JP4750697B2 - 幹細胞の成長及び分化を調節する方法及び組成物 - Google Patents
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Description
メインクレームの特徴の組み合わせは上記目的に合致し、サブクレームは本発明のさらに有利な実施形態を開示する。
(a)成体幹細胞試験群を用意する;
(b)前記試験群を候補化合物と接触させる;
(c)前記試験群の増殖をモニターする;
(d)前記試験群の増殖を前記候補化合物と接触させなかったコントロール群の増殖と比較し、前記試験群の増殖と前記コントロール群の増殖との差をWntシグナル伝達経路調節化合物の指標とする。
これら及び他の本発明の特徴は、添付図面を参照した下記の記載からより明らかになるだろう。
他に定義されていない限り、ここで用いる全ての技術的、科学的用語は、本発明が関係する分野の通常の技術者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明に従って、Wntシグナル伝達経路の候補モジュレーターは、Wntポリペプチドの活性を直接的または間接的に刺激または抑制する化合物及び分子である。直接的モジュレーターは、WntポリペプチドもしくはWntポリペプチドをエンコードする遺伝子に作用し、一方、間接的モジュレーターは、Wntシグナル伝達経路においてWntポリペプチドの上流(「アクティベーター」)もしくは下流(「エフェクター」)で働く一つ以上のタンパク、もしくはタンパクをエンコードする遺伝子に作用する。従って、モジュレーターは、遺伝子レベルで作用して、例えば、WntポリペプチドもしくはWntポリペプチドのアクティベーターまたはエフェクターをエンコードする遺伝子の発現を上方調節もしくは下方調節することができ、あるいはタンパクレベルで作用して、WntポリペプチドまたはWntポリペプチドアクティベータータンパクまたはエフェクタータンパクの活性に影響を与えることができる。それ自身がWntポリペプチド、もしくはその活性フラグメントまたは変異体であり、細胞中のWntレベルを増大させることができるモジュレーターもまた、意図されている。モジュレーターは、例えば、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体または抗体フラグメント、もしくは小分子のアクティベーターまたはインヒビターであることができる。小分子のモジュレーターは、有機物または無機物であることができる。本発明の範囲において、Wntポリペプチドの活性は、幹細胞の分化及び/または増殖を導く活性をいう。
ここで使用される「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、ペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸残基の配列をいう。通常、ポリペプチドは少なくとも6つのアミノ酸長さであり、ペプチドは少なくとも3つのアミノ酸長さである。ポリペプチドもしくはペプチドは、自然発生、組換え、合成、もしくはこれらの組合せであることができる。ポリペプチドもしくはペプチドは、自然発生タンパクもしくはポリペプチドのフラグメントであることができる。ポリペプチド及びペプチドという用語は、ペプチド類似体、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣化合物も包含する。このような化合物は当該分野においてよく知られており、自然発生ペプチドよりもに大きな利点を有していてよく、例えば、より高い化学安定性や、増強されたタンパク分解抵抗性、強化された薬理学的特性(例えば半減期、吸収、作用強度、有効性など)、変化した特異性(例えば、生物学的活性の広域性)、及び/または減少した抗原性などが挙げられる。
本発明の一つの実施形態において、ポリペプチド及びペプチドは組換え技術により生成される。一般的には、これは、ポリペプチドまたはペプチドをエンコードするDNAの全てまたは一部を含む発現ベクターでの、適当な宿主細胞の形質転換(形質移入、形質導入、または感染を含む)を含む。Wntシグナル伝達経路に含まれるタンパクの多くの遺伝子配列が 、当該分野において知られている。Wntシグナル伝達経路における既知タンパクをエンコードする遺伝子の代表的なGenBank Accession No.を表2に示す。
本発明は、Wnt遺伝子、あるいはWntタンパクまたは遺伝子のアクティベーターまたはエフェクターをエンコードする遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドインヒビター及びアクティベーターも意図するものである。本発明に関連して、「オリゴヌクレオチドインヒビター」及び「オリゴヌクレオチドアクティベーター」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短分子干渉RNA(siRNA)、リボザイム及び三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを包含する。
本発明は、Wntシグナル伝達経路の標的タンパクに対して産生され、タンパクへ結合して抑制することができる抗体及び抗体フラグメントの使用も意図している。本発明に関連して、標的タンパクはWntタンパク、またはWntタンパクのアクティベーターまたはエフェクターである。
本発明は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成及び自然発生の有機及び無機分子などのWntシグナル伝達経路の小分子モジュレーターも提供する。例として、塩化リチウム(LiCl)は幹細胞におけるWntシグナル伝達経路の既知の刺激剤であり、それはGSK−3βの抑制を通じてβ−カテニンを安定化するように働く(Hedgepeth, et al.,(1997) Dev. Biol., 185:82−91)。
さらに、本発明は候補化合物の、Wntシグナル伝達経路の調節による成体幹細胞の増殖及び/または系列決定を調節する能力をスクリーニングする方法も提供する。一般に、そのような方法は、成体幹細胞群を候補化合物と接触させるステップ、及び、細胞中の増殖及び/または系列決定の一つ以上の指標をモニターするステップを含む。
さらに、本発明は、細胞をWntシグナル伝達経路の一つ以上のモジュレーターと直接的または間接的に接触させることによって、成体幹細胞の増殖及び/または系列決定を誘導または抑制する方法を提供する。本発明で提供されるモジュレーターは、幹細胞または系列決定された前駆細胞の生存を高め、また、決定された前駆細胞の最終分化を誘導するのに用いることもできる。本発明により提供されるWntシグナル伝達経路の方法及びモジュレーターには、多くの応用がある。例えば、本方法及びモジュレーターは、さらにインビトロで使用するため、例えば研究目的で使用するために、成体幹細胞の増殖を促進するのに、及び/または、細胞の運命が決定づけられる幹細胞の系列決定を促進または抑制するのに、インビトロにおいて使用することができる。幹細胞の増殖を促進する、及び/または系列決定を促進または抑制する化合物及び方法は、薬物試験のための新しいインビトロモデルの開発における応用の可能性もある。幹細胞または前駆細胞の生存を高める本発明のモジュレーターは、これらの細胞のインビトロ培養及び維持の促進に特に有用である。
本発明は、当該分野において公知の様々な「遺伝子治療」法による、オリゴヌクレオチドモジュレーター、またはモジュレーターをエンコードする核酸分子(これは、その後エンコードされた産生物をインビボで発現する)の投与も意図している。遺伝子治療には、エクスビボ及びインビボの両方の技術が含まれる。従って、宿主細胞は、オリゴヌクレオチドモジュレーター、またはモジュレーターをエンコードする核酸分子で、エクスビボにおいて遺伝的に設計することができ、設計された細胞は、その後治療すべき患者に投与される。細胞培養は、例えば、細胞を解離(例えば機械的な解離)し、細胞を薬学的に許容可能な担体(例えばリン酸緩衝生理食塩水)と混合することにより、患者へ投与するために製剤化することができる。あるいは、細胞を適当な生体適合性支持体上で培養し、患者へ移植してもよい。設計された細胞は、通常、異種間またはアロタイプの拒絶反応を避けるため自家系である。そのようなエクスビボでの方法は、当該分野においてよく知られている。
さらに、本発明は、Wntシグナル伝達経路の一つ以上のモジュレーターを医薬組成物中に含む治療キットも提供する。キットの個々の成分は別々の容器に包装され、そのような容器とともに、医薬品あるいは生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関指定の様式の通知を有することがあり、通知はヒト投与のために製造、使用あるいは販売する機関による認可を反映する。
(材料及び方法)
細胞選別
単核細胞は、β−アクチン−EGFPトランスジェニックマウス(Hadjantonakis, 1998, Mech Dev 76, 79−90)、またはMyf5nLacZトランスジェニックマウス(Tajbakhsh, 1995, Development 125, 4155−4162)の後肢筋から得た。筋細胞は以前記載されたように回収した(Megeney, 1996, Genes Dev 10, 1173−1183)。単核細胞を、5%FBSを添加したDMEMで二回洗浄し、2〜3×106cell/mlの濃度で懸濁した。染色は抗体:CD45−APC、クローン30−F11またはCD45.2−FITC(クローン104)、Sca1−PE、クローンD7(BD Pharmingen)を用いて、氷上で30〜45分間行った。あるいは、CD45−ビオチン、クローン30−F11を、ストレプトアビジンTri−Color Conjugate(Caltag Labs)と10分インキュベーション後使用した。一次抗体は、1:200で希釈し、ストレプトアビジンTri−Color Conjugateは1:1000で希釈した。4℃のDMEMで二回洗浄後、細胞を3つのレーザーを備えたMoFlo cytometer(DakoCytomation)で分離した。選別ゲートは、アイソタイプコントロール染色細胞及び単一抗体染色に基づいて、正確に決定した。死細胞及び残骸は、前方及び側方散乱分析結果で開閉することによって排除した。選別は、できるだけ高純度を達成するため、単細胞モードを用いて行った。選別された群の純度は、常に>98%であった。
3週齢のBalb/cマウスの後肢筋から一次筋芽細胞を分離し、20%FBS及び2.5ng/ml bFGF(Invitrogen)を追加したHAM’s F−10培地(Invitrogen)中で維持した。単一筋線維は、以前記載されたように長指伸筋から調製した(Rosenblatt, 1995)。AtT−20、BOSC 23、C3H10T1/2、及びCos1細胞はATCCから入手し、10%FBSを追加したDMEM中で維持した。HA−Wntタンパクを発現する安定細胞系を、以前記載されたようにして得た(Shimizu, 1997, Cell Growth Differ 8, 1349−1358)。HA−Wntの発現は、抗HA抗体(HA−7, Sigma)を用いたウェスタンブロット分析によって確認した。
共培養実験のため、一次筋芽細胞またはWnt発現細胞を、精製したCD45+:Sca1+細胞と1:1の割合で混合し、コラーゲンコートした2穴Permanox Chamber Slides(Lab−Tek)上に撒いた。密度は、増殖条件の共培養では2×104cells/chamber、分化実験では4×104cells/chamberであった。共培養は、20%FBSを追加したHAM’s F−10培地中で3日間維持し、分化実験のためにDMEM/5%ウマ血清に切り替えた。Li2+またはShh転換実験のため、10mMのLiCl(Sigma)、あるいは10または100ng/mLのShh−N(R&D Systems)を分化培地に添加した。免疫組織化学的分析のため、細胞を、2%PFAを用いて室温で15分間固定し、0.05%Triton X−100を用いて15分間透過処理し、PBS中で1%BSA/5%HSによってブロックし、抗体を用いて室温で2時間染色した:染色に用いた抗体は、MyoD、クローン5.8A(BD Pharmingen);ミオシン重鎖、クローンMF−20(Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB));Pax7(DSHB);またはβ−カテニン(BD Transduction Laboratories)である。フルオレセインまたはローダミン結合抗体(Chemicon)を、二次検出に使用した。カバースライドを載せ、Zeiss Axioscop蛍光顕微鏡を使用して分析した。
メーカーの使用説明書に従ってRNAeasy kits(Qiagen)を使用し、全てのRNAを抽出した。Frizzled遺伝子発現の分析のため、保存frizzled配列であるYPERPIIF及びWWVILSLTWに対応する完全縮合プライマーを用いて、以前記載されたようにRT−PCRを行った(Malik, 2000, Biochem J 349 Pt 3, 829−834)。その生成物を、TOPO−PCRIIベクター(Invitrogen)中にクローニングし、配列決定した。Wnt mRNAsのRT−PCR分析は、GeneAmp PCR Core kit(Perkin−Elmer)を使用して行った。次のプライマーを使用した。
Wnt1 (5’-acgtacagtggccgcctg-3’; 5’-acgcgcgtgtgcgtgcagtt-3’; 203 bp);
Wnt3a (5’-ggagatggtggtagagaaa-3’; 5’atagacacgtgtgcactc- 3’; 322 bp);
Wnt4 (5’-agcccccgttcgtgcctgcggtcc-3’; 5’-actccacccgcatgtgtgtca-3’; 607 bp);
Wnt5a (5’-aatggctttggccacgttttt-3’; 5’- tggattcgttcccttt-3’; 541 bp);
Wnt5b (5’-agtgcagagaccggagatgttc-3’; 5’- ggcaaagttcttctcacgc-3’; 459 bp);
Wnt7a (5’-agcgcggcgctgcctgggcc-3’; 5’-cttcagaaaggtgggccgcttgttt- 3’; 752 bp);
Wnt7b (5’-ccgcacctcgccgggggccgac-3’; 5’-gtcggcccccggcgaggtgcgg-3’; 180 bp);
Wnt10a (5'-aaagtcccctacgagagccc-3', 5'-cagcttccgacggaaagctt-3'),
Wnt10b (5'-cggctgccgcaccacagcgc-3', 5'-cagcttggctctaagccggt-3')
sFRP1 (5'-cgcccgtctgtctggaccg-3'; 5'-ctcgcttgcacagagatgt-3', 257 bp);
sFRP2 (5'- ttcggccagcccgacttctcc- 3'; 5'- taggtcgtcgagacagacagggg- 3', 234 bp);
sFRP3 (5'- attttcctatggattcaagtactg-3'; 5'-ttgactttcttaccaagccgatcctt- 3'; 396 bp);
sFRP4 (5’- tggatagacatcacaccagatat-3'; 5'- cctgaagcctctcttccca-3', 423 bp).
5〜8週齢マウスをハロタンガスを用いて麻酔した。10μMカルジオトキシン(Latoxan)25μlを、29 G 1/2インスリン用シリンジを使用してTA筋内へ直接注射した。細胞増殖試験のため、動物を屠殺する90分前に5−ブロモ−デオキシウリジン(BrdU, Sigma)0.3mg/kgを、腹腔内に注射した。BrdUを取り込んだ細胞を、FITC結合抗BrdU 抗体(BD Pharmingen)を用いたフローサイトメトリーにより検出した。sFRP試験のため、組換えSFRP2及び3(R&D Systems)100ngを、再生TA筋へ注射した。コントロール動物へは、同量のPBSを注射した。全TA細胞群の分析のため、1×104の単核細胞を、コラーゲンコートしたチャンバースライド上に一晩プレーティングし、その後、1:200の抗デスミン抗体(DAKO)で染色した。二次検出には、1:500のロバ抗マウスFITC(Chemicon)を用いた。
損傷を受けていない再生TA筋を、液体窒素中で急速冷凍し、粉砕し、抽出緩衝液中(50mM Tris−HCl pH 7.4、0.1% Triton X−100、5 mM EDTA、250mM NaCl、50mM NaF、プロテアーゼインヒビター(Complet, Roche))に溶解した。抽出物を、バイオラッド染料を使用してタンパク内容を正規化した。50μgの溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)によって分離し、ニトロセルロースフィルター上に転写した。フィルターを、Wnt5a,1:200(AF645, R&D Systems);β−カテニン,1:250(BD Transduction Laboratories)、α−チューブリン,1:2000(T 9026, Sigma)に対する抗体で探索した。二次検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体(BioRad)を用いて行った。タンパク発現を、ECL Plus kit(Amersham)を使用して可視化した。
再生マウス腓腹筋の遺伝子発現プロファイリング及びデータ分析は、すでに記載されている(Zhao, 2002, J Biol Chem 277, 30091−30101)ように、CNMC Research Centerで行われた。簡単に言うと、腓腹筋に10mMカルジオトキシン(ctx)(Calbiochem)100μlを注射した。RNAを、ctx注射後0(注射なし)、12時間、1日、2日、及び10日に、4つの別々の筋肉から調製した。ビオチン標識cRNAを、それぞれの複製のために得て、断片化し、Murine Genome U74A version 1 chips(Affymetrix)とハイブリッド形成した。一次データ及び比較分析は、以前に記載されている(Chen, 2000, J Cell Biol 151, 1321−1336)ように、Affymetrix Microarray Suite 4.0を使用して行った。
筋肉再生の間のCD45 + :Sca1 + 細胞の筋原性決定
汎造血性マーカーCD45、及び幹細胞マーカーStem Cell Antigen−1(Sca1)を発現する細胞は、損傷を受けていない前脛骨(TA)筋から精製し、カルジオトキシン(ctx)投与後の様々な時点で再生を誘導した(図1A)。CD45及びSca1発現細胞の比率は、再生の間に平均10倍まで増加した(n=6)(図1A)。興味深いことに、ctx注射後4日目のCD45−:Sca1+細胞(BrdU+細胞の60%)及びCD45+:Sca1+ 細胞(BrdU+細胞の18%)内へのBrdUの選択的な取り込みは、これらの細胞が再生の間に大規模な増殖を起こしていることを示唆した(図1B)。これらの知見は、CD45及びSca1を発現する筋細胞が、筋損傷に反応して活性化され、増殖することを示している。
前記のように、損傷を受けていない骨格筋から精製されたCD45+:Sca1+細胞は、筋原細胞を自発的には形成しない(Asakura, 2002, J Cell Biol 159, 123−134; McKinney−Freeman, 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1341−1346も参照)。しかしながら、一次筋芽細胞との共培養において、投入されたEGFPトランスジェニックマウス由来のCD45+:Sca1+筋細胞の0.5±0.03%は、単核のMHC発現筋細胞を形成した(図2A、コントロール)。前記トランスジェニックマウス由来の筋細胞の50%までしかEGFPが検出できず、また、CD45+:Sca1+細胞のプレーティング効率は低いので、この筋原分化の頻度は、実際の効率よりも過小評価である。単独培養したCD45+:Sca−1+フラクション(n=6)において、筋原細胞は全く観察されなかったことから、選別に起因した筋芽細胞との共培養におけるいかなる汚染の可能性も排除された。
骨格筋再生中のWntシグナル伝達カスケードにおける遺伝子の発現動態の分析のため、半定量RT−PCR分析を用いた。再生筋肉(損傷後4日)において、Wnts5a、5b、7a及び7bのmRNAが誘導され、一方、Wnt4は強く下方制御された(図3A)。リアルタイムPCRを用いた第2の実験において、Wntシグナル伝達カスケードにおける遺伝子の発現は、さらに下記表3の記載の結果を与えた。
CD45+:Sca1+細胞が一次筋芽細胞との共培養において筋原性変化を起こす能力(図2)に鑑み、筋芽細胞、筋管、及び筋原線維をWnts及びsFRPsの発現について試験した。重要なことに、Wnt5a及び5bは、増殖中の筋芽細胞においては発現されたが、分化した筋管では発現されなかった。これに対して、Wnt7aは筋管においては発現されたが、筋芽細胞では発現されなかった(図3B)。興味深いことに、3つのWnts全てが、分離された単一筋線維において発現された。しかしながら、Wnt7bのmRNAは、どのサンプルにおいても検出されなかった。最後に、sFRP1−4も筋芽細胞、筋管、及び筋線維において発現された(図3B)。従って、これらの結果は、筋芽細胞におけるWnt5a及びWnt5bの発現が、我々の共培養実験におけるCD45+成体幹細胞の筋原性決定を誘導するという仮説を示唆するものである。さらに、これらのデータは、再生筋肉における筋原線維及び筋芽細胞によって分泌されたWnt5a、5b、及び7aによる組み合わされたシグナル伝達が、成体筋肉由来幹細胞の筋原性決定の原因であることを示唆するものである。
筋肉再生の間、CD45+:Sca1+細胞がWntsの推定標的を表すならば、CD45+:Sca1+細胞はWnt受容体Frizzled(Fzd)を発現することが予想される。従って、CD45+:Sca1+細胞を休止中及び再生中のTA筋から分離し、Fzdsの発現を試験した。Fzdsに対するRT−PCRを完全縮重プライマーを用いて行い、続いてPCR産物のクローニング及び配列決定を行った。休止筋肉からのCD45+:Sca1+細胞では、Fzd1及び4の発現が観察された。ctx注射後4日までに、CD45+:Sca1+細胞は、全体的にFzd発現を上方制御し、さらにFzd7も発現した(図3C)。重要なことに、休止中及び再生中の全てのTA筋から分離されたRNAで、Fzd mRNA発現に全く変化は見られなかったので、Fzd mRNAsの発現で観察されたこの上方制御はCD45+:Sca1+群に特異的であった。
再生筋肉において、Wntシグナル伝達が活性化されるかどうかを決定するため、ウェスタンブロット分析を用いてβ−カテニンを検出した。β−カテニンの安定化及び核内蓄積は、応答細胞の標準Wnt経路の活性化の証である(Pandur, 2002, Bioessays 24, 881−884)。β−カテニンは、全ての再生TA筋からの抽出物において損傷を受けていない筋肉に比べて強く上方制御された(図4A)。重要なことに、β−カテニンタンパクの発現は、筋肉損傷後CD45+:Sca1+細胞で高レベルに誘導された(図4B)。これに対して、CD45−:Sca1+細胞は、β−カテニンを検出可能なレベルまで発現しなかった。再生筋肉においては、CD45−:Sca1−群、これはほぼ独占的に筋芽細胞からなる(未発表の知見)、はβ−カテニンを高レベルに発現した。これらのデータは、CD45+:Sca1+細胞が、再生TA筋の標準Wntシグナル伝達経路を経てWntシグナル伝達に応答するという仮説を支持するものである。
WntがCD45+:Sca1+細胞の筋原性変化を誘導するのに十分であるかどうかを検討するため、組換えHA標識Wntタンパクを発現する安定細胞系パネルを確立した。異所性Wnt5a、5b、7a、及び7b(Wnt混合)を発現するAtT−20細胞と共培養後、EGFP発現CD45+:Sca1+細胞は、これらの細胞のWntシグナル伝達の活性化に一致するβ−カテニン(矢印)の細胞質及び/または核局在化を示した(図5A)。これに対して、空のベクターを安定に形質移入したAtT−20細胞と共培養したCD45+:Sca1+細胞は、細胞質内または核内にβ−カテニンを蓄積しなかった(図5A)。
インビボにおける筋肉再生のエフェクターとしてのWntシグナル伝達の関連性を評価するため、組換えWntアンタゴニストsFRP2及び3(各100ng)を、Myf5nlacZマウスの再生筋肉内へ毎日注射した。3つのコントロール動物群を、可能性のある外来性の効果を評価するために用いた。第一群(損傷を受けていないコントロール)はctxを注射せず、その後sFRP注射もしなかった。第二群は初めにctxではなくPBSの注射し、次いでsFRPを毎日注射した。最後の群は、再生を誘導するためにctxを注射し、次いでsFRPsの代わりにPBSを毎日注射した。
8−10週齢の雄Myf5nLacZマウスを、2つの群に分けた。第一群(n=3)は、塩化リチウムの腹腔内注射(2mg/kg/day、約100μL量)(Sigma)、第二群は(n=3)は生理食塩水注射(100μL/day)を14日間行った。処理開始後10日目に、カルジオトキシン注射により再生を誘導した(10μMカルジオトキシン(Laxotan)25μlを29G1/2インスリン用シリンジを用いてTA筋へ直接注射した)。
別の実験において、Wnt−5a、−5b、−7b、β−カテニン及びβ−カテニン−IRES−lef1のcDNAフラグメントを、レトロウィルスベクターpHAN(puro)にサブクローニングした。環境栄養性レトロウィルスを調製するため、Phoenix−ecoパッケージング細胞に、lipofectoAMINE(Invitrogen)を用いてレトロウィルスベクターを形質移入した。形質移入後30時間でウィルス上清を回収し、ポリブレン(Sigma、8mg/ml)の存在下で一次筋芽細胞に感染させるために使用した。感染させた細胞を、感染後24時間にピューロマイシン(Sigma、1mg/ml)で選択した。選択した一次筋芽細胞を、100mmの皿中で増殖させ、PBSで2回洗浄し、プロテアーゼインヒビター混合物(Roche)を含む放射性免疫沈降検定(RIPA)緩衝液(50mMTrisHCl、pH 7.5; 150mMNaCl; 0.5% Nonidet P−40; 0.1%デオキシコール酸塩)100ml中に溶解した。細胞抽出物を回収し、微量遠心機にて13,000rpmで5分間遠心した。全タンパク(5μg)は、10%SDS−PAGEにより分離し、Immobilon−P(Millipore)に移した。そのメンブレンを、一次抗体、次いで1:5,000のHRP結合二次抗体(Bio−Rad)をプローブとし、ECLTM Plus (Amersham Biosciences)を使用して発現させた。メンブレンはBIOMAX film(Kodak)へ焼き付けた。この作業で使用した一次抗体は、抗PAX7(1:2)、β−カテニン(BD Bioscience、1:2,000)、抗HA(Sigma、1:5,000)、及び抗α−tublin(Sigma、1:4,000)であった。結果を図9に示す。
全ての引用は、参照することによりここに組み込まれる。
本発明は、好ましい実施形態について記載した。しかしながら、多くの変更及び修飾がここに記載の発明の範囲を逸脱することなく為すことが可能であるということは、当該分野の技術者に明らかであろう。
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Claims (16)
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、筋組織より採取したCD45+:Scal+常在幹細胞の増殖及び筋分化誘導法。
- 前記筋組織が哺乳類筋組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項2に記載の方法。
- 前記WntポリペプチドがヒトWntポリペプチドである、請求項1−3のいずれかに記載の方法。
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、筋組織より採取した筋原前駆細胞群の最終分化誘導法。
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドの阻害剤である可溶性Frizzled関連タンパク2(sFRP2)及び3(sFRP3)を含む組成物を投与することを含む、筋組織より採取したCD45+:Scal+常在幹細胞の増殖及び筋分化抑制法。
- 前記筋組織が哺乳類筋組織である、請求項6に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項7に記載の方法。
- 前記sFRPsがヒトsFRPsである、請求項6−8のいずれかに記載の方法。
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、対象の筋常在CD45+:Scal+幹細胞の増殖及び筋分化誘導剤。
- 前記幹細胞が出生後の対象に由来する、請求項10に記載の誘導剤。
- 前記WntポリペプチドがヒトWntポリペプチドである、請求項10又は11に記載の誘導剤。
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、筋原前駆細胞群の最終分化誘導剤。
- Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、及びWnt7bポリペプチドの阻害剤である可溶性Frizzled関連タンパク2(sFRP2)及び3(sFRP3)と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、対象の筋常在CD45+:Scal+幹細胞の増殖及び筋分化抑制剤。
- 前記幹細胞が出生後の対象に由来する、請求項14に記載の抑制剤。
- 前記sFRPsがヒトsFRPsである、請求項14又は15に記載の抑制剤。
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