JP5025646B2 - 虚血性心疾患の治療方法 - Google Patents
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Description
しかし、これらの分子、即ちSFRP2、SFRP4、MDK、PTN及びTB10の、損傷した心筋における役割、およびそれらの虚血性心筋症に対する治療応用可能性に関してはあまり知られていない。
(心筋梗塞モデルラットの作成)
本実験では、Wistar-Lewisラット[180-220g;6?10週齡;セアック吉富(株)、福岡(SDラット、日本クレア、日本)]を用いた。全てのラットは、「"Principles of Laboratory Animal Care", National Society for Medical Research」及び「"Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", National Institutes of Health, NIH Publication. No. 85-23, 1996」に従って人道的に扱われた。SDラットは、ペントバルビタール(50mg/kg体重)の腹膜内注射により麻酔した。麻酔下のラットに挿管し、人工呼吸器(SN?480?7型、株式会社シナノ製作所、東京)を用いて陽圧換気を維持した。左胸部を横に2.5cm開胸して、心臓を露出させた。左冠動脈主幹部(Left Anterior Descendant main branch)を、7番(segment 7)において6.0プロリン手術用縫合糸で結紮(LAD結紮)し、心筋梗塞モデルとした。以下、LAD結紮2週間後のラットを「モデルラット」ということがある。
(心筋梗塞モデルラットの作成)
雄の8週齡Lewisラット(220?225g;セアック吉富(株)、福岡)を用いた。全てのラットは、大阪大学大学院医学系研究科が定めた動物実験ガイドライン及び動物の愛護及び管理に関する法律に従って適切に扱われた。本実験のプロトコルは、大阪大学動物実験委員会によって検討・承認された。ケタミン(90mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)を用いてラットを麻酔し、文献記載の方法(Circulation. 1988;78:186-201)に従い、人工呼吸(機械換気)下に冠動脈左前下行枝(LAD)を結紮することにより心筋梗塞を引き起こした。以下、これらのラットを「LAD結紮ラット」ということがある。また、LAD結紮2週間後のラットを「モデルラット」ということがある。
(筋芽細胞注入モデル)
SDラットの後肢骨格筋から筋芽細胞を単離した。ラットを安楽死させ、筋肉を切り出してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。非筋組織を注意深く除去した後、筋肉を細かく刻み、5mg/mLのコラーゲナーゼ(ギブコBRL、米国メリーランド州ロックヴィル)酵素により37SYMBOL 176 \f "Symbol" \s 10.5Cで40分間消化した。処理後、細胞を回収し、20%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン_ストレプトマイシン添加ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(ギブコBRL)に再懸濁した。まず、細胞を100−mmコラーゲン被覆培養皿(岩城硝子、東京)に植え、5%CO2含有湿潤雰囲気下37度で培養した。翌日、培養基を替えることにより非付着細胞を除去し、残りの付着細胞を約70%の集密度になるまで培養した。5日間の培養後、細胞を集め、DMEMで洗浄し、移植まで氷上に保存した。通常、一匹のラットから20×106個の筋芽細胞が得られ、培養細胞は約50%のデスミン陽性細胞を含有していた。得られた筋芽細胞を参考例4の筋芽細胞シートの形成に用いた。
(筋芽細胞シートモデル)
参考例1で単離された筋芽細胞を、温度応答性高分子であるポリN-イソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)で被覆された組織培養皿(プロセル、株式会社セルシード、東京)上で培養し、筋芽細胞シートを調製した。なお、これらの培養皿の表面は、37℃においては疎水性であるが、20℃未満の温度になると親水性に変化する。6cm皿内の細胞密度5×106の細胞懸濁液を、20%ウシ胎児血清(FBS)含有DMEM中、5%CO2雰囲気下37℃で1〜2日間培養した。6cm皿で培養した集密細胞(コンフルエント細胞)は、20℃の温度に1時間保持することによって自発的に剥離し、1.5cm×2.0cmの大きさの筋芽細胞シートが得られた。
(ジーンチップ分析)
ラット6匹[Wistar?Lewisラット(180?220g;6?10週齡:セアック吉富(株)、福岡(SDラット、日本クレア、日本)]を屠殺し、非処置心臓サンプルを対照として得た(以下、A群という)。
参考例2で得られたモデルラットから、結紮から4、7、14又は56日後に梗塞及び非梗塞左心室(LV)心筋を採取し、使用するまでの間、直ちにRNAlater(登録商標)溶液(QIAGEN、ドイツ国ヒルデン)中に保存した(各時点につきn=5)。正常ラット15匹から無処置の心筋を同様に採取し、参照試料として用いた。RNeasyミニキット(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出し、PTN又はMDK遺伝子の転写物の相対的レベルを、ABI PRISM7700配列決定システム(J Heart Lung Transplant. 2002;21:1090?1100)を用いた定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT?PCR)により測定した。用いたforwardプライマー、reverseプライマー及びTaqManプローブ(登録商標)の塩基配列は下記の通りである:
ラットMDK;
CGG ATG GTC TCC TGG CAC (配列番号1)、
AGC AAG GAC TGC GGC ATG (配列番号2)、
GCC ACA CGC CCC CCA GCT (配列番号3)、
ラットPTN;
GCA AAT ACC AGT TCC AGG CTT G (配列番号4)、
TTC TTG CCT TCC TTT TTC TTC TTC T (配列番号5)、
GAA CTC ACC AGC CCA AGC CTC AAG C (配列番号6)。
R&Dシステム製SFRP2(1μg)をゼラチン(新田ゼラチン、日本)10mgと混合し、直径100〜150μmの徐放性ゲル微粒子(マイクロスフェア)を調製した。前記微粒子を、2cm×2cmサイズの生分解性PLGAシート(足場用シート;ベーリンガーインゲルハイム製「Resomer RG858」、「Resomer768」)に設置し、LAD結紮2週間後のラット虚血心の表面に移植した。
SFRP2に代えて、SFRP4を1μg(実施例2)、ミッドカインを1μg(実施例3)、プレイオトロフィンを2μg(実施例4)、以上いずれもR&Dシステム製、又はチモシンβ10、シグマ製、を1μg(実施例5)用いた以外は、実施例1と同様の操作を行った。得られたゲル微粒子を、2cm×2cmサイズの生分解性PLGAシート(実施例1に同じ)に設置し、LAD結紮2週間後のラット虚血心の表面に移植した。
SFRP2を用いずに直径100〜150μmのゲル微粒子を調製する以外は、実施例1と同様の操作を行った。得られたゲル微粒子を、2cm×2cmサイズの生分解性PLGAシート(実施例1に同じ)に設置し、LAD結紮2週間後のラット虚血心の表面に移植した。
2μgのSFRP2(R&Dシステム製)をPBS中に溶解したSFRP2溶液を、LAD結紮2週間後のラット虚血心に投与した。投与は、30ゲージ注射針(テルモ、東京)を用いた左側開胸術下6箇所への注入、又は、腹腔内への単回投与により行った。
SFRP2に代えて、SFRP4を1μg(実施例7)、ミッドカインを1μg(実施例8)、プレイオトロフィンを2μg(実施例9)、以上いずれもR&Dシステム製、又はチモシンβ10、シグマ製、を1μg(実施例10)用いた以外は、実施例6と同様の操作を行った。
SFRP2に代えて、SFRP2を2μg、SFRP4を2μg、ミッドカインを1μg、プレイオトロフィンを4μg、以上いずれもR&Dシステム製、及びチモシンβ10、シグマ製、を1μg(実施例10)含有する混合物を用いた以外は、実施例6と同様の操作を行った。
SFRP2溶液に代えて、PBSをLAD結紮2週間後のラット虚血心に投与した以外は、実施例3と同様の操作を行った。
前記参考例2で得られた、LAD結紮2週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋4箇所に、種々の量の組換えヒトPTN又はMDK(R&Dシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス)を注入した(各亜群につきn=10)。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン200μl中に1、5又は25μgの各タンパク質を含有したものを、それぞれ実施例12、13及び14として、30ゲージ注射針を用いてNature.2005;432:466−472に記載のように投与した。比較例3として、コラーゲンゲルのみを対照ラットに投与した。
前記参考例1で得られた、LAD結紮2週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋4箇所に、種々の量の組換えヒトSFRP2又はSFRP4(R&Dシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス)を注入した(各亜群につきn=10)。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン200μl中に4又は20μgの各タンパク質を含有したものを、それぞれ実施例15及び16として、30ゲージ注射針を用いて上記(Nature.2005;432:466−472)のように投与した。比較例4として、PBSを含有するコラーゲンを対照ラットに投与した。
前記参考例1で得られた、LAD結紮2週間後のモデルラットを用いて、心機能のベースラインを測定した。そして、前記梗塞ラットの境界部心筋4箇所に、種々の量の組換えヒトチモシンβ10(R&Dシステム社、米国ミネソタ州ミネアポリス)を注入した(各亜群につきn=10)。注入は、前記と同様の麻酔下にラットの左胸部を再開胸して行った。サイトカインは、コラーゲン200μl中に4又は20μgのチモシンβ10を含有したものを、実施例17として、30ゲージ注射針を用いて上記(Nature. 2005;432:466−472)のように投与した。比較例5として、PBSを含有するコラーゲンを対照ラットに投与した。
組織学的検査
実施例1〜10及び比較例1及び2において移植若しくは注入したラットから心臓を回収し、前記心臓の横断切片(厚み2μm)を10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色及びマッソントリクローム染色を行った。
実施例12〜14及び比較例3のラットについて、注入から6週間後に、冷却心筋保護液(24mEq/Lカリウム含有5%グルコース溶液)を注入することにより、全ての処置心臓を拡張期で停止させ、取り出した。前記心臓を梗塞巣中心部において水平方向に薄切した。サンプルは全て10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。前記特定処置を行った群について、通常のヘマトキシリン・エオジン(HE)染色及びマッソントリクローム染色を常法に従って行った。また、心筋繊維化の評価のためにピクロシリウス赤染色を、又は心筋細胞肥大の評価のために過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を、Hypertension. 2005;46:412−418, Circ Res. 2002;90:d641−648に記載のように行った。各染色について、MacScopeソフトウェア(三谷商事(株)、東京)を用いた定量的形態計測解析を行った。
参考例6で得られたラットの心臓を、LAD結紮から1週間後に取り出し、?80SYMBOL 176 \f "Symbol" \s 10.5Cで保存した(n=5)。厚み5μmの凍結切片を、ポリクローナル山羊抗ラットMDK血清(sc−1398、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州サンタクルーズ)と共に温置し、ABCキット(ABC KIT、ベクターラボラトリー社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて可視化した(Circulation.2002 (suppl I);106:I−264−I−269)。
結果として、ゲル単独又は組換えMDK25μgで処置した心臓の全体の様子が得られた(データ不示)。心筋梗塞の中心部における短軸切片において、青色染料で染色された梗塞瘢痕部は、ゲル単独投与群の方が、左心室腔の拡張のため、より細く且つ長かった。しかし、算出された心筋梗塞巣の総面積については、何れの用量のMDK注入についてもあまり影響がなかった(図3A)。一方、MDK25μgを注入した心臓の非梗塞心筋は厚みが増していた。事実、MDK注入心臓における非梗塞部面積は、ゲル注入心臓の非梗塞部面積よりも有意に大きかった(図3B)。MDK投与心臓における非梗塞部の増加は、MDKの用量に依存していた。このような非梗塞部の拡張の用量依存性は、図2Dに示す心エコー法による知見と一致した。
ピクロシリウス赤染色による顕微鏡観察での評価(データ不示)において、ゲル投与対照群において非梗塞心筋の繊維化について強い変化が認められた。これは、おそらく、梗塞後の左室リモデリングの不適応反応を反映しているものと考えられる。心筋繊維化は、MDK投与群の心臓においても認められるが、ゲル投与対照群の心臓に比べると、その程度は有意に低い(図4)。
さらに、MDKが血管新生能を有することが既に報告されているため、ゲル単独投与群及びMDK25μg投与群の心臓の血管密度を評価した(データ不示)。心筋梗塞後、ゲル又はMDK投与群の心臓の梗塞性瘢痕部及び境界部において、フォン・ウィルブランド因子陽性血管が優勢に認められた。前記境界部及び梗塞性瘢痕の血管密度は、MDK投与群心臓の方が、ゲル投与群心臓よりも有意に高かった(図5)。非梗塞部の血管数は比較的少なく、ゲル投与群心臓とMDK投与群心臓の間で信頼性の高い血管数の比較を行うことは困難であった。
上記作成した組織切片の肉眼的評価によると、実施例1〜10における梗塞巣の壁厚は改善したが、比較例1及び2においては、前記壁厚が薄くなり、心内腔が拡張していた。特に、前記壁厚の改善に関しては、実施例1〜5の方が実施例6〜10よりもさらに厚みが改善されていた。
実施例1〜10並びに比較例1及び2の移植又は注入されたラットについて、イソフルラン麻酔下、12MHz環状配列変換素子を備えた市販の心エコー検査装置SONO 5500(アジレント・テクノロジー社、米国)を用いて、心エコー測定を下記の方法で行った。
上記の方法により、6週間後まで毎週心エコー図を記録した。
一方、実施例12〜14及び比較例3における投与後ラットの左心室機能を、サイトカイン注入から2、4、及び6週間後に、安定した血行動態条件下に心エコー図上でモニターし、注入前(ベースライン)と比較した(表1)。前記心エコー図は、ジエチルエーテル麻酔下、12MHz環状配列変換素子を備えた心エコー検査装置SONOS 5500(アジレント・テクノロジー社、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて記録した。心臓を乳頭筋のレベルで短軸2D画像化し、左心室収縮終期面積(LVESA)、左心室拡張終期面積(LVEDA)、並びに収縮終期及び拡張終期における左心室寸法(LVDs及びLVDd)を測定した。駆出率(EF)は、Pombo法により下記式に従い算出した:EF(%)={(LVDd3−LVDs3)/LVDd3}×100。間接tail−cuff方式を採用したMK−2000型血圧モニター装置(室町機械株式会社、東京)を用いて、ラットの心拍数(HR)及び血圧(BP)を測定中連続的に記録した。ベースラインにおける前記LVEDA、LVESA、EF、HR及び平均BPに関して、7群間に有意差は見られなかった。
データは全て平均値±標準誤差(SE)で表される。心機能の経時的解析データを、StatView 5.0(Abacus Concept社、米国カリフォルニア州バークリー)を用いた二元配置多重比較反復測定分散分析(ANOVA)に供した。それぞれの群間の有意差検定には、独立スチューデントt−検定を用いた。その他の項目の比較は、ボンフェローニの事後検定又は独立スチューデントt−検定を用いた一元配置ANOVAによって行った。P値が0.05より小さければ有意であるとみなした。
非梗塞心筋部面積の増大を細胞レベルで解明するために、ゲル単独投与又はMDK25μg投与群の心臓を処置から6週間後に取り出し、PAS染色を行った(データ不示)。ゲル単独投与群の心筋細胞は、有意にその直径がより大きく(図6A)、長さがより長く(図6B)、細胞サイズがより大きかった(図6C)。これは、心筋梗塞後の体積及び圧力の過負荷を反映している。これに対して、MDK投与群心臓の心筋細胞は、非梗塞正常心臓の心筋細胞よりも若干大きいものの、その増加は、ゲル投与対照群心臓の心筋細胞よりも有意に小さかった。この結果は驚くべきものである。何故なら、MDK投与群心臓は、ゲル投与群心臓に比べ筋体積が増加しており、このことは、MDK投与群心臓の心筋細胞数が、ゲル投与対照群心臓の心筋細胞数よりも多いにちがいないことを強く示唆するからである。
Claims (4)
- SFRP4を含有する、虚血性心疾患の治療剤。
- 薬剤担体に挿入された、請求項1記載の治療剤。
- シートに支持され及び/又は固定された薬剤担体に挿入されたSFRP4を含有する、請求項1記載の治療剤。
- SFRP4を、損傷した心筋組織を修復するために使用する効果的要素として含有する瘢痕形成促進剤。
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