができるが、慢性腎不全は通常進行する。CRF治療は透析前治療と、例えば透析又は移植による尿毒症の積極的治療に分けられる。出発点に関しては、透析前の正確な定義は存在しないが、しかし通常は、透析前は腎不全の診断時と積極的治療の開始時との間の時間と定義される。透析及び移植が積極的治療と考えられる。

アミノ酸吸収を改善する方法
本発明によれば、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるアミノ酸吸収を改善する方法が開示される。この方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、アミノ酸吸収に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。

アミノ酸吸収は、前記AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を得ていない哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるアミノ酸吸収と比較して改善されたと考えられる。

この方法の更なる実施態様の場合、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物が、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸及びアミノ酸誘導体とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、例えばCaAKG、CaAKG₂、及びNaAKGから成る群から選択される。

別の実施態様の場合、脊椎動物はヒトである。ヒトは、例えば腎不全、糖尿病、運動、年齢(小児及び高齢者)、妊娠、拒食症、多食症、過食症、強制過食、又は特定不能のその他の摂食障害(EDNOS)による栄養失調を治療する必要のある患者であってよい。

脊椎動物、例えば前記ヒトは、アミノ酸、例えば必須アミノ酸、又は条件付き必須アミノ酸、具体的にはイソロイシン、ロイシン、リシン及びプロリンの利用効率及び活用効率を増大させる必要のある任意の脊椎動物であってよい。

必須アミノ酸の例は、アルファ-アミノ酸、例えばヒトの場合、イソロイシン(Ileu)、ロイシン(Leu)、リシン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、スレオニン(Thr)、トリプトファン(Try)、及びバリニン(Val)である。必須アミノ酸は種の間で異なる。ラットは2つの他のアミノ酸、つまりアルギニン(Arg)及びヒスチジン(His)を必要とする。

別の実施態様の場合、アミノ酸は、任意のアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、グリシン及びセリンであってよい。

別の実施態様の場合、アミノ酸は任意の必須アミノ酸、又は条件付き必須アミノ酸である。必須アミノ酸又は条件付き必須アミノ酸を表2に示す。

別の実施態様の場合、必須アミノ酸、又は条件付き必須アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、リシン及びプロリンから成る群から選択される。

グルコース吸収を低減する方法、及び血漿グルコースの増大を予防、阻害又は軽減する方法
血漿グルコース・レベルは、血中のグルコース(糖)の量である。これは血清グルコース・レベルとしても知られている。血中のグルコースの量は、1リットル当たりのミリモル(mmol/l)又はmg/dLとして表される。

通常、血漿グルコース・レベルは、1日全体にわたって狭い限界内、ヒトの場合には約4〜8 mmol/lの範囲内に留まる。グルコース・レベルは、食後により高く、そして普通、朝が最も低い。空腹時レベルは通常約70〜110 mg/dL(3.9〜6.1 mmol/L)であり、食事から2時間後には、レベルは通常約80〜140 mg/dL(4.4〜7.8 mmol/L)である。食事から2時間後の血漿グルコース・レベルが180 mg/dL(10.0 mmol/L)を上回ると、これは通常、高い血漿グルコース値と考えられる。このことはまた、空腹時に140 mg/dL上回る血漿グルコースを有する場合にも当てはまる。

人が例えば糖尿病に罹っている場合、血漿グルコース・レベルはこれらの限界を超えて動くことがある。全ての糖尿病患者における基本的な欠陥は、血液からグルコース(糖)分子を除去するように身体の細胞を誘発するインスリンの能力が減少することである。インスリン活性のこのような減少が、産生されるインスリン量の減少による(I型糖尿病)ものなのか、又は正常量のインスリンに対する細胞の不感受性によるものなのかには関係なしに、結果は同じであり、すなわち血漿グルコース・レベルが過度に高くなる。このことは、「高血糖」と呼ばれる。高血糖は、「血中の高レベルのグルコース」を意味する。通常は、「高血糖」とは、血漿グルコースが240 mg/dL(13.4 mmol/L)を上回る場合を言う。

本発明によれば、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物における血漿グルコース吸収を低減する方法が開示される。この方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、グルコース吸収に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の投与後、
グルコース吸収の減少は、開始時の血漿グルコース値の5〜50%、例えば5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 又は50%である。

別の実施態様の場合、吸収の減少は、開始時の血漿グルコース値の20〜40%である。

別の実施態様の場合、減少は、開始時の血漿グルコース値の30%である
さらに、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物における高血漿グルコース状態を予防、阻害又は軽減する方法が開示される。前記方法は、哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物に、前記状態に対する所望の効果を可能にするのに十分な量及び/又は十分な割合で、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を投与することを含む。

別の実施態様の場合、高グルコース状態は高血糖状態である。

高グルコース又は高血糖状態に関連する前記方法の別の実施態様の場合、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物は、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸及びアミノ酸誘導体とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、例えばCaAKG、CaAKG₂、及びNaAKGから成る群から選択される。

さらに別の実施態様の場合、脊椎動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット、モルモット又はウサギ；鳥類、例えば七面鳥、メンドリ、鶏又はその他のブロイラー;家畜、例えば牛、馬、豚、子豚又は放し飼いの家畜；あるいはペット、例えば犬又は猫である。

さらに別の実施態様の場合、脊椎動物はヒトである。

さらに別の実施態様の場合、前記高グルコース状態は、例えば末端肥大症、クッシング症候群、甲状腺機能亢進症、膵臓癌、膵炎、褐色細胞腫、不十分なインスリン量、又は過剰な食物摂取によるものである。

さらに別の実施態様の場合、高いグルコース・レベルは、I型又はII型糖尿病によるものである。

糖尿病及び栄養失調の治療のためのAKGの使用
本発明によれば、高グルコース状態の予防、軽減又は治療のための組成物を製造するために、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を使用することが開示されている。

高グルコース状態及び高血糖状態の例が前段落に記載されている。

別の実施態様の場合、高血糖状態はI型又はII型糖尿病である。

本発明によれば、栄養失調の予防、軽減又は治療のための組成物を製造するために、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を使用することが開示されている。

前記使用の別の実施態様の場合、前記組成物は、任意には医薬として許容されるキャリヤ及び/又は添加剤を有する医薬組成物である。

別の実施態様の場合、組成物は食品又は飼料補足物である。

別の実施態様の場合、食品又は飼料補足物は、固形食品及び/又は飲料の形態を成す食事補足物及び/又は成分である。

別の実施態様の場合、製造された組成物中の、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物は、治療上有効な量で存在する。

治療上有効な量は、1日当たり、0.01〜0.2 g/kg体重である。

AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の投与
上文で開示した方法によれば、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物は、齧歯類、例えばマウス、ラット、モルモット又はウサギ；鳥類、例えば七面鳥、メンドリ、鶏又はその他のブロイラー;家畜、例えば牛、馬、豚、子豚又は放し飼いの家畜；あるいはペット、例えば犬又は猫に投与される。

投与は、治療されるべき脊椎動物がどのような種であるか、前記方法を必要とする脊椎動物の状態、及び治療すべき特定の徴候に応じて、種々異なる方法で実施することができる。

1実施態様の場合、投与は、食品又は飼料補足物、例えば固形食品及び/又は飲料の形態を成す食事補足物及び/又は成分として実施される。別の実施態様は、懸濁液又は溶液の形態、例えばさらに下で説明するような飲料の形態を成していてよい。

また、剤形は、カプセル剤又は錠剤、例えばチュアブル又は可溶性の、例えば発泡錠、並びに粉剤及び当業者に知られたその他の乾燥フォーマット、例えばぺレット、例えばマイクロぺレット、グラニュール及び顆粒を含むことができる。

投与は、上文で明らかにしたように、非経口、直腸、経口用の食品又は飼料補足物の形態を成していてよい。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油を含む。

食品又は飼料補足物は乳化されてもよい。この場合、活性治療成分を賦形剤と混合することができる。賦形剤は医薬として許容されるものであり、活性成分と相溶性である。好適な賦形剤は例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど、及びこれらの組み合わせである。これに加えて、所望の場合には、組成物は、活性成分の効果を高める少量の補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤を含有することができる。

非経口用の食品又は飼料補足物の種々異なる形態、例えば固形食品、液体、又は凍結乾燥又はその他の形式で乾燥させられた配合物を供給することもできる。このような形態は、種々の緩衝液(例えばTris-HCI、アセテート、ホスフェート) の希釈剤、pH、イオン強度、表面への吸収を防止するための添加剤、例えばアルブミン又はゼラチン、洗剤(例えばTween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩)、可溶化剤(例えばグリセロール、ポリエチレングリコール)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、増量剤又は張性改質剤(例えばラクトース、マンニトール)、ポリマー、例えばポリエチレングリコールと組成物との共有結合、金属イオンとの錯形成、又は高分子化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの粒状調製物内又は調製物上への、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単ラメラ又は多重ラメラ小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上への材料の組込みを含んでよい。

飲料
1実施態様の場合、食品又は飼料補足物は飲料の形態、又はその乾燥組成物の形態で、本発明による方法のいずれかで投与される。

飲料は、有効量のAKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を、栄養的に許容可能な水溶性キャリヤ、例えばミネラル、ビタミン、炭水化物、脂肪及びタンパク質と一緒に含む。AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の例は、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸及びアミノ酸誘導体とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、例えばCaAKG、CaAKG₂、及びNaAKGである。

飲料が乾燥形態で提供される場合、これらの成分の全てが乾燥形態で供給される。消費の準備ができた飲料はさらに水を含む。最終的な飲料溶液は、例えば上記段落に記載された概略的な示唆に基づく緩衝溶液のように、コントロールされた張性及び酸性度を有してもよい。

pHは好ましくは約2〜5、具体的には約2〜4であり、これにより細菌及び菌類の成長を防止する。pH約6〜8の滅菌された飲料を使用することもできる。

飲料は、単独で、あるいは1種又は2種以上の治療上有効な組成物との組み合わせで供給することができる。

AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の使用
本発明によれば、高血糖状態、例えばI型及びII型糖尿病の予防、軽減又は治療のための組成物、並びに栄養失調の治療のための組成物を製造するために、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を使用することが開示されている。

本発明の使用の別の実施態様の場合、組成物は医薬組成物である。この医薬組成物は、医薬として許容されるキャリヤ及び/又は添加剤、例えば本発明に開示された方法及び使用において有用な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び/又はキャリヤと一緒になっていてよい。

さらに、本明細書中に使用される「医薬として許容されるキャリヤ」は、当業者によく知られており、例えば0.01〜0.05 Mリン酸緩衝液又は0.8%生理食塩水を含むことができる。加えて、このような医薬として許容されるキャリヤは、水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであってよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチンレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性キャリヤは、生理食塩水及び緩衝媒質を含む、水、アルコール/水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。非経口用ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油を含む。保存剤及びその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが存在していてもよい。

本発明の使用のさらに別の実施態様の場合、組成物は固形食品及び/又は飲料の形態を成す食事補足物及び/又は成分である。

製造されたこのような組成物、例えば医薬組成物又は食品又は飼料補足物は、本発明による組成物を含み、そして任意にはキャリヤ、及び/又は任意の高血糖状態、例えばI型及びII型糖尿病、並びに栄養失調に影響を与える所定量の第2の活性成分又は更なる活性成分を含むことができる。

医薬組成物の投与量
本発明によれば、本発明による組成物を製造するためのAKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の使用は、それを必要とする哺乳類及び鳥類のような脊椎動物に、治療上有効な量を投与することを含む。このような治療上有効な量は、1日当たり、約0.01〜0.2 g/kg体重である。

AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物
本発明によれば、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物含まれる。AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物の例は、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸及びアミノ酸誘導体とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、例えばCaAKG、CaAKG₂、及びNaAKGである。

投与対象
当業者には明らかなように、本発明の方法及び医薬組成物は、それを必要とする任意の脊椎動物、例えば鳥類(例えば七面鳥、メンドリ、鶏又はその他のブロイラー)、及び自由に移動する動物、又は哺乳動物(例えば家庭の動物、例えば猫又は犬、家畜、例えば牛、馬、山羊、羊及び豚)、野生にいるか動物園にいるかにかかわりなく野生動物、研究動物、すなわち獣医学用のマウス、ラット、ウサギ、山羊、羊、豚、犬、猫などに投与するのに特に適している。

また、任意の高いグルコース・レベル又は高血糖状態、例えばI型及びII型糖尿病、並びに例えば腎不全やI型及びII型糖尿病後の栄養失調に付随する任意の状態の治療における投与対象として、ヒトも含まれる。

さらに、投与対象は、アミノ酸、例えば必須アミノ酸、又は条件付き必須アミノ酸、具体的にはイソロイシン、ロイシン、リシン及びプロリンの利用効率及び活用効率を増大させる必要のある上述のような任意の脊椎動物であってもよい。ヒトは、例えば腎不全、手術、例えば膵臓摘出又は移植、老人性の状態、糖尿病、運動、年齢(小児及び高齢者)、妊娠、拒食症、多食症、過食症、強制過食、栄養障害、代謝障害、又は特定不能のその他の摂食障害(EDNOS)、褥瘡、食欲のない脊椎動物、あるいは消耗性疾患に基づいて、栄養失調の治療又はアミノ酸の利用効率及び活用効率の増大を必要とする患者であってもよい。

参考文献
(ここに挙げる全ての参考文献全体を参考のため本明細書中に引用する)

非限定的な数多くの実施例に基づいて、以下に本発明を説明する。開示された特定の実施態様に関連して本発明を説明してきたが、当業者ならば他の実施態様、改変形又は組み合わせに想到することができる。これらに関して具体的に言及はしないが、これらは添付の特許請求の範囲に含まれる。

実施例1-2の材料及び方法
動物の管理
米国農務省ガイドラインに従った動物の収容及び世話
研究の設計
雌の子豚(n=9)をTexas Department of Criminal Justice, Huntsvill, TXから購入した。

豚（１４日齢）がChildren's Nutrition Research Centerに到着し、7日間の調節期間にわたって、豚に液体代用乳の食事(Litter Life, Merrick, Middleton, WI)を50g/(kg・日)の割合で与えた。

代用乳の組成(乾物1kg当たり)は、500gのラクトース、100gの脂肪、及び250gのタンパク質であった。

7日後、食料を子豚から一晩回収し、既述(2)のように手術に向けて準備した。

手短に言えば、イソフルラン麻酔及び無菌の状態で、子豚において、ポリエチレン・カテーテル(外径1.27 mm, Becton Dickinson, Sparks, MD)を総門脈内に、そしてシラスティック・カテーテル(外径1.78 mm)を外頸静脈及び頸動脈内に埋め込んだ。

超音波流量プローブ(内径8〜10 mm, Transonic, Ithaca, NY)を門脈の周りに配置した。

シリコーン・カテーテル(外径2.17 mm, Baxter Healthcare, McGaw Park, IL)を十二指腸内腔内に埋め込んだ。カテーテルに、ヘパリン(2.5 x 10⁴U/L)を含有する滅菌生理食塩水を満たし、これらのカテーテルを左脇腹(門脈及び十二指腸のカテーテル、流量プローブ・リード)又は肩甲骨間(頸静脈及び頸動脈のカテーテル)で露出させた。

手術直前に、動物は抗生物質(20 mg/kgエンロフロキサシン、Bayer, Shawnee Mission, KS)の筋内注射、及び鎮痛剤(0.1 mg/kg酒石酸ブトルフェノール、Fort Dodge Labs, Fort Dodge, IA)の筋内注射を受けた。

手術後に経腸栄養を再開する前に、1日当たり5 mL/1kgの割合で24時間にわたって完全非経口栄養で豚を管理した。豚を7日間にわたって手術から回復させておいた。全ての子豚において、摂取量及び体重増加速度は手術前のレベルに戻っていた。

試料の準備
血液試料を氷上に直ちに置き、そして遠心分離した。

血漿を捕集し、液体N₂中で直ちに凍結し、そして分析まで-80℃で貯蔵した。

アミノ酸分析
血漿アミノ酸分析のために、等量の血漿の0.2 mLアリコートを、メチオニンスルホン(4 mmol/L)の水溶液と混合し、そして10 kDaカットオフ・フィルターを通して10,000 x gで120分間にわたって遠心分離した。

濾液の50 μLアリコートを乾燥させ、そしてアミノ酸を、これらのフェニルイソチオシアネート誘導体の逆相HPLCによって分析した(Pico Tag, Waters, Woburn, MA)。

Bergmeyer及びBernt(8)の方法をわずかに改変して、血漿AKGを測定した。

手短に言えば、100 mmol/L リン酸緩衝液(pH 7.6)、4 mmol/L 塩化アンモニウム、及び50 μmol/L NADHから成る作業溶液0.5 mL中で、アッセイを実施した。

作業溶液には、1〜10mmolのAKGを含有する適量の血漿を添加した。

初期吸収度測定値を340 nmで得た。

初期吸収度測定の後で、〜6単位(10 μL容積中)のウシGDH(G2501; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を各管に添加した。

10分のインキュベーションの後で、第2回吸収度測定値を340 nmで得た。

試料中のAKGの量は、第1測定値と第2測定値との間の吸収度の減少に対して正比例する。

AKG濃度は、標準曲線を用いて計算した。

血漿アンモニア測定
分光光度測定アッセイ・キット(171-C, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用して、血漿アンモニアを測定した。

血漿グルコース測定
分光光度測定アッセイ・キット(315-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用して、血漿グルコースを測定した。

血液重炭酸塩測定
血液重炭酸塩の濃縮を評価するために、全血のアリコート(1.0 mL)を10 mLのVacutainer(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)内に入れ、0.5 mLの過塩素酸(10% wt/wt)を添加した。

ソーダ石灰(Sodasorb; Grace Container Products, Lexington, MA)を通して濾過された室内空気(10 mL)をVacutainer内に注入し、気密シリンジ内に取り出し、そして第2のVacutainerに移した。

ガス試料中の二酸化炭素の同位体濃縮を、連続流ガス同位体比質量分析計(ANCA; Europa Instruments, Crewe, U.K.)で測定した。

血漿ケトイソカプロン酸の測定
カチオン交換クロマトグラフィ(AG-50V樹脂、Bio-Rad)によって、血漿ケトイソカプロン酸(KIC)を分離した。

溶出物を水酸化ナトリウム(100 μL; 10N)及びヒドロキシルアミンHCl(200 μL; 0.36 M)で処理し、そして加熱した(60℃;30分)。冷却後、試料のpHを<2に調節した。

5mLのエチルアセテート中でケト酸を抽出し、そしてこれを室温で窒素下で乾燥させた。

50 μLのN-メチル-N-t-ブチル-ジメチルシリル-トリフルオロアセトアミド+1% t-ブチル-ジメチルクロロシランを添加することにより、KICの誘導体化を達成した。

316 m/z及び317 m/zでイオンをモニタリングすることにより、Hewlett Packard 5890 Series II GCと共にHewlett Packard 5970 GC-質量分析計によって、KICの同位体濃縮を測定した。

血漿尿素同位体濃縮の測定
EI GC-MS分析によって、血漿尿素同位体濃縮を測定した。200 μLの氷温アセトンを用いて、50 μLの血漿からタンパク質を析出した。

ボルテックスにかけた後、遠心分離によってタンパク質を分離し、そして上澄みを取り出し、窒素下で乾燥させた。

乾燥した上澄みに、マロンアルデヒドbid(ジメチルアセタール)と濃塩酸(30 wt%)との1:20希釈物250 μLを添加し、試料を室温で2時間にわたってインキュベートし、次いで乾燥するまで蒸発させた(Speedvac, Savant Instruments, Forma Scientific, Marietta, OH)。

50 μLのN-メチル-N-t-ブチル-ジメチルシリル-トリフルオロアセトアミド+1% t-ブチル-ジメチルクロロシランで、尿素を誘導体化し、そして153〜155 m/zでイオンをモニタリングすることにより、EI GC-MS分析を用いて血漿中の同位体濃縮を測定した。

計算
代謝物の正味門脈収支[μmol/(kg h)]を下記のように計算した：
(Conc._PORT - Conc._ART) x PBF (1)
上記式中、Conc.は血液(μmol/L)中の濃度であり、PORT及びARTは、門脈及び動脈の血液を意味し、PBFは門脈血液流量[L/(kg h)]である。

全身ロイシン・フラックス[Q; μmol/(kg h)]を下記のように計算した：
Q = R*[(IE_infusate/IE_plasma)-1] (2)
上記式中、Rはトレーサー注入速度[μmol/(kg h)]であり、IE_infusateは、注入されたトレーサーの、そしてIE_plasmaは血漿KICの同位体濃縮率(mol%として表す)である。

身体CO₂産生を下記のように計算した：

上記式中、IE 注入物は、注入物中のH¹³CO₃ ^-の濃縮率(モル百分率過剰)であり、IE 動脈重炭酸塩は、動脈血液中の濃縮率(モル百分率過剰)であり、i.v.重炭酸注入中のトレーサー注入速度[μmol/(kg h)]は、各処理期間に生じたものである。等式全体を0.82で割算して、重炭酸塩中の注入された標識付き炭素の回収率を補正した。

全身ロイシン酸化率[μmol/(kg h)]を下記のように計算する。

[IE _CO2/IE _KIC] x 等式3 (4)
IE _CO2は、1-¹³C-ロイシン注入中の重炭酸塩の同位体濃縮率であり、IE _KICは1-¹³C-ロイシン注入中の1-¹³C-KICの同位体濃縮率である。

全身非酸化的ロイシン処理率(NOLD)は、筋肉内へのロイシン取込みの推定値である。NOLD[μmol/(kg h)]は、下記等式によって計算した：
NOLD = 等式2-等式4 (5)
全身ロイシン出現率(Ra)[μmol/(kg h)]はタンパク質異化の推定値であり、下記のように計算された：
Ra = 等式2-ロイシン摂取 (6)
全身尿素フラックスを下記のように計算した：
尿素フラックス = [([¹⁵N₂]尿素IE/[¹⁵N₂]尿素PE)-1]x[¹⁵N₂]尿素IR (7)
上記式中、IEは注入物濃縮率であり、PEは尿素注入中の定常状態における血漿濃縮率であり、そしてIRは注入速度である。

統計分析
全ての統計試験に関し、p値0.05は統計的な有意性を表すとみなした。

実施例1において、個々のアミノ酸の動脈、門脈及び正味門脈出現に対するAKGの効果、AKG、グルコース、アンモニア及びロイシン動態を、General Linear Model処置(Minitab. Inc., State College, PA)を用いて分析した。モデルは、AKG補足及び豚の効果を含んだ。豚をランダム変数として含んだ。処理平均はLSMEANSオプションを用いてコンピュータ処理した。一方向スチューデントT検定により、AKG正味門脈収支が対照処理中のゼロよりも有意に大きいかどうかを試験した。

実施例1-血漿AKG、グルコース、アンモニア、血流及び全身尿素フラックスの測定
目的
この実施例の目的は、血漿AKG、グルコース、アンモニア、血流及び全身尿素フラックスに対するAKG注入の効果を評価することである。

動物試験
試験開始前の15時間にわたって、子豚には食料を与えなかった。試験当日、-1時間目に、〜920kJ及び12.5 gタンパク質/(kg d)を提供する25%(wt/wt)水溶液として調製された代用乳の、プライミング(7.75 mL/kg; 25% wt/wt水溶液；経口)を伴う連続十二指腸注入[Litter Life, Merrick, Middleton, WI; 7.75 mL/(kg・h)]を行った。

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO製の生理食塩水(対照;930 mmol/L NaCl)又はナトリウム-AKG(Na-AKG)930 mmol/Lを代用乳中に溶解した。

AKGレベルを、実験室以外の以前のデータ(6)に基づいて選択した。この場合、食事乾物の2.5%を上回る摂取率が、AKGの検出可能な門脈収支を観察するのに必要であった。

豚はまた、静脈内(200 μmol/kg)の、¹⁵N₂-尿素[20 μmol/(kg h)](98%; Cambridge Isotope Laboratories)の連続的な6時間注入を受けた。

0時間目に、NaH¹³CO₂(15 μmol/(kg h)；99%; Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA)の、プライミングを伴う連続的な2時間注入を開始した。

NaH¹³CO₂の開始から0, 90, 105及び120分後に動脈試料を得ることにより、全身CO₂産生量を見極めた。

2時間目にNaH¹³CO₂注入を終了させ、1-¹³C-ロイシン(40 μmol/(kg h)；99%; Cambridge Isotope Laboratories)の、プライミング(40 μmol/kg)を伴う連続的な4時間注入を開始した。

ロイシン及び尿素動態並びにアンモニア、AKG、グルコース及びアミノ酸の物質収支の測定のために、4, 5及び6時間目に動脈及び門脈の試料を得た。

全ての豚は、処理時間の間に24時間以上置いて、完全にランダム化された構成で、対照処理及びAKG処理の両方を受けた。

結果
血漿AKG、グルコース、アンモニア、血流、及び全身尿素フラックスを表1に示す。
表1. 代謝物濃度、正味門脈収支、及び全身1-¹³C-ロイシン、及び¹⁵N₂-尿素動態に対するAKG注入の効果

¹AKG、α-ケトグルタレート;²SEM

AKG注入率[930 μmol/(kg h)]は、動脈及び門脈AKG濃度、及びAKGの正味門脈収支を増大させた(P<0.01)。十二指腸内ににAKGが注入されないときにも、AKGの正味門脈吸収率[19.7±2.8 μmol/(kg h)]は0よりも有意に大きかった。しかしAKGの正味門脈吸収率は、対照と比較してAKG処理によって高められた(P<0.001)。AKGの正味門脈収支は、95 μmol/(kg h)であり、この値は、注入された量の10.23%を表すにすぎない。

10.23%の正味門脈収支は実際には、注入されたAKGの吸収を僅かに過大評価している。なぜならば、生理食塩水だけを注入した時に、統計的に有意なAKG吸収があったからである。対照食事からのAKGの吸収に対して補正が行われるならば、門脈排出路内に出現する注入AKGの比率は、8.12%に減少する。

興味深いことに、グルコースの正味門脈収支はAKG処理によって減少(P<0.05)した。門脈血流、アンモニア正味門脈収支及び全身尿素フラックスはAKG処理による影響を受けなかった。

プロリンの動脈濃度及び門脈濃度の双方が増大し(P<0.05)、そして門脈ロイシンは、AKG処理によって増大させられる傾向があった(P<0.01)(データは示さず)。アミノ酸の門脈物質収支を表2に示す。AKG処理は、ロイシン、リシン、及びプロリンの門脈物質収支を増大させ(P<0.05)、そしてイソロイシンの門脈物質収支を増大させる傾向があった(P<0.10)。

表2. 0又は930 μmol/(kg h)AKG(n = 5)の十二指腸注入を受けた豚におけるアミノ酸の正味門脈収支

^a対照とは異なる(P≦0.05)；^b対照とは異なる(P<0.10)
¹AKG、α-ケトグルタレート；²LSMean±SEM

全身ロイシン動態を図1に示す。全身フラックス、NOLD、Ra及び酸化は、AKG処理の影響を受けなかった。

実施例2-AKGの平均管腔内消失率の測定
目的
この実施例の目的は、注入されたAKGボーラスの平均管腔内消失率を評価することである。

動物試験
25mg/mLナトリウムAKG(1040 μmol/kg BW)を含有する液体代用乳(Litter Life, Merrick)の十二指腸ボーラス注入(7.75mL/kg; 25%(wt/wt)水溶液)を、豚(n = 7)に施与した。

1時間後、豚を犠牲にした。

近位十二指腸と遠位回腸で、小腸を注意深くクランプし、2 x 50 mLの生理食塩水で流すことにより、腸を洗浄した。

洗浄したものを捕集し、プールし、そして15 mLアリコートを液体N₂中で急速に冷凍し、後でAKG分析を行うために-80℃で貯蔵した。

結果
1040 μmol/kgのAKGボーラスを注入した。平均管腔内消失率は、1時間で663±38 μmol/kgであった。これは、1040 μmol/kgのAKG注入量のうちの63.8 %を表す。

試験1及び2に関する考察及び総体的な結論
実施例1において、AKGを十二指腸内に連続的に注入し、注入されたAKG量の10%しか門脈排出路内に出現しなかった。

注入されたAKG量の10%しか門脈血漿中に出現しないという観察は、管腔内AKGの最終結果に関していくつかの可能性を生じさせる。AKG門脈出現率が低いことの1つの可能な説明は、管腔内AKG輸送が制限されることである。AKGを輸送することができるナトリウム/ジカルボキシレート共輸送体は、豚刷子縁膜上に存在する(9)ので、AKGが腸細胞によって取り上げられないとは考えにくい。このことを試験するために、我々は、1040 μmol/kgの十二指腸ボーラスを１回注入し、1時間で子豚の小腸から660 μmol/kg超が消失することを見いだした(実施例2)。このように、AKGボーラスのほぼ64%が、わずかに1時間で十二指腸内腔から消失していた。

グルタメート及びグルタミンの正味門脈出現率は、以前に観察されたように(6)、AKG注入による影響を受けなかった。吸収されたAKGがグルタメートに変換されたならば、これは門脈血液中に放出されるか、又は他のアミノ酸に変換されることが可能であった。

しかし、通常の食料供給条件下(参考文献1,2)でPDVによって放出される食事性グルタメート又はグルタミンがほとんどないことを考えると、これらのアミノ酸への実質的な変換が生じたとしても、グルタメート及びグルタミンの放出がAKGによって高められることはないと予期することもできる。腸組織によって、腸内グルタメートからプロリンを合成できることが示されている(10)。プロリン正味門脈収支の増大がAKG処理豚において138.1 μmol/(kg h)であること、及び800 μmol/(kg h)超のAKGが門脈収支において行方不明であることを考えると、プロリン正味門脈収支の増大はAKGからの変換によって完全に説明することができる。しかし、腸細胞におけるAKGからプロリンへのこのような大型の変換は、門脈アンモニア収支の減少を招いたはずであるが、門脈アンモニア収支は変わらないままであった。門脈アンモニア収支に対する効果がないことは、2つの群における全身尿素合成速度が同様であることによっても反映される。

分枝鎖アミノ酸(BCAA)トランスアミラーゼは、AKGと分枝鎖アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)との反応を触媒する。BCAAは、アミノ基転移され、AKGからグルタメートを形成し、そしてBCAAのそれぞれから各ケト酸を形成する。補足的AKGは、グルタメートを形成するためにBCAAのアミノ基転移を刺激することによって、PDVからのBCAAの正味放出量を減少させることができる。ロイシンの門脈放出はAKGによって増大させられたが、それでも全身ロイシン動態に影響を与えることはなかった。リシンの正味門脈収支もAKGによって高められた。多くのアミノ酸の正味門脈収支は、AKG処理を伴う場合に多くのアミノ酸に関して100%に近かったので、AKGがアミノ酸を節約したのか、或いは門脈排出内臓内部のタンパク質分解によってアミノ酸放出を高めたのかは明らかでない。

腸細胞内部のAKGの考えられ得る別の最終結果は、TCA回路を介した酸化である。AKGとして注入された炭素の全てが実際に酸化されてCO₂になったならば、PDVからのCO₂出力が増大されることが予期されるはずであるが、全身中のCO₂の産生量はAKG注入によっては増大しなかった。興味深いことに、グルコースの正味門脈収支はAKG処理によって減少した。

かなりの量のAKGが小腸内腔から消失したが、しかしAKG、又はAKG代謝のアミノ酸生成物の正味収支において、このようなAKGは門脈排出路内で行方不明なので、経腸供給されるAKGの最終結果は明らかでないままである。AKGが十二指腸内に注入されると、管腔内供給物の10%しか門脈排出路内に出現しないが、門脈収支及び化合物の循環濃度を高めるには、この量のAKGで十分である。このように、管腔内のAKGの正確な代謝最終結果に関しては不確実ではあるものの、これらの結果は食事性AKGの腸利用効率が制限されることを示唆する。

その結果として生じる循環AKGの増大は、グルタメート、グルタミン、アンモニア、BCAAの正味門脈出現に対して何の効果も有さなかった。

加えて、全身性AKGの増大も、PDV又は全身ロイシン動態又は尿素フラックスに対して効果を有さなかった。これらの結果は、AKGが胃内に提供された以前のデータと合致する。

実施例3-腸細胞及び血漿へのアミノ酸及びケト酸の吸収、並びにこれらの代謝に与えられる、腸内投与されたNa-AKG及びキトサン-AKGの影響の比較

目的
この実施例の目的は、腸細胞及び血漿へのアミノ酸及びケト酸の吸収、及びこれらの代謝に与えられる、腸内投与されたNa-AKG(又はAKGのNa塩)及びキトサン-AKGの影響を比較することである。また、アミノ酸へのケト酸変換に与えられるNa-AKG及びキトサン-AKGの影響は、血漿アミノ酸レベルをモニタリングすることにより測定される。この研究は、AKGがケト酸からアミノ酸への腸内変換に影響を与え、タンパク質合成を改善するという仮説を試験することになる。

動物試験
この試験では全部で3匹の豚を使用した。これらの豚の体重は約20 kgであった。これらの豚をボックスに個別に入れ、4〜5日間にわたって標準食を与えて新しい施設に適応させた。次いで、豚に外科的にカテーテル及び腸カニューレを埋め込み、そして3〜7日間にわたって回復させておいた。用いられた外科処置は、当業者によって典型的に用いられるものであった。

この事例では手術後、3日間の回復期間を置き、豚には1日に1回(10.00時)に標準食(3%体重)を与えた。回復期間後、Na-AKG投与(試験(ii)参照)、キトサン-AKG投与(試験(iii)参照)、及びAKG投与なし(試験(i)参照)の条件下で血漿中のアミノ酸レベルを測定した。これらをより詳細に以下に示す。

AKG投与条件
試験(i)：
ケト酸及びアミノ酸(Amines)(総容積50 ml)を、^*「朝食等価」の投与量で1時間にわたって十二指腸内(i.d.)注入した。
小分けした10の部分を1時間にわたって与えた(50 ml投与量+50 ml生理食塩水)。
これは対照試験であった。
(^*「朝食等価」は、動物が、朝食に相当する食品中に通常存在するのとほぼ同じ量のアミノ酸を得たことを意味する。)
血液試料(ベースライン^**レベル、0時間)を1, 2, 4時間目に採取した。
(^**ベースライン試料は、アミノ酸/ケト酸注入前の0時点における試料として定義される。)
凝集及びプロテイナーゼ活性をストップさせるためにアプロチニンを含有するエチレンジアミン四酢酸(EDTA)上で、血液試料(動脈、門脈、肝静脈から、アミノ酸分析のための5ml全血)を捕集した。
(処理は、5滴のEDTA+トラシロールの使用、遠心分離、-20℃での血漿凍結を伴うことができる。)

試験(ii)
Na-AKG(50 mlの総容積中)と混合されたケト酸及びアミノ酸(Amines)(総容積50 ml)を、^*「朝食等価」の投与量で1時間にわたって十二指腸内(i.d.)注入した。
(小分けした10の部分、50 ml投与量を、任意には生理食塩水と共に1時間にわたって与えた)。
血液試料(ベースラインレベル、0時間)を1, 2, 4時間目に採取した。
凝集及びプロテイナーゼ活性をストップさせるためにアプロチニンを含有するエチレンジアミン四酢酸(EDTA)上で、血液試料(動脈、門脈、肝静脈から、アミノ酸分析のための5ml全血)を捕集した。

試験(iii)
キトサン-AKG(50 mlの総容積中)と混合されたケト酸及びアミノ酸(Amines)(総容積50 ml)を、^*「朝食等価」の投与量で1時間にわたって十二指腸内(i.d.)注入した。(小分けした10の部分、50 ml投与量を、任意には生理食塩水と共に1時間にわたって与えた)。
血液試料(ベースラインレベル、0時間)を1, 2, 4時間目に採取した。
凝集及びプロテイナーゼ活性をストップさせるためにアプロチニンを含有するエチレンジアミン四酢酸(EDTA)上で、血液試料(動脈、門脈、肝静脈から、アミノ酸分析のための5ml全血)を捕集した。

結果
下記表3は、この調査の結果を示す：
表3. アミノ酸投与後の血液中の遊離アミノ酸の増分増加

IはNa-AKG塩を表す。
IIはキトサン-AKG塩を表す。
Δ時間における増分 = (Δ時間0におけるアミノ酸 - 1、1.5及び2.5時間目のアミノ酸レベル)
結果とともに与えられた種々異なる小文字又は大文字は、p<0.05のときの統計的差異を表す。

試験3に関する考察及び総体的な結論
この実施例は、キトサン-AKG塩が必須アミノ酸吸収を改善することを示した。この改善は、Na-AKGを使用して達成されたものよりも良好である。このような観察は、例えば糖尿病又は高齢の患者に見いだされるような、機能を損なった腸組織におけるアミノ酸吸収を改善するように、食事性アミノ酸をより良好に利用するのに重要であり適切である。

図1は、対照及びAKGを注入された豚における全身ロイシン動態を示す。値は平均±SEM；n=9、それぞれの豚は対照及びAKGを受けた。AKGの値は、差異分析(ANOVA)を用いた場合、対照とは異ならなかった。AKGはα-ケトグルタレート;NOLDは非酸化的ロイシン処理率；Raはロイシン出現率；収支は、NOLDからRAを差し引いたものであり、タンパク質粒ロイシン収支を表す。

Claims

哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物におけるアミノ酸吸収を改善するための医薬組成物であって、アルファ-ケトグルタル酸(AKG)、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を含んで成り、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物が、AKG、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、CaAKG、Ca(AKG)₂、及びNaAKGから成る群から選択される、組成物。
哺乳類及び鳥類を含む脊椎動物における血漿グルコース吸収を低減するための医薬組成物であって、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物を含んで成り、AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物が、AKG、オルニチン-AKG、アルギニン-AKG、グルタミン-AKG、グルタメート-AKG、ロイシン-AKG、キトサン-AKG、並びにアミノ酸とのAKGのその他の塩；AKGの一-及び二-金属塩、CaAKG、Ca(AKG)₂、及びNaAKGから成る群から選択される、組成物。
前記AKG、AKG誘導体又は代謝物、AKG類似体、あるいはこれらの混合物が、1日当たり、0.01〜0.2 g/kg体重の量で存在する、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
医薬として許容されるキャリヤ及び/又は添加剤を更に含んで成る、請求項1又は2に記載の医薬組成物。