JP4813917B2 - Skin cosmetics - Google Patents
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Description
本発明は、抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤及び皮膚化粧料に関するものである。 The present invention relates to an anti-aging agent, an elastase inhibitor, a matrix metalloproteinase-1 inhibitor, an epidermal keratinocyte proliferation promoter, a fibroblast proliferation promoter and a skin cosmetic.
皮膚の真皮・表皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の真皮細胞外マトリックスによって構成されており、若い皮膚においてはこれらの皮膚組織が恒常性を維持することにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすることによって、真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチン、コラーゲン等の産生量が減少するとともに、変性や分解を引き起こす。その結果、角質は異常剥離を始め、肌は張りや艶を失い、肌荒れやシワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワの形成、張りの消失、弾力性の低下等には、エラスチン、コラーゲン等の真皮細胞外マトリックス成分の減少、変性が関与している。 The dermis and epidermis of the skin is composed of epidermal cells, fibroblasts, and dermal extracellular matrix such as elastin and collagen that are outside these cells and support the skin structure. In young skin, these skin tissues By maintaining the homeostasis, moisture retention, flexibility, elasticity and the like are ensured, and the skin is maintained in a fresh state with a tension and gloss. However, elastin, which is a major component of the dermal extracellular matrix, due to the influence of certain external factors such as ultraviolet irradiation, significant air drying, excessive skin washing, etc. The production amount of collagen and the like is reduced, and degeneration and decomposition are caused. As a result, the stratum corneum begins to exfoliate abnormally, the skin loses its tension and gloss, and exhibits aging symptoms such as rough skin and wrinkles. As described above, changes accompanying aging of the skin, that is, formation of wrinkles, disappearance of tension, decrease in elasticity, and the like are associated with reduction and degeneration of dermal extracellular matrix components such as elastin and collagen.
エラスチンは、皮膚組織に弾力性を与える線維であり、加齢等に伴ってエラスチンが分解されると皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。エラスチンを分解する酵素であるエラスターゼは、紫外線の照射により活性化され、これによりエラスチンの分解が加速し、皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。そのため、エラスターゼの活性を阻害することによりエラスチンの分解が抑制され、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善できると考えられる。従来、エラスターゼ阻害作用を有する生薬として、スターフルーツ果実抽出物が知られている（特許文献１参照）。 Elastin is a fiber that gives elasticity to the skin tissue. When elastin is decomposed with aging or the like, the elasticity of the skin is lost and the elasticity is lowered. Elastase, an enzyme that degrades elastin, is activated by irradiation with ultraviolet rays, thereby accelerating the degradation of elastin, losing skin tension and lowering elasticity. Therefore, it is considered that by inhibiting the activity of elastase, the degradation of elastin can be suppressed, and skin aging symptoms such as loss of tension and reduced elasticity can be prevented and improved. Conventionally, a star fruit fruit extract has been known as a herbal medicine having an elastase inhibitory action (see Patent Document 1).
近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックス系プロテアーゼの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。従来、ＭＭＰ−１阻害作用を有する生薬として、マツ科マツ属二葉松類の樹皮の抽出物が知られている（特許文献２参照）。 In recent years, the involvement of matrix proteases has been pointed out as a factor that induces changes associated with skin aging. Among matrix proteases, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) is known as an enzyme that degrades collagen, which is a major component of the dermal extracellular matrix of the skin, but its expression is greatly increased by irradiation with ultraviolet rays. It is believed to increase, contribute to the decrease / denaturation of collagen, and to become a major factor such as the formation of wrinkles on the skin and the decrease in elasticity. Therefore, inhibiting MMP-1 activity is important in preventing and improving skin aging symptoms. Conventionally, the extract of the bark of the pine pine genus Futaba pine is known as a crude drug which has MMP-1 inhibitory action (refer patent document 2).
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、角質層に存在する大部分の細胞は、基底層から産まれた角化細胞である。通常、角化細胞は、基底層で産まれ、徐々に分化しながら上層に移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。 The epidermis has a four-layer structure that starts with the basal layer, which is the lowest layer, and continues to the spiny layer, granule layer, and stratum corneum. Most cells in the stratum corneum are keratinized from the basal layer. It is a cell. Normally, keratinocytes are born in the basal layer, gradually move to the upper layer while being differentiated to form horny cells to form the horny layer, and finally fall off from the horny layer as plaque.
角質層は皮膚の最外殻に存在しており、絶えずターンオーバーを繰り返して一定の厚さと水分量を保持して、外界からの刺激に対するバリアーとしての役割を果たしている。皮膚では、このバリアー機能を維持させるため、角化細胞が基底層で産まれてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層は加齢等によって新陳代謝機能が衰えるため、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を呈することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、皮膚の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を予防・改善できるものと考えられる。 The stratum corneum is present in the outermost shell of the skin, and continuously turns over to maintain a certain thickness and moisture content, thereby serving as a barrier against external stimuli. In order to maintain this barrier function in the skin, the cycle (keratinization) from the time when keratinocytes are born in the basal layer until they become plaque and peel off is repeated in a cycle of usually 4 weeks to perform epidermal metabolism. . However, since this stratum corneum has a metabolic function that deteriorates with aging and the like, it exhibits skin aging symptoms such as wrinkles, dullness, pigmentation, and rough skin. Therefore, it is considered that skin aging symptoms such as wrinkles, dullness, pigmentation, and rough skin can be prevented and improved by promoting the proliferation of keratinocytes and restoring the metabolic function of the skin.
従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有する種々の生薬が知られており（非特許文献１参照）、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、ハス胚芽抽出物（特許文献３参照）等が知られている。 Conventionally, various herbal medicines having epidermal keratinocyte proliferation promoting action are known (see Non-patent Document 1), and those having an epidermal keratinocyte proliferation promoting action have a lotus germ extract (see Patent Document 3), etc. It has been known.
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発で、皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。 The epidermis and dermis of the skin are composed of epidermal cells, fibroblasts, and an extracellular matrix such as collagen that is outside these cells and supports the skin structure. In young skin, fibroblasts proliferate vigorously, and the skin tissue interaction maintains homeostasis, ensuring moisture retention, flexibility, elasticity, and the like. It is kept fresh.
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖能が低下し、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少するとともに架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が始まるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ形成等の皮膚の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ形成、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、線維芽細胞の増殖能の低下が深く関与していると考えられる。 However, when there is an influence of certain external factors such as ultraviolet irradiation, drastic air drying, excessive skin washing, etc., or when aging progresses, the proliferative ability of fibroblasts decreases, and the extracellular matrix The production amount of collagen, which is a main component, is reduced, and the elasticity is reduced by crosslinking. As a result, the moisturizing function and elasticity of the skin are lowered, and abnormal exfoliation of the keratin is started, so that the skin loses its tension and gloss, and exhibits skin aging symptoms such as rough skin and wrinkle formation. Thus, it is considered that the decrease in fibroblast proliferation ability is deeply involved in changes accompanying skin aging, that is, wrinkle formation, dullness, disappearance of texture, decrease in elasticity, and the like.
このような考えに基づき、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化を防止又は改善でき、安全性の高い天然物系の線維芽細胞増殖促進剤について種々の提案がなされている。例えば、五斂子の葉部からの抽出物（特許文献４参照）、ハス胚芽抽出物（特許文献５参照）、有色素米又は有色素米の糠からの抽出物（特許文献６参照）、月桃の葉及び／又は茎からの抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
本発明は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用及び線維芽細胞増殖促進作用を有する物質を見出し、当該物質を配合した皮膚化粧料、並びに当該物質を有効成分とする抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。 The present invention finds a substance having an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action and a fibroblast proliferation promoting action, a skin cosmetic containing the substance, and the substance effective An object is to provide an anti-aging agent, an elastase inhibitor, a matrix metalloproteinase-1 inhibitor, an epidermal keratinocyte proliferation promoter and a fibroblast proliferation promoter as components.
上記課題を解決するために、本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸を配合したことを特徴とし、また、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とする。 In order to solve the above-mentioned problems, the skin cosmetic of the present invention is characterized in that corosolic acid is blended, and the anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinization of the present invention. The cell growth promoter or the fibroblast growth promoter contains corosolic acid as an active ingredient.
本発明によれば、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用及び線維芽細胞増殖促進作用を有する物質を見出し、当該物質を配合した皮膚化粧料、並びに当該物質を有効成分とする抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供される。 According to the present invention, a substance having an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action and a fibroblast proliferation promoting action is found, and a skin cosmetic containing the substance, and the substance Are provided as anti-aging agents, elastase inhibitors, matrix metalloproteinase-1 inhibitors, epidermal keratinocyte proliferation promoters and fibroblast proliferation promoters.
以下、本発明について説明する。
〔抗老化剤，エラスターゼ阻害剤，マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤，表皮角化細胞増殖促進剤，線維芽細胞増殖促進剤〕
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸を有効成分として含有する。
The present invention will be described below.
[Anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter, fibroblast proliferation promoter]
The anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter and fibroblast proliferation promoter of the present invention contain corosolic acid as an active ingredient.
コロソリン酸（corosolic acid）は、次式で表される化学構造を有するトリテルペノイド類化合物の一種である。 Corosolic acid is a kind of triterpenoid compound having a chemical structure represented by the following formula.
コロソリン酸は、コロソリン酸を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる（特開２００５−２９５７０号公報参照）。 Corosolic acid can be produced by isolation and purification from a plant extract containing corosolic acid, or can be produced by synthesis. In addition, when manufacturing by synthesis | combination, the synthesis | combining method is not specifically limited, It can synthesize | combine by a well-known method (refer Unexamined-Japanese-Patent No. 2005-29570).
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。コロソリン酸を含有する植物としては、例えば、ビワ（学名：Eriobotrya japonica）、バナバ（学名：Lagerstroemia speciosa）等が挙げられる。 A plant extract containing corosolic acid can be obtained by an extraction method generally used for plant extraction. Examples of plants containing corosolic acid include loquat (scientific name: Eriobotrya japonica) and banaba (scientific name: Lagerstroemia speciosa).
ビワ（Eriobotrya japonica）は、バラ科の常緑高木であり、果実部は食用にされ、葉部は胃腸虚弱、神経痛、下痢等の治療等に用いられている。ビワは、日本、台湾、中国等に自生しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るビワの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。 Biwa (Eriobotrya japonica) is an evergreen Takagi of the Rosaceae family, the fruit part is edible, and the leaf part is used for the treatment of gastrointestinal weakness, neuralgia, diarrhea and the like. Loquat is native to Japan, Taiwan, China, etc., and can be easily obtained from these regions. The constituent parts of loquat that can be used as the raw material for extraction are not particularly limited. For example, leaf parts, branch parts, bark parts, trunk parts, stem parts, fruit parts, seed parts, flower parts, etc. Or the mixture of these site | parts etc. are mentioned, It is preferable to use a leaf part among these.
バナバ（Lagerstroemia speciosa）は、フィリピンやオーストラリア等の熱帯・亜熱帯地域に広く分布するミソハギ科の植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るバナバの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。 Banaba (Lagerstroemia speciosa) is a plant belonging to the family Lamiaceae widely distributed in tropical and subtropical regions such as the Philippines and Australia, and can be easily obtained from these regions. The constituent parts of banaba that can be used as an extraction raw material are not particularly limited, for example, leaf parts, branch parts, bark parts, trunk parts, stem parts, fruit parts, seed parts, flower parts and other above-ground parts, root parts Or the mixture of these site | parts etc. are mentioned, It is preferable to use a leaf part among these.
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。 A plant extract containing corosolic acid can be obtained by drying an extraction raw material, pulverizing it as it is or using a crusher, and subjecting it to extraction with an extraction solvent. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Moreover, after performing pretreatment, such as degreasing, with a nonpolar solvent such as hexane, it may be used as an extraction raw material. By performing pretreatment such as degreasing, extraction treatment with a polar solvent of a plant can be performed efficiently.
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。 As the extraction solvent, it is preferable to use a polar solvent, and examples thereof include water and hydrophilic organic solvents. These are used alone or in combination of two or more at room temperature or a temperature below the boiling point of the solvent. It is preferable.
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。 Examples of water that can be used as the extraction solvent include pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, and those subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, osmotic pressure adjustment, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。 Examples of hydrophilic organic solvents that can be used as extraction solvents include lower aliphatic alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; 1,3-butylene. Examples thereof include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycol, propylene glycol and glycerin.
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。 When using the liquid mixture of 2 or more types of polar solvents as an extraction solvent, the mixing ratio can be adjusted suitably. For example, when using a liquid mixture of water and a lower aliphatic alcohol, it is preferable to mix 1 to 90 parts by weight of a lower aliphatic alcohol with respect to 10 parts by weight of water. When using a mixed solution, it is preferable to mix 1 to 40 parts by mass of a lower aliphatic ketone with 10 parts by mass of water, and when using a mixed solution of water and a polyhydric alcohol, water 10 It is preferable to mix 10 to 90 parts by mass of polyhydric alcohol with respect to parts by mass.
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。 The extraction treatment is not particularly limited as long as the soluble component contained in the extraction raw material can be eluted in the extraction solvent, and can be performed according to a conventional method. For example, the extraction raw material is immersed in an extraction solvent 5 to 15 times (mass ratio) of the extraction raw material, the soluble components are extracted at room temperature or under reflux, and then filtered to remove the extraction residue. A liquid can be obtained. When the solvent is distilled off from the obtained extract, a paste-like concentrate is obtained, and when this concentrate is further dried, a dried product is obtained.
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からコロソリン酸を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、植物抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコール、アセトンの順で溶出させ、アルコール及びアセトンで溶出される画分として得ることができる。カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られた画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。 The method for isolating and purifying corosolic acid from the extract obtained as described above, the concentrate of the extract or the dried product of the extract is not particularly limited, and may be performed by a conventional method. it can. For example, a plant extract is subjected to column chromatography using a porous material such as silica gel or alumina, a porous resin such as styrene-divinylbenzene copolymer or polymethacrylate, and the order of water, alcohol and acetone. And can be obtained as a fraction eluted with alcohol and acetone. The alcohol used as the eluent in the column chromatography is not particularly limited, and examples thereof include lower aliphatic alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, and their aqueous solutions. Can be mentioned. Furthermore, any organic compound purification means such as reverse phase silica gel chromatography using ODS, recrystallization, liquid-liquid countercurrent extraction, column chromatography using ion exchange resin, etc., for the fraction obtained by column chromatography You may refine | purify using.
以上のようにして得られるコロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有しているため、それらの作用を利用して抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤として使用することができる。なお、抽出処理により得られた植物抽出物はコロソリン酸を含有しており、そのまま抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤の有効成分として使用し得るが、精製してコロソリン酸の純度を高めたものを使用することが好ましい。コロソリン酸の純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層使用効果に優れた抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を得ることができる。コロソリン酸を含有する植物抽出物には、コロソリン酸を含有する植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。 The corosolic acid obtained as described above has an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action or a fibroblast proliferation promoting action, and therefore uses these actions. It can be used as an anti-aging agent, an elastase inhibitor, a matrix metalloproteinase-1 inhibitor, an epidermal keratinocyte proliferation promoter or a fibroblast proliferation promoter. The plant extract obtained by the extraction treatment contains corosolic acid, and is used as it is as an anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter or fibroblast proliferation promoter. Although it can be used as an active ingredient of the agent, it is preferable to use a product that has been purified to increase the purity of corosolic acid. Anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter or fibroblast which is more excellent in use effect by using the one having higher purity of corosolic acid as an active ingredient A cell growth promoter can be obtained. The plant extract containing corosolic acid includes an extract obtained from a plant containing corosolic acid as an extraction raw material, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or these Both of these crudely purified products and purified products are included.
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物のみからなるものでもよいし、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物を製剤化したものでもよい。 The anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter or fibroblast proliferation promoter of the present invention consists of corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid only. Alternatively, corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid may be formulated.
コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物を製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤の形態としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等が挙げられる。 Corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid can be prepared in any form such as powder, granule, liquid, etc. according to a conventional method using a pharmaceutically acceptable carrier such as dextrin and cyclodextrin and any other auxiliary agent. It can be formulated into a dosage form. At this time, as an auxiliary agent, for example, an excipient, a stabilizer, a flavoring agent and the like can be used. As an anti-aging agent, an elastase inhibitor, a matrix metalloproteinase-1 inhibitor, an epidermal keratinocyte proliferation promoter or a fibroblast proliferation promoter formulated with corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid, For example, ointments, external liquids, patches and the like can be mentioned.
なお、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、必要に応じて、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する天然抽出物等を、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。 The anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloprotease-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter or fibroblast proliferation promoter of the present invention may be an elastase inhibitory action, matrix metalloprotease- A natural extract or the like having 1 inhibitory action, epidermal keratinocyte proliferation promoting action or fibroblast proliferation promoting action can be blended with corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid and used as an active ingredient.
本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。また、本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。さらに、本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の抗老化剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The anti-aging agent of the present invention can suppress the degradation of elastin through the elastase inhibitory action possessed by corosolic acid, prevent and ameliorate skin aging symptoms, and also through the matrix metalloproteinase-1 inhibitory action possessed by corosolic acid. It can suppress the degradation of collagen and prevent or improve skin aging symptoms. Further, the anti-aging agent of the present invention can promote the proliferation of epidermal keratinocytes through the action of corosolic acid to promote the proliferation of epidermal keratinocytes, and can prevent or improve skin aging symptoms. Furthermore, the anti-aging agent of the present invention can promote the proliferation of fibroblasts through the action of promoting the proliferation of fibroblasts possessed by corosolic acid, and can prevent or improve skin aging symptoms. However, in addition to these uses, the anti-aging agent of the present invention is significant in that it exhibits an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action or a fibroblast proliferation promoting action. It can be used for all applications.
本発明のエラスターゼ阻害剤は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスターゼの活性を阻害することができる。これにより、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のエラスターゼ阻害剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The elastase inhibitor of the present invention can inhibit the activity of elastase through the elastase inhibitory action of corosolic acid. Thereby, decomposition | disassembly of elastin can be suppressed and the skin aging symptom can be prevented and improved. However, the elastase inhibitor of this invention can be used for all the uses meaningful in exhibiting an elastase inhibitory effect besides these uses.
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性を阻害することができる。これにより、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、これらの用途以外にも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The matrix metalloproteinase-1 inhibitor of the present invention can inhibit the activity of matrix metalloproteinase-1 through the matrix metalloprotease-1 inhibitory action of corosolic acid. Thereby, degradation of collagen can be suppressed, and skin aging symptoms can be prevented and improved. However, the matrix metalloprotease-1 inhibitor of the present invention can be used for all purposes that are meaningful in exhibiting the matrix metalloprotease-1 inhibitory action in addition to these uses.
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進することができ、これにより、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、表皮角化細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The epidermal keratinocyte proliferation promoter of the present invention can promote proliferation of epidermal keratinocytes through the action of corosolic acid to promote epidermal keratinocyte proliferation, thereby preventing and improving skin aging symptoms. be able to. However, the epidermal keratinocyte proliferation promoter of the present invention can be used for all purposes other than these uses, which are meaningful for exerting the epidermal keratinocyte proliferation promoting action.
本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進することができ、これにより、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The fibroblast proliferation promoter of the present invention can promote fibroblast proliferation through the fibroblast proliferation promoting action of corosolic acid, thereby preventing and improving skin aging symptoms. . However, the fibroblast proliferation promoter of the present invention can be used for all purposes other than these uses, which are meaningful for exerting a fibroblast proliferation promoting action.
〔皮膚化粧料〕
本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸を配合したものである。
コロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有しており、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物をそのまま配合してもよいし、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物から製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を配合してもよい。コロソリン酸、コロソリン酸を含有する植物抽出物、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物から製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料にエラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を付与することができる。
[Skin cosmetic]
The skin cosmetic of the present invention contains corosolic acid.
Corosolic acid has an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action or a fibroblast proliferation promoting action, and has excellent usability and safety when applied to the skin. Therefore, it is suitable for blending into skin cosmetics. In this case, corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid may be blended as it is, or anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloprotease- formulated from corosolic acid or a plant extract containing corosolic acid 1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter or fibroblast proliferation promoter may be added. Corosolic acid, plant extract containing corosolic acid, corosolic acid or anti-aging agent formulated from plant extract containing corosolic acid, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter Alternatively, by adding a fibroblast proliferation promoter to the skin cosmetic, the skin cosmetic is imparted with an elastase inhibitory action, a matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, an epidermal keratinocyte proliferation promoting action or a fibroblast proliferation promoting action. be able to.
コロソリン酸を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、リップ、入浴剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。 There are no particular limitations on the skin cosmetics that can contain corosolic acid. For example, ointments, creams, emulsions, lotions, packs, lips, bath preparations, shampoos, rinses, hair arts, hair lotions, soaps, bodies Examples include shampoos.
コロソリン酸を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して、約０．０００１〜１０質量％である。 When corosolic acid is blended into the skin cosmetic, the blending amount can be adjusted as appropriate depending on the type of skin cosmetic, etc., but the preferred blending ratio is about 0.0001 in terms of a standard extract. -10 mass%.
本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。これらの助剤等を併用することで、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。 The skin cosmetic of the present invention is a normal skin cosmetic as long as it does not interfere with the elastase inhibitory action, matrix metalloproteinase-1 inhibitory action, epidermal keratinocyte proliferation promoting action or fibroblast proliferation promoting action of corosolic acid. Main agents, auxiliaries or other components used in the above, such as astringents, bactericides / antibacterial agents, whitening agents, UV absorbers, moisturizers, cell activators, anti-inflammatory / antiallergic agents, antioxidant / active oxygen removers, Fats and oils, waxes, hydrocarbons, fatty acids, alcohols, esters, surfactants, fragrances and the like can be used in combination. By using these auxiliaries and the like in combination, a synergistic effect with other active ingredients used in combination may bring about an excellent effect that is normally expected.
本発明の皮膚化粧料によれば、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。また、本発明の皮膚化粧料によれば、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。 According to the skin cosmetic of the present invention, it is possible to inhibit elastin degradation through the elastase inhibitory action of corosolic acid, prevent and improve skin aging symptoms, and inhibit matrix metalloproteinase-1 possessed by corosolic acid. Through its action, it can suppress the degradation of collagen and prevent or improve skin aging symptoms. In addition, according to the skin cosmetic of the present invention, corosolic acid can promote the proliferation of epidermal keratinocytes through the action of promoting the proliferation of epidermal keratinocytes, and can prevent or improve skin aging symptoms. Through the fibroblast proliferation promoting action of acid, it is possible to promote the proliferation of fibroblasts and to prevent or improve skin aging symptoms.
なお、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤又は皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。 The anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter, fibroblast proliferation promoter or skin cosmetic of the present invention is suitably applied to humans. However, as long as each effect is exhibited, it can be applied to animals other than humans.
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。 Hereinafter, although a manufacture example, a test example, and a compounding example are shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not restrict | limited to each following example at all.
〔製造例１〕コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部３００ｇにエタノール３０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行い、熱時濾過した。得られた濾液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物８３ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を多孔性吸着樹脂（製品名：ダイヤイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）に付し、水５０００ｍＬ、５０質量％メタノール２０００ｍＬ、メタノール２０００ｍＬ、アセトン２０００ｍＬの順で溶出させた。これらの溶出部を薄層クロマトグラフィー（商品名：シリカゲルＦ６０，Ｍｅｒｃｋ社製）に付したところ、メタノール溶出部及びアセトン溶出部にコロソリン酸が含まれていることが確認されたため、これらの溶出部をあわせて（固形分２７．６ｇ）、シリカゲルカラム（移動相：クロロホルム：メタノール＝２０：１から３０：１，富士シリシア社製）を用いて分離・精製し、精製物１５２ｍｇを得た（試料１）。この精製物を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を以下に示す。
[Production Example 1] Production of corosolic acid To 300 g of shredded loquat leaves, 3000 mL of ethanol was added, followed by heating under reflux at 95 ° C for 2 hours, followed by hot filtration. The obtained filtrate was concentrated and dried with an evaporator to obtain 83 g of loquat leaf extract. The obtained loquat leaf extract was applied to a porous adsorption resin (product name: Diaion HP-20, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and eluted in the order of water 5000 mL, 50 mass% methanol 2000 mL, methanol 2000 mL, and acetone 2000 mL. I let you. When these elution parts were subjected to thin layer chromatography (trade name: Silica gel F60, manufactured by Merck), it was confirmed that corosolic acid was contained in the methanol elution part and the acetone elution part. (Solid content 27.6 g) and separation and purification using a silica gel column (mobile phase: chloroform: methanol = 20: 1 to 30: 1, manufactured by Fuji Silysia) to obtain 152 mg of purified product (sample) 1). The result of analyzing this purified product by 13 C-NMR is shown below.
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）＞
17.2（25-C），17.7（24-C），17.8（29-C），17.8（26-C），19.1（6-C），21.6（30-C），24.0（11-C），24.1（27-C），25.1（16-C），28.9（15-C），29.5（23-C），31.3（21-C），33.7（7-C），37.6（22-C），38.7（10-C），38.8（19-C），39.6（4-C），40.1（20-C），40.3（8-C），42.8（14-C），48.1（9-C），48.2（1-C），48.3（17-C），53.7（18-C），56.1（5-C），68.7（2-C），84.0（3-C），125.6（12-C），139.3（13-C），179.8（28-C）
< 13 C-NMR chemical shift δ (assigned carbon)>
17.2 (25-C), 17.7 (24-C), 17.8 (29-C), 17.8 (26-C), 19.1 (6-C), 21.6 (30-C), 24.0 (11-C), 24.1 (27-C), 25.1 (16-C), 28.9 (15-C), 29.5 (23-C), 31.3 (21-C), 33.7 (7-C), 37.6 (22-C), 38.7 ( 10-C), 38.8 (19-C), 39.6 (4-C), 40.1 (20-C), 40.3 (8-C), 42.8 (14-C), 48.1 (9-C), 48.2 (1 -C), 48.3 (17-C), 53.7 (18-C), 56.1 (5-C), 68.7 (2-C), 84.0 (3-C), 125.6 (12-C), 139.3 (13- C), 179.8 (28-C)
以上の結果から、製造例１で得られた精製物が、コロソリン酸であることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the purified product obtained in Production Example 1 was corosolic acid.
〔製造例２〕３％コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部１００ｇに８０質量％エタノール１０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行い、熱時濾過した。得られた抽出液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物１６ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した結果、当該抽出物にコロソリン酸が３質量％含まれていた（試料２）。
[Production Example 2] Production of 3% corosolic acid To 100 g of crushed loquat leaves, 1000 mL of 80% by mass ethanol was added, and the mixture was subjected to reflux extraction at 95 ° C for 2 hours, followed by hot filtration. The obtained extract was concentrated and dried with an evaporator to obtain 16 g of loquat leaf extract. As a result of analyzing the obtained loquat leaf part extract using liquid chromatography under the following conditions, the extract contained 3% by mass of corosolic acid (Sample 2).
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：６５％アセトニトリル
移動相流速：１．２ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
<Liquid chromatography conditions>
Product name: Agilent 1100 (Agilent Technologies)
Stationary phase: Wakosil-II 5C18HG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Column diameter: 4.6 mm
Column length: 250mm
Mobile phase: 65% acetonitrile Mobile phase flow rate: 1.2 mL / min Detector: UV
〔製造例３〕１０％コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部１００ｇに９０質量％エタノール１０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行った後、活性炭（製品名：カルボラフィン，日本エンバイロケミカルズ社製）を用いて濾過した。得られた濾液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、５０質量％エタノールに懸濁させ、当該懸濁液を珪藻土で濾過した。残渣を９０質量％エタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物１．８ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した結果、当該抽出物中にコロソリン酸が１０質量％含まれていた（試料３）。
[Production Example 3] Production of 10% corosolic acid After adding 1000 mL of 90 mass% ethanol to 100 g of shredded loquat leaves and heating and refluxing extraction at 95 ° C. for 2 hours, activated carbon (product name: carborafine, The product was filtered using Nippon Enviro Chemicals. The obtained filtrate was concentrated and dried with an evaporator, suspended in 50 mass% ethanol, and the suspension was filtered through diatomaceous earth. The residue was extracted with 90% by mass ethanol, and the resulting extract was concentrated and dried with an evaporator to obtain 1.8 g of loquat leaf part extract. As a result of analyzing the obtained loquat leaf part extract using liquid chromatography under the following conditions, the extract contained 10% by mass of corosolic acid (Sample 3).
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：６５％アセトニトリル
移動相流速：１．２ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
<Liquid chromatography conditions>
Product name: Agilent 1100 (Agilent Technologies)
Stationary phase: Wakosil-II 5C18HG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Column diameter: 4.6 mm
Column length: 250mm
Mobile phase: 65% acetonitrile Mobile phase flow rate: 1.2 mL / min Detector: UV
〔試験例１〕エラスターゼ阻害作用試験
製造例１〜３により得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、以下のようにしてエラスターゼ阻害作用を試験した。
[Test Example 1] Elastase inhibitory action test The elastase inhibitory action of corosolic acid (samples 1 to 3) obtained in Production Examples 1 to 3 was tested as follows.
９６ウェルプレートにて、０．２ｍｏｌ／Ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した試料溶液５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬのエラスターゼ・タイプIII溶液５０μＬを混合した。その後、上記緩衝液で調製した０．４５１４ｍｇ／ｍＬのN-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide１００μＬを添加して、２５℃で１５分反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、次式に基づき、エラスターゼ阻害率（％）を算出した。 In a 96-well plate, 50 μL of a sample solution prepared with 0.2 mol / L Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 50 μL of 20 μg / mL elastase type III solution were mixed. Thereafter, 100 μL of 0.4514 mg / mL N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide prepared in the above buffer solution was added and reacted at 25 ° C. for 15 minutes. After completion of the reaction, absorbance at a wavelength of 415 nm was measured. A blank test was performed and corrected in the same manner. From the obtained results, the elastase inhibition rate (%) was calculated based on the following formula.
エラスターゼ阻害率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表す。
Elastase inhibition rate (%) = {1- (C−D) / (A−B)} × 100
In the formula, A represents “absorbance at a wavelength of 415 nm when no sample is added / enzyme added”, B represents “absorbance at a wavelength of 415 nm when no sample is added / enzyme is added”, and C is “sample added / enzyme added” "Absorbance at a wavelength of 415 nm", and D represents "absorbance at a wavelength of 415 nm when a sample is added and no enzyme is added".
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、エラスターゼの活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
上記試験の結果を表１に示す。
The inhibition rate was measured by gradually decreasing the sample concentration, and the sample concentration IC 50 (μg / mL) that inhibits the activity of elastase by 50% was determined by interpolation.
The results of the above test are shown in Table 1.
［表１］
試 料 ＩＣ ５０ （μｇ／ｍＬ）
試料１ ４８．４
試料２ ＞４００
試料３ ＞４００
[Table 1]
Sample IC 50 (μg / mL)
Sample 1 48.4
Sample 2> 400
Sample 3> 400
表１に示すように、コロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用を有することが確認された。 As shown in Table 1, corosolic acid was confirmed to have an elastase inhibitory action.
〔試験例２〕マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）阻害作用試験
製造例１〜３により得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、以下のようにしてマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を試験した。
[Test Example 2] Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) inhibitory action test Corosolic acid (samples 1 to 3) obtained in Production Examples 1 to 3 was subjected to matrix metalloproteinase-1 inhibitory action as follows. Tested.
蓋付試験管にて、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）で調製した試料溶液５０μＬ、０．４ｍｏｌ／Ｌのマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１，シグマ社製）溶液（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１））５０μＬ、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのＰｚ−ペプチド（BACHEM Feinchemikalien AG社製）溶液（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１））４００μＬを混合し、３７℃にて３０分間反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え、反応を停止させた。 50 μL of sample solution prepared with 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 20 mmol / L calcium chloride in a test tube with a lid, 0.4 mol / L matrix metalloproteinase-1 (MMP-1, Sigma) solution (solvent: 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 20 mmol / L calcium chloride) 50 μL, and 0.01 mg / mL Pz-peptide (BACHEM Feinchemikalien AG) solution (solvent: 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 20 mmol / L calcium chloride) 400 μL was mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 1 mL of a 25 mmol / L citric acid solution was added to stop the reaction.
その後、酢酸エチル５ｍＬをさらに加えて、激しく振とうした。これを遠心分離し（１６００×ｇ，１０分間）、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様の方法により空試験を行った。得られた結果から、次式に基づき、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害率（％）を算出した。 Thereafter, 5 mL of ethyl acetate was further added and shaken vigorously. This was centrifuged (1600 × g, 10 minutes), and the absorbance of the ethyl acetate layer at a wavelength of 320 nm was measured. A blank test was conducted by the same method. From the obtained results, matrix metalloproteinase-1 inhibition rate (%) was calculated based on the following formula.
ＭＭＰ−１阻害率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加・酵素添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加・酵素無添加時の吸光度」を表し、Ｃは「試料添加・酵素添加時の吸光度」を表し、Ｄは「試料添加・酵素無添加時の吸光度」を表す。
MMP-1 inhibition rate (%) = {1− (C−D) / (A−B)} × 100
In the formula, A represents “absorbance at the time of no sample addition / enzyme addition”, B represents “absorbance at the time of sample addition / no enzyme addition”, and C represents “absorbance at the time of sample addition / enzyme addition”. , D represents “absorbance when sample is added and enzyme is not added”.
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
上記試験の結果を表２に示す。
The inhibition rate was measured by gradually reducing the sample concentration, and the sample concentration IC 50 (μg / mL) that inhibits the activity of matrix metalloproteinase-1 by 50% was determined by interpolation.
The results of the above test are shown in Table 2.
［表２］
試 料 ＩＣ ５０ （μｇ／ｍＬ）
試料１ ４５．９
試料２ ６６．２
試料３ １１０．４
[Table 2]
Sample IC 50 (μg / mL)
Sample 1 45.9
Sample 2 66.2
Sample 3 110.4
表２に示すように、コロソリン酸は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を有することが確認された。 As shown in Table 2, corosolic acid was confirmed to have a matrix metalloprotease-1 inhibitory action.
〔試験例３〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例１，２で得られたコロソリン酸（試料１，２）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
[Test Example 3] Epidermal keratinocyte proliferation promoting action test The corosolic acid (Samples 1 and 2) obtained in Production Examples 1 and 2 was tested for epidermal keratinocyte proliferation promoting action as follows.
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度にＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した各試料（試料１，２）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。 Normal human neonatal foreskin keratinocytes (NHEK) were cultured in normal human epidermal keratinocyte long-term culture growth medium (EpiLife-KG2) at 37 ° C. under 5% CO 2 , and the cells were treated with trypsin. It was collected. The collected cells were diluted with EpiLife-KG2 to a cell density of 1.5 × 10 4 cells / mL, then seeded at 100 μL per well on a collagen-coated 96-well plate, and cultured overnight. After completion of the culture, 100 μL of each sample (samples 1 and 2) dissolved in EpiLife-KG2 was added to each well and cultured for 3 days.
表皮角化細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記式に基づいて表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。 Epidermal keratinocyte proliferation was measured using the MTT assay. After completion of the culture, the medium was removed, and 100 μL of MTT dissolved in PBS (−) at a final concentration of 0.4 mg / mL was added to each well. After culturing for 2 hours, blue formazan produced in the cells was extracted with 100 μL of 2-propanol. After extraction, the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured. At the same time, the absorbance at a wavelength of 650 nm was measured as turbidity, and the difference between the two was used as the amount of blue formazan produced. From each measured absorbance, an epidermal keratinocyte proliferation promotion rate (%) was calculated based on the following formula.
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
試験の結果を、表３に示す。
Epidermal keratinocyte proliferation promotion rate (%) = St / Ct × 100
In the formula, St represents “absorbance when a sample solution is added”, and Ct represents “absorbance when no sample solution is added”.
The results of the test are shown in Table 3.
［表３］
試 料 試料濃度（μｇ／ｍＬ） 表皮角化細胞増殖促進率（％）
１ ３．１３ １２２．３±４．４
０．７８ １２７．１±３．７
０．１９ １１５．８±３．４
２ ３．１３ １１８．０±２．５
０．７８ １１７．３±３．９
[Table 3]
Specimen sample concentration ([mu] g / mL) keratinocytes growth promoting factor (%)
1 3.13 122.3 ± 4.4
0.78 127.1 ± 3.7
0.19 115.8 ± 3.4
2 3.13 118.0 ± 2.5
0.78 117.3 ± 3.9
表３に示すように、コロソリン酸は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。 As shown in Table 3, corosolic acid was confirmed to have an excellent epidermal keratinocyte proliferation promoting action.
〔試験例４〕線維芽細胞増殖作用試験
製造例１〜３で得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、線維芽細胞増殖作用を以下のようにしてＭＴＴ法（J. Immunol. Method 93，157，1986）に準拠して試験した。
[Test Example 4] Fibroblast Proliferation Action Test With respect to corosolic acid (Samples 1 to 3) obtained in Production Examples 1 to 3, the fibroblast proliferation action was determined as follows using the MTT method (J. Immunol. Method 93). , 157, 1986).
２５ｃｍ２の培養フラスコに入れた１０％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）にヒト正常新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）１×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いでトリプシン処理し、遠心分離して細胞を回収した。沈殿として得られた細胞を５％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）に懸濁し、９６ウェルプレートの１穴につき７×１０３個ずつ分注した。 10% FBS-containing medium (α-MEM medium: GIBCO BLR, pH 7.2) placed in a 25 cm 2 culture flask was seeded with 1 × 10 6 human normal neonatal dermal fibroblasts (NBIRGB) at 37 ° C. , and cultured for 4 days under 5% CO 2 -95% air. The cells were then collected by trypsinization and centrifugation. Cells obtained as a precipitate were suspended in 5% FBS-containing medium (α-MEM medium: GIBCO BLR, pH 7.2), and 7 × 10 3 cells were dispensed per well of a 96-well plate.
２４時間培養後、試料（試料１〜３）を溶解した５％ＦＢＳ含有培地を１穴につき１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で３日間培養した。培養後、培地を１穴につき１００μＬずつ除去し、ＭＴＴ試薬（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ(−)溶液）２０μＬを添加し、４．５時間インキュベーションした（増殖した細胞中のミトコンドリア由来の活性酸素がＭＴＴ試薬と反応し、黄色であった試薬の色が５７０ｎｍに吸収のピークを有する青黄色に変わる。）。その後、各穴に１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム−０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を１００μＬずつ分注し、１８時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。別に、試料だけでもブランクをとり、同様の操作を行い吸光度の測定を行った。 After culturing for 24 hours, 100 μL of 5% FBS-containing medium in which the samples (Samples 1 to 3) were dissolved was added at a rate of 100 μL per well, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 -95% air for 3 days. After incubation, remove 100 μL of medium per well and prepare MTT reagent (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide, 5 mg / mL PBS (-) solution) 20 μL was added and incubated for 4.5 hours (reactive oxygen derived from mitochondria in the grown cells reacted with the MTT reagent, and the color of the yellow reagent changed to blue-yellow with an absorption peak at 570 nm). . Thereafter, 100 μL of 10 mass% sodium dodecyl sulfate-0.02 mol / L sulfuric acid solution was dispensed into each well and incubated for 18 hours. After completion of the incubation, absorbance at 570 nm was measured using a microplate reader. Separately, a blank was taken with only the sample, and the absorbance was measured by the same operation.
また、各吸光度測定値は、同時に測定した６５０ｎｍの吸光度を差し引いて、増殖した細胞による濁度の影響を補正した。補正後の各吸光度より下記式に基づいて線維芽細胞増殖促進率（％）を求めた。 In addition, each absorbance measurement value was corrected by subtracting the absorbance measured at 650 nm at the same time to correct the influence of turbidity caused by the grown cells. The fibroblast proliferation promotion rate (%) was determined from the corrected absorbance based on the following formula.
線維芽細胞増殖促進率(％)＝{(Ａ−Ｃ)−(Ｂ−Ｄ)}／(Ｂ−Ｄ)×１００
式中、Ａは「試料添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の吸光度」を表し、Ｃは「試料添加、細胞無添加時の吸光度」を表し、Ｄは「試料無添加、細胞無添加時の吸光度」を表す。
結果を表４に示す。
Fibroblast growth rate (%) = {(AC) − (BD)} / (BD) × 100
In the formula, A represents “absorbance at the time of sample addition”, B represents “absorbance at the time of no sample addition”, C represents “absorbance at the time of sample addition and no cell addition”, and D represents “absorbance without sample addition”. , “Absorbance without addition of cells”.
The results are shown in Table 4.
［表４］
試 料 試料濃度（μｇ／ｍＬ） 線維芽細胞増殖促進率（％）
１ １００ １５７．９±４．２
２ ４００ ２０１．２±３．０
２００ １６０．９±２．６
１００ １３４．６±１．８
３ ４００ １７４．９±６．９
２００ １２４．３±４．４
[Table 4]
Specimen sample concentration ([mu] g / mL) fibroblast growth promoting factor (%)
1 100 157.9 ± 4.2
2 400 201.2 ± 3.0
200 160.9 ± 2.6
100 134.6 ± 1.8
3 400 174.9 ± 6.9
200 124.3 ± 4.4
表４に示すように、コロソリン酸は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。 As shown in Table 4, corosolic acid was confirmed to have an excellent fibroblast proliferation promoting action.
〔配合例１〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１） ０．００１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
ローズマリー抽出物 ０．１ｇ
ハマメリス抽出物 ０．１ｇ
縮合リシノレイン酸ポリグリセリル ３．０ｇ
スクワラン ８．０ｇ
マカダミアナッツ油 ３．０ｇ
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ５．０ｇ
メチルフェニルポリシロキサン ４．０ｇ
塩化ナトリウム ０．５ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸プロピル） ０．１ｇ
香料 適量
１，３−ブチレングリコール ５．０ｇ
グリセリン ３．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
[Formulation Example 1]
A cream having the following composition was produced by a conventional method.
Corosolic acid (Production Example 1) 0.001 g
0.1g dipotassium glycyrrhizinate
Rosemary extract 0.1g
Hamamelis extract 0.1g
3.0g polyglyceryl condensed ricinoleate
Squalane 8.0g
Macadamia nut oil 3.0g
Glyceryl tri-2-ethylhexanoate 5.0 g
4.0 g of methylphenylpolysiloxane
Sodium chloride 0.5g
Preservative (Propyl paraoxybenzoate) 0.1g
Perfume appropriate amount 1,3-butylene glycol 5.0 g
Glycerin 3.0g
Purified water remainder (total amount is 100 g)
〔配合例２〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１） ０．００２ｇ
ニンジン抽出物 ０．１ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
ローヤルゼリー抽出物 ０．１ｇ
モモ葉抽出物 ０．１ｇ
酵母抽出物 ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 適量
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
[Formulation Example 2]
A serum having the following composition was produced by a conventional method.
Corosolic acid (Production Example 1) 0.002 g
Carrot extract 0.1g
Oil soluble licorice extract 0.1g
Royal jelly extract 0.1g
Peach leaf extract 0.1g
Yeast extract 0.1g
Xanthan gum 0.3g
Hydroxyethylcellulose 0.1g
Carboxyvinyl polymer 0.1g
1,3-butylene glycol 4.0 g
Glycerin 2.0g
Potassium hydroxide 0.25g
Fragrance Appropriate amount Preservative (methyl paraoxybenzoate) 0.15g
Ethanol 2.0g
Purified water remainder (total amount is 100 g)
〔配合例３〕
下記組成のパックを常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１） ０．００１ｇ
ポリビニルアルコール １５．０ｇ
カルボメキシメチルセルロース ５．０ｇ
グリセリン ３．０ｇ
エタノール １０．０ｇ
香料 ０．５ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸ブチル） 適量
酸化防止剤（酢酸トコフェロール） 適量
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
[Composition Example 3]
A pack having the following composition was produced by a conventional method.
Corosolic acid (Production Example 1) 0.001 g
Polyvinyl alcohol 15.0g
Carboxymethylcellulose 5.0g
Glycerin 3.0g
Ethanol 10.0g
Fragrance 0.5g
Preservative (butyl paraoxybenzoate) appropriate amount Antioxidant (tocopherol acetate) appropriate amount Purified water remainder (total amount is 100 g)
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤及び皮膚化粧料は、シワの形成、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状の予防・改善に大きく貢献できる。
The anti-aging agent, elastase inhibitor, matrix metalloproteinase-1 inhibitor, epidermal keratinocyte proliferation promoter, fibroblast proliferation promoter, and skin cosmetic of the present invention have wrinkle formation, tension disappearance, elasticity It can greatly contribute to the prevention and improvement of skin aging symptoms such as reduction.
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