JP4731157B2

JP4731157B2 - 生体分子の分離、輸送、および集中のための進行波グリッド

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Publication number: JP4731157B2
Application number: JP2004350363A
Authority: JP
Inventors: エイチ．リーンメン; ピンルジェン; エイチ．ホージャクソン; シーチンウェン; アール．フォルケルアーミン; シエエイチ．ベン; エイチ．ダニエルユルゲン
Original assignee: Palo Alto Research Center Inc
Current assignee: Palo Alto Research Center Inc
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2011-07-20
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Description

本発明は分子の電気泳動的分離の分野に係るものである。

誘電泳動の効果的な応用として、連続して並ぶ電極間に時間変動する電気ポテンシャルをかけることにより電極系に可変電場を生じさせる進行波誘電泳動（ＴＷＤ）がある。そのような進行波場泳動の方法はＰａｒｔｏｎらによる特許文献１に記載されている。この技術は満足できるものであるが、蛋白分析の分野を対象としたものではなく、特にゲル電気泳動技術を対象としたものではない。さらに、誘電泳動は高い電圧（〜１００Ｖ）、高い周波数（〜１０ＭＨｚ）、細かい電極ピッチ（＜１０μｍ）を必要とする。

ＤＮＡや蛋白のような生体分子の電気泳動的分離のための微小流体装置は非特許文献１に記載されている。この装置ではマイクロチャネルの長さに沿って数千の電極が用いられている。電気ポテンシャルが電極間にかけられ、選択的に変化させられることによって、マイクロチャネル中の分子はラチェット機構によって２つのグループに分離される。この機構では進行波は用いられていない。この手法は生体分子の分離を対象としたものではあるが、マイクロデバイス技術に基づくものであって、従来からのプロテオミクス実験室器具にそのまま適用できるものではない。しかも、Ｄｕｎｐｈｙらによって記載された手法ではゲル電気泳動技術への応用については何ら記載がない。そのため、ゲル電気泳動技術および器材と組み合わせて用いるための、静電進行波を利用するための装置および技術に対する需要がある。

二次元ゲル電気泳動は簡便であり、容量が高く、質量分析器と組み合わせればゲル上で分析された全ての蛋白を同定することができるため、プロテオミクスの研究に有用な手法であることが認知されている。しかしながら、とりわけ、二次元ゲル電気泳動には長時間を要し、存在量が少ない蛋白の解析が難しく、再現性にも乏しいことから、プロテオミクスの決定的な手段となるには不十分な面がある。
米国特許５６５３８５９号ダンフィーら（Dunphy et al.）"ラチェット電気泳動マイクロチップによるＤＮＡの高速分離操作"（ "Rapid Separation and Manipulation of DNA by a Ratcheting Electrophoresis Microchip (REM)"）, プロシーディングスオブアイエムイーシーイー２００２（Proceedings of IMECE2002）, ２００２年１１月１７−２２日（November 17-22, 2002）,ニューオリンズ（ New Orleans）, ルイジアナ（La.）, ナンバーアイエムイーシーイー２００２３３５６４（No. IMECE2002 33564）

本発明によれば、進行波グリッドアセンブリーであって、
平らな誘電体の基板と
前記基板上に配置された、導電性で互いに近接した複数の電極であって、電極は互いに平行に位置し、各々の電極は第一端と、第一端とは逆側の第二端を有する、前記複数の電極と、
その内部に分散された生体物質の保持および移動に適したゲル物質の層と、
複数の相を有する電気シグナルを与えるのに適した電圧調整器と、
前記電圧調整器と前記複数の電極との間を電気的に連絡する複数の導電性バスであって、前記バスの数は前記電圧調整器によって与えられる前記電気シグナルの相の数に対応し、前記バスの各々は対応する電極の第一端と第二端の双方に電気的に連絡している、前記複数の導電性バスと、
を含む、前記進行波グリッドアセンブリー、が提供される。

また、複数の進行波モジュールを有する電気泳動セルであって、
平らな第一基板と、
前記第一基板からは間隔を空けて配置され、前記第一基板と平行な、平らな第二基板と、
前記第一基板と前記第二基板の間に配置された複数の進行波モジュールであって、前記進行波モジュールの各々は、
モジュール基板と
前記基板上に広がる、互いに近接した複数の電極と、
前記電極と電気的に連絡した複数の導電性バスと、
前記バスへの電気的連絡を提供する複数の接触パッドと、
前記電極に隣接して配置される電気泳動技術に適したゲルの層と、
を含み、前記複数の進行波モジュールは二つ以上の進行波モジュールを含む一つ以上の列をなすように前記第一基板と前記第二基板の間に配置され、前記列中の前記二つ以上の進行波モジュールはその接触パッド同士が電気的に接触することによって互いに電気的に連絡されている、前記複数の進行波モジュールと、
を含む、前記電気泳動セルが提供される。

図１はガラスプレート３０とプレキシグラスバックプレート４０の間に配置されたポリアクリルアミドゲルの薄層２０を含むゲル電気泳動システム１０を示している。ゲルの厚さはテフロン（登録商標）詰め材を適切に配置することによって調節される。進行波グリッド５０は、プラチナ電極をガラス３０上に被覆することによって作られる。プラチナのガラスに対する接着を改善するためにチタン薄層が用いられても良い。もう一方のプレートについても、同様の進行波グリッドをグラス上に設けて、両面構造としても良い。電極とゲルアセンブリーは電源８０と電気的に連絡するように配置される。一つのアセンブリーでは、電極とゲルアセンブリーは適当な導電性バッファー溶液の中に浸される。それぞれ符号７０および７２で表された内側および外側のチャンバーにはバッファー溶液が入っている。電源８０からの、および電源８０への、バッファー溶液を通じての電子の流れの唯一の経路が電極とゲルアセンブリーによるものとなるように電源８０による電気回路が形成される。外側チャンバー７２の中のバッファー溶液はその中に浸された電極およびゲルアセンブリーを冷却する機能も有している。

図１のチャンバー７０および７２の中の２つのバッファー溶液のようなイオン性バッファーは、それを通じてＤＣ電場がかけられる２つの電極として機能する。蛋白サンプルは典型的にはゲルの頂部にロードされ、電気泳動電流がゲル中を流れるようにする。泳動する蛋白はゲルの層２０中を下向きに移動する。

図２に示された別のシステムはプレキシバックプレート１４０を用いており、プレキシバックプレート１４０の内側の面１４２上には、２００オングストロームのプラチナ薄層が被覆されゲル１２０に接触している。形成された電極およびゲルアセンブリーと電気的に連絡するように、電源１８０が設けられる。プラチナは対電極を形成し、静電圧力を発生させて、進行波グリッド１５０に蛋白１６０をロードし、それによって図２に示されたように蛋白のローディングを促進する。１００μｍの厚さのゲル層に対しては、たった−０．１Ｖで、ＳＤＳ処理された負に帯電した蛋白に必要な静電圧力を十分に発生する。この電圧は実質的なガス発生が起こる閾値よりも低い。図２に示されたグリッドに蛋白を「ロード」するための実施形態は、図１の実施形態や本明細書中に記載されるほかの実施形態と組み合わせて用いることもできる。

図３はプレート２１０と、複数の平行に近接された電極２１２、２１４、２１６、および２１８と、前記電極と電気的に連絡した有効量のゲル２２０と、を含む片面グリッドアセンブリー２００を示している。電極は白金あるいはその合金で形成されている。前記プレートはガラスからなっており、電極とプレートとの接着を高めるためにチタンの薄層を前記プレート上に被覆することも好ましい。本明細書では、多相の、最も好ましくは四相の電気シグナルを、システム、アセンブリー、グリッドに対して用いることが好ましい。

図４は、第一プレート３１０と、複数の平行に近接された第一電極３１２、３１４、３１６、および３１８と、第２プレート３４０と、複数の平行に近接された第二電極３４２、３４４、３４６、および３４８と、第一および第二電極と電気的に連絡した有効量のゲル３２０と、を含む両面進行波グリッドアセンブリー３００を示している。

図５はシステムおよび進行波グリッドにおいて用いられる代表的な四相電圧パターン又は波形を示す。具体的には、図５は各相が９０度づつ離れた四相電圧波形を示している。各相の各波形は、方形波パルスであることが好ましい。各パルスは隣接する電極に順々にかけられる。この、規則的な順序だった電圧パルスの配列によって、ゲル中に分散した生体分子は一つの電極の近傍から別の電極へと「飛び移る」。伝播の同期した態様は図６に示されており、生体分子や蛋白が電極から電極へとパルス列の方向に飛び移る「飛び移り」モードと表現することもできる。

図７は、複数に分散され、再構築可能で、再プログラム可能な進行波グリッドを用いたゲル電気泳動システム４００を示している。具体的には、図７は、多セグメント進行波グリッドシステムを示している。前記多セグメント進行波グリッドシステムには、第一グリッドセグメント４１０と、第二グリッドセグメント４２０と、第三グリッドセグメント４３０と、が含まれる。各グリッドセグメントには、複数の平行して近接配置された電極が含まれる。２つの隣接したパッドが各々の側に設けられ、それらのパッドは一つ以上のバス４４０、４５０、および４６０を介して四相回路への接続を提供している。システム４００にはさらに、図７に示された電圧調整器Ａ、Ｂ、およびＣのような、プログラム可能な一つ以上の電圧調整器が含まれている。電圧調整器は、前記バスを介して、進行波グリッド（あるいはそのセグメント）と電気的に連絡している。

システム４００を用いる際の手法の一つとして、目的の蛋白を進行波グリッドセグメント各々の上に電圧調整器Ａを用いて移動させ、そこで蛋白は電圧調整器Ｂ、Ｃなどを用いた次の処理にかける手法がある。各々の電圧調整器に別々のＰＩＣ（周辺機器接続制御用ＩＣ）が設けられても良いし、あるいはＰＩＣは一つでそれが複数のあらかじめプログラムされた命令を備えていても良い。図７の好ましい形態のシステム４００は様々な生体分子のサンプルの分離に用いることができる。サンプル４７０はグリッドセグメント４１０上に載せられる。サンプルは領域４７２に移動し、続けて隣のグリッドセグメント４２０に移動する。システム４００の動作はグリッド４２０内に生体分子の領域４７４が形成されるまで続く。生体分子とグリッドパラメーターによっては、領域４７４を構成する生体分子は隣のグリッドセグメント４３０にさらに移動し、生体分子領域４７６を形成する。

本主題によれば、個々の進行波モジュールの組み合わせを利用した電気泳動セルが提供される。モジュールは比較的大きいセルあるいはグリッドとなるように配置あるいは構成される。モジュールの電極への電気的連絡を与える一つ以上の接触パッドが設けられる。適当なゲルの有効量が電極に沿って配置される。セルは、その中に配置された進行波モジュールの列を利用する。モジュールの集合からいくつかの列が形成される。各列が２以上のモジュールを含んでいてもよい。各列内の複数のモジュールは互いに各々の接触パッド間が適切に接続されることによって電気的に連絡している。これらのモジュールのシステムは、２枚の、間隔を空けた、ガラスなどの平らな支持基板の間に、複数のモジュール列を形成することによって形成されても良い。各列には２乃至１０個のモジュールが含まれ、好ましくは３乃至６個のモジュールが含まれる。典型的なシステムでは２乃至２０列が用いられ、好ましくは３乃至９列である。

図８、９、および１０には蛋白分離用ゲルセル５００が示される。システム５００には間隔を空けた一対のプレート５４０および５５０が含まれる。このシステムには、ガラス支持体上に設けられた進行波モジュールの３かける３（３×３）の並びが含まれ、各モジュールは０．８ｃｍ×１．０ｃｍの寸法を有しそのトレースは長さ０．８ｃｍ以下である。前記０．８ｃｍ×１．０ｃｍ進行波モジュールは図８において符号５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、および５２６によって示されている。これらのモジュールは図８ではＡ、Ｂ、およびＣの３列に配置されている。各列は、その中に蛋白混合物がロードできる「ウェル」を有し、蛋白分離のための別々の経路として用いられる。図８においてはこのウェルは蛋白ロード電極５３０として示されている。Ａ、Ｂ、およびＣの各列は３つの進行波モジュールグリッドの隣接した配置であり、全ての列は最初の分離操作において一致して電力供給される。よって、図８において、列Ａにはモジュール５１０、５１２、および５１４が、列Ｂにはモジュール５１６、５１８、および５２０が、列Ｃにはモジュール５２２、５２４、および５２６が含まれる。各々別個に適切な進行波アルゴリズムを割り当てることによって、二次的な集中、濃縮を、前記３つの列のどれでも、あるいは全てで、行うことができる。小さい方のプレートであるガラスカウンタープレート５４０は２つの垂直側面および底部に高分子からなる隆起部を有するが、一角に設けられる排出孔５４５には前記隆起部を有しない。図９に示された隆起部５５５は好ましくはＳＵ−８のようなポリマーによって形成される。ＳＵ−８はゲルの厚さを調節するためのスペーサーとしても用いられる。セルを逆さまにし、上部の開口部をゲルの入った幅広のビーカーに浸すことによって、毛管力によりゲルは２枚のプレート５４０と５５０の間に充填される。電気接触パッドはゲルエリアの外部に設けられる。図１０は４つの接触パッド１から４のセットの詳細図である。

図１１は図８乃至１０で用いられる縦に一体化された進行波モジュールの概観図であるが、カウンタープレート５４０は示されていない。プラチナ電極は酸窒化物やＢＣＢなどの絶縁体の上に形成され、ビアによって絶縁体の下の断面積の大きなバスラインに結合される。図８に示されるモジュール５１０乃至５２６のいずれにも、あるいは全てに、同様の構成を用いることが好ましく可能である。図１１のモジュール５１０はガラス基板５５０を含み、ガラス基板５５０上には、バスあるいは接地平面として働く導電性物質の層５６０が配置されている。層５６０は銅あるいはアルミニウムから形成される。導電性層５６０上には絶縁体の層５７０が設けられている。好ましい絶縁体は酸窒化物あるいはＢＣＢである。絶縁体５７０上には複数の進行波電極５８０が配置されている。有効量の適当なゲル５９０は電極５８０上およびその周囲に配置されている。ゲル５９０の末端領域沿いに１つ以上のビアが設けられている。この一体構造は進行波モジュールの表面積、つまり「フットプリント」を最小化する。

拡張可能な用途のために、進行波モジュールの配列は所望のセルサイズ又はゲルサイズに合うように、図１２に示されたように設けられても良い。電圧降下はトレース寸法に抑えられる。図１２は別のゲル電気泳動システム６００の模式図である。システム６００には、進行波モジュールの３かける９（３×９）配列が含まれる。システム６００にはＡからＩの９つの列が含まれ、各列は３つのモジュールを含んでいる。例えば、列Ａはモジュール６１０、６１２、および６１４を含んでいる。システム６００に用いられるモジュールは各々、先に述べた図１１のモジュール５１０のような構成を有している。

図１３は本明細書で述べられているシステムのうちの任意のシステムで用いられる典型的な電極の配置を示す。具体的には、図１３は、進行波電極と電気的に連絡しているバスへのアクセスのため、あるいは前記バスとの電気的な連絡を提供するため、に用いられる４つの接触パッドを示している。接触パッドＲ１には進行波グリッド７００にかけられる多相電圧波形のうちのＮ２相が割り当てられても良く、また接触パッドＲ１は導電性のトレース７０４によってバス７０２と連絡している。同様に接触パッドＲ２にはグリッド７００にかけられるＮ１相が割り当てられ、接触パッドＲ２は導電性のトレース７０８によってバス７０６に連絡している。接触パッドＬ１にはグリッド７００にかけられるＮ３相が割り当てられ、導電性トレース７１２によってバス７１０に連絡している。さらに接触パッドＬ２にはグリッド７００にかけられるＮ４相が割り当てられ、導電性トレース７１６によってバス７１４に連絡している。図１３中の矢印は、グリッド７００に誘導される静電進行波の方向を示す。

図１４および１５は４−φアセンブリーを駆動するための回路の検討案を示す。図１４はトレースの全長に沿って電圧が降下する進行波グリッドに適用可能なシングルバスラインである。シングルバスライン８００から電圧のかかった中心電極８０２に流れ、ゲルを通って２つの隣接する電極又はアース８０４へと流れる。図１５はトレース長さの半分に沿ってしか電圧降下の起こらない特徴を有するダブルバスライン型である。図１５において２つのバス８２０および８２２から電圧のかかった中心電極８３２へ電流が流れ、次いでゲルを通り２つの隣接する電極あるいはアース８３４に流れる。シングルバスの等価回路は図１６に示されている。ダブルバスの等価回路は図１８に示されている。図１７は、図１４の電極８０２、およびそれが進行波グリッドおよびゲルアセンブリー８４０に組み込まれること、を示した概観模式図である。電極８０２を通しての電流の流れの方向は矢印Ｍで表されている。図１９は、図１５に示された電極８３２、およびそれが進行波グリッドおよびゲルアセンブリー８５２に組み込まれること、を示した概観図である。電極８３２を通じての電流の流れは矢印Ｎで表されている。

４−φグループ間のバス距離については、多くのシステムにおいては１６０μｍの間隔が好ましい。４−φグループ間の短いバス距離を無視した場合、等価トレースとゲル抵抗を用いて電流と電圧のパラメーターは表１の様に計算される。

表１において、「ρケ゛ル」と「ρトレース」はそれぞれゲルの抵抗とトレース（あるいは電極）の抵抗率を表す。「Ｗトレース」はトレースの幅である。「ｈトレース」はトレースの高さである。「ピッチ」は隣接するトレースの中心間距離である。「スペーサー」は隣接するトレース間の誘電スペーサーである。「ｄｃ」はデューティーサイクルである。「Ｗケ゛ル」はゲルの幅である。「Ｌケ゛ル」はゲルの長さである。「ｈケ゛ル」はゲルの高さである。「有効ｈケ゛ル」は電場圧縮後のゲルの有効高さである。「Ｖハ゜ット゛」は接触パッドにおいて測定された電圧である。「Ｒケ゛ル」はゲルの抵抗である。「Ｒトレース」はトレースの抵抗である。「Ｒ相」は相の抵抗である。「ｎク゛ルーフ゜」は四相グループの数である。「Ｒ等価」はグリッドの等価抵抗である。「Ｉ全」はグリッドを通しての電流フローである。「Ｉ相」は四相グループの各々の相を通しての電流フローである。「ΔＶトレース」はトレースによる電圧降下である。「＊Ｖトレース」はトレースの平均電圧である。「Ｐ相」は相の電力消費である。「Ｐ全」はグリッドの電力消費である。

表１を参照すると、シングルバスライン構成の場合０．８ｃｍの白金トレース長を通して０．５Ｖの電圧降下が見られるのに対し、ダブルバス構成ではその際の電圧降下は０．２Ｖである。これらの結果は３０．５μｍのピッチと６３％のデューティー比を有する進行波グリッドについて得られた。より望ましい操作のために、４０μｍのピッチと２５％の電極デューティーサイクルを有する形態がある。プラチナトレースによる対応する電圧降下はこの場合表１第７欄に記されるように０．３２６Ｖである。これは電圧レベルが実質的なガス発生の閾値よりも低く維持されるように、パッドの電圧を１Ｖから１．５Ｖに上昇させることで補償できる。シングルバスラインおよびダブルバスライン両者の構成におけるトレース電圧降下は図２０および２１にそれぞれ示されている。

上側進行波グリッドの下には、酸窒化物やＢＣＢのような薄い絶縁材によって分けられたデュアルバスラインが配置されている。好ましい８バスラインの各々は１ｍｍ以下の幅でもよく、電圧効果を最小化するために大きな断面積を有していても良い。ゲルの面内電場に悪影響を与えない範囲で、使用できる最も薄い層を決定するための分析が行われても良い。図２２、２３、および２４はそのような分析を行う目的で示されているものである。

例えば図２２のアセンブリーにおけるゲルの厚さを決定するために、２つの電場平均が算出され感度が求められる。断面平均は、進行波グリッドの中間スペーサー領域のゲルの厚さを用いて算出される。ゲルの厚さは、図２３においてｇで示されている。ゲル内に広がる中間スペーサー平面は破線で示されている。

図２６および２７は２つの実施形態における電位の概略を示したものである。実施形態の一つはアース面に近接したもので、もう一つの実施形態はアース面から離れたところ若しくはアース面が本質的に除かれた場合のものである。図２５は、ゲル９１０の上層と誘電体９２０の下層の間に配置された２つの隣接する電極９１２および９１４を含むアセンブリー９００を示す図である。導電層９３０が誘電体上の逆側の面に設けられていても良い。層９３０は電気シグナルへのアクセスを提供するバスの形態でも良い。図２６および２７は層９３０が電極９１２および９１４の周囲に広がる電場に及ぼす影響を示したものである。図２６は層９３０が存在する場合の電場を示し、図２７は層９３０が存在しない場合の電場を示す。図２６および２７は進行波グリッドの電極間およびその周囲に広がって生じる電場に対する接地平面の影響を示したものである。

スペーサーの中央点に沿ってプロットされたゲル内の面内電場分布が図２８に示される。３つの曲線は、厚さ３μｍ、１０μｍ、および無限大（バスラインが進行波グリッドの下に無いとしたもの）に対応する。３μｍを設計パラメーターとして選択する。

図２９は他のアセンブリー１０００の断面の模式図である。図２９は図９の断面に類似する。アセンブリー１０００には、間隔を置いて配置された一対のプレート１０１０および１０２０の間に配置された、複数の進行波グリッドあるいは進行波モジュールの列が含まれている。平均電場値は、図２９のシステムについて、表２に表されている。電場値が大きくなれば、生じる進行波グリッドの性能も良くなる。

表２において「：」は先に述べた無限大の場合を指す。図３０に示されているシステムでは、白金トレースを層の下のバスラインに接続する銅のビアに加えて、断面積の大きい端子接続がシステムの一端で用いられ、さらに電圧降下を最小化している。ビアの間の間隔は、電圧降下がトレース長の半分以下に抑えられるような間隔である。図３０はバスラインと電極の構成および向きを示している。図３０に示されるシステム１１００には、複数の進行波電極１１０２、１１０４、１１０６、および１１０８が含まれる。システム１１００には、複数のバス１１２０、１１２２、１１２４、１１２６、１１３０、１１３２、１１３４、および１１３６が含まれる。それぞれのバスは、トレース１１４０、１１４２、１１４４、および１１４６などの一つ以上のトレースによって他のバスと電気的に連絡していても良い。各々のバスと各々の電極の間の電気的連絡はビアによってなされている。図３０に示されるシステム１１００においては、ビア１１５０がバス１１３０と電極１１０２の間の電気的な連絡を提供している。

進行波シグナルは正に帯電した生体分子、薬剤、蛋白と負に帯電した生体分子、薬剤、蛋白とを同時に、それらの等電点（ｐｌ）に向けて移動させるために用いられる。図３２は、多セグメント進行波グリッド１２２０上に配置された不動化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ１２１０を含むシステム１２００の上面図である。グリッド１２２０は第一進行波グリッドモジュール１２２２と、第二進行波グリッドモジュール１２２４と、第三進行波グリッドモジュール１２２６とを、含んでいる。各モジュールは、一つ以上のバス１２４０を介して進行波電圧調整器１２３０と電気的に連絡している。典型的な蛋白の、ｐＨ勾配の関数としての荷電反応が、図３１の代表的滴定曲線に示されている。４−φ正電極電圧パターンが調整器１２３０によって与えられ、蛋白をその等電点に輸送し、蛋白はそこで停滞する。図３２に示すように、第一の蛋白がＩＰＧ上の地点Ａに載せられる。システム１２００の作動によって、蛋白はＡ_plで表される新しい地点まで移動し得る。その新しい地点は、第一の蛋白の等電点に対応しうる。例えば第二の蛋白がＩＰＧ上地点Ｂに載せられ、第一の蛋白の輸送と同時に、新しい地点Ｂ_plへ第一の蛋白とは逆方向に輸送されうるように、システム１２００は構成されている。

図３３はシステム１２００に用いられる進行波グリッドの一部分の片面の形態である。図３４は中心電極と二つの隣接する電極との間の対応するフリンジ電界ベクトルを示している。図３３は、ゲル層１３１０と基板１３３０との間に配置された電極１３２２、１３２４、１３２６、および１３２８を含むアセンブリー１３００を示している。電極の周囲に広がる電場は図３４に示されている。他の実施形態では、両面進行波グリッドを利用し得、その場合、ゲルの厚さが同じなら電場の利点が倍増し得、あるいはゲルの厚さを倍増し得る。

輸送のメカニズムは図３５に示されており、２つの続いた電圧パルスの間の間隔が使われうる。電場（Ｅで表される）の方向と、電荷極性（ｑで表される）の４つの組み合わせが、各々の場合における移動の好ましい方向を決定する。電圧パルスの立ち下りにおいて、電場は波の掃引方向に向いている。正に帯電した蛋白は前に向かって（図３５では右に）移動する。負に帯電した蛋白は後ろに向かって（図３５では左に向かって）移動する傾向を示す。電圧パルスの立ち上がりでは、電場の方向は波の掃引方向とは逆向きである。正に帯電した蛋白は今度は後ろ向き（図３５では左に向かって）移動する傾向を示す。負に帯電した蛋白は今回は波の掃引方向に、つまり前向き（図３５では右向き）に移動するであろう。支配的な輸送の組み合わせは、正に帯電した蛋白についてはパルスの立ち下り、負に帯電した蛋白についてはパルスの立ち上りである。電圧パルスの間には、正に帯電した蛋白に対する圧縮効果と、負に帯電した蛋白に対する小さな発散効果とが、それぞれの蛋白の輸送速度に若干の非対称性を生じさせる。

図３６および３７は正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白両者の一方向性前進輸送のためのアルゴリズムを示す。図３６は２つの隣接した４−φ電極グループの電圧空間分布を示す。四相各々の一時的電圧分布は図３７に示されている。このアルゴリズムは、パルスの立下りを正に帯電した蛋白の移動に、パルスの立ち上りを負に帯電した蛋白の移動に利用している。どちらの種も電圧掃引の方向に移動する。

正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の「飛び移る」軌道は図３８に示されている。シミュレーションパラメーターは２０μｍの厚さのゲルに典型的なもので、１Ｖの進行波パルス、４−φシグナル、２５％電極デューティーサイクルで５０μｍピッチ、リボヌクレアーゼＡの蛋白分子量１３．７ｋＤａを用いた。進行波において用いられた正電場のため、正に帯電した蛋白はグリッドからより遠くに移動する。各々の電極上でかなりの滞在時間があるため、この経路の長さの違いは広がりをもたらすような遅れを生じさせはしない。横方向への移動距離は図３９に示されている。２つの曲線の分離は、電圧パルスと電圧パルスの間の時間に一時的に間隔が開くことを示している。この分離は維持される。傾きは伝播速度を示し、どちらの極性の電荷を有する蛋白でも同じである。

図４０および４１は正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の二方向性輸送のための別のアルゴリズムを示す。２つの隣接する４−φ電極グループ上の電圧の空間配置は図４０に示されている。四相各々の一時的な電圧分布は図４１に示されている。手法としては、パルスの立ち下りを正に帯電した蛋白の波の進行方向への（図４１では右向きへの）移動に利用するものである。負に帯電した蛋白もパルスの立ち下がりを利用して、波の進行方向とは逆向きに（図４１では左向きに）移動する。これは当該電極に新しいパルスがかかる前に、次の電極に電圧パルスをかけることによって達成され、このパルスにより負に帯電した蛋白の流れの方向が転換される。

図４２および４３は図４０および４１に関連して議論された２つの電荷種についての、逆方向に移動するサンプル軌道を示している。

図４１乃至４３で示された逆方向に移動する蛋白の対応する移動距離は図４４に示されている。

本発明はまた、両電荷種に対するパルス列の連続性を妨げるためのアルゴリズムも提供する。図４５および４６は蛋白あるいは他の種の輸送の停滞につながるアルゴリズムを示している。正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の対応する軌道は図４７に示されており、ここでは蛋白は４−φグループの１ピッチの幅にトラップされている。

図４８に示された移動は、トラップされた蛋白の前進後退運動を明らかにしている。

先に述べた四相調節シグナルを選択的に変えることによって達成される様々な輸送態様は表３に示されている。様々な輸送態様は異なるアルゴリズムおよび四相シグナルを用いて達成しても良く、また異なる相のシグナルに基づいたアルゴリズムを用いて達成しても良い。

電極ピッチは好ましくは１０μｍ乃至６００μｍの範囲で、より好ましくは４０μｍ乃至２００μｍの範囲である。隣接する電極の相対する端面間の距離は７．５μｍ乃至３００μｍで、より好ましくは３０μｍ乃至１００μｍである。グリッドおよび電極にかけられる電圧のレベルは約０．００１Ｖ乃至約５Ｖで、より好ましくは約０．１０Ｖ乃至約２Ｖである。電気シグナルの周波数は輸送される生体物質や帯電種によるが、約０．００１乃至１０Ｈｚの範囲の周波数が有効であることが分かっており、０．０２０乃至２Ｈｚが好ましい周波数である。

図１はゲル電気泳動システムを示す。図２は別のゲル電気泳動システムを示す。図３は片面進行波グリッドをゲルとともに示す。図４は両面進行波グリッドをゲルとともに示す。図５はシステムおよび進行波グリッドで用いられる、代表的な四相進行波電圧パターンである。図６は電極から電極への生体分子の移動を示す。図７は分散し、再構築可能で、再プログラム可能な進行波グリッドを用いたゲル電気泳動システムを示す。図８は別のゲル電気泳動システムを示す。図９は図８に示されたシステムの断面図である。図１０は図８に示されたシステムで用いられる典型的な電極セットと共に規定される接触パッドである。図１１は図８乃至１０に示されたシステムで用いられる進行波モジュールを示し、図においてモジュールの内部構造を示すためにカウンタープレートは除かれている。図１２は別のゲル電気泳動システムを示す。図１３は進行波グリッドへのアクセスを提供するために用いられる接触パッドを示す。図１４はシングルバスと進行波グリッド構造を示す。図１５はデュアルバスと進行波グリッド構造を示す。図１６は図１４に示されたシングルバス構造の等価回路の模式図である。図１７は一方の端から電力供給される電極と、その電極が進行波グリッドに組み込まれることとを示す概観模式図である。図１８は図１５に示されたデュアルバス構造の等価回路の模式図である。図１９は両端から電力供給される電極と、その電極が進行波グリッドに組み込まれることとを示す概観図である。図２０はシングルバスライン構造においてトレース距離を変化させた場合のトレース電圧降下を示すグラフである。図２１はデュアルバスライン構造においてトレース距離を変化させた場合のトレース電圧降下を示すグラフである。図２２は片面進行波グリッドの概観模式図である。図２３はゲルの厚さを最適化するために用いられる解析の図である。図２４は進行波グリッド中の２つの電極の周囲に広がる、生じた電場を示す。図２５は電極とゲルの、設置平面を用いたアセンブリーの模式図である。図２６は図２５のアセンブリー中の隣接する電極間に広がる電場のプロットである。図２７は設置平面の存在しない場合の、図２５において示された電極間に広がる電場のプロットである。図２８はゲル層中の、面内電場のグラフである。図２９は別のアセンブリーの模式図である。図３０は別のアセンブリーの模式図である。図３１は蛋白の代表的な滴定曲線およびその等電点を示す。図３２は多セグメント進行波グリッドおよび不動化ｐＨ勾配ストリップシステムを示す。図３３は図３２のシステムで用いられる進行波グリッドの一部を示す。図３４は図３３に示される電極に与えられる進行波によって生じる電場を示す。図３５は生体物質輸送の模式図である。図３６は２つの隣接する四極電極グループ上の電圧の空間分布を示す。図３７は図３６に示される四極それぞれの一時的な電圧分布、および一方向性蛋白輸送を示す。図３８は正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白が進行波グリッド上で一方向性輸送の過程にある際の、軌道のグラフである。図３９は、図３８に示され一方向性運動の過程にある蛋白の泳動距離のグラフである。図４０は２つの隣接する四相電極グループ上の電圧の空間分布を示す。図４１は図４０に示された四相それぞれの一時的な電圧分布、および二方向性蛋白輸送を示す。図４２は正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白が図４１に示されるような二方向性輸送の過程にある際の、軌道のグラフである。図４３は図４１の正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の軌道の別のグラフである。図４４は二方向性輸送の過程にある正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の、対応する泳動距離のグラフである。図４５は２つの隣接する四相電極グループ上の電圧の空間分布を示す模式図である。図４６は図４５に示される四相それぞれの一時的な電圧分布、および選択的に誘導される停滞を示す。図４７は図４６に示された停滞の過程にある正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の軌道のグラフである。図４８は図４５乃至４７で参照された正に帯電した蛋白と負に帯電した蛋白の対応する泳動距離のグラフである。

符号の説明

１接触パッド
２接触パッド
３接触パッド
４接触パッド
１０電気泳動システム
２０ゲル薄層
３０ガラスプレート
４０バックプレート
５０進行波グリッド
７０内側チャンバー
７２外側チャンバー
８０電源
１００電気泳動システム
１２０ゲル
１４０バックプレート
１４２内側の面
１５０進行波グリッド
１６０蛋白
１８０電源
２００片面グリッドアセンブリー
２１０プレート
２１２電極
２１４電極
２１６電極
２１８電極
２２０ゲル
３００両面進行波グリッドアセンブリー
３１０第一プレート
３１２第一電極
３１４第一電極
３１６第一電極
３１８第一電極
３２０ゲル
３４０第二プレート
３４２第二電極
３４４第二電極
３４６第二電極
３４８第二電極
４００ゲル電気泳動システム
４１０グリッドセグメント
４２０グリッドセグメント
４３０グリッドセグメント
４４０バス
４５０バス
４６０バス
４７０サンプル
４７２領域
４７４領域
４７６領域
５００蛋白分離用ゲルセル
５１０進行波モジュール
５１２進行波モジュール
５１４進行波モジュール
５１６進行波モジュール
５１８進行波モジュール
５２０進行波モジュール
５２２進行波モジュール
５２４進行波モジュール
５２６進行波モジュール
５３０蛋白ロード電極
５４０カウンタープレート
５４５排出孔
５５０ガラス基板
５５５隆起部
５６０導電性物質層
５７０絶縁体層
５８０電極
５９０ゲル
６００ゲル電気泳動システム
６１０モジュール
６１２モジュール
６１４モジュール
７００進行波グリッド
７０２バス
７０４トレース
７０６バス
７０８トレース
７１０バス
７１２トレース
７１４バス
７１６トレース
８００シングルバスライン
８０２中心電極
８０４電極又はアース
８２０バス
８２２バス
８３２中心電極
８３４電極又はアース
８４０ゲルアセンブリー
８５２ゲルアセンブリー
９００アセンブリー
９１０ゲル
９１２電極
９１４電極
９２０誘電体
９３０導電層
１０００アセンブリー
１０１０プレート
１０２０プレート
１１００電気泳動システム
１１０２電極
１１０４電極
１１０６電極
１１０８電極
１１２０進行波電極
１１２２進行波電極
１１２４進行波電極
１１２６進行波電極
１１３０進行波電極
１１３２進行波電極
１１３４進行波電極
１１３６進行波電極
１１４０トレース
１１４２トレース
１１４４トレース
１１４６トレース
１１５０ビア
１２００電気泳動システム
１２１０不動化ｐＨ勾配ストリップ
１２２０多セグメント進行波グリッド
１２２２第一進行波グリッドモジュール
１２２４第二進行波グリッドモジュール
１２２６第三進行波グリッドモジュール
１２３０進行波電圧調整器
１２４０バス
１３００アセンブリー
１３１０ゲル層
１３２２電極
１３２４電極
１３２６電極
１３２８電極
１３３０基板
Ｒ１接触パッド
Ｒ２接触パッド
Ｌ１接触パッド
Ｌ２接触パッド

Claims

進行波グリッドアセンブリーであって、
平らな誘電体の基板と
前記基板上に配置された、導電性で互いに近接した複数の電極であって、電極は互いに平行に位置し、各々の電極は第一端と、第一端とは逆側の第二端を有する、前記複数の電極と、
その内部に分散された生体物質の保持および移動に適したゲル物質の層と、
複数の相を有する電気シグナルを与えるのに適した電圧調整器と、
前記電圧調整器と前記複数の電極との間を電気的に連絡する複数の導電性バスであって、前記バスの数は前記電圧調整器によって与えられる前記電気シグナルの相の数に対応し、前記バスの各々は対応する電極の第一端と第二端の双方に電気的に連絡している、前記複数の導電性バスと、
を含む、前記進行波グリッドアセンブリー。
複数の進行波モジュールを有する電気泳動セルであって、
平らな第一基板と、
前記第一基板からは間隔を空けて配置され、前記第一基板と平行な、平らな第二基板と、
前記第一基板と前記第二基板の間に配置された複数の進行波モジュールであって、前記進行波モジュールの各々は、
モジュール基板と
前記基板に広がる、互いに近接した複数の電極と、
前記電極と電気的に連絡した複数の導電性バスと、
前記バスへの電気的連絡を提供する複数の接触パッドと、
前記電極に隣接して配置される電気泳動技術に適したゲルの層と、
を含み、前記複数の進行波モジュールは二つ以上の進行波モジュールを含む一つ以上の列をなすように前記第一基板と前記第二基板の間に配置され、前記列中の前記二つ以上の進行波モジュールはその接触パッド同士が電気的に接触することによって互いに電気的に連絡されている、前記複数の進行波モジュールと、
を含む、前記電気泳動セル。