JP4792561B2

JP4792561B2 - ヒト免疫不全ウイルス感染・増殖抑制剤

Info

Publication number: JP4792561B2
Application number: JP2004308365A
Authority: JP
Inventors: 浩川上; 昌子森内; 浩幸森内
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2024-10-22
Also published as: JP2006117597A

Description

本発明は、シアリルラクトースを有効成分とするヒト免疫不全ウイルスの感染・増殖抑制剤、及びシアリルラクトースを配合したヒト免疫不全ウイルス感染・増殖抑制用飲食品に関する。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染によって起こる重篤な免疫不全症状の呼称である。エイズの感染拡大は世界的に深刻な状況にあり、世界保健機構（WHO）に報告されたエイズ患者数は、278万人（平成13年11月25日現在）に上るとともに、国連合同エイズ計画（UNAIDS）は、世界のエイズウイルス感染者数は4,000万人との推計報告を発表している（平成13年11月28日）。わが国においても、平成14年3月31日現在、エイズ患者は2,311件、ＨＩＶ感染者は4,649件が報告されている。
当初ＨＩＶ感染は、同性愛者、麻薬常習者等に特徴的な感染症であると考えられていたが、現在では異性間交渉による感染が最も重要な感染経路となっている。エイズの治療法として開発が進められているものには、逆転写酵素阻害剤、ウイルス吸着阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、糖鎖合成阻害剤、中和抗体・受動免疫法、ワクチン、アンチセンス剤、免疫調節剤、遺伝子治療法などがある。

これらの治療法の中で、感染の最も初期に作用する吸着阻害剤を用いた方法は、個体にＨＩＶを侵入させない、あるいは生体内で他の細胞にＨＩＶを感染させないという意味で非常に重要である。
吸着阻害剤を用いた開発の多くは、ＨＩＶのレセプターである白血球分化抗原のＣＤ４に関するものである。ＣＤ４そのものや、毒素や抗体で修飾したＣＤ４分子を用いて、ＨＩＶ感染を阻害することを狙っている（例えば、特許文献１〜３、及び非特許文献１参照。）。このような研究開発の他に、ペプチドＴと呼ばれるペプチドを用いたウイルス吸着競合阻害剤、カブトガニ由来の生体防御ペプチドのタキプレシン・ポリフェムシン類縁体であるＴ２２などを投与する方法が開発されつつある（例えば、非特許文献２参照。）。しかし、これらの吸着阻害物質は、遺伝子組み換えや、化学合成によって製造されたものであり、人体に投与した場合の安全性は未知である。また、製造コストも比較的高く、全世界的にエイズに対する予防が必要なことから、安全で、しかも安価なＨＩＶ吸着阻害方法の開発が強く望まれていた。

本発明者らは、母乳に含まれるオリゴ糖の抗ウイルス作用について研究を進める過程でシアリルラクトースがＨＩＶに対しても作用し強い感染防御効果を有することを初めて見出した。シアリルラクトースは、乳中に多く含まれており、感染防御活性などの生理活性を有していることが知られている。近年、このシアリルラクトースについては、結合様式の違いによりその生理的効果が異なることが解明されつつある。例えば、シアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→３結合したＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃについては、胃炎の原因菌といわれているヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) の付着を阻害すること（例えば、非特許文献３参照。）や、新生児の脳膜炎や敗血症の原因菌であるＳ型大腸菌の付着を阻害すること（例えば、非特許文献４参照。）が報告されている。また、シアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→６結合したＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃについては、Ａ型インフルエンザウイルスのレセプターであることが報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。
また、グルコースオキシダーゼやパーオキシダーゼ（ラクトパーオキシダーゼまたはミエロパーオキシダーゼ）がＨＩＶ−１に対する抗ウイルス作用があることが報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。
しかしながら、シアリルラクトースのＨＩＶ感染・増殖抑制効果については知られていない。
特開平3-53894号公報特開平3-35781号公報特開平2-311493号公報日経バイオテクノロジーアニュアルレポート1991/92、251-260 中島、山本、医学会新聞、1991号（1992年4月20日） Infect. Immun., vol.56, pp.2896-2906, 1988 Acta Pediatr., vol.82,pp.6-11, 1993 Nature, vol.333, pp.426-431, 1988 Antimicrob Agents Chemother. 1993 Jan;37(1):26-31.

本発明は、上に述べたような既存のＨＩＶ吸着阻害療法に見られるような、製造コストが高く、人体に投与した場合の安全性は未知であるという問題を解決し、ＨＩＶによる感染やＨＩＶの増殖を効率よく阻止する物質を得ることを課題とする。すなわち、比較的安価な原料から得られ、ＨＩＶ感染・増殖抑制効果が良好な有効成分を用いて、安全に、エイズの予防あるいは治療を行うことのできる物質を提供することを課題とする。

ＨＩＶはリンパ球の細胞表面上に発現されているＣＤ４分子をレセプターとして細胞の中に入り込むと考えられている。ＣＤ４を発現している細胞の多くはＴ細胞と呼ばれる一群の免疫担当細胞であるが、ＨＩＶはＣＤ４を発現した他の細胞にも感染することが明らかにされている。
本発明者らは、母乳に含まれるオリゴ糖の抗ウイルス作用について研究を進める過程でシアリルラクトースがＨＩＶに対して強い感染防御効果を有することを初めて見出した。本発明者らは、再現性のよいＨＩＶウイルス感染判定系を用い、種々の天然成分のスクリーニングを行った結果、シアリルラクトースにＨＩＶ感染・増殖抑制作用が存在することを見出して本発明を完成するに至った。

本発明の実施により提供されるＨＩＶ感染・増殖抑制剤は次の効果を奏する。
（１）ＨＩＶの感染を防ぐことができ、また、既感染者に対しては、体内でさらにウイルスが増殖して感染細胞が増加することを防ぐことができる。
（２）すでに通常の食品として摂取している成分を有効成分とする組成であるため、投与することによる副作用の心配が少ない。
（３）原料が比較的大量に存在するため、従来の抗ＨＩＶ製剤に比べて製造コストが非常に安い。
（４）従来の抗ＨＩＶ製剤に比べて比較的容易に、しかも大量に調製できるため、特定の患者の治療に使用が限定されることがなく、広くＨＩＶ感染・増殖を予防することができる。

本発明は、シアリルラクトースを有効成分とするヒト免疫不全ウイルスの感染・増殖抑制剤に関する。
本発明の有効成分としては、牛乳をはじめとする哺乳類の乳から精製したシアリルラクトースが用いられる。シアリルラクトースは哺乳類の乳汁や分泌液等から公知の方法によって調製することができる（特開平０７‐０７９８００号公報）。シアリルラクトースは哺乳類の乳から分離されるオリゴ糖であるが、本発明の実施においてはどのような種、由来のものでも差し支えない。
また必要に応じて、乳糖、グルコース、ガラクトース、シアル酸などから化学合成あるいは酵素合成により生産することもできる。現在最も安価でかつ容易に入手できるシアリルラクトースとしては牛乳より分離したものである。

牛乳より分離する場合は、特開平８−２５２４０３号公報に開示された擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）などを使用する方法が採用し得る。シアリルラクトースを含む原料溶液を擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）に供給して、シアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→３結合したＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃと、α２→６結合したＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを分離する。本方法により、ＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを工業的規模で大量かつ簡便に分離することができる。このシアリルラクトースについては、通常、牛乳などの乳から分離、回収されることが多い。しかし、乳から分離、回収されるシアリルラクトース中には、結合様式の異なるＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとが混在している。本発明は、結合様式の異なるシアリルラクトースについても使用することが出来る。

本発明のヒト免疫不全ウイルスの感染・増殖抑制剤の投与は、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されないが、剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤等にして直接投与したり、食品や飲用水に混ぜて経口的に投与することができる。これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができる。製剤上許可されている担体や賦型剤等と混合して成型する。
また、ヒト血清アルブミン等とともにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で溶解し滅菌して注射製剤とすることもできる。
また、本発明のシアリルラクトースを、牛乳、乳飲料、発酵乳、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、飴、麺類、チーズ、バター、ソーセージ等の飲食品、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物等に配合することができる。
これらのヒト免疫不全ウイルスの感染・増殖防御剤及びヒト免疫不全ウイルスの感染・増殖抑制用飲食品は、ヒト免疫不全ウイルスの感染および増殖抑制能を有するので、ヒト免疫不全ウイルスにより引き起こされるさまざまな病態の予防、治療、改善に非常に有益となりうる。

本発明のシアリルラクトースの経口あるいは経注による投与量は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常、成人1日あたりシアリルラクトースとして経口で1〜100mg、静脈注射で1μg〜10mgを投与すれば、ヒト免疫不全ウイルスの感染および増殖を抑制する治療または予防効果が得られる。このように本発明は低用量でも効果がある。
シアリルラクトースは日常摂取されている乳中にも存在するものであり、本発明において使用される量では毒性は知られていない。

以下に本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制剤に関し、実施例及び試験例により詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

［試験例１］
（シアリルラクトースの抗ＨＩＶ活性の測定）
（多サイクル感染実験）
ＨＩＶの標的細胞として単球由来マクロファージ（MDM）を用い、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(10%ヒト男性AB血清含有)で一週間培養した後に感染実験に供した。
ＨＩＶとしてAD8 (R5-HIV-1)を用い、感染の12時間前にシアリルラクトース（SL）を最終濃度がそれぞれ0μg/ml、10μg/ml及び30μg/mlとなるように添加した。ウイルスを感染させた後に3日毎に培養液を半量採取し、それぞれに同量の0μg/ml、10μg/ml及び30μg/ml SL含有DMEM(10%ヒト男性AB血清含有)を添加して、18日間培養を継続した。採取した培養上清は-20℃に保存しておき、培養が終了した後にそれらの逆転写酵素活性をPCR法を用いて測定した。陽性対照としてはSLの代わりに、ＨＩＶ感染・増殖防御作用が公知であるラクトパーオキシダーゼ(LPO)を用いて同様に行った。その結果を図１に示す。
図１にみられるように、SL無添加(0μg/ml)では、培養日数とともに逆転写活性が上昇しているのに対して、SL濃度が10μg/ml、30μg/mlでは逆転写酵素活性が上昇していなかった。このことはSL添加によりＨＩＶのMDMへの感染が抑制された結果、逆転写酵素活性が上昇しなかったことを示している。

（単サイクル感染実験）
ＨＩＶの標的細胞として、ヒト乳腺上皮MCF-7細胞を用い、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (10%ヒト男性AB血清含有)で一週間培養した後に感染実験に供した。
ＨＩＶとして、ＨＩＶエンベロープタンパク質の一種であるHXB2(X4)-Env、JRFL(R5)-Env、又はアンフォトロピックマウス白血病ウイルスエンベロープタンパク質であるMLV(amphotropic)-EnvでＨＩＶ遺伝子クローンNL4-3-Luc-R(-)E(-)をレスキューしたシュードタイプ(pseudotype)ウイルスを用いた。これらのウイルスはレスキューに用いられたエンベロープタンパク質を利用して細胞に吸着侵入し、逆転写した後にプロバイラル(proviral)DNAを染色体に組み込んでウイルス遺伝子を発現させるが、Vpr (R)やEnv (E)やNefの遺伝子の欠損のために、次の感染サイクルへは到達できないという性質を有するので、ウイルス感染は一度しか起こらない。
感染の12時間前に或いは12時間後に、SLを最終濃度がそれぞれ30μg/mlとなるように添加し、ウイルス添加後24時間培養した後、細胞を回収して細胞抽出液を調製した。ＨＩＶ遺伝子クローンNL4-3-Luc-R(-)E(-)に組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子の発現を、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase Reporter Assay System(Promega社製)を用いて測定することで調べた。コントロールとしてはSLを添加しない培地を用い、SLの代わりに、ＨＩＶ感染・増殖抑制作用が公知であるラクトパーオキシダーゼ(LPO)を用いて同様に行った。ルシフェラーゼ活性値は、コントロールの値を100％とした相対値で示した。その結果を図２に示す。
図２にみられるように、ＨＩＶウイルスエンベロープタンパク質でレスキューしたＨＩＶについては、SL添加によりコントロール及び陽性対照であるLPOと比較してルシフェラーゼ活性が抑制されていた。また、アンフォトロピックマウス白血病ウイルスエンベロープタンパク質で再生したＨＩＶについては、SL添加により陽性対照であるLPOには劣るもののコントロールと比較してルシフェラーゼ活性が抑制されていた。また、全てのエンベロープタンパク質においてウイルス感染前に添加(pre)した方がウイルス感染後に添加(post)するよりルシフェラーゼ活性が抑制されていた。ルシフェラーゼ活性が抑制されているということはＨＩＶの感染が抑制されていることを示している。
このことは、感染前にSLを添加することでより効果的に抗ＨＩＶ作用を発揮することを示している。また、これらの抗ＨＩＶ効果はエンベロープタンパク質の種類に拘らず発揮することが示された。
なお、本発明のSLは、陽性対照として用いたLPOと比較して熱処理に対して安定であるという性質を有しているので、加熱処理を必要とする飲食品に配合しても抗ＨＩＶ効果が得られるという利点を有している。

限外濾過装置で脱脂乳から蛋白質を除去し、シーディングにより生成した乳糖結晶を除去した乳糖結晶母液をエバポレーターで固形率30％となるまで濃縮したものを擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）処理液とした。また、脱イオン水をＳＭＢ溶離液とした。なお、ＳＭＢは、カラム直径25mm長さ460mm の８塔型で、各々、カチオン交換樹脂 UBK510L（三菱化学社製）の対イオンをＮａ型として充填したものを用いた。ＳＭＢの運転条件は、ＳＭＢ処理液供給量3.4ml/分、ＳＭＢ溶離液供給量5.8ml/分、エキストラクト抜き出し量5.0ml/分、ラフィネート抜き出し量4.2ml/分、カラム温度10℃、ステップ時間7.40分とした。以上のＳＭＢ処理条件で乳糖結晶母液濃縮液46.5リットルを処理したところ、ラフィネートにシアリルラクトースを含む画分69.0リットルを得た。次に、このラフィネートをロータリーエバポレーターで固形率30％となるまで濃縮した後、再びＳＭＢ処理液とし、同様の条件で処理した。このようにして得られたシアリルラクトース画分を濃縮し、凍結乾燥して純度99％のシアリルラクトース900gを得た。
このようにして得られた本発明のシアリルラクトースは、そのままＨＩＶ感染・増殖抑制剤としても利用可能である。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制注射用製剤の製造）
本実施例においては、上記実施例１により得たシアリルラクトースの注射用製剤の生産例を示した。
（１）シアリルラクトース 100 mg
ヒト血清アルブミン 100 mg
上記組成をＰＢＳで溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2mlずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。
（２）シアリルラクトース 100 mg
ツイーン80 1 mg
ヒト血清アルブミン 100 mg
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。
（３）シアリルラクトース 100 mg
ツイーン80 1 mg
ソルビトール 4 mg
上記組成をＰＢＳで溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2mlずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。
（４）シアリルラクトース 2 g
ツイーン80 2 mg
グリシン 2 g
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2mlずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。
（５）シアリルラクトース 2 g
ツイーン80 1 mg
ソルビトール 2 g
グリシン 1 g
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2mlずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。
（６）シアリルラクトース 2 g
ソルビトール 4 g
ヒト血清アルブミン 50 mg
上記組成をＰＢＳで溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2mlずつ分注し、常法により凍結乾燥密封した。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制錠剤の製造）
乳糖 170g、馬鈴薯澱粉 5g、実施例１で調製したシアリルラクトース 20g、ステアリン酸タルク 5gを混合し、圧縮錠剤機（富士薬品機械 Y-5010-Q）により圧縮して(条件1〜4ton)、本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制用錠剤を製造した。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制用スティック状栄養健康食品の製造）
ビタミンＣとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gに、上記実施例１で得られたシアリルラクトース 40gを加えて混合した。混合物を１袋1.5gずつ袋に詰め、本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制用スティック状栄養健康食品を製造した。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制用飲料の製造）
表１に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱殺菌して、本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制用飲料を製造した。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制用ビスケットの製造）
表２に示した配合で原料を混合し、ドウを作成して成型した後、焙焼して、本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制用ビスケットを製造した。

（ＨＩＶ感染・増殖抑制用ゼリー）
表３に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱殺菌して、本発明のＨＩＶ感染・増殖抑制用ゼリーを製造した。

シアリルラクトース（SL）の多サイクル感染実験によるＨＩＶ感染抑制効果を示す。シアリルラクトース（SL）の単サイクル感染実験によるＨＩＶ感染抑制効果を示す。

符号の説明

［図１］ SL (30μg/ml)、SL (10μg/ml)は、シアリルラクトースをそれぞれ30 μg/ml、10μg/ml添加した場合の逆転写酵素活性を表す。LPO (30μg/ml) 、LPO (10μg/ml)は、陽性対照のラクトパーオキシダーゼをそれぞれ30 μg/ml、10μg/ml添加した場合の逆転写酵素活性を表す。Controlはネガティブコントロールを表す。
［図２］ SL (pre)は、感染前のシアリルラクトース添加を、SL (post)は、感染後のシアリルラクトース添加を表す。LPO (pre)は、感染前の陽性対照のラクトパーオキシダーゼ添加を、LPO (post)は、感染後の陽性対照のラクトパーオキシダーゼ添加を表す。Controlはネガティブコントロールを表す。

Claims

シアリルラクトースを有効成分とするヒト免疫不全ウイルス感染・増殖抑制剤。