JP4810483B2 - 植物系乳酸菌を含む発酵食品 - Google Patents

Description

この発明は、植物系乳酸菌を含む健康食品、及びその製造方法に属するものであり、その安全性が既に認められている乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４を用いた培養液を食することにより生体に於ける抗高血圧効果が期待出来る健康食品及びその製造方法に関する。

高血圧症の大部分を占める本態性高血圧症は、いわゆる生活習慣病の一つとして位置づけられる。本態性高血圧症は、動脈硬化や心臓病、脳梗塞等の主要な原因の一つでもあることから、これの適切な制御は、予防医学の面からも喫緊の課題となっている。本態性高血圧症の治療法にはいくつかあるが、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリン）等のアンギオテンシン転換酵素（以下ＡＣＥ）阻害薬を用いる方法が現在主流である。一方、ある種の食品にも抗高血圧作用をもたらすものが知られていて、日常的にこれらを摂取することにより、副作用の心配なく穏やかな程度の血圧の制御が期待できる。これらの多くは、いわゆる機能性食品或いは健康食品と呼ばれる食品群に属し、魚等に由来するタンパクをタンパク分解酵素で分解した結果生じる低分子ペプチドを主体とした製品で、その機序は、カプトプリル等と同じくＡＣＥ活性を阻害することによるもの、と考えられている。このような抗高血圧食品の一つに乳酸菌を利用するものがある。これは、ラクトバシラス・ヘルベティカス等の乳酸菌によって産生されるプロテアーゼによって牛乳タンパクであるカゼインを分解し、その結果生じるジペプチドやトリペプチドを主体とする一種の発酵乳である。（特開２００３−３２７５４３）
特開２００３−３２７５４３号公報

従来、抗高血圧作用を謳った乳酸菌の多くは、獣乳や糞便由来のいわゆる動物系乳酸菌であり、これらによって発酵を受ける基材もまた牛乳等の動物系のものであって、消費者にとっては商品としての選択の幅が狭い課題があった。

上記課題を解決するため、植物系漬け物から分離選別された乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）の培養液を抗高血圧作用を有する食性素材として使用する乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）の培養液の使用方法を提案する。なお、この明細書に記載された乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓＫＮ−３４）は、この出願の願書に添付した発明者の一人である寄託者中山雅晴宛の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターの受託証（通知年月日２００７年３月２０日、通知番号０６−１７７）のコピーに記載の通り、２００７年３月１３日付で寄託した受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３３６に基づく受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６により寄託されたものである。

また、乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）の培養液を含むことを特徴とする発酵食品及びその製造方法を提案する。更にまた、植物系漬け物から分離選別された乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４を乳酸菌用液体大豆麹培地等に接種して得られた培養液を含むことを特徴とする発酵食品及びその製造方法を提案する。

市販の漬け物から新たに分離された新規乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４株は、植物系乳酸菌であり、一般の漬け物から分離可能なことから、この菌を用いて発酵することにより、容易に安全な発酵食品を提供することができる。乳酸菌用液体大豆麹培地等を用い、これに市販の漬け物から新たに分離された新規植物系乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４株を、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＡＨＵ−３０３５と共に接種することによって得られた培養液を含有する食品を食することによって、ＡＣＥ阻害効果を介した抗高血圧作用が期待出来る。

更に、市販の漬け物由来の植物系乳酸菌並びに酒造り等で用いられている酒精酵母による発酵物であるため長期間服用しても人体への副作用がなく安全性の高い食品となる効果がある。また、乳酸菌用液体大豆麹培地に関しては、本願発明者及び本願出願人により出願された特願２００７−０７３１１３号で表示した内容の通りである。この培養液をそのまま飲用として用いることはもちろん、固形化、粉体化等して医薬品や健康食品として用いたり、他の形態の食品に添加して使用することが可能である。

次に、この発明の実施形態について説明する。

この発明に使用される植物系乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４の選別法を具体的に述べる。市販の漬け物並びに自家製糠床から、１３３種類の乳酸菌株を分離した。分離法は、基本的に岡田らの方法（乳酸菌の科学と技術：学会出版センター）に従った。具体的には、ＧＹＰ寒天培地に上記試料のホモジネートを適量接種し、３０℃で４８時間好気的に培養した。培地の透明環の発現を指標として集落を釣菌し、これをさらに同培地に接種し、単集落を形成させた。単集落を釣菌し、これをＭＲＳ液体培地に接種し、３０℃、２４時間培養した。同培地で２回継代した後、３，５００回転で２０分遠心し、菌体を回収。新鮮滅菌ＭＲＳ液体培地に再浮遊させ、これを１ｍｌずつ滅菌バイアルに分注し、−８０℃の冷凍庫に保存した。試験に於いてはこれを解凍し、適宜ＢＬ寒天培地或いはＭＲＳ液体培地に接種し、上記条件で培養後、試験に供した。尚、当該菌株は、平成１３年６月５日に、市販の西瓜の奈良漬けより分離されたものの一つである

リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４株の菌学的特徴を以下に述べる。
乳酸菌菌属の同定において要求される一般的性状：
ＧＹＰ寒天培地に於いて透明環を形成する白色円形光沢のある菌集落、通性嫌気性、グラム（＋）の短桿菌。ＭＲＳ寒天培地、或いはＢＬ寒天培地において、３０℃での４８時間培養により、上記特徴を示す明瞭な菌集落を形成する。運動性（−）、芽胞（−）、カタラーゼ（−）、ガスの産生（＋）、産生乳酸の型（Ｄ）

乳酸菌菌種の同定に於いて要求される糖分解試験の結果（ＡＰＩ ５０ＣＨによる：日本ビオメリュー社）：
グリセロール（−）、エリスリトール（−）、Ｄアラビノース（−）、Ｌアラビノース（＋）、リボース（−）、Ｄキシロース（＋）、Ｌキシロース（−）、アドニトール（−）、ベータメチルＤキシロシド（−）、ガラクトース（＋）、グルコース（＋）、フラクトース（＋）、マンノース（＋）、ソルボース（−）、ラムノース（−）、ズルシトール（−）、イノシトール（−）、マンニトール（−）、ソルビトール（−）、アルファーメチルＤマンノシド（−）、アルファーメチルＤグルコシド（＋）、Ｎアセチルグルコサミン（＋）、アミグダリン（＋）、アルブチン（＋）、エスクリン（＋）、サリシン（＋）、セロビオース（＋）、マルトース（＋）、ラクトース（−）、メリビオース（＋）、スクロース（＋）、トレハロース（＋）、イヌリン（−）、メレジトース（−）、ラフィノース（＋）、スターチ（−）、グリコーゲン（−）、キシリトール（−）、ゲンチオビオース（＋）、Ｄチュラノース（＋）、Ｄリクソース（＋）、Ｄタガトース（−）、Ｄフコース（−）、Ｄアラビトール（−）、Ｌアラビトール（−）、グルコネート（＋）、２ケトグルコネート（−）、５ケトグルコネート（−）

以上の結果を基にしてアピラボソフト（日本ビオメリュー社）で解析したところ、９９．９％の確率をもってリューコノストック・メゼンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニクムであると同定され、ＥＸＣＥＬＬＥＮＴ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ の評価が得られた。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列約５００ｂｐの解析結果：
ＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＣＡＣＡＧＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＡＧＴＧＴＣＧＣＡＴＧＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＧＧＣＴＡＡＡＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴ

以上の配列を細菌基準株データベースのＢＬＡＳＴを用いて基準菌株との相同性を検索したところ、９９．６％の確率でリューコノストック・メゼンテロイデス・サブスピーシーズ・クレモリスＤＳＭ−２０３４６並びにリューコノストック・メゼンテロイデスＤＳＭ−２０３４３に相同性を示した。以上の結果から、当該菌株はリューコノストック・メゼンテロイデス種に属する株であると同定し、リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（以下ＫＮ−３４）と命名して、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）。

初めに、ＡＣＥ阻害活性を指標として、上記１３３の株から阻害活性の高い数株を選別した。特願２００７−０７３１１３号に記述した乳酸菌用液体大豆麹培地に、各菌株並びに酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＡＨＵ３０３５株を接種し、３０℃で７２時間共生培養した。培養終了後、３，５００回転で２０分間遠心し、菌体を除去した。上清を回収し、０．２μｍで濾過したものを試料とした。試料は、以下の試験直前に沸騰水中で５分間加熱処理して酵素を失活させた。１．５ｍｌ容のプラスチック試験管に１００μｌの２．１５ｍｇ／ｍｌのＨＨＬ（Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、和光純薬）／０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を入れ、さらに同緩衝液を２５μｌ加えた。これに５Ｍの塩化ナトリウム溶液を１０μｌ、各試料液を３５μｌ加え、最後にＡＣＥ（牛肺製、和光純薬）を５ｍＵ／試験管に加えた後、３７℃で１時間攪拌した。その後、０．５Ｎの塩酸を１００μｌ加え、反応を停止させた。続いて酢酸エチルを１ｍｌ加え、１分間十分に攪拌した後、２０００回転で１０分間遠心し、酢酸エチル層と下層とに分けた。酢酸エチル層から８００μｌ採取し、別の試験管に移送して、これを１１０℃で乾固した。これに１Ｍ塩化ナトリウム溶液を１ｍｌ加え、攪拌後、１５分間室温で放置した。その後これを採取し、石英セルに加え、さらに１Ｍ塩化ナトリウム溶液を１ｍｌ加えて混じ、２２８ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度の測定は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製のＵｌｔｒｏｓｐｅｃ ２０００を用いて行った。測定吸光度の値を以下の式に適用し、阻害活性値とした。

ＡＣＥ阻害（％）＝｛（Ｃ−Ｓ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
Ｃ：試料の代わりに０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を加えたセルの吸収
Ｓ：試料由来のセルの吸収
Ｂ：あらかじめ０．５Ｎの塩酸を加えて反応を停止させているセルの吸収
各試料につき３本の試験管を用意し、結果は３本の平均値として表した。その結果、ＫＮ−３４以下数種の菌株が高いＡＣＥ阻害活性を示した。その中で、同定が確かであったＫＮ−３４を以下の実験に供した。

試験管的に高いＡＣＥ阻害活性を示したＫＮ−３４の培養液が、実際に生態の血圧低下作用を示すか否か、自然高血圧発症ラットであるＳＨＲラット／イズモ（日本ＳＬＣ）を用いて調べた。試料には、ＡＣＥ阻害試験で用いたＫＮ−３４の乳酸菌用液体大豆麹培養液上清を用いた。陽性対照として、高血圧治療剤であるカプトプリルを用いた。血圧測定法としては、ソフトロン社製の非観血式自動血圧測定装置を用い、ラットの尾にカフを巻いて、最高血圧と最低血圧を測定した。ラットは購入後数週間の訓化期間を設け、測定に慣れるようにした。一群５匹とし、最高血圧が２００ｍｍＨｇ以上を示す１２週齢で実際の測定に供した。試料は胃ゾンデを用いての単回投与とし、３００ｇ体重当たり５ｍｌ、２．５ｍｌ（５ｍｌを蒸留水で１／２に希釈したもの）、１．２５ｍｌ（同１／４希釈）の３群を設け、陽性対照としては１０ｍｇ／ｋｇに蒸留水に溶解したカプトプリルを投与した。いずれの群も、１匹当たり５ｍｌ／３００ｇ体重に投与した。投与０、４、８、１２、２４時間後に、各自３回／匹ずつ測定した。これの平均値を各個体の値とし、匹数で割って各群の代表値とした。カプトプリルは投与１時間後で最低値を示したが、ＫＮ−３４は投与８時間後で最高血圧、最低血圧共に最低値を示した。また、５ｍｌ、２．５ｍｌ、１．２５ｍｌの各群共に投与８時間後の最高血圧において、０時間に対して有意に低下したが、最低血圧で有意差をもって低下したのは５ｍｌ群のみであった。図１にＫＮ−３４を５ｍｌ投与した群の日内血圧変動を示す。

以上の結果から、濃度５ｍｌ／３００ｇ体重で次の実験を行った。ＡＣＥ阻害試験で好成績であったＫＮ−３４と、低い成績であったラクトコッカス・ラクチスＫＮ−１７、ラクトバシラス・ファーメンタムＫＫ−１０８２の乳酸菌用液体大豆麹培養液上清、並びに中間の値を示した乳酸菌用液体大豆麹培地との比較を行った。陰性対照として蒸留水を５ｍｌ／３００ｇ、陽性対照としてカプトプリル１０ｍｇ／ｋｇを用いた。投与後最低を示した値と０時での値の差を降圧値とし、５匹の降圧値の平均を群の代表値とした。実験は２回行い、同傾向を示すことを確認した。図２は初回の最高血圧差のグラフを示すものである。ＫＮ−３４は、陰性対照である蒸留水投与群に対して有意な抗高血圧作用を示した。一方、ＡＣＥ阻害試験では低い成績であったＫＮ−１７も、ＫＮ−３４とほぼ同様な抗高血圧作用を示した。以上の結果から、ＫＮ−３４はＡＣＥの阻害を介して血圧の降下をもたらすのに対し、ＫＮ−１７は他の経路を介して同様な効果をもたらすものと解釈された。

植物系漬け物から分離された植物系乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４によって発酵された乳酸菌用液体大豆麹培養液を含む発酵食品を提供でき、安全で安価な健康食品として利用可能性が高い。

さらに、植物系乳酸菌株であるリューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４の乳酸菌用液体大豆麹培養液をそのまま飲用として用いることはもちろん、固形化、粉体化等して医薬品や健康食品として提供することが出来る。

ＫＮ−３４とＡＨＵ−３０３５との共生培養による乳酸菌用液体大豆麹培養液（３０℃、７２時間培養）の培養上清５ｍｌ経口投与後のＳＨＲラットの日内血圧変動を示すグラフ 各種乳酸菌株とＡＨＵ−３０３５との共生培養による乳酸菌用液体大豆麹培養液（３０℃、７２時間培養）の培養上清及び各比較液のＳＨＲラット経口投与（各５ｍｌずつ）８時間後の０時間に対する最高血圧の差（ｍｍＨｇ）の比較を示すグラフ

Claims (2)

1. 植物系漬け物から分離選別された乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）を乳酸菌用液体大豆麹培地に接種して得られた培養液を含むことを特徴とする発酵食品。
2. 植物系漬け物から分離選別された乳酸菌リューコノストック・メゼンテロイデスＫＮ−３４（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３３６）を乳酸菌用液体大豆麹培地に接種して得られた培養液を含むことを特徴とする発酵食品の製造方法。

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