JP4786405B2 - 発光測定装置及び発光測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料からの発光を測定する発光測定装置、及び発光測定方法に関するものである。

創薬分野等において細胞などの試料に試薬を注入したときに生じる発光を測定する方法として、マイクロプレートを利用した発光測定方法が用いられている（例えば、文献１：特開２００１−１８８０４４号公報、文献２：特開平９−２６４２６号公報参照）。マイクロプレートは、それぞれ試料を保持可能な複数のウェル（テストホール）が設けられた板状の試料保持部材であり、各ウェル内に保持された試料からの発光を測定することで、試料の評価や必要な発光解析を効率的に行うことが可能である。
特開２００１−１８８０４４号公報 特開平９−２６４２６号公報 特許第３４５２５６６号公報 特開２００２−３１０８９４号公報

上記文献１に記載された発光測定装置では、試薬を注入したときの試料からの発光を透過するように底面が形成されたマイクロプレートによって試料を保持し、その下方に設置された光検出手段によって発光を検出している。一方、このような発光測定においては、近年、試薬として様々な種類のルシフェラーゼ等が用いられるようになり、それぞれ異なる波長スペクトルを有する多色、多種類の発光現象が測定に利用できるようになりつつある。

これに伴って、発光測定装置においても、多色の発光測定に対応した構成が求められつつある（例えば、文献３：特許第３４５２５６６号公報、文献４：特開２００２−３１０８９４号公報参照）。しかしながら、従来の発光測定装置では、いずれも多色の発光の測定効率等の点において問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、多色の発光測定を効率良く行うことが可能な発光測定装置、及び発光測定方法を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による発光測定装置は、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートによって保持された状態で、測定位置に配置された試料からの発光を測定する発光測定装置であって、（１）マイクロプレートのウェル内に保持された試料からの発光を含むマイクロプレートの２次元光像を導く導光光学系と、（２）導光光学系によって導かれた２次元光像を検出して、２次元の発光画像を取得する画像取得手段と、（３）マイクロプレートから画像取得手段への２次元光像の光路上の所定位置に配置され、複数の光学フィルタ部がマイクロプレートの複数のウェルに対応するように２次元アレイ状に配置されたシート状のフィルタ部材とを備え、（４）フィルタ部材は、複数の光学フィルタ部のそれぞれが、波長についての光透過特性が互いに異なる第１フィルタ領域、及び第２フィルタ領域を少なくとも含み、試料からの発光に対して、第１フィルタ領域を透過した第１光成分、及び第２フィルタ領域を透過した第２光成分のそれぞれについて発光測定を行うことが可能に構成されていることを特徴とする。

また、本発明による発光測定方法は、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートによって保持された状態で、測定位置に配置された試料からの発光を測定する発光測定方法であって、（ａ）マイクロプレートのウェル内に保持された試料からの発光を含むマイクロプレートの２次元光像を導く導光光学系と、導光光学系によって導かれた２次元光像を検出して、２次元の発光画像を取得する画像取得手段とを備える発光測定装置を用い、（ｂ）複数の光学フィルタ部がマイクロプレートの複数のウェルに対応するように２次元アレイ状に配置されたシート状のフィルタ部材を、マイクロプレートから画像取得手段への２次元光像の光路上の所定位置に配置した状態で、画像取得手段によって発光画像を取得する画像取得ステップと、（ｃ）発光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、（ｄ）画像取得ステップにおいて、フィルタ部材として、複数の光学フィルタ部のそれぞれが、波長についての光透過特性が互いに異なる第１フィルタ領域、及び第２フィルタ領域を少なくとも含むフィルタ部材を用い、（ｅ）データ解析ステップは、発光画像での光強度分布を解析データとし、ウェル内に保持された試料からの発光に対して、光学フィルタ部での第１フィルタ領域を透過した第１光成分、及び第２フィルタ領域を透過した第２光成分のそれぞれについて発光解析処理を行う解析処理ステップを含むことを特徴とする。

上記した発光測定装置及び発光測定方法においては、試料からの発光を検出する光検出手段として、２次元の発光画像を取得可能な画像取得手段を用いるとともに、マイクロプレートから画像取得手段への２次元光像の光路上に、発光の波長成分選択用のフィルタ部材を配置する。そして、マイクロプレートのウェルに対応するフィルタ部材の光学フィルタ部について、波長選択性が互いに異なる複数のフィルタ領域を設けた構成としている。

このように、フィルタ部材を介してマイクロプレートからの発光画像を画像取得手段で取得し、得られた発光画像に対して、それぞれのフィルタ領域を透過した光成分について発光解析処理を行う構成によれば、波長スペクトルが異なる複数種類の発光現象を同時に測定することができる。これにより、多色の発光測定を効率良く行うことが可能となる。

なお、上記構成においては、発光測定装置は、発光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段をさらに備え、データ解析手段は、発光画像での光強度分布を解析データとし、ウェル内に保持された試料からの発光に対して、光学フィルタ部での第１フィルタ領域を透過した第１光成分、及び第２フィルタ領域を透過した第２光成分のそれぞれについて発光解析処理を行う解析処理手段を有する構成とすることが好ましい。

ここで、発光測定装置において、データ解析手段は、発光画像に対し、第１光成分について発光解析処理を行うための第１解析領域、及び第２光成分について発光解析処理を行うための第２解析領域を設定する解析領域設定手段を有することが好ましい。同様に、発光測定方法において、データ解析ステップは、発光画像に対し、第１光成分について発光解析処理を行うための第１解析領域、及び第２光成分について発光解析処理を行うための第２解析領域を設定する解析領域設定ステップを含むことが好ましい。このように、発光画像に対して、フィルタ部材での光学フィルタ部の構成に応じた複数の解析領域を設定して発光解析処理を行うことにより、多色の発光測定を確実かつ容易な方法で行うことができる。

また、フィルタ部材における光学フィルタ部は、第１フィルタ領域及び第２フィルタ領域のそれぞれの面積が、第１光成分及び第２光成分のそれぞれの測定条件に応じて設定されていることが好ましい。このように、フィルタ領域での光透過特性に対応する発光での波長成分を参照し、各光成分の測定条件に応じて光学フィルタ部での複数のフィルタ領域のそれぞれの面積、及びその面積比を設定することにより、各フィルタ領域で選択される波長成分について、それぞれ充分な精度で発光測定を行うことが可能となる。

マイクロプレートと画像取得手段との間でのフィルタ部材の設置構成については、フィルタ部材が、マイクロプレートの画像取得手段側の面上に取り付けられている構成を用いることができる。あるいは、フィルタ部材が、マイクロプレートの画像取得手段側の面上に、マイクロプレートと一体化されて設けられている構成を用いることができる。あるいは、導光光学系が、マイクロプレートの２次元光像を画像取得手段へと導くファイバ光学ブロックを有し、フィルタ部材が、ファイバ光学ブロックのマイクロプレート側の面上に取り付けられている構成を用いることができる。

本発明の発光測定装置及び発光測定方法によれば、マイクロプレートから画像取得手段への光路上に配置された発光の波長成分選択用のフィルタ部材について、マイクロプレートのウェルに対応するフィルタ部材の光学フィルタ部に波長選択性が互いに異なる複数のフィルタ領域を設けた構成とし、フィルタ部材を介して取得されたマイクロプレートからの発光画像に対して、それぞれのフィルタ領域を透過した光成分について発光解析処理を行うことにより、多色の発光測定を効率良く行うことが可能となる。

以下、図面とともに本発明による発光測定装置、及び発光測定方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による発光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。本実施形態による発光測定装置１は、試料保持部材としてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓ（図３参照）からの発光現象を測定するための装置である。

なお、試料Ｓについては、発光測定の対象となるものであれば特に限定されないが、細胞や抗体などの生体試料が例として挙げられる。また、測定対象となる試料Ｓからの発光現象としては、試料Ｓに試薬を注入したときに生じる発光が例として挙げられる。以下、本発光測定装置１の構成について説明する。図１に示す発光測定装置１は、データ取得装置１０及びデータ解析装置５０を備えて構成されている。

まず、試料Ｓの発光の測定データの取得に用いられるデータ取得装置１０について説明する。データ取得装置１０は、発光測定の対象となる試料Ｓを保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの発光の検出に用いられる画像取得部４０とを有している。

本実施形態において試料保持部材として用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（テストホール）２１が２次元アレイ状に配置された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて発光測定の対象となる試料Ｓを保持可能な構成となっている。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個のウェル２１が、２次元アレイ状に配置されている。また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓからの発光を透過可能な材質によって形成されている。さらに、マイクロプレート２０の画像取得部４０側の面である底面２２上には、後述するシート状のフィルタ部材３０が設置されている。

暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されている。また、これらのマイクロプレート２０及びホルダ１１に対して、暗箱１５内で所定の方向を搬送方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）とするマイクロプレート搬送機構１２が設置されている。

搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートストッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートストッカー１４が設置されている。

このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な発光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びストッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。

発光測定の実行時にマイクロプレート２０、及びそれに保持された試料Ｓが配置される測定位置Ｐに対し、測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０の各ウェル２１内の試料Ｓに対して発光測定用の試薬を注入するための分注装置１６が設置されている。発光測定に用いられる発光試薬としては、例えば、ルシフェラーゼ、エクオリン、ルミノールなどがある。また、図１においては、分注装置１６がマイクロプレート２０上方の注入位置にある状態を示しているが、この分注装置１６については、注入位置に加えて、分注装置交換位置、試薬吸引位置、洗浄位置を移動可能に構成することが好ましい。

測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２、及びフィルタ部材３０を介して放出される発光の測定に用いられる画像取得部４０が設置されている。本実施形態においては、画像取得部４０は、試料Ｓからの発光による２次元の発光画像を取得可能な撮像装置４５を有している。この撮像装置４５は、例えば、高感度の２次元フォトンカウンティングカメラを用いて構成することができる。また、必要があれば、２次元カメラの前段にイメージ増倍管、リレーレンズ等を配置して画像取得部４０を構成しても良い。

また、発光測定時にマイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、画像取得部４０の撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。この導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた２次元光像を画像取得部４０へと導く光学系である。画像取得部４０は、導光光学系４１によって所定の導光条件で導かれた試料Ｓからの発光を含むマイクロプレート２０の２次元光像を検出して、発光測定に必要な２次元の発光画像を取得する。なお、図１においては、導光光学系４１での２次元光像の光路を、実線によって模式的に示している。

導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。特に、この導光光学系４１は、画像取得部４０において発光画像を好適に取得するため、マイクロプレート２０の２次元光像を縮小しつつ画像取得部４０へと導く縮小光学系を含むことが好ましい。

図４は、マイクロプレート２０、導光光学系４１、及び画像取得部４０を含む光学系の一例を示す構成図である。本構成例においては、導光光学系４１として、マイクロプレート２０及びその底面２２側のフィルタ部材３０と、画像取得部４０との間に配置されたファイバ光学ブロック４２を用いている。また、上記構成において、フィルタ部材３０は、マイクロプレート２０から画像取得部４０への２次元光像の光路上に配置されている。

ファイバ光学ブロック（ファイバ光学プレート）４２は、多数の光ファイバを束にすることで光像を伝達可能に形成された光学素子である。また、ここでのファイバ光学ブロック４２は、ファイバプレート２０側から画像取得部４０側へと断面積が小さくなるテーパ形状に形成されており、縮小光学系として機能する構成となっている。なお、図４においては、説明のため、マイクロプレート２０及びフィルタ部材３０とファイバ光学ブロック４２、及びファイバ光学ブロック４２と画像取得部４０について、それぞれ間をあけた配置で図示しているが、これらは直接光学的に接続された構成であっても良い。

次に、試料Ｓを保持するマイクロプレート２０に対して設けられたフィルタ部材３０について説明する。図５は、マイクロプレート２０及びフィルタ部材３０の構成の一例について示す図である。なお、ここでは、説明の便宜のため、８×１２＝９６個のウェル２１が２次元アレイ状に配置された構成のマイクロプレート２０を例示するとともに、その構造を一部簡略化して示し、また、各ウェル２１の平面形状を矩形状とする。

図５（ａ）は、マイクロプレート２０及びフィルタ部材３０の側面断面構造を示し、図５（ｂ）は、画像取得部４０側からみたフィルタ部材３０の平面構造を示している。図５（ｂ）に示すように、マイクロプレート２０は、それぞれ８個のウェル２１が配置された１２列のウェル列Ｌ_１，Ｌ_２，…，Ｌ_ｉ，…，Ｌ_１２からなる２次元のウェル構造を有している。このようなマイクロプレート２０に対し、その底面２２上に設けられたシート状のフィルタ部材（フィルタシート）３０には、上記したウェル列Ｌ_１〜Ｌ_１２にそれぞれ対応するように形成された、１２列の光学フィルタ部３１_１〜３１_１２が設けられている。

フィルタ部材３０の光学フィルタ部３１_ｉ（ｉ＝１〜１２）は、対応するウェル列Ｌ_ｉにおけるウェル２１の配列方向（図中の縦方向）に沿って延びる形状に形成されている。これにより、光学フィルタ部３１_ｉは、ウェル列Ｌ_ｉを構成する８個のウェル２１に対応する８個の光学フィルタ部を合わせたものとなっている。すなわち、この１２列の光学フィルタ部３１_１〜３１_１２を有するフィルタ部材３０の構成は、２次元アレイ状に配置されたウェル２１に対応するように９６個の光学フィルタ部を２次元アレイ状に設けた構成と同等となっている。

また、上記のように複数のウェル２１に対応するように配置された光学フィルタ部３１のそれぞれは、図５に示すように、ウェル列Ｌの中心線を境界として、第１フィルタ領域３１ａ（図中の左側の領域）、及び第２フィルタ領域３１ｂ（図中の右側の領域）を有して構成されている。これらのフィルタ領域３１ａ、３１ｂは、波長についての光透過特性が互いに異なるように形成されている。

次に、測定データの解析に用いられるデータ解析装置５０について説明する。データ解析装置５０は、画像取得部４０によって取得された発光画像を含む測定データに対して解析処理を行う解析手段である。また、データ解析装置５０は、データ取得装置１０の各部の動作を制御することによって、本発光測定装置１における試料Ｓに対する発光測定を制御する。また、図１においては、データ解析装置５０に対して、測定結果等を表示する表示装置７１と、データの入力や発光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置７２とが接続されている。

図６は、図１に示した発光測定装置１に用いられるデータ解析装置５０の構成の一例を示すブロック図である。本データ解析装置５０は、解析処理部５１と、解析領域設定部５６とを有して構成されている。解析処理部５１は、データ取得装置１０の画像取得部４０によって取得された発光画像での光強度分布を解析データとして、試料Ｓについての発光解析処理を行う解析処理手段である。本構成例においては、解析処理部５１は、発光強度算出部５２と、解析データ選択部５３とを有している。

解析データ選択部５３は、データ取得装置１０から入力された測定データの発光画像に対して設定された解析領域を参照し、発光画像の画像データから解析領域に基づいて必要なデータを選択して解析データとする。また、発光強度算出部５２は、解析データ選択部５３によって選択された解析データを用い、試料Ｓについての発光解析処理として、その発光強度を算出する処理を行う（解析処理ステップ）。この発光強度は、例えば解析領域内での光強度分布における平均光強度として算出される。

また、図６に示す解析処理部５１においては、データ取得装置１０から入力される発光画像などの測定データに対して、測定データ補正部５４が設けられている。測定データ補正部５４は、画像取得部４０によって取得された発光画像に対するダーク補正、シェーディング補正など、測定データに対して必要な補正を行う。ここで、ダーク補正は、撮像装置４５の暗中での出力分を測定データから差し引く補正である。また、シェーディング補正は、撮像装置４５や導光光学系４１を含む光学系に起因するデータばらつきについての補正である。

解析処理部５１において発光画像に対して適用される解析領域は、解析領域設定部５６において設定される。本実施形態においては、この解析領域は、マイクロプレート２０の各ウェル２１に対して配置されているフィルタ部材３０の光学フィルタ部３１の構成に対応するように設定される（解析領域設定ステップ）。

すなわち、ウェル２１に対応する光学フィルタ部３１は、図５（ｂ）に示したように、波長に対する光透過特性が互いに異なる２つのフィルタ領域３１ａ、３１ｂに分けられた構成となっている。このとき、ウェル２１内の試料Ｓからの発光に対し、光学フィルタ部３１での第１フィルタ領域３１ａを透過した第１光成分と、第２フィルタ領域３１ｂを透過した第２光成分とでは、発光の異なる波長成分が選択された光成分となる。また、これらの第１光成分の像（第１フィルタ領域３１ａの像）と、第２光成分の像（第２フィルタ領域３１ｂの像）とは、画像取得部４０で取得される２次元の発光画像中において、異なる領域に結像される。

これに対して、解析領域設定部５６では、画像取得部４０で得られた発光画像に対し、第１光成分について発光解析処理を行うための第１解析領域、及び第２光成分について発光解析処理を行うための第２解析領域が設定される。これにより、解析処理部５１においては、第１フィルタ領域３１ａを透過した第１光成分、及び第２フィルタ領域３１ｂを透過した第２光成分のそれぞれについて、発光解析処理が行われる。

また、図６に示すデータ解析装置５０においては、データ記憶手段として、測定データ記憶部６１、及び補正データ記憶部６３が設けられている。測定データ記憶部６１は、データ取得装置１０から入力された測定データ、あるいは測定データ補正部５４によって補正された測定データ等の格納に用いられる。また、補正データ記憶部６３は、測定データ補正部５４で測定データの補正を行う際に必要な補正データ等の格納に用いられる。

図７は、図６に示したデータ解析装置５０のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。本構成例におけるデータ解析装置５０は、バス８０と、バス８０に接続されたＣＰＵなどの演算部８１とを有している。また、バス８０には、画像メモリ８２、外部装置接続用のインターフェース８３、プログラム記憶部８４、及びデータ記憶部８５が接続されており、これによってデータ解析装置５０が構成されている。

画像メモリ８２は、データ取得装置１０の画像取得部４０で取得された発光画像などの画像データの入力に用いられる。インターフェース８３は、発光測定装置１を構成するデータ取得装置１０などの各装置を接続するために用いられる。プログラム記憶部８４は、データ取得装置１０の動作、データ取得装置１０で取得された測定データの解析処理等に必要なプログラムが格納され、また、必要に応じて作業領域、パラメータ領域等が設けられる。データ記憶部８５は、例えば、図６に示した構成におけるデータ記憶部６１、６３に対応している。

また、このデータ取得装置５０のバス８０には、表示装置７１として用いられるモニタ７３、及び入力装置７２として用いられるキーボード７４、マウス７５等が接続されている。また、必要に応じて、ハードディスクなどの外部記憶装置をさらに接続しても良い。

以上の構成において、試料Ｓがウェル２１内に保持されたマイクロプレート２０が暗箱１５内で測定位置Ｐに配置されると、データ解析装置５０は、分注装置１６に対して試薬の分注を指示する。指示を受けた分注装置１６は、発光測定に用いられる試薬をマイクロプレート２０の各ウェル２１へと分注する（試薬注入ステップ）。このとき、ウェル２１内において、試料Ｓと注入された試薬との相互作用の結果として光が発生する。

ウェル２１内で生じた試料Ｓからの発光を含む２次元光像は、マイクロプレート２０の底面２２、フィルタ部材３０、及び導光光学系４１を介して画像取得部４０へと導かれ、撮像装置４５によって２次元の発光画像が取得される（画像取得ステップ）。画像取得部４０で取得された発光画像を含む測定データは、データ解析装置５０へと送られる。そして、データ解析装置５０は、入力された測定データに対して、図６に関して上述したように試料Ｓの評価等に必要な解析処理を行う（データ解析ステップ）。

本実施形態による発光測定装置１、及び発光測定方法の効果について説明する。

図１〜図７に示した発光測定装置１、及び発光測定方法においては、試料Ｓからの発光を検出する光検出手段として、２次元の発光画像を取得可能な撮像装置４５を有する画像取得部４０を用いるとともに、マイクロプレート２０から画像取得部４０への２次元光像の光路上に、試料Ｓからの発光のうちで測定したい波長成分を選択するためのフィルタ部材３０を配置する。そして、マイクロプレート２０のウェル２１に対応するフィルタ部材３０の光学フィルタ部３１について、波長選択性が互いに異なる複数のフィルタ領域３１ａ、３１ｂを設けた構成としている。

このように、フィルタ部材３０を介してマイクロプレート２０からの発光画像を画像取得部４０で取得し、得られた発光画像を用いて、第１フィルタ領域３１ａ、及び第２フィルタ領域３１ｂのそれぞれを透過した第１光成分、第２光成分について発光測定を行うことを可能とした構成によれば、波長スペクトルが異なる複数種類の発光現象を同時に測定することができる。これにより、多色の発光測定を効率良く行うことが可能となる。

このような発光現象としては、例えば、発光波長５６５ｎｍのルシフェラーゼ反応（中性下）、及び発光波長４３０ｎｍのルミノール反応（水溶液中）がある。また、これらの発光現象に対してフィルタ領域３１ａ、３１ｂに用いることが可能な光学フィルタとしては、例えば、波長５６０ｎｍ以下の光成分をカットするシャープカットフィルタ（FUJI SC 56、富士フィルム製）、及び波長４２０ｎｍ付近の光成分を透過するバンドパスフィルタ（FUJI BPB 42、富士フィルム製）がある。

ここで、文献３：特許第３４５２５６６号公報には、カメラの前段に波長選択フィルターを切り換える回転ディスクを配置した構成が記載されている。また、文献４：特開２００２−３１０８９４号公報には、検出可能な光の波長が互いに異なる２つのカメラを設置した構成が記載されている。しかしながら、これらの構成では、試料Ｓからの多色の発光現象を同時に測定することができないなど、多色の発光の測定効率の点で問題がある。これに対して、上記した発光測定装置１は、画像取得部４０に対して、２次元光像の光路上に、波長選択性が互いに異なる複数のフィルタ領域を用いて光学フィルタ部を構成したフィルタ部材を配置することにより、複数種類の発光現象を同時に測定することを可能にするものである。

また、図６に示した構成のデータ解析装置５０では、解析領域設定部５６において、２次元の発光画像に対し、第１フィルタ領域３１ａを透過した第１光成分についての第１解析領域、及び第２フィルタ領域３１ｂを透過した第２光成分についての第２解析領域を設定して発光解析処理を行っている。このように、発光画像に対して、フィルタ部材３０での光学フィルタ部３１の構成に応じた複数の解析領域を設定して発光解析処理を行うことにより、多色の発光測定を確実かつ容易な方法で行うことができる。

ただし、これらの第１光成分及び第２光成分に対する発光解析処理については、上記のように解析領域を設定する方法に限らず、他の方法で発光解析処理を行っても良い。一般には、データ解析装置５０の解析処理部５１は、発光画像での光強度分布を解析データとし、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓからの発光に対して、光学フィルタ部３１での第１フィルタ領域３１ａを透過した第１光成分、及び第２フィルタ領域３１ｂを透過した第２光成分のそれぞれについて発光解析処理を行うように構成されていれば良い。

また、マイクロプレート２０と画像取得部４０との間でのフィルタ部材３０の設置構成については、図３及び図４に示した構成例では、マイクロプレート２０の画像取得部４０側の底面２２上にシート状のフィルタ部材３０を設置した構成としている。

このような構成では、具体的には、フィルタ部材３０をマイクロプレート２０とは別の部材とし、必要に応じてマイクロプレート２０の底面２２にフィルタ部材３０のシートを取り付ける構成を用いることができる。この場合、取り付けるフィルタシートの種類により、試料Ｓの発光測定において、様々な波長成分を有する発光現象に対応することが可能である。また、マイクロプレート２０の種類への対応も容易である。

あるいは、フィルタ部材３０が、マイクロプレート２０の底面２２上に、マイクロプレート２０と一体化されて設けられている構成を用いることができる。この場合、マイクロプレート２０自体が、その底面が光学フィルタとして機能する試料保持部材となる。このような一体型の構成では、ウェル２１と光学フィルタ部３１との位置合わせを確実に行うことができ、それに対応する解析領域の設定が容易であるという利点がある。また、フィルタ部材３０の設置構成については、図４に示した構成例以外にも、様々な構成を用いて良い。

図８は、マイクロプレート２０、導光光学系４１、及び画像取得部４０を含む光学系の他の例を示す構成図である。本構成例においては、導光光学系４１として、図４の構成と同様に、マイクロプレート２０と、画像取得部４０との間に配置されたファイバ光学ブロック４２を用いている。また、このファイバ光学ブロック４２に対し、そのマイクロプレート側の上面４２ａ上にフィルタ部材３０ａが取り付けられている。この構成では、光学フィルタ部３１の構成に対応する解析領域の設定が容易である。また、複数のマイクロプレート２０についての発光測定にフィルタ部材３０ａを継続的に使用することが可能であるため、発光測定のランニングコストが安価となる。

図９は、マイクロプレート２０、導光光学系４１、及び画像取得部４０を含む光学系のさらに他の例を示す構成図である。本構成例においては、導光光学系４１として、図４の構成と同様に、マイクロプレート２０と、画像取得部４０との間に配置されたファイバ光学ブロック４２を用いている。また、このファイバ光学ブロック４２に対し、その画像取得部４０側の底面４２ｂ上にフィルタ部材３０ｂが取り付けられている。この構成では、フィルタ部材３０ｂの面積が小さくなる。

なお、図８、図９に示した例のように、フィルタ部材３０ａ、３０ｂがファイバ光学ブロック４２の端面に取り付けられている構成では、フィルタ部材を継続的に使用することが可能であるため、発光測定のランニングコストが安価となる。ただし、この構成では、例えば、９６ウェルのマイクロプレート用に作製されたフィルタ部材がファイバ光学ブロック４２に取りつけられている場合、３８４ウェル、あるいは１５３６ウェルなどのウェル数が異なるマイクロプレートを用いた発光測定への適用について制約が生じ得る。この場合には、使用するマイクロプレートのウェル数に応じて作製されたフィルタ部材へ取り替えることが好ましい。あるいは、各種のマイクロプレートに対応させてフィルタ部材が取り付けられたファイバ光学ブロックを複数用意しておき、マイクロプレートの種類に応じて、適宜ファイバ光学ブロックを選択または取り替える構成としても良い。

図１０は、マイクロプレート２０、導光光学系４１、及び画像取得部４０を含む光学系のさらに他の例を示す構成図である。本構成例においては、導光光学系４１として、縮小光学系としての機能を有するレンズ光学系４３を用いている。また、フィルタ部材３０の設置構成については、図４の構成と同様に、マイクロプレート２０の底面２２上にフィルタ部材３０を設置した構成としている。このように、マイクロプレート２０からの２次元光像を画像取得部４０へと導く導光光学系４１については、様々な構成の光学系を用いることが可能である。

フィルタ部材３０における光学フィルタ部３１の構成、発光解析処理における解析領域の設定等について、さらに具体的に説明する。なお、発光解析処理における解析領域は、画像取得部４０で取得されたフィルタ部材３０の像を含む２次元の発光画像上で設定されるものであるが、以下においては、説明の便宜のため、フィルタ部材３０の構成と、設定される解析領域とを同一図面上で対応させて示すこととする。また、以下に示すフィルタ部材３０の構成例では、光学フィルタ部３１はマイクロプレート２０のウェル２１と一対一で対応するように２次元アレイ状に配置されているものとする。

図１１は、フィルタ部材３０の構成の一例を示す図である。本構成例においては、ウェル２１に対応する光学フィルタ部３１は、その正方形の外形形状の縦の中心線を境界として分割されて、第１フィルタ領域３１ａ、及び第２フィルタ領域３１ｂの２つのフィルタ領域によって構成されている。これに対して、発光画像上での第１解析領域Ｒａ、及び第２解析領域Ｒｂは、対応するフィルタ領域３１ａ、３１ｂをそれぞれ透過した光成分が選択される領域に設定される。そして、これらの解析領域Ｒａ、Ｒｂのそれぞれについて発光解析処理を行うことにより、例えば図１２に発光強度の時間変化の例のグラフＧａ、Ｇｂを示すように、試料Ｓからの発光の各波長成分（２色）についての発光特性の情報が得られる。

なお、このように２つのフィルタ領域によって光学フィルタ部３１が構成される場合、図５に示したように、ウェル列に対応する複数の光学フィルタ部３１を合わせた、ウェル列でのウェルの配列方向に沿って延びる形状の光学フィルタ部の構成とすることも可能である。ただし、この場合においても、解析領域の設定については、図１１に示したように各ウェルに対応するように個別に設定される。また、図１１においては、解析領域Ｒａ、Ｒｂをフィルタ領域３１ａ、３１ｂよりもやや小さい面積で設定しているが、フィルタ領域３１ａ、３１ｂに対応する領域の全体を解析領域Ｒａ、Ｒｂとし、解析領域Ｒａ、Ｒｂ同士が直接に隣接するように設定しても良い。

図１３は、フィルタ部材３０の構成の他の例を示す図である。本構成例においては、光学フィルタ部３１は、その正方形の外形形状の縦の中心線、及び横の中心線を境界として分割されて、第１フィルタ領域３１ａ、第２フィルタ領域３１ｂ、第３フィルタ領域３１ｃ、及び第４フィルタ領域３１ｄの４つのフィルタ領域によって構成されている。これに対して、発光画像上での第１解析領域Ｒａ、第２解析領域Ｒｂ、第３解析領域Ｒｃ、及び第４解析領域Ｒｄは、対応するフィルタ領域３１ａ、３１ｂ、３１ｃ、３１ｄをそれぞれ透過した光成分が選択される領域に設定される。そして、これらの解析領域Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄのそれぞれについて発光解析処理を行うことにより、例えば図１４に発光強度の時間変化の例のグラフＧａ、Ｇｂ、Ｇｃ、Ｇｄを示すように、試料Ｓからの発光の各波長成分（４色）についての発光特性の情報が得られる。

図１５は、フィルタ部材３０の構成のさらに他の例を示す図である。本構成例における光学フィルタ部３１は、図１３に示したものと同様の構成を有しているが、その外形形状が正方形ではなく円形となっている点で異なる構成となっている。このような構成は、例えば、マイクロプレート２０でのウェル２１の平面形状が正方形ではなく円形である場合に適用可能である。

また、上記の図５、図１１、図１３、及び図１５に示したフィルタ部材３０では、いずれも光学フィルタ部３１の複数のフィルタ領域がそれぞれ同じ面積を有する構成となっている。これに対して、フィルタ部材３０における光学フィルタ部３１は、複数のフィルタ領域（例えば、第１フィルタ領域３１ａ及び第２フィルタ領域３１ｂ）のそれぞれの面積が、それらを透過する複数の光成分（例えば、第１光成分及び第２光成分）のそれぞれの測定条件に応じて設定されていることが好ましい。

このように、フィルタ領域での光透過特性に対応する発光での波長成分を参照し、各光成分の測定条件に応じて光学フィルタ部での複数のフィルタ領域のそれぞれの面積、及びその面積比を設定することにより、各フィルタ領域で選択される波長成分について、それぞれ充分な精度で発光測定を行うことが可能となる。ここで、フィルタ領域の面積を設定する際に参照すべき測定条件としては、例えば、画像取得部４０において撮像装置４５として用いられるカメラの分光感度特性、試料Ｓでの発光現象において予想される発光強度バランス（例えば試料Ｓ中での遺伝子発現量、発光効率等によって生じる強度差）などが挙げられる。

図１６は、画像取得部４０における撮像装置４５の分光感度特性の一例を示すグラフである。このグラフにおいて、横軸は光の波長（ｎｍ）を示し、縦軸は撮像装置４５での相対感度（％）を示している。このような分光感度特性において、第１フィルタ領域３１ａで選択される光成分の波長域（青）をＳａ、第２フィルタ領域３１ｂで選択される光成分の波長域（赤）をＳｂとすると、相対感度の比率はおよそ青：赤＝４：１である。

これに対して、図１７に示すように、第１フィルタ領域３１ａの面積：第２フィルタ領域３１ｂの面積＝１：４となるように光学フィルタ部３１を構成する。このような構成とすることにより、その全体として発光の各光成分に対する測定感度を合わせることが可能である。このようなフィルタ領域の面積の設定方法については、試料Ｓでの発光強度バランスに応じた設定についても同様である。また、本構成例では２つのフィルタ領域を有する場合の光学フィルタ部の構成を示したが、例えば図１８に４つのフィルタ領域を有する場合の構成を例示するように、フィルタ領域の個数に限らず、上記したフィルタ領域の面積の設定方法を適用可能である。

本発明による発光測定装置及び発光測定方法は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、発光測定装置の具体的な構成については、図１に示した発光測定装置１は、その構成の一例を示すものであり、一般には、導光光学系及び画像取得部を含む光学系の構成、分注装置の構成、発光測定の条件等に応じて、様々な構成を用いて良い。また、発光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析装置５０については、発光測定装置１とは別に設ける構成としても良い。

本発明は、多色の発光測定を効率良く行うことが可能な発光測定装置、及び発光測定方法として利用可能である。

発光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。 マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。 図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。 マイクロプレート、導光光学系、及び画像取得部を含む光学系の一例を示す構成図である。 マイクロプレート及びフィルタ部材の構成の一例を示す図である。 データ解析装置の構成の一例を示すブロック図である。 図６に示したデータ解析装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。 マイクロプレート、導光光学系、及び画像取得部を含む光学系の他の例を示す構成図である。 マイクロプレート、導光光学系、及び画像取得部を含む光学系の他の例を示す構成図である。 マイクロプレート、導光光学系、及び画像取得部を含む光学系の他の例を示す構成図である。 フィルタ部材の構成の一例を示す図である。 図１１に示したフィルタ部材を用いた発光測定の例を示すグラフである。 フィルタ部材の構成の他の例を示す図である。 図１３に示したフィルタ部材を用いた発光測定の例を示すグラフである。 フィルタ部材の構成の他の例を示す図である。 画像取得部における撮像装置の分光感度特性の一例を示すグラフである。 フィルタ部材の構成の他の例を示す図である。 フィルタ部材の構成の他の例を示す図である。

符号の説明

１…発光測定装置、１０…データ取得装置、１１…マイクロプレートホルダ、１２…搬送機構、１３…搬入側マイクロプレートストッカー、１４…搬出側マイクロプレートストッカー、１５…暗箱、１６…分注装置、２０…マイクロプレート、２１…ウェル、２２…底面、３０、３０ａ、３０ｂ…フィルタ部材、３１…光学フィルタ部、３１ａ…第１フィルタ領域、３１ｂ…第２フィルタ領域、３１ｃ…第３フィルタ領域、３１ｄ…第４フィルタ領域、４０…画像取得部、４１…導光光学系、４２…ファイバ光学ブロック、４３…レンズ光学系、４５…撮像装置、
５０…データ解析装置、５１…解析処理部、５２…発光強度算出部、５３…解析データ選択部、５４…測定データ補正部、５６…解析領域設定部、６１…測定データ記憶部、６３…補正データ記憶部、７１…表示装置、７２…入力装置、７３…モニタ、７４…キーボード、７５…マウス、８０…バス、８１…演算部、８２…画像メモリ、８３…インターフェース、８４…プログラム記憶部、８５…データ記憶部。

Claims (9)

1. それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートによって保持された状態で測定位置に配置された試料からの発光を測定する発光測定装置であって、
   マイクロプレートのウェル内に保持された試料からの発光を含む前記マイクロプレートの２次元光像を導く導光光学系と、
   前記導光光学系によって導かれた前記２次元光像を検出して、２次元の発光画像を取得する画像取得手段と、
   前記マイクロプレートから前記画像取得手段への前記２次元光像の光路上の所定位置に配置され、複数の光学フィルタ部が前記マイクロプレートの複数のウェルに対応するように２次元アレイ状に配置されたシート状のフィルタ部材とを備え、
   前記フィルタ部材は、前記複数の光学フィルタ部のそれぞれが、波長についての光透過特性が互いに異なる第１フィルタ領域、及び第２フィルタ領域を少なくとも含み、前記試料からの発光に対して、前記第１フィルタ領域を透過した第１光成分、及び前記第２フィルタ領域を透過した第２光成分のそれぞれについて発光測定を行うことが可能に構成されていることを特徴とする発光測定装置。
2. 前記発光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段を備え、
   前記データ解析手段は、前記発光画像での光強度分布を解析データとし、前記ウェル内に保持された前記試料からの発光に対して、前記光学フィルタ部での前記第１フィルタ領域を透過した前記第１光成分、及び前記第２フィルタ領域を透過した前記第２光成分のそれぞれについて発光解析処理を行う解析処理手段を有することを特徴とする請求項１記載の発光測定装置。
3. 前記データ解析手段は、前記発光画像に対し、前記第１光成分について前記発光解析処理を行うための第１解析領域、及び前記第２光成分について前記発光解析処理を行うための第２解析領域を設定する解析領域設定手段を有することを特徴とする請求項２記載の発光測定装置。
4. 前記光学フィルタ部は、前記第１フィルタ領域及び前記第２フィルタ領域のそれぞれの面積が、前記第１光成分及び前記第２光成分のそれぞれの測定条件に応じて設定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の発光測定装置。
5. 前記フィルタ部材は、前記マイクロプレートの前記画像取得手段側の面上に取り付けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の発光測定装置。
6. 前記フィルタ部材は、前記マイクロプレートの前記画像取得手段側の面上に、前記マイクロプレートと一体化されて設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の発光測定装置。
7. 前記導光光学系は、前記マイクロプレートの前記２次元光像を前記画像取得手段へと導くファイバ光学ブロックを有し、
   前記フィルタ部材は、前記ファイバ光学ブロックの前記マイクロプレート側の面上に取り付けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の発光測定装置。
8. それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートによって保持された状態で測定位置に配置された試料からの発光を測定する発光測定方法であって、
   マイクロプレートのウェル内に保持された試料からの発光を含む前記マイクロプレートの２次元光像を導く導光光学系と、前記導光光学系によって導かれた前記２次元光像を検出して、２次元の発光画像を取得する画像取得手段とを備える発光測定装置を用い、
   複数の光学フィルタ部が前記マイクロプレートの複数のウェルに対応するように２次元アレイ状に配置されたシート状のフィルタ部材を、前記マイクロプレートから前記画像取得手段への前記２次元光像の光路上の所定位置に配置した状態で、前記画像取得手段によって前記発光画像を取得する画像取得ステップと、
   前記発光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、
   前記画像取得ステップにおいて、前記フィルタ部材として、前記複数の光学フィルタ部のそれぞれが、波長についての光透過特性が互いに異なる第１フィルタ領域、及び第２フィルタ領域を少なくとも含むフィルタ部材を用い、
   前記データ解析ステップは、前記発光画像での光強度分布を解析データとし、前記ウェル内に保持された前記試料からの発光に対して、前記光学フィルタ部での前記第１フィルタ領域を透過した第１光成分、及び前記第２フィルタ領域を透過した第２光成分のそれぞれについて発光解析処理を行う解析処理ステップを含む
   ことを特徴とする発光測定方法。
9. 前記データ解析ステップは、前記発光画像に対し、前記第１光成分について前記発光解析処理を行うための第１解析領域、及び前記第２光成分について前記発光解析処理を行うための第２解析領域を設定する解析領域設定ステップを含むことを特徴とする請求項８記載の発光測定方法。

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