JP4761311B2 - Ｈｌａ結合性ペプチド、それをコードするｄｎａ断片および組み換えベクター - Google Patents

Description

本発明は、ＨＬＡ結合性ペプチド、その前駆体、それをコードするＤＮＡ断片および組み換えベクターに関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスに感染すると、自然免疫によるウイルス排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答が誘導され、ウイルスの排除反応が起こる。

特異的免疫応答では、体液中のウイルスが中和抗体により排除され、細胞内のウイルスが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により排除される。すなわち、ＣＴＬは、感染細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８〜１１のアミノ酸からなるウイルス抗原（ＣＴＬエピトープ）を特異的に認識し、感染細胞を傷害することによりウイルスを排除する。したがって、このようなウイルスに特異的なＣＴＬエピトープを同定することは、ウイルスに対する治療ワクチンを作成する上で重要である。

この種の技術として、特許文献１記載のものがある。特許文献１には、特定のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、ＨＬＡ結合性を有する旨が記載されている。
特開平８−１５１３９６号公報

しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。

第一に、上記文献記載のＨＬＡ結合性ペプチドは、ＨＬＡ分子と有効に結合するか否かは不明であり、ＨＬＡとの結合性の面でさらなる改善の余地を有していた。

第二に、上記文献記載のＨＬＡ結合性ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ４と結合性がある旨記載されている。しかし、欧米人種に多いＨＬＡ−Ａ２型分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子などの産物）および日本人種に多いＨＬＡ−Ａ２４型分子（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子などの産物）に対して結合するか否かは不明である。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、特定の型のＨＬＡ分子との結合性に優れるＨＬＡ結合性ペプチドを提供する。

本発明によれば、ＨＬＡ−Ａ型分子に結合するＨＬＡ結合性ペプチドであって、配列番号１から１８３からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるＨＬＡ結合性ペプチドが提供される。

また、本発明によれば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて、配列番号１、２、３、５、８、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２２、２３、２５、２７、３４、３７、３８、４０、４２、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、７１、７２、７４、７５、７６、８４、８６、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１２３、１２４、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４１、１４２、１４６、１４７、１４９、１５０、１５２、１６２、１７０、１７３、１７６、１７７および１７９からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドが提供される。

また、本発明によれば、ＨＬＡ−Ａ型分子に結合するＨＬＡ結合性ペプチドであって、上記のＨＬＡ結合性ペプチドに含まれるアミノ酸配列のうち１若しくは２個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるＨＬＡ結合性ペプチドが提供される。

このように、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性を有する特定のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列を含む構成であっても、上述のＨＬＡ結合性ペプチドと同様の作用を奏する。

また、本発明によれば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片が提供される。

また、本発明によれば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターが提供される。

また、本発明によれば、ほ乳類の生体内において、上記のＨＬＡ結合性ペプチドに変化することを特徴とするＨＬＡ結合性ペプチド前駆体が提供される。

本発明によれば、特定のアミノ酸配列を含むため、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性に優れるＨＬＡ結合性ペプチドが得られる。

上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。

［図１］実施例で用いた能動学習実験計画を説明する模式図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。

〈実施形態１〉
本実施形態では、能動学習実験法（特開平１１−３１６７５４号公報）を用いて得られる仮説により予測された、ＨＬＡ分子との結合性が、−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチドを、ＨＬＡ結合性ペプチド候補とした。そして結合実験を行った結果、実際にこれらのペプチドがＨＬＡ結合性ペプチドであることを確認した。

その結果、ＨＬＡ分子との結合性が、−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列を含むため、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性に優れる、多数のＨＬＡ結合性ペプチドを効率よく得ることができた。

具体的には、本実施形態に係るＨＬＡ結合性ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ型分子に結合するＨＬＡ結合性ペプチドであって、後述する配列番号１から１８３からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるＨＬＡ結合性ペプチドである。

ヒトＨＬＡ−Ａ型のうち、日本人種の約５０％がＨＬＡ−Ａ２４型をもつ。また、ドイツ人などの欧米人は、ＨＬＡ−Ａ２型が多い。

なお、これらの配列は、いずれもＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）の所定のゲノムタンパク質に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。

配列番号１から４４の配列を、下記の表１に示す。

配列番号１から４４の配列は、後述するＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１８４）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号１から４４の配列は、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号１から４４まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号１が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−ｌｏｇＫｄ値にて示されている。

配列番号４５から８３の配列を、下記の表２に示す。

配列番号４５から８３の配列は、後述するＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１８５）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号４５から８３の配列は、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号４５から８３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号４５が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−ｌｏｇＫｄ値にて示されている。

配列番号８４から１２３の配列を、下記の表３に示す。

配列番号８４から１２３の配列は、後述するＨＣＶのｐＢＲＴ７０３’Ｘ株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１８６）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号８４から１２３の配列は、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号８４から１２３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号８４が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−ｌｏｇＫｄ値にて示されている。

配列番号１２４から１８３の配列を、下記の表４に示す。

配列番号１２４から１８３の配列は、後述するＨＣＶのｐＢＲＴ７０３’Ｘ株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１８６）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号１２４から１８３の配列は、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ２型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号１２４から１８３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号１２４が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のＨＬＡ−Ａ２型分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−ｌｏｇＫｄ値にて示されている。

なお、詳しくは、後述するが、表１から表４のいずれにおいても、予測スコアと結合実験データとの間に関連性が存在していることが明らかである。すなわち、多少の誤差はあるが、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が高いペプチドは、実験的に確認してもＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が高いといえる。

従来は、このように実験計画法を活用してＨＬＡ結合性ペプチドを見出す手法は採られていなかったために、実験的にＨＬＡ結合性が確認された極少数のＨＬＡ結合性ペプチドが知られていたに過ぎなかった。そのため、従来の手法で全くランダムに９アミノ酸残基からなるペプチドを合成し、ＨＬＡ分子との結合実験を行っても、結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して６を超えるものは、確率的には約１００個に１個しかなかった。

本実施形態においては、このように実験計画法を活用してＨＬＡ結合性ペプチドを見出す手法を採用したため、上記のような、１８３配列にも及ぶ多数のＨＬＡ結合性ペプチドを見出すことができた。また、得られたＨＬＡ結合性ペプチドの一部についてＨＬＡ結合性を実験的に確認したところ、実験を行った配列のいずれにおいても予測と同等かそれ以上のＨＬＡとの優れた結合性が確認された。

なお、これらの配列の中でも、配列番号１、２、３、５、８、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２２、２３、２５、２７、３４、３７、３８、４０、４２、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、７１、７２、７４、７５、７６、８４、８６、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１２３、１２４、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４１、１４２、１４６、１４７、１４９、１５０、１５２、１６２、１７０、１７３、１７６、１７７および１７９からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドは、実験によりヒトＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が確認されている。このため、確実にヒトＨＬＡ−Ａ型分子との結合性に優れるＨＬＡ結合性ペプチドであると言える。

ここで、本実施形態に係るＨＬＡ結合性ペプチドの、ＨＬＡ分子との結合性は、−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上とすることができ、特に好ましくは５以上であり、さらに好ましくは５．４以上である。

生化学の分野では、−ｌｏｇＫｄ値に換算しておおよそ結合能の３前後が、実際にペプチドがＨＬＡをはじめとするＭＨＣに結合するかしないかのしきい値として知られている。よって、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であれば、ＨＬＡ結合性ペプチドであると言える。

また、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して５以上であれば、ＨＬＡ分子に対する結合性が優れるペプチドが得られるため、免疫疾患などに対する効果的な治療薬、予防薬などの開発に好適に利用できる。

また、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して５．４以上であれば、ＨＬＡ分子に対する結合性が特に優れるペプチドが得られるため、免疫疾患などに対してさらに効果的な治療薬、予防薬などの開発に好適に利用できる。

また、本実施形態に係るＨＬＡ結合性ペプチドは、８以上１１以下のアミノ酸残基からなる構成とすることができる。

このように、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチドであれば、ＨＬＡ分子との結合性に優れる。また、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、ウイルスなどに感染した細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８〜１１のアミノ酸からなるウイルス抗原（ＣＴＬエピトープ）を特異的に認識し、感染細胞を傷害することによりウイルスを排除する。そして、このようなウイルスなどに特異的な８〜１１のアミノ酸からなるＣＴＬエピトープを作ることは、ウイルスなどに対する治療または予防のためのワクチンを作成する上で重要である。

例えば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドは、アミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。

また、上記のＨＬＡ結合性ペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａ２４型分子に結合するペプチドであってもよい。
さらに、上記のＨＬＡ結合性ペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａ２型分子に結合するペプチドであってもよい。

この構成によれば、日本人種を含むアジア人種に多いＨＬＡ−Ａ２４型分子に対して結合するペプチドが得られるため、日本人種を含むアジア人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。
さらにこの構成によれば、日本人種に加えて欧米人種に多いＨＬＡ−Ａ２型分子に対して結合するペプチドが得られるため、日本人種に加えて欧米人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。

また、上記のＨＬＡ結合性ペプチドに含まれるアミノ酸配列は、ＨＣＶの所定のゲノムタンパク質由来のアミノ酸配列としてもよいが、特に限定するわけではない。例えば、ＨＩＶのタンパク質由来のアミノ酸配列や、杉花粉のタンパク質由来のアミノ酸配列などであってもよい。また、その他の病原性またはアレルゲン性を有するタンパク質由来のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

例えばＨＣＶのエンベロープタンパク質由来のアミノ酸配列を含む場合には、ＨＣＶによりもたらされる疾病の予防、治療などに利用可能なＨＬＡ結合性ペプチドが得られる。

〈実施形態２〉
本実施形態によれば、ＨＬＡ−Ａ型分子に結合するＨＬＡ結合性ペプチドであって、上記のＨＬＡ結合性ペプチドに含まれるアミノ酸配列のうち１若しくは２個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるＨＬＡ結合性ペプチドが提供される。

後述するように、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性を有する特定のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列を含む構成であっても、上述の実施形態１に係るＨＬＡ結合性ペプチドと同様の作用を奏する。

上記のＨＣＶのＤ９０２０８株、Ｄ８９８１５株およびｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）のポリタンパク質のアミノ酸配列は、互いに一部異なっているが、Ｄ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質中の一部の配列に関する−ｌｏｇＫｄ値における予測データと実験データとの相関性が高いこと、すなわち予測データで結合性ありと判断された配列は実験データにおいても良好な−ｌｏｇＫｄ値を示すことから、Ｄ８９８１５株およびｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）においても予測データにて上位にランクされた−ｌｏｇＫｄ値を示すことが予測できる。したがって、結合性を示すアミノ酸配列のうち１若しくは２個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であるＤ８９８１５株およびｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の所定のゲノムタンパク質中のアミノ酸配列であっても、同様に優れたＨＬＡ結合性を示すことが予測される。

すなわち、配列番号１から１８３に示したＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が優れるアミノ酸配列のうち１若しくは２個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加されてなるアミノ酸配列であっても、同様に優れたＨＬＡ結合性を示すものと予測することができる。

別の観点から言えば、上述の方法により予測された、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が優れるアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加されてなるアミノ酸配列であっても、同様に優れたＨＬＡ結合性を示すものと予測することができる。なお、置換されるアミノ酸残基同士は、ともに疎水性アミノ酸残基などの互いに特性の類似するアミノ酸残基同士とする方がよい。

また、実施形態１および実施形態２に記載のＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。また、これらのＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ断片または組み換えベクターから発現することにより、これらのＨＬＡ結合性ペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。

〈実施形態３〉
本実施形態によれば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片が提供される。本実施形態に係るＤＮＡ断片は、特定のＤＮＡ配列を含むため、上記のＨＬＡ結合性ペプチドを発現可能である。

また、本実施形態に係るＤＮＡ断片を用いて上記のＨＬＡ結合性ペプチドを発現する場合には、このＤＮＡ断片を細胞内に導入して発現させてもよく、市販の人工的なタンパク質発現キットを用いて発現してもよい。

さらに、上記のＤＮＡ断片は、例えばヒトの細胞内に導入することにより、持続的な発現を行うことができる。そのため、細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドそのものを導入する場合よりも、細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ断片を導入する方が、持続的に細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドを存在させることができる。ＨＬＡ結合性ペプチドをワクチンとして用いる場合には、このように持続的に発現可能であることは、ワクチンの有効性を高める上で有利である。

また、本実施形態に係るＤＮＡ断片は、当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、市販のＤＮＡシンセサイザーなどにより、人工的に合成してもよい。あるいは、ＨＣＶのゲノムより制限酵素などを用いて切り出してきても良い。あるいは、プライマーを用いてＨＣＶのゲノムよりＰＣＲ法で増幅して得てもよい。また、こうして得られたＤＮＡ断片は、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、市販のＤＮＡシークエンサーなどにより同定可能である。

〈実施形態４〉
本実施形態によれば、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターが得られる。本実施形態に係る組み換えベクターは、特定のＤＮＡ配列を含むため、上記のＨＬＡ結合性ペプチドを発現可能である。

また、本実施形態に係る組み換えベクターを用いて上記のＨＬＡ結合性ペプチドを発現する場合には、この組み換えベクターを細胞内に導入して発現させてもよく、市販の人工的なタンパク質発現キットを用いて発現してもよい。

さらに、上記の組み換えベクターは、例えばヒトの細胞内に導入することにより、持続的な発現を行うことができる。そのため、細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドそのものを導入する場合よりも、細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドをコードする組み換えベクターを導入する方が、持続的に細胞内にＨＬＡ結合性ペプチドを存在させることができる。ＨＬＡ結合性ペプチドをワクチンとして用いる場合には、このように持続的に発現可能であることは、ワクチンの有効性を高める上で有利である。

また、上記の組み換えベクターにおいては、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流のプロモーター領域などの転写・発現に関する調節領域を任意の配列とすることにより、ＨＬＡ結合性ペプチドの発現量を精度よく制御可能である。また、組み換えベクターのオリジン領域などの複製に関する調節領域を任意の配列とすることにより、組み換えベクターの細胞内でのコピー数を精度よく制御可能である。

また、上記の組み換えベクターは、上記のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列以外にも任意の配列を含むことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の配列を含んでいてもよい。

また、本実施形態に係る組み換えベクターは、当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９などの市販のベクターのマルチクローニングサイトを任意の制限酵素サイトにて開裂し、そのサイトに上記ＤＮＡ断片を挿入してライゲーションすることにより得られる。また、こうして得られた組み換えベクターは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、任意の制限酵素により切断したＤＮＡ断片の長さがｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９などの市販のベクターの開裂地図と対応するか、アガロースゲル電気泳動により確認し、さらにマルチクローニングサイトから切り出したＤＮＡ配列中に上記ＤＮＡ配列が含まれているか、ＤＮＡシークエンサーなどにより同定可能である。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

例えば、上記実施の形態ではＨＣＶの所定のゲノムタンパク質（配列番号：１８４，１８５，１８６）由来のアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドとしたが、ＨＣＶの他のタンパク質由来のアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドとしてもよい。このような場合にも、それぞれの由来するタンパク質に関連する各種の免疫疾患の治療に利用することが可能である。

また、ＨＣＶ以外のＨＩＶウイルスなどの病原体に対するＨＬＡ結合性ペプチドとしてもよく、杉花粉などのアレルゲン、またはガン細胞などのタンパク質由来のアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドとしてもよい。

なお、このようにしても、上述の方法を用いてＨＬＡ結合性に優れると予測されたアミノ配列を含むのであれば、実験的に確認しても同様に優れたＨＬＡ結合性を示すと考えられる。このため、これらのＨＬＡ結合性ペプチドは、感染症（インフルエンザ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶ、ＨＣＶなど）を中心にして、ガン免疫療法、アレルギー疾患（花粉症、リウマチ、アトピー、喘息など）、自己免疫疾患などの治療または予防に好適に用い得る。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返した。ここで用いた能動学習実験計画の模式図を図１に示す。

（１）後述する下位学習アルゴリズムの試行１回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点（ペプチド）に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。

（２）選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。

本実施例では、下位学習アルゴリズムとして、隠れマルコフモデルの教師付き学習アルゴリズムを用い、２２３種のペプチドの初期データからスタートし、１回の実験あたり２０〜３０種のペプチドを予測、選択し、上記手順を４回繰り返し、合計３４１件のデータ
を得た。

より具体的には、本実施例の能動学習法では、２０種類あるアミノ酸を９個ならべたアミノ酸配列からなるペプチドの設計・合成を、１回の実験あたり２０〜３０種類分行った。そして、それらのＨＬＡ分子との結合の強さ（結合能）の計測を行った。そして、実験結果として、結合能（Ｋｄ値）を得た。結合能が高ければ、ワクチンの材料として利用可能なＨＬＡ結合性ペプチドの候補とした。

そして、得られた結果を、数学的アルゴリズムとして隠れマルコフモデルを利用する学習機械を備える学習システムに入力し、ルールを作成した。ここで、学習機械は、それぞれ異なる結果をサンプリングし、ルールを作った。なお、学習機械により、発現されるルールも異なる構成とした。なお、得られたルールや、
実験データは、蓄積データとして随時格納される。

そして、そのルールにより、２０^９＝５０００億以上のペプチド配列の中から、次回の実験候補を選び出し、上記のプロセスを繰り返した。この際、異なるルールを実験候補に適用し、実験結果の予測が割れる候補を実験にかけた。このように、実験結果の予測が割れる候補を次回の実験にかけるため、最終的な予測精度が向上した。

このように、複数の学習機械が、異なる予測をするサンプルを実験候補に選ぶ選択的サンプリングを行うことで、効率的に情報を獲得し、精度の高い仮説（ルール）を得た。上記のプロセスを、４回繰り返せば、後述する実施例のように優れた結果を得られた。また、７回以上繰り返せば、さらに優れた結果が得られる。

このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、９アミノ酸残基からなるペプチドについて、ＨＬＡ結合性ペプチドの全候補物質５０００億通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。能動学習法においては、実験からルールを作成し、ルールを適用して予測した数十の候補配列について実験を行うことを繰り返した。このため、実験の回数を削減して初期スクリーニングの時間／コストを大きく低減できた。

また、このようにして能動学習法により得られるルールによる、ペプチドのＨＬＡとの結合性の予測の的中率は、７０〜８０％にも達した。一方、アンカー法などの他の公知の技術による的中率は３０％程度に過ぎない。

〈ペプチド合成と精製〉
ペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製をし、９５％以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて行った（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＲＰ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）。ペプチドの定量は、ＢＳＡを標準蛋白質としてＭｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）にて行った。

〈ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４型分子への結合実験〉
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ２４型分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ２４型分子を発現するＣ１Ｒ−Ａ２４細胞（熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。）を用いて行った。

まず、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞をｐＨ３．３の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に元来結合している内因性ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に共通して会合している軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞に精製β２ｍを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、氷上４時間インキュベートした。この間に再会合したＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ペプチド、β２ｍの３者の会合体（ＭＨＣ−ｐｅｐ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体１７Ａ１２を用いて染色した。

その後、個々のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞当たりのＭＨＣ−ｐｅｐ数（上記蛍光抗体の蛍光強度に比例する）を、蛍光細胞解析装置ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて定量測定した。１細胞当たりの平均蛍光強度から、論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５１、８１６−８２８、２０００）に発表した方法にて、ＨＬＡ−Ａ２４型分子とペプチド間の結合解離定数Ｋｄ値を算出した。

〈ペプチドのＨＬＡ−Ａ２型分子への結合実験〉
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ２型分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する細胞株ＪＹを用いて行った。

まずＪＹ細胞をｐＨ３．８の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子にそれまで非共有結合的に会合していた内因性ペプチドと軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、再会合実験を行った。
結合能を測定したいペプチドの段階希釈列に上記ＪＹ細胞と精製β２ｍを加えたのち、氷上で４時間インキュベートした。この時点までに再会合したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて染色した。

その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５１、８１６−８２８、２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。

〈評価結果〉
その結果、上記表１〜表４に示した予測結果および実験結果が得られた。

表１の配列番号１から４４の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質の全長配列に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号１から４４の配列は、実施形態１で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号１から４４まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号１が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、ＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１８４（

また、配列番号４５から８３の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質の全長配列に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号４５から８３の配列は、実施形態１で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号４５から８３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号４５が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、ＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１８５（

また、配列番号８４から１２３の配列は、大阪大学微生物病研究所付属感染症研究センターの松浦善治教授より入手した、ＨＣＶのｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の所定のゲノムタンパク質に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号８４から１２３の配列は、実施形態１で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、ＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号８４から１２３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号８４が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、ＨＣＶのｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の所定のゲノムタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１８６（

また、配列番号１２４から１８３の配列は、上述のＨＣＶのｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の所定のゲノムタンパク質に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号１２４から１８３の配列は、実施形態１で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、ＨＬＡ−Ａ２型分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号１２４から１８３まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号１２４が、最も結合性が優れると予測される配列である。

また、表１から表４には、ＨＣＶのＤ９０２０８株、Ｄ８９８１５株、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）のそれぞれについて、上述の予測プログラムを用いた予測結果のスコア上位に相当するアミノ酸配列、予測スコア、それに対応する結合実験データが記載されている。なお、結合実験データはすべて、９アミノ酸ペプチドを上述の合成方法により人工合成して行った。

なお、ＨＣＶのＤ９０２０８株およびＤ８９８１５株の上記所定のゲノムタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋにも登録されているが、その中のＨＬＡ結合性ペプチドとなる９アミノ酸残基からなる配列については現時点では登録されていない。

また、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）は、日本人種のＣ型肝炎患者に多く見られるＨＣＶの亜株に近似する変異株である。本実施例では、日本人種に多い亜株に近似する変異株の所定のゲノムタンパク質に含まれるＨＬＡ結合性ペプチドを見出した。このＨＬＡ結合性ペプチドは、日本人種のＣ型肝炎治療薬の開発に好適に利用できる。

ここで、上記のＨＣＶのＤ９０２０８株、Ｄ８９８１５株およびｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の所定のゲノムタンパク質のアミノ酸配列は、互いに一部異なっているが、互いにアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であっても、前述したように同様に優れたＨＬＡ結合性を示すことを予測することができる。

例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号１のペプチドの左から６番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号４６のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号８５のペプチドではＦではなくＹとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号１７のペプチドの左から２番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号４９のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号９８のペプチドではＬではなくＦとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号３のペプチドの左から５番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号７１のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１１０のペプチドではＶではなくＡとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号２のペプチドの左から７番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号４５のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号８４のペプチドではＤではなくＥとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号４０のペプチドの左から７番目が、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１０７のペプチドではＣではなくＧとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号４３のペプチドの左から５番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号５９のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号８７のペプチドではＥではなくＤとなり、Ｄ９０２０８株の配列番号４３のペプチドの左から８番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号５９のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘの配列番号８７のペプチドではＶではなくＴとなっている。

また、Ｄ９０２０８株の配列番号４４のペプチドの左から７番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号６２のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号９３のペプチドではＩではなくＶとなり、Ｄ９０２０８株の配列番号４４のペプチドの左から９番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号６２のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘの配列番号９３のペプチドではＶではなくＦとなっている。

上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号１７のペプチドの左から２番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号４９のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号９８のペプチドではＬではなくＦとなっており、Ｄ９０２０８株の配列番号１７のペプチドの結合実験値が６．９８０３８であるのに対して、Ｄ８９８１５株の配列番号４９のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号９８のペプチドの結合実験値が７．７３４４となり、いずれもよく結合することを確認できる。

また、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号４０のペプチドの左から７番目が、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１０７のペプチドではＣではなくＧとなっており、Ｄ９０２０８株の配列番号４０のペプチドの結合実験値が６．９７５０７であるのに対して、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１０７のペプチドの結合実験値が６．３７３７３となり、いずれもよく結合することを確認できる。

また、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号３のペプチドの左から５番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号７１のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１１０のペプチドではＶではなくＡとなっており、Ｄ９０２０８株の配列番号３のペプチドの結合実験値が６．１４８４８であるのに対して、Ｄ８９８１５株の配列番号７１のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号１１０のペプチドの結合実験値が６．７５７５６となり、いずれもよく結合することを確認できる。

また、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号２のペプチドの左から７番目が、Ｄ８９８１５株の配列番号４５のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号８４のペプチドではＤではなくＥとなっており、Ｄ９０２０８株の配列番号２のペプチドの結合実験値が５．３２４１７であるのに対して、Ｄ８９８１５株の配列番号４５のペプチドとｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号８４のペプチドの結合実験値が５．００３４３となり、いずれもよく結合することを確認できる。

また、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、ｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）の配列番号９０のペプチドと配列番号１１２のペプチドでは、アミノ酸の配列が一つ横にずれているが、配列番号９０のペプチドの結合実験値が６．５１８７４であるのに対して、配列番号１１２のペプチドの結合実験値が６．６３４２３となり、いずれもよく結合することを確認できる。

また、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列のうち、例えば、Ｄ９０２０８株の配列番号１３のペプチドおよびＤ８９８１５株の配列番号６０のペプチドと、Ｄ９０２０８株の配列番号１８のペプチドおよびＤ８９８１５株の配列番号６４のペプチドでは、アミノ酸の配列が一つ横にずれているが、配列番号１３および６０のペプチドの結合実験値が７．８９５１９であるのに対して、配列番号１８および６４のペプチドの結合実験値が５．９１６９となり、いずれもよく結合することを確認できる。

したがって、上記の互いに１または２アミノ酸残基が置換されてなるペプチド配列は、いずれも同様に優れたＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性を示すことが予測される。よって、配列番号１から１８３に示したＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が優れるアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加されてなるアミノ酸配列であっても、同様に優れたＨＬＡ結合性を示すものと予測することができる。

別の観点から言えば、実施形態１で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、ＨＬＡ−Ａ型分子との結合性が優れるアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加されてなるアミノ酸配列であっても、同様に優れたＨＬＡ結合性を示すものと言える。なお、置換されるアミノ酸残基同士は、ともに疎水性アミノ酸残基などの互いに特性の類似するアミノ酸残基同士とする方がよい。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

たとえば、上記実施例では、ＨＣＶのＤ９０２０８株、Ｄ８９８１５株およびｐＢＲＴ７０３’Ｘ株（Ｄ８９８１５の変異サブクローン）を用いたが、ＨＣＶの他の株を用いてもよい。この場合も、本発明に用いる予測プログラムによれば、ＨＬＡ結合性を精度よく予測可能である。

Claims (3)

1. 配列番号１７のアミノ酸配列からなり、ヒトＨＬＡ−Ａ２４型分子に結合することを特徴とするＨＬＡ結合性ペプチド。
2. 請求項１に記載のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
3. 請求項１に記載のＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換えベクター。

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