JP2000507695A

JP2000507695A - 空間的且つ時間的に変動する電場による荷電粒子の分離

Info

Publication number: JP2000507695A
Application number: JP9534662A
Authority: JP
Inventors: ベイダー，ジョエル，エス．; ロスバーグ，ジョナサン，エム．; ディーム，マイケル，ダブリュ．; マルハーン，グレゴリー，ティー．; ウェント，グレゴリー，ティー．
Original assignee: カラゲンコーポレーション
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2000-06-20
Also published as: EP0972187A1; CA2250584A1; EP0972187A4; US5938904A; WO1997036171A1; AU735398B2; AU2597097A

Abstract

(57)【要約】上部基板（１１）；下部基板（１２）；上部基板で規定された分離レーン（１５）；第１の複数の電極（２０、２２…）；第１のパッド（１３）（ここで、前記第１の複数の電極は前記第１のパッド（１３）に接続されている）；第２の複数の電極（２１，２３…）；第２のパッド（１４）（ここで、前記第２の複数の電極は前記第２のパッドに接続されている）を含み、前記パッドおよび電極は、下部基板に配置されており、前記第１の複数の電極および前記第２の複数の電極は互いにかみ合わされている、荷電粒子の分離装置。装置の運転中、荷電粒子はオフ状態と１以上のオン状態の間を周期変動する電位に曝されるものであり、その電位は、好ましくは複数の偏心形の定在ポテンシャルウェルによって空間的に周期的である。

Description

【発明の詳細な説明】空間的且つ時間的に変動する電場による荷電粒子の分離本出願の開示には、一部、著作権で保護される資料が含まれている。著作権者は、本特許の明細書は特許商標庁のファイルおよび記録に記載されているので、その特許明細書の複写複製に異論はないが、それ以外の場合にはいかなる場合であっても全ての著作権を留保するものである。本発明は、国立標準規格技術研究所(National Institute of Standards and T echnology)によって審査された審査No.70NANB5H1036に基づいて米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。１．発明の分野本発明は、媒体中の荷電粒子を、空間的且つ時間的に変動する電位の使用による媒体中の該粒子の拡散率の違いにしたがって分離するための方法および装置に関する。特に、本発明は、液体媒体中の荷電生体高分子の分離のための方法および装置に関するものであり、より特定的には、ＤＮＡ配列決定および一般的な断片長の測定用の１本鎖または２本鎖ＤＮＡ断片の分離のための方法および装置に関する。２．発明の背景荷電粒子、特に、化学種の物理的混合物の分離は、重要な分析操作である。関連する化学種には、合成高分子のような非生体荷電種、およびＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のような生体荷電種などがある(A.J.Kostichkaら，1992，Bio/Te chnology 10:78)。ＤＮＡ断片の混合物の分離は特に重要である。例えば、ヒトゲノムプロジェクトは、ＤＮＡ断片の効果的な分離方法および装置が必要であることを表明している。このプロジェクトは、ヒトの遺伝地図を改良し、2006年までにヒトおよびいくつかのモデル生物のゲノム配列を完全に決定し、そして急増する情報を保存し、アクセスするためのコンピューターツールを開発するための大がかりな国際的作業である。このプロジェクトには、迅速で費用対効果に優れた手法で高品質の配列情報を供給することができる技術基盤が必要である。 2006年までに約３×10⁹塩基対を有するヒトゲノム配列を完全に決定するには、現在の世界中の全ＤＮＡ配列決定能力のおおよそ100倍の能力が必要である(M. V.Olson，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4338)。現在のＤＮＡ配列決定方法、例えば、質量分析法(T.D.Woodら，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92 :11451)、ハイブリダイゼーションによる配列決定法(R．Drmanacら，1993，Scie nce 260:1649)、クロマトグラフィー(C.G.Huberら，1993，Nucl．Acids Res．21 :1061)、音波泳動法(acoustophoresis)(J.S.Heyman，米国特許第5,192,450号）、および電気で移動法は、この配列決定の目標を達成するには一般的に不十分である。上記の方法には種々の欠点がある。質量分析法には高価な質量分析計が必要である。かかる費用のために、この方法は広範な適用性を持つ見込みがない。ハイブリダイゼーションによる配列決定法は、まだ比較的新しく、試験されていない。液体クロマトグラフィーは、２本鎖ＤＮＡ断片の迅速な分離を行うことはできるが、分解能が不十分なために制限される。配列決定に必要な１塩基分解能は、 150塩基対よりも小さい断片においてのみ証明されている。音波泳動法においては、音波が液体媒体を通じて断片を押し動かす。この方法は、同様の長さのＤＮＡ断片では音響学的に同じ特性を有するため、効果的な分離が妨げられることによって制限される。電気泳動法は、ＤＮＡ配列決定に対して最も一般的な方法である。通常の電気泳動法はどれもおおむね類似している(F.Sangerら，1977，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 74:5463;L.M.Smith，1993，Science 262:530)。まず、ＤＮＡ試料を、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）によって増幅する（すなわちＤＮＡ鎖を複製する）。次に、増幅試料から、鎖終結ＤＮＡポリメラーゼ反応（これは、Sangerらによって最初に記載された）によって、４種の鎖終結塩基（ddATP、d dCTP、ddGTP、またはddTTPのどれか）の中の１つが結合した４種の特有の蛍光染料の中の１つで標識されたＤＮＡ断片のネステッド集合(nested sets)を産生させる。関連の方法においては、鎖を、化学的手段によって切断し、標識断片の同様の集合を産生させる(M.Maxamら，1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:560)。次いで、これらの断片を、種々の電気泳動技術によってそれらの分子のサイズにしたがって分離し、各鎖終結塩基を標識している特有の染料をその蛍光によって検出する。ＤＮＡ塩基配列は、その検出された鎖断片パターンから再構築される。ＤＮＡ断片のサイズの測定に必要な精度は、その適用法に依存する。例えば、ＤＮＡ配列決定反応は、個々の塩基によって分離された長さを有する断片の混合物（「ラダー」と呼ばれる）を産生し、正確な長さの測定を必要とする。その他の適用法は断片長間に大きな違いを生じさせ、迅速にサイズを決定する方法は、必ずしも長さの情報は正確ではないが、価値がある。そのような適用法の典型は、制限断片長多型（「ＲＦＬＰ」）のパターンの作製、遺伝子型分類、連鎖分析、マイクロサテライト(microsatellite)分析およびその他の断片分析方法である。電気泳動分離において、ＤＮＡ分子は電場中の移動速度にしたがって分離される。電気推進力は、分子の正味電荷に比例する。ＤＮＡのような一様に荷電した生体高分子については、推進力はＤＮＡ断片中の塩基対の数に比例する。液体のようなストークスの法則に従う物質中では摩擦係数も塩基対の数に比例するので、ＤＮＡ断片は、断片長とほぼ同一で独立の電気泳動移動速度を有する。これは、ＤＮＡ断片の電気泳動分離はストークスの法則に従う液体またはその他の媒体においては難しいということを意味するものである。したがって、電気泳動ＤＮＡ分離には、一般的に、液体媒体の代わりに架橋ゲルおよび非架橋ポリマー溶液が用いられる。これらの媒体中では、電気泳動移動速度は長さまたは分子量の増加とともに減少するので、ＤＮＡはストークスの法則に従わない。よって、生体高分子の電気泳動分離は、通常、アガロースまたはポリアクリルアミドのようなポリマーゲル中で行なわれるが、ここで、ＤＮＡまたはＲＮＡのような同様の電荷密度を有する生体高分子の分離は、分子量に依存する。ゲル中では、断片サイズに対する摩擦係数はストークスの法則に依存しないことから、異なる長さのＤＮＡ断片の電気泳動分離が可能になる。したがって、生体高分子断片は、大きさが小さいものから大きいものの順に装置から出てゆく。一般的な構成においては、電気泳動ゲルは、２枚の平らで平行な長方形のガラス板の間に薄いシートとして配置されている。電場は、その長方形配置の長軸に沿って生じ、分子移動が電場に平行ないくつかの経路または「レーン」中で同時に生じるように配列される。分離分解能を高めるために、移動レーン中のゲルは、可能な限り均一であり（または液体のように均一であり）、そしてレーンが明確に区別され得るように十分に分離されているのが都合がよい。均一な移送特性を有する均一なゲルを作製する、または「注型する(cast)」ことは困難であることが判明している。主な問題の一つは、ゲル重合中、架橋によって生じる不均一なゲル収縮である。均一なゲルを注型することにおけるこの問題は、均一で再現性のあるローディング領域（ここに試料混合物を分離前にのせる）を作ることも困難にする。より再現性の良好な移送特性（すなわち、均一な液体のような移送特性）を有する分離媒体は有用性が大きいということは一般的に認識されている。分離分解能を高めることに加えて、電気泳動をより迅速に行いたいという要求によっても、ゲル操作に対してさらなる問題が引き起こされる。迅速で、高能力の生体高分子分析には、迅速な電気泳動が望ましい。これには、第一に、分子をより大きな速度で移動させるために、分子の移動においてより大きな力をはたらかせるより強力な電場が必要である。しかしながら、高電場、電圧および速度によりゲル中の抵抗加熱が上昇してゲル中に有意な熱勾配が生じる。かかる熱勾配は、分離分解能をさらに損なうようなさらなるゲル不均一性を引き起こす。高電圧で分解能を維持するために、有害な熱をより簡単に取り除くことが可能なように、より小さい形状寸法のゲルが用いられる。したがって、電気泳動は、典型的には1000μｍよりも大きい通常のスペースの代わりに、平行したガラス板の間に25〜150μｍの間隔をあけた形状寸法で記載されている(A.J.Kostichkaら，1992，Bio/Technology 10:78)。そのような薄さの均一ゲルを注型し、そのように薄いシート中に長く、平行で、狭く、かつ間隔の接近した移動レーンを確実に得るのはかなり困難であることが判明した。また、薄いゲルにおけるこのような難点を克服するために、物理的分離手段がレーンの区別を維持するために用いられている。これらの分離手段によってさらに一連の問題が生じる。物理的に区別されたレーンを作るそのような方法の一つにおいては、100μｍ未満の径を有する毛管を配列したものが用いられている(X. C.Huangら，1992，Anal．Chem．64:2149)。このような毛管を配列したものでは、均一なゲルの状態に注型するのが困難であり、断片試料をローディングするのが困難である。ローディングが簡単であるということは、分離のセットアップ（これは、大きな労働力を要することが多い）の時間および費用を最小にするのに都合がよい。代案としては、各毛管にゲルの代わりに希薄なポリマー溶液を用いることがある(P.D.Grossman,米国特許第5,374,527号)。しかしながら、そのような溶液における１塩基分解能は、200塩基未満のＤＮＡ鎖に限られており、毛管への試料のローディングは困難なままである(A.E.Barronら，1993，J．Chromato gr．A 652:3;A.E.Barronら，1994，Electrophoresis 15:597;およびY.Kimら，19 94，Anal，Chem．66:1168)。その他の代案としては、電気泳動装置中にチャンネルをマイクロ製造(microfabrication)することによって物理的に区別されたレーンを作ることなどが挙げられる(D.J.Harrisonら，1992，Anal．Chem．64:1926およびD.J.Harrisonら，1993，Science 261:895)。電極は、電気泳動場の正確な制御が行なわれるように配置され得る(G.T.A.Kovacsら，1990，ヨーロッパ特許037 6 611 A3およびD.S.Soaneら，米国特許第5,126,022号)。ゲル中を移動させる別の代案では、光マイクロリソグラフィーを用いることにより、ＤＮＡの電気泳動分離のために移動障害物を準二次元的に配列したものが製造された(W.D.Volkmut hら，1992，Nature 358:600)。レーンサイズが小さいということは多数の移動レーンにおける多数の試料の分離に望ましいが、同時に矛盾する物理的要求を生み出す。多数のレーンで移動している断片を同時に検出するには、全レーンを限られた口径の分光器によって同時に観察することができるように、移動レーンを空間的にコンパクトに配置する必要がある。しかしながら、分離前の移動レーンへの試料のローディングは、広く間隔があけられたレーンの方がより簡単で迅速であるので、そのような移動レーンに物理的に近い必要がある。通常の平板技術は、まっすぐな平行したレーンのみを有しており、これらの異なる要求を受け入れることはできない。従来のゲルに基づく電気泳動分離方法についてのそのような問題が、新規の分離方法を調査する動機となった。電気的に分極可能であるが、荷電していない粒子の非電気泳動分離方法は、粒子の液体中の拡散率における違いに基づくものである。非常に大きい塩基サイズのＤＮＡ断片のみが、この方法によって分離するのに十分な分極性を有している(A.Ajdariら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 88:4468;J．Rousseletら，1994，Nature 370:446;およびJ.F.Chauwinら，1994 ，Europhys．Lett．27:421)。この方法では、空間において周期的であるが非対称の、分離の方向に実質的に垂直な電場であって、オンからオフに時間的に周期変動するものを使用する。この非対称の電場が生じると、この電場は公知の静電気学の法則にしたがって一連の空間的に周期的な誘引領域に分極可能な粒子を誘引し、トラップする。しかしながら、電位がなくなると、粒子は自由に拡散する。より小さい粒子はより迅速に拡散するので、周期変動している電場によって分極可能な粒子がサイズ分離される。分極に基づく装置は、ウイルスの大きさ程度の粒子を分離するのに適しており、染色体全体のような非常に大きい塩基サイズのＤＮＡ断片を分離することも可能であり得る(J.Rousseletら，1994，Nature 370:446)。この粒子サイズの制限は、分離される粒子が、液体中に実際に生じ得る電場によって誘引されるのに十分な大きさの分極性を有するという要求によるものである。誘引力は、電場の二乗で変化するので、高電圧が必要である。配列決定反応またはＲＦＬＰによって通常生じるサイズである、塩基の長さが数百のＤＮＡ断片の分離は、実際には電場の強さおよび電圧に限界があるため、このようなまたはこれと類似の分極に基づく装置の能力範囲外である。前述の全ての技術の問題は、多数の生体高分子試料の迅速な同時分析のための機械を、低コスト且つ最小限の人間の介在で作ることを妨げるものである。そのような機械は、例えば、生物学的研究、ヒトゲノムプロジェクト、バイオテクノロジー工業、および臨床診断などの生物学の多くの分野において広く必要とされていると感じられる。上記の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の従来技術であることの認識を構成するものではない。３．発明の概要本発明の方法および装置の目的の１つは、従来技術の問題を克服した、都合がよく、効率のよい荷電粒子の分離を提供することである。分離される粒子は、正または負のいずれに荷電していてもよい。特に、分離される荷電粒子は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡのような生体高分子断片であり得る。本発明の方法および装置の別の目的は、分離を、空間的且つ時間的に変動する電位を用ぃて行なぅことである。電位は、電位が比較的強い場合に荷電粒子をトラップする、複数の偏心形状のポテンシャルウェルを有する。分離は、電位がかなり弱い（またはオフの）場合、粒子が分離媒体における拡散率の違いに基づいてウェルからウェルに示差的に拡散するために生じる。粒子分離のラインに沿った全体的な電位差が存在しないことは都合がよい。本発明の方法および装置の利点は、荷電粒子が電位と相互作用することである。これは、容易に得られる電場に対しては、分極可能な粒子と均一でない電場との間の弱い相互作用よりも強い相互作用であり、電場の強さの二乗、電場の空間的不均一性、および粒子の分極性に依存する。本発明の方法および装置の利点は、本発明の電位状態が、荷電粒子を分離媒体中のそれらの拡散率に基づいて単独で分離するということである。それによって、本発明は、通常の電気泳動では不可能な、液体中またはストークスの法則に従う媒体中においてＤＮＡ断片を分離することができる。さらに、液体拡散率はゲル拡散率よりも大きいので、より迅速なＤＮＡ分離が可能である。しかしながら、本発明の方法および装置は、液体分離媒体に限定されるものではない。本発明の方法および装置の利点は、ゲルを基材とする媒体の代わりに液体媒体が用いられ得るということである。液体媒体を用いる場合、本発明の方法および装置は、例えば、小さい形状寸法でのゲルローディングの困難さ、収縮によるゲル不均質性、電気的内浸透、および不均質ゲル注型などの、ゲルを基材とする媒体についての制限の多くから解放される。液体分離媒体は実質的に均一であるので、より再現性が良好な分離が可能であり、分離媒体における不均質性が最小化される。さらに、装置はすばやく再使用できる。試料は、均一な高電圧を印加することによって除去され得る。また、液体分離媒体を迅速に流し出し、次いで装置を洗浄溶液で洗浄し、新たな液体媒体を再ローディングする。本発明の装置は、マイクロ製造に適した小規模のものであり得るという利点がある。小規模の結果、高処理量になる。小規模の結果、効率のよい熱伝達が得られ、局所加熱による分離媒体不均質性が低減される。さらに、装置が小さくなればなるほど、分離がより迅速になる。その上、装置は、低コストマイクロ製造に適している。多数のレーンは、１平方センチメートルの１個の基質上で作ることができる。本発明による分離モジュールは、試料調製および断片検出装置と一体化することができる。ローディングゾーンは、ローディング電位を発生する電極を含む分離モジュール上に、分離前にローディングした試料を小容量に局在化させるために製造され得る。本発明の方法および装置の利点は、操作パラメーターを分離される分子のサイズおよび要求される分離分解能に合わせることができるということである。したがって、全ての分子が短いか、または近似のサイズ（精度５〜10％）のみが要求される場合には、より迅速な分離が得られ得る。本発明の方法および装置の利点は、表１に挙げたような通常の電気泳動システムに対する優位性を有するということである。表１：従来の電気泳動システムに対応する優位性これらの目的および利点は、空間的および時間的に変化し得る電位の使用により、分離媒体中の粒子の拡散率の差異にしたがって、分離媒体中の荷電粒子、特に荷電化学種を分離することからなる、発明によって達成される。電位の空間的変化は、分離ラインに沿って、荷電粒子を誘引してトラップする複数のポテンシャルウェルを形成する。このポテンシャルウェルは、電位の最小点がウェルの中心からはずれて位置している、偏心型である。１態様において、ウェルは一方の側が一般的に他方よりも急勾配であり、全体的には鋸歯型である。ポテンシャルウェルは各種の空間配置を取ることができるが、分離ラインに沿って周期的な配置が好ましい。時間的には、電位は２以上の状態間を循環するが、２つの状態の場合が好ましい。少なくとも状態の１つ、「オン−状態」において、粒子がポテンシャルウェル中で誘引されてトラップされる。少なくとももう一方の状態、「オフ−状態」において、粒子は分離媒体中でその拡散率にしたがって実質的に自由に拡散する。好ましい態様において、オン−状態は各粒子がいずれかのポテンシャルウェルに局在化するのに十分な持続時間を有し、オフ−状態の持続時間は可能な限り最も迅速な分離が得られるように最適化される。これによって、電位が時間的状態間で循環するにつれて、粒子は拡散率にしたがって予測される様相で、ポテンシャルウェルからポテンシャルウェルに拡散し、これによって、それらの拡散率にしたがって分離される。本方法の重要な適用例において、粒子は荷電生体高分子である。特に、液体などの媒体中のＤＮＡの分離は、例えば、ＤＮＡ配列決定、ならびに制限断片長多型(“RFLP”)の観察、遺伝子型の分類、連鎖解析、マイクロサテライト分析およびその他のＤＮＡ分析の適用において、重要である。一本鎖および二本鎖ＤＮＡ分子は実質的にそれらの断片の長さのみに依存する液相拡散率を有する荷電物質であるので、本方法をＤＮＡの分離に適用することができる。本発明の方法および装置は、分離ラインに沿って隣接する最大点に関して偏心的に設置された複数のポテンシャルウェルを形成する空間的変化を有し、かつウェル中に荷電粒子をトラップする１以上の状態と媒体（好ましくは液体媒体）中で実質的に自由な拡散を許す１以上の状態との間の時間的変化を有する広範囲に変化する電場によって、効果的になる。ポテンシャルウェルは急勾配側と緩勾配側を有してもよいし、トラップ粒子をしっかりと閉じこめるための狭い最小点を持つ偏心型にしてもよいし、または一般的な非対称および偏心型でもよい。ポテンシャルウェルは分離ラインに沿って周期的にまたは距離を変化させて設置することができる。好ましい電位は分離ラインに沿った鋸歯型である。時間的には、電位は３以上の状態間を変化させるかまたは連続的に変化させてもよい。時間的変化は分離期間中一定にしてもよいし、分離期間中変化してもよい。好ましい電位はオン−状態とオフ−状態間のみで変化する。以下の開示で明らかになるように、電位の空間的および時間的変化を確定するパラメーターは、装置がどんな物理的サイズでもよいように、分離すべき粒子の拡散率および電荷の観点から選択することができる。しかし、好ましい態様において、特にＤＮＡ断片の分離のためには、可能な限り最も速い分離を達成するように構築される。こうした態様の１つにおいて、器具は利用可能なマイクロ製造 (microfabrication)技術を使用して構築することができるほどの小さいものである。分離装置の１態様は分離媒体を保持するための１以上の連絡していない分離レーンを含むモジュールを有し、これに沿ってＤＮＡ断片が分離される。このモジュールはセンチメーター（“ｃｍ”）スケールの２つの基体で構築される。１つの基体は平板で、他方は、例えば溝を掘るか壁を設置するかによって製造されたチャンネルを有する。この２つの基体を１つに合わせると、これによって分離レーンが形成される。分離レーンの配置を変えることも可能である。１つの配置は平行直線状レーンである。好ましい配置の１つは、ローディングのためにレーンへの物理的接近が容易になるように、モジュールのローディング部ではレーン間隔を広くとるが、末端検出部では、分離された断片を全分離レーンにおいて同時に検出することができるように、間隔を狭くするものである。チャンネルサイズは1ｍｍ未満、５００μｍ、または１００μｍとすることができ、２５μｍ程度に小さくすることもできる。分離モジュールの好ましい態様において、平板状（溝がない方）の基体に設置された電極によって、空間的および時間的に変化する電位が形成される。好ましい態様において、電極は上記のチャンネルに対して実質的に直交方向に置かれ、空間的に周期的なポテンシャルウェルを形成するように配置され、この各ウェルは一般的に偏心「鋸歯」型をしている。この好ましい態様において、「オン」タイム、ｔ_onについては電極に電圧差が加えられ、「オフ」タイム、ｔ_offについては電極は同一の電位とする。電位差および「オン」タイムはポテンシャルウェル中に荷電断片が局在化してトラップされるために十分であるように選定される。「オフ」タイムは断片が次のポテンシャルウェルへの拡散について有限の確率を有するように、選定される。電位に周期を与える結果、荷電断片は拡散率の差異に基づいて分離される。詳細な説明（第５節）によって、各種の操作パラメーターの選定の方法が明らかにされる。分離媒体はいくつかの基準に適合するように選定される。第１に、分離すべき粒子がその媒体中で荷電し、そして好ましくは広い範囲の拡散率を有することである。第２に、媒体が高電気破壊電位勾配を有し、しかも容易には電気分解されないことである。好ましくは、分離媒体は液体である。ＤＮＡを分離するのに適切なこうした媒体の例として、水性液体媒体、水性緩衝液、およびホルムアミドなどの非水性変性用液体媒体が含まれる。本発明は液体分離媒体に限定されるものではない。適切な電気特性を有し、その中で分離すべき粒子が荷電して異なる拡散率を有するような、各種濃度の各種のゲルまたはポリマーなどの媒体はいずれも使用することができる。本発明によって、基本的な分離モジュールにおいて、各種の強化および変更が意図される。１態様において、液体分離媒体および分離するサンプルを、例えば分離モジュールの基体板の一方にドリルで開けた穴であるローディング口からローディングすることができる。こうしたローディング口を収容するため、それらの近傍で分離レーンの間隔をより広くする必要があるかもしれない。その他、装置の１態様として、分離の前に、ローディング口の中にローディングするサンプルを局在化およびトラップして、コンパクトな初期容量にするような、別のゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）を形成する、特別の電極が含まれる。装置中での温度および温度勾配の制御が望ましくく、これは好ましくは基体の一方または両方とうまく熱接触させた温度制御モジュールによって達成される。好ましい小サイズの装置では特に良好な熱制御が得られる。なぜならば、小さい分離媒体チャンネルは必然的に両方の基体板を含む全側面で良好な熱接触となるからである。装置の１態様において、温度制御モジュールとして、分離モジュールと、例えば空気または水の交換流体と熱を交換する熱シンクとの間でいずれかの方向に熱を送るように配置した、Ｐｅｌｔｉｅｒ熱電モジュールなどの、２方向熱転移器具が含まれる。好ましい態様において、分離された粒子の観測は光学的方法によって実施される。こうした光学的観測方法の中の可能な１つとして、分離レーンに直交するレーザまたはその他の励起によって蛍光シグナルを発生する、独特の蛍光タグで粒子を標識し、そのタグ蛍光を標準的な分光分析で検出するものが含まれる。多数の分離レーンから同時に蛍光を検出するためには、透過型イメージング分光器を使用するのが有利である。本発明は、ＤＮＡ配列分析に特に適合する。この場合、各ＤＮＡ分子は４つの鎖終結ｄｄＮＴＰの１つとに統合させた４種の光学的に識別し得る蛍光染料の１つで別々に標識される。分離すべき粒子が多種の染料で標識される応用例に対しても同様に適用することができる。関連する分野の当業者によってこの装置になされる多数の改変は、本発明によって意図されるものである。これらの改変の一部として以下のものが含まれる。拡散率を強化するために、媒体の温度を変化させることができる。ポリマー溶液またはゲルなどの分離用媒体もまた使用することができる。この装置の分離モジュールの基体、ならびに絶縁体、導電体および抵抗器などの電気部品として、種々の材料を使用することができる。ポテンシャルウェルを形成させる機能を有する電位を得るために、様々な電極形状を使用することもできる。例えば、電極を分離レーンの底部に接触する層状に配置することもできる。これらは分離レーンの厚さを超えるほど厚いものでもよく、または中間の厚さでもよい。あるいは、分離レーンんの外側の電極によってポテンシャルウェルを形成することができる。各種のレーン形状が可能であり、これらとして、直線、部分的直線、開曲線、または閉曲線状の形状が含まれる。円形の配置では、レーンは円柱の周囲をとりかこんでいる。本発明の方法および装置は多くの分野での用途を有する。生物学の研究室ではゲノムの配列決定のための高処理量で複雑なＤＮＡ分析のための容易に使用できるシステムが必要とされている。医学の研究室でも、迅速で低コストのＤＮＡ分析および配列決定の必要度が高まっている。例えばＲＮＡおよび蛋白質などのその他の荷電粒子の分離も研究室および診断実験室で同様の用途を有する。４．図面の簡単な説明本発明のこれらおよびその他の目的、特徴および利点は添付した図面、詳細な説明および特許請求の範囲を参考にして、当業者にとって明らかになるであろう。ここで；図１は本発明にしたがった分離器具を示す。図２は図１の分離器具のＩ型の具体例の１つの分解図を示す。図３は図２の器具の分離方向に対して直交する断面図を示す。図４Ａ−４Ｂは図２の器具の電極の詳細、およびこの電極によって発生される電位を示す。図５は図２の器具の分離方向に沿った断面図を示す。図６は図２の器具のローディング部を示す。図７は図１の分離器具のII型の具体例の１つの分解図を示す。図８は図７の器具の分離方向に対して直交する断面図を示す。図９Ａ−９Ｅは本発明の方法の操作を要約して示す。図１０は図９Ａ−９Ｅの方法において使用するのに適合し得る電位の形態を示す。図１１Ａ−１１Ｄは図９Ａ−９Ｅの方法における隣接する２つのポテンシャルウェル中の粒子濃度プロフィールの挙動の詳細を示す。図１２Ａ−１２Ｅは図９Ａ−９Ｅの方法における隣接する複数のポテンシャルウェル中の詳細な粒子濃度プロフィールの挙動を示す。図１３は図９Ａ−９Ｅの方法の操作パラメーターを選択するための好ましい方法に関するｔ_off対Ｔ_totの挙動を示す。図１４は図９Ａ−９Ｅの方法の操作パラメーターを選択するための好ましい方法にしたがって方法を操作するパラメーターが選択されたときの、ＤＮＡ分子の分離分割の百分率対Ｔ_totの挙動を示す。図１５は図２の器具のための電極を製造するための代表的な写真平板マスクを示す。図１６Ａ−１６Ｂは図２の器具用のチャンネルを製造するための代表的な写真平板マスクを示すそして、図１７は図９Ａ−９Ｅの方法にしたがったＤＮＡ分子の仮想上の分離の例を示す。５．発明の詳細な説明第５．１節に、本発明にしたがった代表的な分離器具の構造を説明する。第５．２節に、分離方法および器具の操作を要約して記載する。第５．３節に、分離方法および器具の操作をより詳細に記載し、そして方法の操作条件および器具設計のパラメーターの選択のための方法を提供する。第５．４節に、ＤＮＡの分離の重要な事例を記載する。最後に、第５．５節に、本発明にしたがった分離器具のマイクロ製造の代表的な方法を記載する。５．１．分離器具の説明図１は本発明にしたがった分離器具を図示している。この分離器具およびその特定の具体例である、器具Ｉ型およびII型は器具として好ましい物理構造である。しかし、本発明の方法にしたがった荷電粒子の分離は、分離媒体を保持し、本発明の方法にしたがって電位を与えられる１以上の分離レーンを有する、別の任意の物理構造においても実施することができる。例えば、外部から電位を加えられるおそらくは毛細管サイズの１以上のチューブ中で実施することができる。あるいは、分離媒体をスラブとして配置し、分離レーンをそのスラブ中に走らせた一般的な配置で、本発明を実施することができる。図１において、分離器具１０は２枚の基体、上部基体１１および下部基体１２を含み、これらによって、これらの間にレーン１５などの１以上の分離レーンが画定される。レーン１５は、例えば上部基体１１に開けられた穴からなるローディング口１６から一般的に１８において表示される観測ゾーンまで伸びている。荷電粒子が蛍光標識されている場合は、観測はレーザービーム１９による観測ゾーン１８の照射によって簡便に行うことができる。分離レーン中の粒子に誘発された蛍光２０は分光分析器によって観測される。ＣＣＤ検出器を使用する標準的オプチックスでは、同一面上の照射面１００μｍ中０．０１フェムトモル（“ｆｍ”）の蛍光染料標識粒子を検出することができる。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｓｉｍｐｓｏｎら、「生体高分子断片の産生、分離、検出および認識のための装置および方法」、米国特許出願番号Ｎｏ．０８／４３８，２３１、１９９５年５月９日出願、を参照されたい。この全文をここに参考として引用する。本発明の１方法にしたがう電位は、基体の一方または両方に設置または貼り付けられた、以下に記載する、あるパターンの電極によって、チャンネル１５に沿って発生される。各電極は電極パッド１３または１４の一方に接続され、このパッドを通じて外部電圧源１７から誘導される、時間によって変化する電圧によってエネルギーが与えられる。本方法の操作パラメーターを選択することによって、器具をどんなサイズにも構築することができる。荷電粒子をより速く分離するためには、選択した製造またはマイクロ製造技術の制約の範囲内で、できるだけ器具を小さく製造することが好ましい。小さなサイズであれば１つの基体上に一連のチャンネルを置き、それによって同時に多数の分離を達成することも可能になる。しかし、器具は、分離すべき荷電粒子が分離中に互いに独立して移動すると同時に、少なくとも数百の粒子が器具中を共に移送されるのに十分なほどの大きさにすべきである。荷電粒子が荷電分子の場合、この後者の条件は器具中の最小の寸法を分子の寸法の５０から５００倍の大きさに製造することによって、容易に満たすことができる。基体、（II型器具における）チャンネル壁および電極については多くの材料を使用することができる。１つの制限は、分離レーンに露出するどの材料も、使用する媒体および分離すべき荷電粒子などのレーンの内容物に対して実質的に不活性でなければならない点である。材料が本来不活性であるか、または不動態化層、例えば電極の上側に配置された酸化珪素層によって保護されていなければならない。さらに、分離された粒子の検出を容易にするため、基体が蛍光標識の使用を可能にするものであるのが好ましい。こうして、基体は励起および誘発された蛍光波長の光に対して実質的に透過性であるべきである。非晶質酸化珪素は、標識ＤＮＡ断片に通常使用されるような大部分の蛍光染料に対して許容される基体の１例である。許容される材料のその他の例を第５．５節に記載する。分離すべき荷電粒子はあらゆるサイズの個別の分子から任意の数および種類の分子の複合体まで、および巨視的サイズの粒子までの範囲とすることができる。分離レーンは好ましくはいくつかの特性を示す分離媒体で充満される。第１の特性は、分離すべき粒子を溶解してイオン化することである。第２の特性は、分離すべき荷電粒子の型がその媒体中で異なる拡散率を有することである。全体として拡散率が大きいほど、そして拡散率の差異が大きいほど、媒体としてより好ましい。迅速な分離のための第３の特性は、媒体が高電位勾配に耐えることである。したがって、印加電位において媒体は好ましくは電気分解に抵抗性であることであり、そして分解電場が高いほど好ましい。最後に、媒体が小さい誘電率および小さいイオン強度であるのが好ましい。なぜならば、電場の強度は媒体による誘電遮蔽および含有イオンによるイオン遮蔽によって減少するからである。この後者の特性は、もちろん、荷電分子の溶媒和の必要性による制限を受ける。すなわち、対イオンが存在するために、一般的には高誘電溶媒および限定されたイオン強度を必要とするからである。分離すべき特定の型の荷電粒子に関してこれらの条件に適合する分離媒体は実験によって最も簡単に決定することができる。ＤＮＡなどの生体高分子を分離するためには、好適な分離媒体は通常の電気泳動において普通に使用される水性溶媒または水性緩衝液である。あるいは、媒体はホルムアミドのような変性溶媒でもよい。荷電状態で分子を溶媒和することができ、そして十分な電位勾配が可能な、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはアルコール溶液などの、その他の有機溶媒もまた使用可能である。さらに、希薄ゲルまたはポリマー溶液も可能な分離媒体である。分離器具は構成材料および使用する分離媒体に適合するどの温度でも操作することができる。ここにあげるすべての実施例および計算は特に明記しないかぎり周囲温度がおよそ２９８°Ｋでの操作を仮定している。操作温度にかかわらず、分離媒体を各分離レーン間で均一に保持するするため、熱勾配を最小にすることが重要である。これは、分離器具の上部または底部基体、あるいはその両方を適宜熱シンクまたは熱源と熱接触するように設置することによって達成される。Ｉ型およびII型と称する、図１に示す分離器具の特定の２つの具体例を以下の分節でさらに説明する。Ｉ型器具においては、チャンネル１５のような分離レーンを形成するチャンネルを基体１１または１２の一方の面にエッチングする。II 型器具においては、基体の一方の上に平行なチャンネル壁を配置することによって分離チャンネルを形成する。どちらの具体例においても、電極は基体の一方に配置される。５．1．1．I 型器具図２はＩ型器具の代表的な具体例の分解図である。器具１０は上部基体１１および底部基体１２を含んでいる。１以上の分離チャンネル１５は、例えばエッチングまたはマイクロ機械加工によって上部基体１１中に製造される。分離はチャンネルに沿って起こり、したがって、このチャンネルによって分離方向Ｓが確定される。１つのチャンネルの形状は好ましくは幅が約５０μｍおよび高さが１０μｍのほぼ半円から矩形である。より小さい高さおよび幅のものが好ましい。なぜならば、分析のためにより少量のサンプルが必要とされるからである。幅は、従来からのゲルを基礎とする電気泳動器具の幅に匹敵するほどの大きなサイズまでの範囲でもよい。高さは、発生した電位でオ−状態中に十分粒子を局在化させられるように、十分小さいものが好ましい。このオン−状態は、分離すべき粒子を代表する粒子を使用した、与えられた器具の形状についての実験によって、最も簡単に決定される。各チャンネルは実質的に基体の全長まで伸びており、これは典型的には１〜１０ｃｍであるが、第５．３節および５．４節の設計方法にしたがって選定される。チャンネル間はできるだけ接近させ、好ましくはその幅とほぼ同程度の距離とする。上部板１１には、以下にさらに記載するように、図１のローディング口１６の穴を製造することができる。この注入口の直径は分離すべき粒子をレーン内にローディングすることができるように選択される。チャンネルは実質的に平行でもよいが、あるいはローディング口近辺での広い間隔から観測ゾーンでの狭い間隔へと収束させてもよい。２枚の基体を接合することによって、上部板に製造したチャンネルを密閉し、閉鎖された粒子分離レーンを形成させる。外部電圧源１７と電気接続をするため、電極パッドが露出されるように、上部基体は底部基体に対して凹みを有する。互いに対面し、互いにかみ合った２つの複数電極であって、複数の電極の組のそれぞれが２つの電極パッド１３および１４の一方に接続されている電極を底部基体１２の平面状の上面に設置する。あるいは、電極を上部基体１１の平面状でない面に設置することができる。電極２０および２２はパッド１３に接続された複数の電極の代表例であり、電極２１および２３はパッド１４に接続された複数の電極の代表例である。これらの電極は好ましくは分離軸Ｓに対して実質的に直交する方向に伸びている。あまり好ましくはないが、収束する分離レーンの配置で生ずるように、電極が分離軸および分離レーンに対して傾いているものもある。傾斜の角度が大きいほど、効果は小さくなり、そして粒子の分離能が悪くなる。これらの各電極の厚さは、好ましくは約０．１−０．２μｍよりも小さく、あまり好ましくはないが１μｍよりも小さいものでもよい。ただし、大きなサイズのものが必ずしも器具の操作を妨害するわけではない。これらの各電極の幅は、その主要サイズをＲ’で示すが、好ましくは約１−２μｍよりも小さい。これよりも大きい値のＲ’が器具の操作を妨害するわけではないが、Ｒ’²のスケールで操作時間がより好ましくない結果になる。主要サイズが約１μｍのものは標準的なマイクロ製造技術で容易に達成することが可能である。好ましくは、電極パッド１３および１４に接続された複数の電極のそれぞれが均一な距離Ｌをおいて周期的に配置される。例えば、電極２０および２２は距離Ｌだけ離れており、電極２１および２３も同様である。好ましくは、複数の電極のそれぞれが互いに間隔Ｒになるように配置される。例えば、電極２０および２１の中心は距離Ｒだけ離れており、電極２２および２３の中心も同様である。好ましくは、ＲはＲ’とほぼ等しく、一方ＬはＲ／Ｌが約０．１よりも小さくなるように選定される。しかし、０．５までの比率のものも使用することができる。選択した製造技術において達成し得る主要サイズＲ’に関して、最適なＲ，ＬおよびＲ／Ｌを選定する方法を、第６．２節に記載する。あるいは、第５．２および５．３節に記載したモデルにしたがって、ある種の様相の粒子分離を最適化するため、Ｒ，ＬまたはＲ／Ｌを分離軸に沿って規則的に変化させることができる。図３は、器具１０の分離方向Ｓに対して直交する軸３−３に沿った断面図を示している。上部基体１１および底部基体１２は、チャンネル１５などの３つのチャンネルを形成し、これらは密閉されて分離レーンを形成している。代表的な電極２０は、必要ならば好ましくは不動態化層で被覆されて、チャンネルの底部に沿って伸びている。図４Ａは２つの複数電極をより詳細に図式的に示している。一方の複数電極の電極２０および２２は電極パッド１３に接続され、他方の複数電極の電極２１および２３はパッド１４に接続されている。１つの複数電極内の電極は距離Ｌだけ離れている。複数電極の間で互に隣接する電極の中心は距離Ｒだけ離れている。各電極の幅はＲ’である。したがって、電極２１と２２の隣接する端部間の距離はＬ−２Ｒ−Ｒ’であり、電極２０および２１（または２２および２３）の隣接する端部間の距離はＲ−Ｒ’である。パッド１３および１４はそれぞれ電位−Ｖ_O ／２および＋Ｖ_O／２に荷電される。Ｖ_O＞０の場合、陽性荷電粒子の分離方向はＳである。Ｖ_O＜０の場合、Ｓは陰性荷電粒子の分離方向である。図４Ｂは、分離レーンに沿って観測した、２つの複数電極によって発生される電位の大略を理念的に図示している。電位は、パッド１３に接続された電極の近傍の最小値−Ｖ_O／２からパッド１４に接続された電極の近傍の最大値＋Ｖ_O／２まで変化する、一連のポテンシャルウェルを形成している。この電位は一般的に鋸歯形で、空間的に周期的であり、ポテンシャルウェルの各周期は均一かつ偏心的に位置した最小値を有する。各周期は、距離Ｒで分離された位置３６および３７間の比較的短くてより急激に上昇する部分３２と、距離Ｌ−で分離された位置Ｒ３５および３６間の比較的長くてより緩やかに下降する部分を有している。分離方向、矢印Ｓは１つの最小点から最も近い隣接する最大点への方向である。すなわち、矢印Ｓは最小点３６から最も近い隣接する最大点３７への方向である。ポテンシャルウェルはこれらの方向においてすべてのウェルについて均一であり、すべてが同一の方向、ここでは矢印Ｓ、に並んでいる。さらに、電極形成部の近傍の空間でも、このポテンシャルウェルは不動のままであることは明らかである。パッドが反対の電位に荷電された場合は、上昇および下降部分が交替する。各ポテンシャルウェルに関する最小サイズは、分離すべき粒子を数百以上含有する、好ましい様相によって、一般的に制限を受ける。また、ウェルは含有される粒子が何ら相関関係なく独立して動くことができるほど大きくなければならない。荷電生体高分子が分離される、好ましい適用例において、Ｒが約０．１μ ｍよりも大きけれは、これは満たされる。図５は、レーン１５などの分離レーン中の分離方向である、図２の軸４−４に沿った器具１０の断面図を示している。分離レーンは上部基体１１で上部の、そして底部基体１２で下部の境界が区切られ、これらの基体はＨの距離があり、これがレーンの高さになっている。レーンの高さは好ましくは１０μｍに選定されるが、電位がオン−状態で粒子を局在化させるのに十分強いことという制限はあるものの、より大きな高さも可能である。一般的に底部プレート１２上の２０，２１，２２および２３にある電極は分離方向Ｓに対して実質的に直交し、分離レーンに露出して電位を発生する。これらの電極は好ましくは約０．１−０．２μ ｍより小さい高さｄ、好ましくは１−２μｍの幅Ｒ’であり、そして間隔Ｒは好ましくは約２Ｒ’であるが、より小さな間隔の方が、迅速な分離ができることになるのでより好ましい。電極は好ましくはＲ／Ｌが０．１以下になるように選定した一定の距離Ｌで周期的に配置されるのが好ましい。あるいは、あまり好ましくはないが、Ｒ／Ｌを０．３未満とする。効果は劣るが、限界比率０．５（すなわち、対称的なウェル）でも、器具は機能し続ける。分離の前の粒子のローディングを容易にするため、器具にローディング部を設置するのが有利である。現行のローディング技術でローディングするのを容易にするため、ローディング部は好ましくはマイクロピペットのサイズである、５０ −１００μｍ程度の直径を有する。したがって、分離レーンの幅および間隔にとって、これが好都合な尺度となる。あるいは、好ましいサイズのローディング口を可能にするため、もっと狭い分離レーンにしてローディング部で広い間隔をとらせることができ、そして観測ゾーンで間隔を狭くするように収束させることができる。最適な分離能および速度を達成するため、分離前に全粒子が１つのポテンシャルウェルの中に引き込まれ、一連のポテンシャルウェル間の間隔は前記のようにするのが好ましい。図１のローディング口１６についての器具１０の拡大および分解図である図６はこれらの特性を満たすように適合させたローディング部を示している。分離すべき粒子を器具の外部から部位５１においてピペット５１、または同様な機序で分離レーン１５の内部の部位５２に導入する。ローディング口１６の下の電極５４および５５はローディング口１６の直径の程度まで大きな間隔をとらせている。粒子のローディング中またはローディング後、電極パッド、したがって電極５４および５５に、全粒子を電極５５のごく近傍、部位５３に引き付けるのに十分な時間、電位を与える。十分な時間は、第５．３節に記載したｔ_onの決定と同様の方法で評価することができる。粒子を引き付けてトラップした後、粒子の分離を開始することができる。分離すべき粒子の初期分布をより小さくするため、口ーディング領域に別の電極配置を使用することもできる。例えば、分離開始前に電極５６および５５の間の全粒子を局在化させるため、電極５６を電極５５とは別により引き付けが強い電位にすることもできる。５．１．２．II 型器具図７は分離器具の好ましい態様であるII型器具の代表的な態様の分解図である。器具１０は上部基体１１および底部基体１２を含んでいる。Ｉ型器具と同様の電極パターンおよび接続する電極パッドが底部基体１２の平板状の上面に配置されている。あるいは、電極をチャンネル壁が製造された後の非平面部または上部基体１１の下面に設置することができる。２つの型の器具のただ１つの差異は、II型器具においては２つの基体の一方に分離方向Ｓに沿って実質的にまっすぐなチャンネル壁を製造することによって、分離レーンが形成されることである。図７は、底部基体の上部表面で、あらかじめ製造しておいた電極パターンの上に製造された、分離レーン１５を形成するチャンネル壁４１および４２を示している。Ｉ型器具と同様に、分離レーンは電極に露出している。この電極は好ましくは実質的に分離方向Ｓに直交するか、あまり好ましくはないが、４８°未満の傾斜角を有している。分離レーンの形状はＩ型器具のレーン寸法と同様の実質的な矩形である。チャンネル壁が上部および底部基体によって密閉された分離レーンを形成するように、上部および底部基体を接合する。電圧源１７と電気接続するためパッドを露出させるように、上部基体に底部基体に対する食い違い部を持たせる。図８は、分離方向Ｓに直交する、図７の軸８−８に沿った器具１０の断面図を示している。上部基体１１および底部基体１２は３つのチャンネルの境界となっている。チャンネル１５は基体の１つの表面に製造された壁４１および４２によって境界が作られている。代表的な電極２０はチャンネルの底部に沿って伸びている。５．２．方法の実施概要第５．１節で説明したデバイス中に組み込まれる本発明の方法を図９Ａ〜Ｅに示す。これらの図は、２つのタイプの荷電粒子の分離、すなわち、９１としてより大きいロッドによって示されたより大きい粒子タイプと、９２としてより小さいロッドによって示されたより小さい粒子タイプとの分離を示している。電位は、曲線９０で示されている。図９Ａ、９Ｃ、および９Ｅでは時間ｔ_onに対して鋸歯形を仮定し、図９Ｂおよび９Ｄでは時間ｔ_offに対して平坦形を仮定する。これらの粒子が種々のサイズの一本鎖ＤＮＡ分子である場合、実際には、分子は球の形状をとる可能性が高くなる。図９Ａは分離の開始を示しており、この時点では、すべての粒子が最も左側のポテンシャルウェルにトラップされている。図９Ｂでは、ｔ_offに対する電位が平坦形であり、このときは粒子が分離チャンネルに沿って両方向に均等に拡散する。拡散は９３として略図で示されている。図９Ｃでは、再び電位が鋸歯形であると仮定され、右にドリフトして少なくとも距離Ｒだけ次のポテンシャルウェルの方向に進んだ粒子は、中間のウェルに誘引されてトラップされる。しかしながら、拡散距離がＲ未満である粒子は、最も左側のもとのポテンシャルウェルに誘引されてトラップされる。より大きい拡散定数を有するより小さい粒子は、より小さい拡散定数を有するより大きい粒子よりも遠くまで拡散する可能性が高く、中間のポテンシャルウェルに達するのは、小さい粒では２つであるが大きい粒子では１つである。図９Ｄでは、再び電位が平坦形であり、９３および９４の両方のポテンシャルウェルから両方向に均等に拡散する。最後に、図９Ｅでは、再び電位が鋸歯形であると仮定され、小さい粒子のうちの１つは中間のポテンシャルウェルから十分に遠くまで拡散して最も右側のウェルに誘引されてトラップされ、２つの小さい粒子は中間のポテンシャルウェルの中に存在する。一方、大きい粒子は十分に遠くまで拡散しないために最も右側のウェルには存在せず、中間のウェルに大きい粒子が１つだけ存在する。従って、より大きい拡散定数を有する粒子はデバイスを介して右側まで選択的に移送されることが分かる。粒子の前進運動の差異は粒子の拡散に基づくものである。ポテンシャルウェルが空間的に定在状態にあって、印加時は最小電位に粒子を誘引する働きのみを呈する。電位が印加されていないときの有意な拡散に対して距離Ｒが著しく大きい場合、粒子はデバイス中で定常状態を保つ。特に、ＤＮＡの拡散定数Ｄが分子の寸法に依存することが期待されるため、従って、一本鎖または二本鎖の断片中の塩基の数Ｎに依存することが期待されるため、この方法によってＤＮＡ分子を分離することができる(Doi et al.，1986，T he Theory of Polymer Dynamics，Clarendon Press，Oxford，p．300)。ｄｓＤＮＡの実測値およびｓｓＤＮＡに対する理論予測値は、水溶液に対する値として次のように与えられる：例えば、Weast，ed.，1987，Handbook of Chemistry and Physics，Chemical Ru bber Publishing Co.，Boca Raton，FLおよび第５．４節を参照のこと。次に、デバイスに対する作動条件についていくつか述べる。電位の分離速度は電位の偏心率に依存し、偏心率が大きくなるほど分離は速くなる。偏心率とは、ポテンシャルウェルに対する電位の最小の位置を意味し、電位の最小が最近接最大に近づくほど電位の偏心率は大きくなる。例えば、同一周期Ｌを有する一連の鋸歯形電位では、最も小さいＲ／Ｌ比を有する電位のときに最も速く作動する。もちろん、Ｒは、特定の製造技術で得られる構造体サイズＲ’よりも実質的に小さくすることはできないし、得られる電位の傾きが分離媒体の破壊電界を超えるほど小さくすることもできない。また、ポテンシャルウェルが少なくとも数百個の独立移動粒子をトラップできるように、Ｌを十分に大きくすることが好ましい。好ましくは、ｔ_onがｔ_offと比べて適切な範囲内でできるかぎり小さくなるように、電極パッドを横切って印加される電圧Ｖを十分に大きくすることが必要である。しかしながら、電極において実質的な電解が起こるか、分離媒体の破壊電界を超えるか、または分離媒体の抵抗加熱により分離の分解能が妨げられるほど大きくしてはならない。第５．３節には、実質的に横方向の電極を備えた狭いチャンネル中における分離方法のモデルに基づくＲ、Ｌ、Ｒ／Ｌ、ｔ_on、ｔ_off、およびＶの選択方法が提示されている。このモデルにより、実際のデバイスに対する作動パラメータを所定の範囲内で正確に予測しなければならない。必要な場合には、通常の実験による最適化処理によって正確な作動パラメータを決定することもできる。例えば、ＤＮＡ分子を分離する場合、既知の長さを有する断片のはしご型構造体を含んでなるＤＮＡ標準を用いてデバイスを作動させることにより、予測される作動パラメータを最適化することができる。本発明の方法は、あらゆるサイズの荷電粒子に適用できる。分離対象となる荷電粒子は、あらゆるサイズの個々の分子から任意の数および種類の分子の複合体や巨視的な大きさの粒子までに及ぶ。５．３．方法の実施の詳細序この節では、本発明の方法の実施について詳細に説明する。この説明では以下の変数を使用する：Ｌ電位の空間周期。Ｒ電位の最小から最近接最大までの距離。（ＲがＬ／２よりもどの程度小さいかは電位の各周期の偏心率の測度である）Ｐ電位の時間的周期（Ｐ＝ｔ_on＋ｔ_off）。ｆ電位の時間的周波数（ｆ＝１／Ｐ）。ｔ_on 電位が印加されている時間。この間に粒子はポテンシャルウェルに誘引されてトラップされる。ｔ_off 電位が印加されていない時間。この間は粒子が自由に拡散できる。Ｑ荷電粒子の電荷。Ｖ_O 印加電位差。Ｔ温度。Ｄ分離対象となる１つのタイプの荷電粒子の拡散定数。Ｄ＋ΔＤ分離対象となるもう１つのタイプの荷電粒子の拡散定数（ΔＤは拡散定数の差を意味する）。Ｎ_eyc 完全分離処理に対する電位の時間的サイクルの数。Ｔ_tot 完全分離処理の合計時間（Ｔ_tot＝Ｐ＊Ｎ_cycおよびＮ_cyc＝ｆ＊Ｔ_tot）。Ｖ_drift 電位中での荷電粒子のドリフト速度。Ｌ_tot 分離レーンの全長。第１に、本発明の方法およびデバイスに対する好ましい実施態様を提示する。第２に、作動パラメータおよびデバイスパラメータを最も適切に選択する方法を提示する。第３に、本発明の範囲内の模範的な他の作動モードについて説明する。５．３．１．本発明の実施態様この節には、本発明の方法の空間的および時間的変動電位、作動方法のパラメータに対する判定基準、ならびにこれらの判定基準から見て好ましい本発明のモデル、についての説明が含まれる。最初にΔＤ＜＜Ｄと仮定し、続いてΔＤ≧Ｄの場合を説明する。電位図１０は、本発明で使用可能な電位Ｖ（ｘ）を分離軸に沿った距離ｘの関数として一般的に略図で示している。この電位は、空間周期Ｌで空間的に反復される。このほかに空間周期をもたない電位を本発明で使用することもできる。電位の各周期に偏心性をもたせ、分離レーンに沿った１つの方向に隣接した最大に電位の最小がより近接するようにしなければならない。この方向は粒子の分離方向Ｓである。最小と最近接最大との間隔はＲで表され、Ｒ＜Ｌ／２である。例えば、最小１００３は隣接の最大１００２からＬ／２未満の距離Ｒだけ離れているが、隣接の最大１００１からはＬ／２を超える距離Ｌ−Ｒだけ離れている。すべての最小は、Ｓの方向に隣接した最大により近接している。この電位は、デバイスタイプＩおよびIIの電極パターンの近傍で発生する電位にほぼ等しい。Ｖ_O＞０の場合、図１１Ａ〜Ｄの電位は正に帯電した粒子をＳの方向に分離する。この場合、負に帯電した粒子はデバイスを介して反対方向に移送されるが、必ずしも分離する必要はない。負に帯電した粒子をＳの方向に分離するためには、電位の極性を反転しなければならない。すなわち、Ｖ_O＜０としなければならない。後者の場合、正に帯電した粒子はデバイスを介して反対方向に移送されるが、必ずしも分離する必要はない。有利なことに、デバイスの一方の端のローディングゾーンに粒子をローディングし、最初に一方の極性でデバイスを作動させ、次に逆の極性で作動させることにより、両方の荷電粒子を連続的に分離することができる。しかしながら、ＤＮＡの分離に特異的な好ましい実施態様では、すべての粒子が負の電荷を有すると考えられる。本発明を実施するにうえで、電位の精密な空間配置Ｖ（ｘ）は重要でない。重要なことは、電位が、分離の軸に沿って交互に出現する電位の最大と電位の最小とをもつことである。ウェルは、ほぼ距離Ｌだけ離間させる。次に、分離の方向と反対の方向に隣接した最大よりも分離の方向に隣接した最大に各最小がより近接するように、すべての最大およびすべての最小を偏心的に配置しなければならない。最小と最近接最大との距離はほぼＲである。距離ＬおよびＲは、こうした電位の領域を特徴付けるように便宜的に決められる。本発明の方法は、この制約条件を満足する任意の電位に適用可能であり、ウェルに誘引される電荷の分離方向に粒子を分離する。電位が周期的な類似のポテンシャルウェルをもつことが好ましく、以下の説明ではすべて、空間的周期性を仮定する。しかしながら、空間的周期性が本発明に必要というわけではない。最大の分離効率を得るために、すなわち、最小の分離時間とするために、移動軸を横切る方向に電位が均一であることが好ましい。しかし、電場ベクトルが分離の軸に垂直な成分をもつ場合、言い換えると、分離の方向に沿った変位に垂直な成分をもつ場合、本発明の方法およびデバイスの使用効率は低下する。本発明の実施効率は近似的にcos(θ)である。ただし、θは分離方向に沿った変位に対する電場ベクトルの角度である。従って、電場と分離方向との間のほぼすべての相対方向に対して本発明は機能することが分かる。しかしながら、すべての電場ベクトルが分離の軸に実質的に沿っていることが好ましい。この場合、実質的に沿っているとは、θが約４５〜５０°未満であること、すなわち、cos(θ)が約０．５より大きいことを意味する。更に、本発明の特定の実施態様において、電位の横方向の不均一性の影響を最小限に抑えるように作動パラメータを調節することが可能である。例えば、電位が分離レーンに隣接した電極により発生され、かつ、電位が、例えば、デバイスタイプＩおよびIIにおいて、時間ｔ_offに対する実質的にオフ状態から時間ｔ_on に対する実質的にオン状態へ変化する実施態様では、好ましい分離レーン幅と比較したときの電極サイズおよび間隔が原因で移動軸の横方向に不均一になる可能性がある。電位は電極から離れるにつれて減衰するため、ポテンシャルウェルは電極に最も近いところで最も深くなる。最小の電極間隔よりもレーン幅が大きい場合および電極がチャンネルを完全に包囲しない場合、電極から最も遠いレーンの側面でポテンシャルウェルが弱くなる可能性がある。しかしながら、このことは本発明では問題にはならない。なぜなら、第１に、荷電粒子を電極に誘引してトラップするようにｔ_onは最適に選択され、更に、粒子が最長でも電極間隔にほぼ等しい距離を拡散するようにｔ_offは最適に選択されるからである。従って、分離される粒子は、デバイスの最適作動中、比較的深いポテンシャルウェルの領域に滞留するため、電極の上の電位の不均一さは実質的に無視できる。また、分離レーン壁の近傍の電位が乱れる可能性もある。この場合にも、荷電粒子はポテンシャルウェルの比較的深い場所に滞留するため、不均一さは実質的に無視できる。電位はまた時間的にも変化する。この場合に必要なことは、粒子が空間的ポテンシャルウェルに誘引されてトラップされる第１の強さから、最近接ポテンシャルウェルへの拡散の確率がゼロではないが粒子が比較的自由に両方向に拡散する第２の強さまで、電位を変化させることだけである。この確率は０．１％以下の極めて小さい値かまたはほぼ１００％の極めて大きい値であってよい。可能なかぎり迅速な分離が行えるように最適化を行うことが好ましい。便宜的な都合だけのために、以下の説明では、時間的変化は周期的で、周期Ｐおよび周波数ｆを有し、オン状態とオフ状態との間で変化するものと仮定するが、これに限定されるものではない。時間ｔ_onに対しては電位±Ｖ_O／２を印加し、時間ｔ_offでは電位を印加しない。従って、時間Ｔの作動の各サイクル中、電位は時間ｔ_onではオン状態、時間ｔ_offではオフ状態である。ただし、ｔ_on＋ｔ_off＝Ｔおよびｆ＝１／Ｔである。本発明の方法は時間的に周期的な２つの状態の電位を用いてをモデル化されるが、他の変化を有する電位を本発明に使用することもできる。第１に、時間的変化が周期的である必要はない。例えば、分離が進むにつれて、時間的周期を体系的に変化させてもよい。第２に、サイクル中に他の状態が含まれていてもよい。例えば、パラメータＲがより小さい値になるように、各サイクルの開始時にウェルの底に粒子をより強く集中させるための状態が含まれていてもよい。電位を時間と共に連続的に変化させてもよい。方法パラメータの好ましい制約条件電位がオン状態の場合、ポテンシャルウェルは、分離される荷電粒子を熱じょう乱に対抗して誘引してトラップすべく十分に深くなければならない。この条件は、Ｖ_Oが十分に大きく以下の不等式が成立する場合に満足される。（ｋ_bはボルツマン定数である）電位がオフ状態の場合、１つのウェルの中の拡散定数Ｄの粒子は、次のポテンシャルウェルに向かって分離の方向に距離Ｒだけ拡散する確率α_Dをもたなければならない。この確率は、有利には、できるかぎり迅速に分離が行われるようにｔ_offを最適化することによって決められる。本発明のための好ましいモデルにおいて、この条件は、次式：によって与えられるＲとｔ_offとの関係として表される。ただし、「erfc」は補充誤差関数である。更に、電位がオフ状態の場合、拡散定数Ｄの粒子は、前のポテンシャルウェルに向かって距離Ｌ−Ｒだけ拡散して戻る確率をもつはずであるが、この確率は好ましくはα_D／１００未満である。本発明のための好ましいモデルにおいて、こうした結果は、ＲとＬとα_Dとが次の条件を満足するときに得られる。粒子が距離Ｌ＋Ｒだけ拡散して次の最近接ウェルより先にあるポテンシャルウェルまで達する確率は、距離Ｌ−Ｒだけ拡散して戻る確率よりも必然的に小さい。これらの条件は容易に満足される。例えば、α_D＝０．０５およびＲ／Ｌ＝０．１の場合、逆方向に拡散する確率は極端に小さい約１０^-50であり、１つのポテンシャルウェルを越えて拡散する確率は更に小さい。好ましいモデル本発明の方法のための作動パラメータおよび本発明のデバイスのための設計パラメータを選択するうえで、様々なモデルを構成することが可能である。例えば、実際に使用される電極により発生される電位の正確な空間的および時間的構造、ならびにこのような電位に暴露される分離媒体中の荷電粒子の正確な動きは、電磁気および粒子運動の既知の微分方程式を解くことによって決定することが可能である。これらの方程式は標準的な方法により数値的に解くことができる(Pre ss et al.，1992,Numerical Recipes in C，2nd ed.，Cambridge Univ．Press， New York(数値解法の解説書))。この代わりに、適切な結果を与える近似モデルを構築したり、実際のデバイスを用いた実験に基づいてパラメータを最適化することも好ましい。この好ましい方法によれば、正確なモデルを用いた場合よりも短時間にかつ低コストで、作動パラメータおよび設計パラメータに対する適切な精度が得られる。好ましい近似モデルでは、本発明の方法およびデバイスを、ドリフトを有するランダムウォークとして記述する。例えば、Wax，ed，1954,Selected Papers on Noise and Stochastic Processes ，Dover Publishers，New Yorkを参照のこと。ランダムウォーク成分は、電位がオフ状態のときの粒子の拡散によって生じ、ドリフト成分は、電位がオン状態のときに電位の最小に粒子がトラップされることによって生じる。本明細書中では、距離ＬおよびＲにより特徴付けられる好ましいほぼ鋸歯形の電位、ならびにローディングゾーン中の１つのポテンシャルウェルに初期にトラップされた粒子、を参照しながら好ましいモデルについて説明する。この場合、電位の各サイクル中の分離の方向へのドリフトはα_DＬである。ただし、α_Dは、拡散定数Ｄの粒子が距離Ｒだけ拡散して最近接ウェル中へ入る確率である。好ましいパラメータ制約条件下では、粒子が後退または前進して１つのポテンシャルウェルを越えて拡散する確率は無視できる。電位サイクルごとの粒子位置の平方偏差は、（α_D−α² _D）Ｌ²に従って増加する。中心極限定理によりば、多くのポテンシャルウェルにわたり観測される粒子の濃度プロフィルはガウス分布になる。例えば、Wax，ed，1954,Selected Papers on Noise and S tochastic Processes ，Dover Publishers，New Yorkを参照のこと。従って、時間ｔを経た後すなわちｔｆサイクル後の粒子濃度のガウス分布は＜ｘ_D（ｔ）＞と呼ばれるピークを有し、このピークは次式：で与えられる。粒子濃度のガウス分布の半値幅はδｘ_D（ｔ）と呼ばれ、次式：で与えられる。これらの式により、いくつかのポテンシャルウェルを横切る粒子濃度の特徴付けがなされる。電位がオフ状態のときは粒子が自由に拡散するため、α_Dは、時間ｔ_offの間に右方向に少なくとも距離Ｒだけ拡散する粒子の部分として計算することができる。標準的な拡散の理論によれば、これは次式：で与えられる。例えば、Wax，ed，1954,Selected Papers on Noise and Stochas tic Processes ，Dover Publishers，New Yorkを参照のこと。この式において、補充誤差関数は、次式：で定義される。erfc(x)に対する多項式近似については、Abramowitz et al.，19 72,Handbook of Mathematical Functions，Dover Publishers，New Yorkに記載がある。α_Dに対する式７では、各ポテンシャルウェル中の粒子の初期分布は非常に幅が狭いと仮定する。実際には、電位が有限な幅をもつときに各ウェルの底にトラップされる粒子の初期密度分布の幅は、電極の幅程度である。しかしながら、この差はα_Dの数値的記述に影響を与えるにすぎない。これは特に式５および６のモデルに影響を及ぼすことはない。なぜなら、これらの場合はいずれも、 α_Dが拡散性Ｄに関数的にどのように依存するかが分かっている必要があるからである。このモデルは、異なる拡散性の粒子種が本発明によってどうように分離されるかを示す。第１に、式５および７は、より大きな拡散性をもつ種がより小さな拡散性をもつ種よりも速く分離の方向に移送されることを示している。式５はまた、異なる拡散性の種の分離が時間ｔと共にまたは同じようにサイクル数Ｎ_cycと共に直線的に進行することを示している。第２に、式６は、それぞれの種の濃度プロフィルの幅がｔ^1/2と共に増大することを示している。十分な数の電位のサイクルの後では、それぞれの種に対する濃度プロフィルの分離は任意の種の濃度プロフィルの幅よりも速く進行するため、異なる拡散性の種に関連した濃度ピークは観測できる程度に空間的に分離される。更に、式７は、分離に必要な時間がデバイスの構造体サイズにどのように依存するかを示している。種の濃度プロフィルの形状および種の分離の速度は、確率パラメータα_Dによって完全に決まる。このパラメータはまた、補充誤差関数の変数だけに依存するため、構造体サイズＲの変化は、時間ｔ_offの変化によりバランスをとることができ、この変数は不変のままに保たれる。Ｒは直線的に関与し、ｔ_offは平方根の形で関与するため、構造体サイズＲが１／２に減少すると分離に必要な時間は１／４に減少する。デバイスの全体の長さはＲと共に直線的に増大する（一定のＲ／Ｌにおいて）。従って、十分に小さいデバイス長では、分離はより迅速に行われる。この場合、微細加工技術の進歩を利用して構造体サイズを減少させれば、デバイスの性能を直接向上させることができる。デバイスは、先に述べた最小、すなわち、分離される粒子のサイズよりも桁数の大きい値、を越える大きさでなければならない。図１１Ａ〜Ｄおよび図１２Ａ〜Ｅは、このモデルに従った本発明の実施状態を示している。図１１Ａ〜Ｄは、１１０１および１１０２として略図で示されている２つの隣接したポテンシャルウェル中における異なる拡散性の２種の粒子ＡおよびＢの詳細な濃度プロフィルを示している。ただし、種Ｂは種Ａよりも大きい拡散性を有する。Ｒとしても表記されている位置１１０８は、最小１１０１に隣接した最近接電位最大である。図１１Ａにおいて、電位１１０７はオン状態にあり、粒子は初期ポテンシャルウェル１１０１に誘引され、式２による熱拡散に対抗して強くトラップされている。種Ａおよび種Ｂの濃度プロフィル１１０３および１１０４は、各ウェル中でほぼガウス型である。図１１Ｂにおいて、電位はオフ状態に切り換えられ、分子は、分離媒体中を分子の拡散性に従った速度で両方向に拡散する。このときには、種ＡおよびＢは、より幅の広いガウス型の濃度プロフィル１１０３および１１０４を有する。ただし、種Ｂの方が拡散性が大きいので、種Ｂのプロフィル１１０４の方が幅が広い。プロフィル１１０３の種Ａの一部分およびプロフィル１１０４の種Ｂのより多くの部分は、隣接した最大１１０８を越えて拡散する。図１１Ｃにおいて、電位は再びオン状態に切り換えられ、粒子は再びウェル１１０１および１１０２に誘引されて強くトラップされる。しかしながら、このときには、最大１１０８を越えて拡散する粒子はウェル１１０２にトラップされ、種Ａおよび種Ｂは濃度プロフィル１１０５および１１０６を示す。これらの粒子はウェルを１つ越えて前方にドリフトする。図１１Ｄにおいて、電位は再びオフ状態に切り換えられ、両方の種が両方のウェルから外側に向けて拡散する。電位の対称性に基づいて、分子の濃度プロフィルは、より大きい拡散性の種がより速く移送されるように選択的に右方向に移動した。図１２Ａ〜Ｅは、多くのポテンシャルウェルを含むスケールでの本発明のモデルの実施状態を示している。これらの図は、ドリフトモデルを用いたランダムウォークに基づいく正確な計算から作成したものである。水平軸は分離の方向に沿っており、３０個のポテンシャルウェルを含む。垂直軸は、分離される２つの荷電粒子種ＡおよびＢの濃度を表している。拡散性の低い方の種Ａはバー１２０１で表され、拡散性の高い方の種Ｂはバー１２０２で表されている。時間ｔ_onおよびｔ_offは、記載の方法に従って最適に選択される。図１２Ａは、両方の種が第１のポテンシャルウェルにのみトラップされている初期状態を示している。図１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、および１２Ｅは、それぞれ２５サイクル後、５０サイクル後、７５サイクル後、および１００サイクル後の両方の種の濃度プロフィルを示している。これらのプロフィルは、中央極限定理に従って、サイクル数が増大すると多くのポテンシャルウェルにわたりガウス分布するようになる。図１２Ｂ〜Ｅより、種Ｂが種Ａよりも速く右方向に移送され、かつ両方の濃度プロフィルが時間と共に広がりを呈することは明らかである。また、濃度ピークが濃度プロフィルの広がりよりも速く分かれて移動するために種が分離されることは明らかである。５．３．２．最適パラメータの選択方法の作動パラメータおよびデバイスの設計パラメータの最適な選択は、粒子の分離特性のうちのどれを最適化するかに依存する。この節では、好ましいモデルによる分離時間を最小化するための方法について説明する。デバイス、電位、および粒子移送に関するより多くの詳細な構造を組み込んだより現実的なデバイスモデルに対しても同じ方法が適用できることは明らかであろう。このほか、好ましいモデルおよびより複雑なモデルによる類似の方法を用いて、当業者は、例えば分離の空間的距離など、他の分離特性を最適化することもできる。好ましい作動パラメータは、電位のサイクル時間ｔ_on＋ｔ_offによって決まる全分離時間を最小化するように選択される。この節では、第１に、ｔ_onおよび関連パラメータの最適化、第２に、ｔ_offおよび関連パラメータの最適化について説明する。これらの方法により選択されたパラメータは、必然的に近似的なものである。実際のデバイスを用いた通常の実験により決定された本明細書中に記載のパラメータから、より正確な最適パラメータを決定することができる。更に、任意の方法により決定された正確な最適パラメータを用いて実際のデバイスを作動させる必要はない。例えば、利用可能な装置の特性、作動パラメータの設定の誤差などを考慮に入れて、正確な最適値から僅かにまたはかなりずれたパラメータを用いて実際のデバイスを作動させることができることは、当業者には分かるであろう。最適状態を得るために、決定されたパラメータに近いところでデバイスを作動させることが好ましいというだけである。本明細書中に記載の方法は、Ｃ、Basic、Fortranなどの適切なコンピュータ言語への通常の変換を行うことにより、コンピュータプログラムとして実行することができる。このコンピュータプログラムにより汎用コンピュータシステムに指令を与え、記載のパラメータ選択方法を実行することができる。このようなコンピュータシステムとしては、例えばＩＢＭＰＣまたはそれと同等なＰＣが挙げられる。ｔ_on及び関連パラメータの好ましい最適化ｔ_onができるかぎり小さくなるように操作及び装置のパラメータを選択することが好ましい。ここで、まず第１に、ｔ_onと関連パラメータの関係を示す関係式が好ましいモデルに従って決定され、第２に、これらのパラメータについての最適な値を決定するためにこれらの関係式が用いられる。時間ｔ_onは、荷電粒子が、ポテンシャルの影響下で分離方向に、そのポテンシャルにおける最大値からそれに続く最小値まで、つまり距離Ｌ−Ｒだけドリフトするための時間である。例えば、図１０において、ｔ_onは、粒子が１００１から１００３までドリフトする時間である。この時間は、次の式から得られる。なお式中、Ｖ_driftは、そのポテンシャルにおける粒子のドリフト速度である。分離媒質中の粒子の運動は過剰減衰されることから、Ｖ_driftは、電位に由来する力に摩擦係数を乗じたものに正比例し、以下の式から求められる：ここで、ポテンシャルは偏心的でなくてはならないためＲ＜Ｌ/２である点に留意されたい。ドリフトの適切な領域における電界Ｅは、−Ｖ_O/（Ｌ−Ｒ）である。摩擦係数γは、変動−散逸の定理により拡散定数に次のように関係づけされる。例えば、Wax,ed,１５９５４，Selected Papers on Noise and Stochastic Pro cesses 雑音及び確率過程に関する選択論文集、Dover Publishers，New Yorkを参照のこと。これらの式を組合わせて、ｔ_onは、以下の式から求められる：従って、式１２により、Ｌ−Ｒがわかっているため、最小値ひいては最も好ましいｔ_onを計算することができる。さらに、Ｖ_Oは、使用される分離媒質の破壊電界及び電解しきい値よりも低い残留電界と一貫性のある、できるかぎり大きいものとなるように選択されるべきである。最大電界Ｅ_maxは、ポテンシャルのより急な側に沿って発生し、次の式から求められる。最適には装置をできるかぎり限界電界近くで作動させるべきである。この場合、ｔ_onは、次の式から求められる。例えば、水の場合、限界破壊電界は約１０⁴Ｖ/ｃｍである（Avallone et al.e ds.，１９８７，Mark's Standard Handbook for Mechanical Engineers（機械技師のためのMarks標準ハンドブック）、マグローヒル、ニューヨークｐ１５〜１９）。従って、Ｅ_max＝１０⁴Ｖ/ｃｍでＲ＝１μｍである場合、最大Ｖ_Oは１Ｖである。ｔ_off及び関連パラメータの好ましい最適化ｔ_off及び関連パラメータを最適に選択するためには、拡散率Ｄ＋ΔＤのタイプから拡散率Ｄの粒子タイプを首尾よく分離するということが何を意味するかを規定する必要がある。本節では、ΔＤがＤよりもはるかに小さいと仮定されている。好ましい１つの分離仕様は、装置からの２つのタイプの粒子の濃度ピークの退出時間の差異が少なくとも濃度ピークの広がりと同じ位大きい時点で分離が発生するというものである。この場合、２つのタイプの粒子の濃度プロフィールを経験により区別することが可能である。あるいは別の表現では、２つのタイプの粒子の濃度ピークの位置差が少なくとも２つのピークのガウスの広がりと同じ位大きい時間又はサイクル数において分離が発生するということである。例えば図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃで、２つの濃度ピークは、この好ましい仕様に従うと、分離されているとはみなされない。しかしながら、図１２Ｄ及び１２Ｅでは、ピークは分離されているとみなされる。操作パラメータを選択するには、多少厳しさが増減した代替的な分離仕様を利用することも可能である。厳しさがより少ない条件であれば、例えば図１２Ｃを、同じく分離されたものとみなす可能性がある。この好ましい分離仕様に従うと、分離は、以下の式から得られる時間ｔ_Dにおいて発生する：ここで、拡散率Ｄの粒子が装置を横断するのに必要とされる時間である時間ｔ_D を経過した後に、装置から退出した時点で、２つのタイプの粒子の濃度プロフィールは分離される。式５及び６から、分離条件を次のように表わすことができる：なお式中、α_Dは、拡散率Ｄの粒子がｔ_offの間に次のポテンシャルウェルまで拡散する確率である。α_Dは、ここで便宜上繰返し示す式７によって求められる。式１６より、拡散率Ｄの粒子を拡散率Ｄ＋ΔＤの粒子から分離するのに必要とされるサイクル数Ｎ_cyc(＝ｔ_Nf)は、次の式から得られる：差α_D−α_D＋Δ_Dは、充分に小さなΔＤについては−ΔＤδα_D/δＤとして近似することができる。合計分離時間は、以下の通りである：好ましい最適なパラメータは、Ｔ_totを最小にするように選択される。操作及び装置パラメータは、予めｔ_onを最小にするように選択されている。Ｔ_totは、式１９を通して直接ｔ_offに左右されると同時に、次にｔ_offに影響されるα_DにＮ_cycが依存していることから、間接的にもｔ_offによって左右される。ｔ_offの最適な値を選択するためには、これらの式全てが一緒に最小にされなくてはならない。この最小化は、標準的な数値的方法、例えば最小値が見い出されるまでｔ_off についてのさまざまな値を系統的に試すことによって最も容易に行なわれる。例えばPress et al.，１９９２、Numerical Recipes in C（Ｃの数値的配合表）、第２版，Cambridge Univ．Press，New Yorkを参照のこと。最適なｔ_offの選択例は、ＤＮＡ断片分離の場合について第５.４節に記されている。最適なｔ_off及びＮ_cyc値がひとたび選択された時点で、分離のために必要とされる合計装置長は、次の式から得られる：選択される好ましい最適な数量は、ポテンシャルの空間特性によって左右される。Ｌ及びＲの好ましい最適化ｔ_on及びｔ_offの前述の最適化では、Ｒ及びＬが固定されていると仮定している。これらの長さを変動させることができる場合、これらは、以前の最適な時間パラメータの決定を考慮して選択すべきである。まず第１に式１４を考慮して、Ｌはできるかぎり小さく選択すべきである。第２に、式１７を考慮して、Ｒの２分の１削減はｔ_offにおける４分の１の減少を可能にすることから、Ｒはできるかぎり小さく選択すべきである。第３に、ポテンシャルウェルの充分な偏心率を得るには、Ｒ/Ｌ＜０.３であることが好ましい。そして第４に、Ｒ及びＬは少なくとも、選択された製造技術が許容する最小寸法と同じ位大きいものに制限される。これらのＲについての矛盾する要求は、固定されたＥ_max（Ｖ_oは変動している）をもつ選択された分離媒質について最適なＲが存在することを意味している。最適化のための好ましい方法において、分離時間Ｔ_totは、結果として得られる装置のサイズが、選択された製造技術により製造可能であるという制約条件の下で、Ｌ及びＲの関数として最小化される。１つの付加的な制約条件としては、Ｌ及びＲの各々の値について、電界が破壊電界Ｅ_maxよりも小さくなるように、適用されるポテンシャルＶ_oを選択することが最適であるというものがある。このＶ_oの値のため、時間ｔ_on及びｔ_offは、前述したとおり、一定の与えられたＬ及びＲについて最適なＴ_totに到達するよう最適な方法で選択される。コンピュータ技術の当業者にとっては周知のものである多次元最小化技術を用いて(Press et al.，１９９２，Numerical Recipes in C（Ｃの数値的配合表）第２版、Cam bridge Univ．Press，New York)、このときＬ及びＲの最適な対は、この最適化問題から容易にかつ好ましい形で決定される。もう１つの方法においては、最適なＲは、式１４、１７、１８及び１９の技術的に許容された範囲内での同時最小化によって決定され得る。これは、Press et alからの標準的な数値的技術により実行可能である。あるいは、この最適化は、以下の単純な検索手順により実行できる。最小許容範囲における初期Ｒを選び取り、前述の方法により最適値Ｔ_totを決定する。Ｒを幾分かの分画だけ、例えば５％だけ増加させ、最適なＴ_totの決定をくり返す。Ｔ_totの全ての決定について、選択された一定の与えられた分離媒質の中で適用可能なＶ_oの最大値を選択する。Ｒについての低い方の範囲又はＲの中間値のいずれかで、Ｔ_totの最小値が発見されるまで、この反復を続ける。Ｒの好ましい値は、Ｔ_totを最小にするものである。Ｒを選択した時点で、好ましくはポテンシャルウェルの充分な偏心率を提供する固定値をＲ/Ｌが有するように、Ｌを決定することができる。好ましくはＲ/Ｌは０.３未満であり、より好ましくは約０.１である。以下のサンプル計算全てについて、特にことわりのない限り、最適値はＲ＝１ μｍ及びＬ＝１０μｍであると仮定されている。この周期性をもつポテンシャルが、第５.５節に記述されているもののように、共通のマイクロ製造技術によって容易に生成される。最後に、分離媒質は、分離すべき粒子が媒質内において荷電された状態で懸濁させられ、懸濁状態で異なる拡散率をもつように選択されるべきである。拡散率の差が大きくなればなるほど、媒質は好ましいものとなる。さらに、分離媒質が、その他の適当な媒質に比べ比較的高いＥ_max及び比較的高い電解電圧をもつようその他の点では適当な媒質の中から選択されることが好ましい。ここでは、比較的高いという語は、その他の点では適当な媒質について少なくとも平均値超を意味するものと考えることができる。これらの条件は、最小値ｔ_onを許容する。最後に、分離媒質がポテンシャルウェルの遮蔽を最低限にするため低いイオン強度をもつことが好ましい。５.３.３．拡散率が大幅に変動する場合以上の節では、分離すべき粒子が類似した拡散率をもつ場合についての、好ましいモデル及びそのモデルを考慮した好ましい操作及び装置パラメータの決定について記述してきた。本発明はまた、拡散率が大幅に変動する粒子を含有する混合物にも適用可能である。このような混合物を分離するための１つの操作形態は、ｔ_on及びｔ_offがより高い拡散率の粒子を分離するために最適な短かい時間にある状態で開始することにある。これらの時間では、拡散率がより高い粒子が急速に分離される。しかしながら、拡散率のより低い粒子は、はるかに小さいα_D値をもち、ほぼ静止状態にとどまる。より拡散率の高い粒子が分離された後、時間ｔ_on及びｔ_offは、拡散率のより低い粒子の分離のために最適なより大きな値まで増大させられる。このとき、拡散率のより低い粒子はその後急速に分離される。このような混合物を分離するためのもう１つの操作様式は、拡散率のより低い粒子に適切なより長いｔ_on及びｔ_off時間を用いるものである。このようなより長い時間では、拡散率のより高い粒子はより大きなα_D値を有し、複数のポテンシャルウェルを順方向ならびに逆方向に拡散させる能力をもち得る。前述のモデルでは、分離すべき粒子が移動しなかったか又は、せいぜい１つのポテンシャルウェルをｔ_off中に順方向に拡散したかのいずれかであると仮定されたい。しかしながら、分離すべき粒子のいくつかが、ｔ_off中に複数のポテンシャルウェルを拡散させる場合にっいては、ドリフトを伴うランダムウォークに基づく類似のモデルを構築することができる。このようなモデルを構築するためには、拡散率Ｄの粒子が、自由拡散のため時間ｔ_off中にｎ個のポテンシャルウェルを拡散させる確率として、α_D ⁽ⁿ⁾を定義づける。式７に類似の仕方で標準的拡散理論に従うと、これらのαは以下の式から得られる。拡散率Ｄがｔ_offに比べ比較的小さい場合、α_D ⁽¹⁾は急速に式７のα_Dの値に近づく。この場合、α_D ⁽¹⁾及びα_D ⁽⁰⁾（粒子が置かれた状態にとどまる確率）は、唯一の非ゼロα_D ⁽ⁿ⁾であり、このことは、粒子が置かれた状態にとどまるか又は順方向に単一のポテンシャルウェルの間隔だけ拡散するかのいずれかであることを意味する。ただし、拡散率が比較的大きい場合、ｎ＝−１、２などについての α_D ⁽ⁿ⁾は大きいものとなり得る。粒子がｔ_off中に複数のポテンシャルウェルを拡散できる場合において発明をモデリングするためには、パラメータα_Dを有効な確率の高い拡散距離として定義づけし直す。この定義では、ここでも〈Ｘ_D(t)〉と呼ばれるガウス様の粒子濃度プロフィールの最大値の平均的位置は、次の式により求められる：これは、粒子がせいぜい１つのポテンシャルウェルだけ拡散すると仮定された前述のモデルの式５と同じである。ここでもδＸ_D(t)と呼ばれる、合計時間ｔの後の拡散率Ｄの粒子のガウス様粒子濃度プロフィール内のばらつきは、その後から得られる単一サイクルについてのばらつき変化＜δＸ_D ²＞をｔｆである時間ｔ内の拡散サイクル数に乗じたものに等しい。ここでもまた、この場合ΔＤがＤ以上の大きさを表す拡散率Ｄ＋ΔＤの粒子からの拡散率Ｄの粒子の分離の発生を定義する好ましい条件は、濃度ピーク間の距離が濃度プロフィールの幅の半分以上の大きさでなくてはならないというものである。式２３及び２４から、分離のためのこの条件は、次の式より得られる。これらの式は、ΔＤ＜＜Ｄである前述の場合と同様、ΔＤがおよそＤ以上であるこの場合についても同じ結論を可能にする。前述の通り、式２１及び２３は、より大きい拡散率をもつ粒子がより小さな拡散率の粒子よりも急速に装置を通って移送されること、そして濃度ピーク間の距離が時間と共に線形的に増大することを立証している。式２５は、異なる拡散率のピークが分離されることを立証している。ここでもまた、濃度ピークの幅でＮ_cycの平方根として増大するにすぎないのに対し、濃度プロフィール間の距離がＮ_cycと共に線形的に増大することから、分離が発生する。さらに、式２１の挙動のため、分離時間は、ポテンシャルの空間スケールでの２分の１減少毎に４分の１に減少させられる。さらにｔ_onを最適化する操作パラメータを、前述の場合と類似した仕方で選択することができる。例えば、Ｎ_cycは、次の式により求められる：これは、式１８の形態に対応する。従って、Ｔ_totを最小にするｔ_offは、ｔ_of _f 中に粒子がせいぜい１つのポテンシャルウェルだけ拡散した前述のケースに類似した形で式１９、２１、２２及び２６の数値的最小化により得ることができる。このようにして、より拡散率の高い粒子がｔ_off中に複数のポテンシャルウェルを拡散させるように操作パラメータが選択される場合でさえも、該方法によって、拡散率が大幅に変動する粒子の混合物を分離することが可能である。このような混合物を分離するための１つの操作形態においては、サイクル時間ｔ_on及びｔ_offを、まず最初に拡散率のより高い粒子の急速な分離のために最適化させ、次に拡散率のより低い粒子の分離のために最適化されたより大きな値まで漸進的に増大させることができる。第２の操作形態においては、サイクル時間を最大断片を分離するように最適化させ、それでもなおより小さな断片のための適切な分離を提供することが可能である。５.３.４．代替的操作形態：多数の状態もう１つの操作形態は、２つの状態ではなく３つの状態を通してポテンシャルをサイクルさせることからなる。これら３つの状態は、以下の段階を含む：１．ポテンシャルをオンに切替える；２．オン条件の間に１回又は複数回ポテンシャルを短く反転させる；３．自由拡散を可能にする。オン条件の間にポテンシャルを１回又は複数回短かく反転させることは、ポテンシャルウェル又は電極にひきつけられた小くて移動度の高い対イオンにより形成されたイオン２重層からの静電遮蔽を低減させる上で有効であり得る。ポテンシャルの極性が反転させられるいくつかの高速パルスにｔ_onを散在させることによって、これらの対イオンを移動させ２重層を最小にすることができる。好ましくは、より大きい、移動度のより低い粒子の分布に対し実質的に全く影響のないものの移動度の高い、より小さい対イオンがポテンシャルウェルから外へ又は電極から逆方向に移動させられるように、反転周期は充分小さいものである。これは不等式ｔ_pulse＜＜ｔ_on，ｔ_offを満たすことで達成される。もう１つの３状態操作形態では、タイプＩ及びIIの装置内に存在する２組の電極の間の第３の電極により作り出すことができるような、各々のポテンシャルウェルの底を中心とする急で実質的に対称的なＶ字形ポテンシャルを伴う第３の状態が用いられる。本実施形態の電極は、Ｌという周期性で、相対的位置−Ｒ、Ｏ、及びＲに位置設定されている。時間ｔ_onだけ継続する第１の状態では、相対的位置Ｏにある電極はＶ_o/２に荷電され、相対的位置Ｒにある電極は−Ｖ_o/２に荷電される。時間ｔ_offだけ継続する第３の状態では、電極は電荷が全て除去され、粒子は自由に拡散する。これらの第１及び第３の状態は、前出の節で記述された操作形態の２つの状態と同一である。付加的な第３の中間状態においては、相対的位置−Ｒ及び＋Ｒにある電極は＋Ｖ_o/２に荷電され、相対的位置０にある中間電極は−Ｖ_o/２に荷電される。こうして、粒子を密に局在化する狭いＶ字形のポテンシャルウェルが作り出される。これは、いずれかの側に急な壁をもつポテンシャルウェルの底で粒子のためのより強くより狭いトラップを提供することができることから有用なことである。これは、各ポテンシャルサイクル中の各々のウェルの中に、ほとんどない位に薄い好ましい分布により近い密度分布を生成することになる。５.４．ＤＮＡ分離への応用本発明の重要な利用分野は、（生体高分子断片を含む）生体高分子、特にＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ）及びＲＮＡのような核酸を分離することにある。ＤＮＡの拡散率はほぼ全面的にＤＮＡ分子内のヌクレオチドの数に左右されることから、この分野における利用が可能になっている。さらに、実質的ではないが、合計塩基組成、すなわちｄｓＤＮＡについてはＡ＋Ｔ対Ｇ＋Ｃの比率に対する拡散率の依存性も存在する。必要とされる分離分解能は、ＤＮＡ分離の利用分野によって異なり、単一塩基対の分解能から合計ＤＮＡ長の１０％以上という大きい分解能にまで至る。例えば、恐らくは比較的親しみのある利用分野であるＤＮＡ配列決定のためには、ＤＮＡは一般に単一塩基又は塩基対の分解能で分離されなくてはならない。このようにして、標準配列決定反応により生成されたＤＮＡのアリコート（例えばＦ.S anger et al.,１９７７,Proc．Natl．Acad．Sci.ＵＳＡ７４；５４６３;Ｍ.Maxa m et al.，１９７７，Proc．Natl．Acad．Sci.ＵＳＡ７４：５６０）を、本発明の分離方法に付すことが可能である。サイズ評価（選別）と呼ばれるＤＮＡ分離のもう１つの利用分野では、断片長のわずか±５％又は±１０％の分解能が必要とされる。サイズ評価は、ＲＦＬＰ決定、遺伝子型決定、連鎖分析、マイクロサテライト分析及びその他の断片分析の利用分野のために生成されうるようなＤＮＡ混合物内のサイズのパターン又は指紋を迅速に生成するために使用される。５.４.１．ＤＮＡの拡散率操作及び装置パラメータの選択のために用いられるｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡの拡散定数は、ストークスの法則から推定するか又は実験により得ることができる。ストークスの法則の粒子の拡散定数は次の式から得られる：なお式中、Ｔは温度、ηは分離媒質の粘度（例えば、水については０.０１ｇｍ/ｃｍ秒）、Γは有効粒子半径である（Doi et al.，１９８６，The theory of Polymer Dynamics ，Clarendon Press，Oxford,ｐ３００）。変性ｓｓＤＮＡといった球形粒子については、Γは回転半径として識別される。スケーリング論が、重合体様のｓｓＤＮＡの輪郭長さと回転半径を関係づけてい参照のこと）。ｄｓＤＮＡといったようにａ＞＞直径ｂである長い円筒についておいては、この近似を伴うストークスの法則の拡散定数は、以下の式から求められる：なお式中、直径ｂ＝１０Åであり、長さａ＝３ＮÅである。温度Ｔは、全体を通して２９８°ｋであると仮定される。拡散定数についての実験式が好ましく、以下では全体を通してこれが用いられている。水中室温でのｄｓＤＮＡの拡散率は、以下の式から近似的に、実験により求められる：なお式中、Ｎは塩基対の数である（Weast，ed.，１９８７，Handbook of Chem istry and Physics，Chemical Rubber Publishing Co，Boca Raton，FL，ｐ１１７）。観察上、Ｎに対する逆依存性が、式３１中の比較的弱い１ｎ（Ｎ）項を支配している。ｓｓＤＮＡについては、拡散率は、理論的に次の式から得られると仮定される。Ｎでのスケーリングは、Ｄが有効半径の逆数により左右されることを予測するストークスの法則から演繹される。有効半径は、ｓｓＤＮＡ拡散が、Ｎ^0.59といった塩基数により有効半径が左右される自己回避ウォークに似ているとみなすことから演繹される。例えばDoi et al.,前出、を参照のこと。５.４.２ｔ_on及びｔ_offの最適な選定最適なｔ_onの好ましい決定ポテンシャルウェルの中でＤＮＡ断片を誘引するのに必要な時間であるｔ_onは、ｔ_onについての式１２又は１４とＤＮＡの拡散定数についての式３２及び３３を組み合わせることによって決定することができる。ＤＮＡ上の電荷Ｑは、ｓｓＤＮＡについて−Ｎ｜ｅ−｜そしてｄｓＤＮＡについて−２Ｎ｜ｅ−｜であり、ここでＮは塩基又は塩基対の数であり、｜ｅ−｜は電子の電荷の絶対値である。ボルト単位のＶ_o及びμｍ単位の（Ｌ−Ｒ）を用いて、ｔ_onが以下の式から求められる：Ｖ_oが水の破壊電圧として選択される場合、ｔ_onは、Ｌ及びＲがμｍ単位であるものとして以下の式から得られる：表２は、Ｌ＝１０μｍ、Ｒ＝１μｍ及びＶ_o＝１Ｖの場合の装置についての秒単位のｔ_onを示す。好ましい、最も高速の分離については、ｔ_onはできるかぎり小さいものとして選択されるべきである。時間ｔ_onは、ポテンシャルの空間スケール（Ｒ及びＬ）と共に線形的にスケーリングする。これは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡについてのＮと共に異なる形でスケーリングする。ｓｓＤＮＡについては、駆動力が分子長と共に線形的に増大するものの拡散率はより低速で減少することから、ｔ_onは分子長の減少関数である。ｄｓＤＮＡについては、分子長に対する駆動力の依存性が断片長に対する拡散率の依存性を正確に取消すことから、ｔ_onは分子長とは無関係である。最適なｔ_offの好ましい決定好ましくは、最適なｔ_offは、合計分離時間Ｔ_totを最小にするように選定される。Ｔ_totは、Ｔ_totについての式１９をＮ_cycについての式１８と組合わせることによって得られる。Ｄ及びｔ_offに対するα_Dの依存性は、式７から得られ、これはここで繰返して示される。Ｄは、式３２及び３３に従って、分離されるべきＤＮＡ内の塩基又は塩基対の数であるＮによって左右される。Ｔ_totを最小にするため、パラメータｔ_offはＴ_totについて最小値を得るべく系統的に変動させられる。パラメータｔ_offは、Ｔ_totを最小にする値となるように最適な形で選定される。これらの関係式、特に式３３，３４及び３５に従って本発明のためのＤＮＡ分離のパラメータを計算するためのＣ言語でのプログラム例が第８節に記述されている。入力には、分離されるべきＤＮＡ分子についての長さＲとＬ，長さＮ及びＮ＋ΔＮ，そしてｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡ間の選択が含まれる。電圧Ｖ_oは、水の破壊電界及び水の電解が起こる過剰ポテンシャルと一貫性のある最大値となるように自動的に選定される。プログラムは、その他の分離媒質に適当なこれらのパラメータの値について変更することができる。プログラムは、最適なＴ_totを見い出すため系統的にｔ_offを変動させる。出力には、最適な操作条件ｔ_on及びｔ_off及びＮ_cyc及びＴ_totを含む操作のさらなる詳細が含まれる。出力には同様に、最適値のまわりの範囲内にこれらの数量の値を含有するファイルも含まれている。このプログラムは、Ｃ言語コンパイラ及びランタイムシステムを内含するあらゆるコンピュータシステム上でコンパイルし実行することができる。当業者であれば、このプログラムを、その他の類似の言語をもつコンピュータシステム上での実行のためにこのような言語に翻訳することができる。図１３は、プログラムを用いたｔ_offの最適な選定の一例を示す。Ｔ_totは、長さ１００のｄｓＤＮＡ分子が水性分離媒質内の長さ１０５のものから分離されることになる、Ｌ＝１０μｍ及びＲ＝１μｍを有するポテンシャルについてのｔ_of _f を用いて、数値的に評価される。図１３は、これら２つの数量の間の関係についての、結果として得られたグラフを示している。図１３から、ｔ_offについての最適な選択が０.１０秒であり、これが６.８分の最適な合計分離時間を生み出すということは明白である。表３は、さまざまなＤＮＡ分子長及び必要とされる分離分解能についての類似の最適化の結果を提示している。全てのケースにおいて、分離は、Ｌ＝１０μｍ及びＲ＝１μｍを有するポテンシャルで、水性媒質中でのものである。図１４は、多数のこのような最適化計算の要約をグラフで示している。グラフの水平軸は、分子長の百分率として表わされた望ましい分離分解能を表している。垂直軸は、分単位の所要合計分離時間Ｔ_totを表わす。グラフは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡについての２つの分子長１００及び５００に必要とされる分離時間を示している。ここでもまた、全ての分離は、Ｌ＝１０μｍ及びＲ＝１μｍを有するポテンシャルで水性媒質中でのものである。図１４から、分離が、１％以下の分解能を必要とする配列決定の場合に比べ、５〜１０％の分解能しか必要としないサイズ評価の場合はるかに高速であるということが明白である。図１４から、必要とされる分解能の１０という係数での変化がＴ_totの１００という係数での変化を導く。例えば、５塩基の分解能（５％）による長さ１００の分子の分離は、１塩基の分解能（１％）による長さ１００の分子の分離よりも２５倍速く実行できる。従って、この装置を用いると、ＤＮＡの迅速な配列決定及びきわめて迅速なサイズ評価が可能であるということが明らかにわかる。例えば、分離媒質を変更するか又は温度を上昇させることによって、装置のサイズを削減し拡散率を増大させると、その装置の分離時間は短縮される。５.４.３−ポテンシャルの偏心率この節では、分離時間が速くなればなるほど偏心率の高いポテンシャルが好ましくなるということの実証例について記述する。１０μｍという固定した周期長Ｌをもつもののポテンシャルウェルと最も近い隣接する最大値の間の距離Ｒが変動するポテンシャルについて、最適な分離パラメータが計算される。より小さいＲ/Ｌ比というのは、ポテンシャル最小値が各々のポテンシャルウェルの中により高い偏心率で置かれていることを意味する。表４は、水性媒質内の単一塩基分解能（１％）で長さ１００のｓｓＤＮＡ断片の分離のために行なわれた計算の結果を示す。全てのケースにおいて、Ｖ_o＝２Ｖが用いられる。Ｒ/Ｌ比が減少するにつれて装置の性能は増大する。すなわち合計分離時間は減少する。５.５．タイプＩ及びIIの装置のマイクロ製造本発明の方法に従って作動する装置は、分離の利用分野に適切でしかも前述された最小サイズと一貫性のあるいかなる物理的サイズのものであってもよい。装置が荷電された生体高分子断片をできるかぎり高速で分離するような好ましい実施形態においては、物理的サイズは、一般に製造技術が許容しかつ意図された分離媒質が許すかぎり小さいものであることが好ましい。本節では、約２ボルトの電位差が適用される水性分離媒質に適したタイプＩ及びIIの装置について、標準的マイクロ製造技術を用いた製造方法の例を紹介する。本発明は、その他の技術に従った製造及びその他の寸法の装置を内含することから、これらの方法は一例にすぎない。タイプＩ及びIIの装置例のサイズは、分離軸に沿って約１ｃｍ〜１０ｃｍであり、分離軸に対し横方向に約１ｃｍ〜１０ｃｍである。装置内のチャンネルは、幅約３０〜５０μｍ、深さ１０μｍ，で１００μｍ毎に離隔され、隣接するチャンネル間の離隔距離は約５０μｍである。各複数セットの中の電極は、約２０μ ｍ離隔され、すなわちＬ＝２０μｍであり、幅は約０.８〜１μｍである。各複数セットの中の電極は、ほぼその幅の分だけ相対的に移動させられる。すなわちＲ＝０.８〜１.０μｍ。各複数セットの中の電極は、外部の電圧源に対するリンクのため装置の縁部で電極パッドに接続されている。記載のある場合を除き、以下のマイクロ製造計画は、両方のタイプの装置に同等に適用される。記述されている方法は、マイクロ製造技術において標準的なものである（Sze，１９８８，ＶＬＳＩTechnology，McGraw Hill，New York）５.５.１．基板該装置にとって好ましい基板は、ソーダ石灰ガラスといったようなガラスである。代替的な基板としては、溶融シリカ、ホウケイ酸塩、石英、パイレックス及びポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミドなどといったプラスチックが挙げられる。ガラス基板の寸法は、約１〜１０ｃｍ× １〜１０ｃｍであり、厚さは１〜５ｍｍである。ガラス基板の適切な供給源は、ソーダ石灰ガラスの顕微鏡用スライド、例えば７５×５０×１ｍｍのスライドである（Fisher Scientific社カタログ番号１２−５５０Ｃ）。その他全てのマイクロ製造段階に先立ち、基板を清浄しなくてはならない。ガラス基板については、これはＨ₂ＳＯ₄/Ｈ₂Ｏ₂の熱浴中に基板を浸漬させ、１０分間Ｈ₂Ｏ中で洗浄し、再びＨ₂Ｏで洗浄し、約１５０℃のオーブン中で１０分間乾燥して吸着された水を除去することによって行なうことができる。５.５.２．電極製造装置のための電極はさまざまな金属から製造することができる。好ましい金属は、Ａｌ、Ａｇ、Ａｕ及びＰｔである。容易に利用可能なＣＭＯＳ鋳造工場を使用できる点でＡｌが有利であるが、これは、貴金属に比べ電解変質を受けやすいという点で不利である。これらの金属のための代替的電極製造方法が記述されている：すなわち、エッチングを用いて全ての好ましい金属に適した第１の方法、Ｐｔに適した第１の代替案そしてＡｕに適した第２の代替案である。第１の方法又は第１の代替的方法を用いた電極製造に先立ち、フォトリソグラフィーのためのパターンマスクが製造される。図１５は、マスクの一例を例示している。１５０１、１５０２、１５０３及び１５０４にあるような電極は、分離軸Ｓに対し実質的に横方向に配置されている。各々の電極は、幅が約１μｍである。電極は、２つの複数セットを形成し、各セットの電極は、電極パッド１５０５及び１５０６のうちの１つに接続されている。これらのパッドは巨視的規模で約０.１ｍｍであり、外部電圧源に対する接点として役立つ。各複数セットの電極は、距離Ｌで周期的に間隔どりされ、互いに対し距離Ｒだけ移動させられている。これらの寸法のマスクが、標準的なマイクロリソグラフィー技術を用いて容易に製作可能である。例えば、石英表面上に被着したクロムを選択的に除去することにより適切なマスクが得られる。クロムは、例えば、パターン生成プログラムのために入力を提供する計算機援用設計を用いて除去される。入手可能であるならば、より小さな特長サイズが好ましい；ここで用いられるサイズは一例にすぎない。電極を製造するための第１の方法は、電極を支持するべき基板の側面上に選択された金属の均等厚さ１μｍの層を被着させることから始まる。金属は例えば物理蒸着、化学蒸着又はスパッタリングにより被着させることができる。このとき、金属層の上にポジ型フォトレジストがスピンコーティングされ、ソフトベークにより安定化される。マスク上の特長は、ＵＶ光を照射することによりフォトレジストに転写され、光に露呈された無保護領域は適切な溶剤により溶解させられる。存続するフォトレジストは、高温でのハードベーキングにより、所定の場所に固定される。電極は、フォトレジストにより保護されていない金属領域をエッチングすることによって生成される。Ａｌ電極については、エッチングは、Ｃｌ₂蒸気に表面を露呈することによって達成できる。Ｃｌ₂分子は表面上のＡｌ原子と反応してＡｌＣｌ₃を生成し、このＡｌＣｌ₃は、揮発性で表面から離れる。Ａｕ及びＡｇ電極については、アンダカットがμｍスケールの電極を破壊することになるため、ウェットエッチングは好ましくない。これらの特長は好ましくはＡｒ＋イオンミリングを用いてエッチングされる。この方法では、Ａｒ無線周波数プラズマからのＡｒ＋イオンが表面内へと加速され、物理的衝撃によるエッチングをひき起こす。ミリングにより、マスク寸法を保つまっすぐな側壁を伴う電極を製造することが可能となる。エッチングの後、残りのフォトレジストは基板の表面から除去され、電極を支持する表面は、その後の処理のため清浄される。Ｐｔ電極に適した第１の代替的方法は、標準的なマイクロ機械加工技術を用いる。製造は、蒸発システムを用いた厚さ１０ｎｍのＴｉの被着から始まる。のＴｉ層は、その後のｐｔ層とガラスの間の付着層として作用する。次に、厚さ１００ｎｍのＰｔ層が、Ａｒイオンスパッタリングシステムを用いてＴｉの上面に被着させられる。電極は、フォトリソグラフィー及びエッチングを用いて金属層の中に構成される。このプロセスは、Ｐｔの上面にフォトレジストをスピンコートし、上に電極パターンをもつフォトリソグラフィーマスクを通してＵＶ光にフォトレジストを露呈することから始まる。次に、現像剤の中でフォトレジストの露光部域を溶解させて除去し、電極パターンを構成する未露光領域を残すことができる。フォトレジストは、保持されるべき金属の部域を保護することになる；金属の残りの部分は、イオンミリングを用いて除去される。ミリングプロセスにおいては、正に荷電されたＡｒ＋イオンが電気的に加速されて金属の表面に衝突し、層を物理的に腐食する。このエッチングがひとたび完了すると、フォトレジストはアセトンで溶解されて、仕上った電極を残す。Ａｕに適した第２の代替的方法は、マイクロ密着焼付け法（μＣＰ）を用いる（Ｘia et al.,１９９５，Ｊ.Ａｍ．Chem．Soc.１１７：３２７４−３２７５；J ackman et al.，１９９５，Sciece２６９：６６４−６６６）。フォトリソグラフィーマスクの代りに、同じ寸法の同一パターンに従って作られたエラストマスタンプが用いられる。図１６Ａ〜Ｂは、パターン例を示す。スタンプはポリジメチルシロキサンから製造できる。前述のものと同様に、Ａｕは、標準的方法を用いて基板の表面上に１μｍの厚さに被着させられる。次に、エラストマスタンプはアルカンチオールで湿潤化され、金表面に押しつけられる。適当なアルカンチオールは、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₅ＳＨ（Kumar et al.，１９９４，Langmuir１０：１４９８−１５１１）である。金表面上のパターン化された自己組立式アルカンチオール単層の制御された展延は、水中での焼付けを行なうことにより達成できるが、これにはさらに、予測可能な形で特長サイズを収縮するという利点がある。スタンプ及び基板は水から除去され、Ｎ₂ガスを用いて乾燥され、次に基板からスタンプが除去される。無保護の金は、酸化剤として空気又は酸素を用いて激しく撹拌しながらシアン化物溶液（０.１ＭのＫＣＮ，１ＭのＫＯＨ）の中に浸漬させることによって除去される（Kumar et al.，前出）。充分にすすいだ後、表面からアルカンチオールを除去して、複数組の金電極を生成する。５.５.３．タイプＩの装置のチャンネル製造タイプＩの装置のチャンネルは、ガラス基板をウェットエッチングすることにより製造できる。チャンネル製造に先立って、フォトリソグラフィーマスクを構築しなくてはならない。図１６Ａは、１つのマスク例を示している。チャンネルは、そうでなければ不透明なマスクの上に、１６０１及び１６０２にあるように透明な筋により構成される。各筋の幅Ｃは、望ましいチャンネル幅から、エッチングプロセス中に予想されるあらゆるアンダカットを差し引いたものである。記述されているプロセスについては、予想アンダカットは８〜１０μｍであることから、幅４０μｍの筋は、望ましい最終幅が５５〜６０μｍのチャンネルを製造する。筋の間の幅Ｗは、望ましいチャンネル間隔に予想されるあらゆるアンダカットを加えたものである。図１６Ｂは、代替的チャンネル幾何形状を例示している。ここでチャンネル１６０６といったチャンネルは、全体として１６０３で表わされている負荷ゾーンの広い間隔から、全体として１６０５で示されている検出ゾーンの狭い間隔まで収束する。負荷ゾーン１６０３内の間隔が広いために、チャンネルは、チャンネル間の望ましい間隔よりも大きい直径の１６０４といった注入ポートを収容することが可能となる。図１６Ｂは、断片状の直線チャンネルを例示しているが、例えば曲線といった代替的なチャンネル幾何形状も本発明に適合させることができる。適当なフォトリソグラフィーマスクは、石英表面上に被着されたクロムを選択的に除去することによって製造可能である。例えばクロムは、パターン生成プログラムへの入力として役立つ計算機生成設計を用いて除去される。チャンネル製造は、ガラス基板上にポジ型フォトレジストをスピンコートすることから始まる。基板を５分間ヘキサメチルジシラザン蒸気に露呈し、フォトレジストでスピンコートし（Microposit S１４００−３１，Shipley，Newton,ＭＡ）、９０℃で０.５時間加熱することによりフォトレジストを安定化させることによって適切なフォトレジスタが生成される。マスクは、コーティングされたガラス基板全体にわたり整列させられ、パターンは，ＵＶ光を用いてフォトレジスト上に刻印される。ＵＶ光に露呈されたフォトレジストの領域は、溶解され（Ｈ₂ＯとMicroposit現像剤濃縮物の１：１混合物、Shipley）、存続するフォトレジストは、１５０℃で１時間ベーキングすることによって定着させられる。あるいは、チャンネルを、Ｃｒ層を用いてガラス基板内に構成することもできる。このプロセスは、ガラス上に厚さ１００ｎｍのＣｒ層を蒸発させることで始まる。製造すべきレーン全体にわたるＣｒ層はこのとき、フォトリソグラフィーとエッチングを用いて除去される。次に、基板の無保護部域は、水性ＮＨ₄/ＨＦエッチング溶液（ＢＯＥ５：１とＢＯＥ１０：１の１：１混合物、Ｊ.Ｔ．Baker,Phillipsburg，ＮＪ）にガラスチップの表面を露呈することによってウエットエッチングされる。２０分間のエッチングで、深さ１０−〜１０ｎｍのチャンネルが製造され、各々の側でフォトレジストが８〜１０μｍずつアンダカットされる。従ってパターン化用マスク上の４０μｍの特長サイズは、５５〜６０μｍという例示的な幅のチャンネルを生成する。エッチングの後、フォトレジスト又はＣｒ層は、例えばガラスの場合、前述のような高温Ｈ₂ＳＯ₄/Ｈ₂Ｏ₂を用いた清浄により、基板から除去される。５.５.４．タイプIIの装置のチャンネル製造タイプIIの装置のためのチャンネルが、好ましくは、電極の上面に製造される。あるいは、これらのチャンネルはその他の基板の上面に製造することもできる。まず最初に適切なフォトリソグラフィーマスクが製造される。このようなマスクは一般に、次の３つの点を除いてタイプＩの装置のチャンネルの場合と類似している。すなわち、第１にこのマスクは、各々のチャンネルの筋を形成する２つのチャンネル壁を構成する。第２に、チャンネル壁は透明な筋により構成され、マスクの残りの部分が不透明な状態となる（ネガ型マスク）。第３に、この方法ではいかなるアンダカットも予想されていないことから、マスクの寸法は、意図されたチャンネル及びチャンネル壁の寸法と正確に一致していなくてはならない。その後、チャンネルは、まず最初に約１０μｍの深さまで基板の表面の上にＵＶ感応性ポリアミド溶液をスピンコートすることによって製造される。ポリアミドはＵＶ光に露呈された領域内で所定の位置にとどまり、そのためフォトリソグラフィーマスクをネガ画像にすることが必要となる。マスクパターンは、ＵＶ光を照射することによりポリアミドフォトレジスト上に刻印される。マスクの透明な部分の下のポリアミド層の領域は、ＵＶ放射線による架橋によって安定化される。ポリアミド層の残りの部分は、適当な現像剤で溶解される。架橋は、現像及び硬化段階の間、保持されるまっすぐな側壁を形成する。次に、ガラスチップを約１５０℃でハードベークしてポリアミド層を硬化させる。こうしてチャンネルのマクロ製造が完了する。５.５.５．注入ポートの製造望ましい場合、電極パターンを支持していない基板の中に注入ポートを製造することができる。注入ポート用の穴は、レーザ又はダイヤモンドチップ付きのドリルビットのいずれかで穴あけ加工することによって製造できる。好ましくは、加工穴は、マイクロピペットチップによるサンプルの注入を可能にするようにサイズ決定され、従って５００μｍが適切なサイズである。注入ポートの好ましいサイズは、チャンネル間の好ましい間隔の５〜１０倍であることから、移動及び検出領域における密に間隔どりされたチャンネルのためには、図１６Ａのまっすぐなパターンよりも図１６Ｂの収束するチャンネルパターンの方が好ましい。５.５.６．基板の溶融装置内に閉じた分離レーンを作り出すため、チャンネルを伴う基板及びその他の基板を合わせてボンディングしなくてはならない。最初に、両面を徹底的に清浄し、次に接触させる。タイプＩの装置については、温度は約５００〜６００℃ のアニール温度まで着実に上昇させられ、このアニール温度で数時間保持され表面の良好なボンディングを確実にする。タイプIIの装置については、平坦なシリカプレートが約２００℃のより低い温度でチャンネルのポリアミド表面に溶融させられる。６．実施例６.１．一本鎖ＤＮＡの分離第５.３節に記述されている本発明の好ましいモデルを用いて、分離装置の挙動を計算する。以下の装置設計パラメータを仮定する：Ｌ＝１０μｍ、Ｒ＝１μ ｍ、長さ１ｃｍ、電位差１Ｖ及び水性分離媒質。１００塩基ｓｓＤＮＡを分離する上で２塩基分解能を提供するため最適なものとして、ｔ_on＝１msec及びｔ_off ＝６０msecを計算する。合計分離時間は６０分である。これらの設計及び操作パラメータを用いて、長さ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０及び１００のｓｓＤＮＡ断片の混合物について（Research Genetics，Hunstvi lle，Alから入手可能な標準的１０塩基配列決定用梯子として知られている）、装置の挙動を計算する。図１７は、装置の予測される挙動を例示している。水平軸は、増大する合計分離時間を記録し、垂直軸は、装置から退出するＤＮＡの濃度を記録している。このグラフは、分離時間の関数として、装置から退出するＤＮＡの予測された濃度を例示している。ＤＮＡ断片が全て明確に分離可能でなくてはならないということは明白である。７．特定の実施形態、参考文献の引用本発明は、本明細書に記述した特定の実施形態により範囲が制限されるべきものではない。実際、本明細書に説明されているものに加えて、以上の説明及び添付図面から、当業者には本発明のさまざまな修正が明らかになることだろう。このような修正は、添付のクレームの範囲内に入るものと意図されている。本明細書にはさまざまな刊行物が引用されており、その開示は全体が参考として内含されるものである。８．最適パラメーターを選択するコンピュータープログラム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ディーム，マイケル，ダブリュ. アメリカ合衆国 02139 マサチューセッツ州，ケンブリッジ，ハイランドアベニュー 14番 24 (72)発明者マルハーン，グレゴリー，ティー. アメリカ合衆国 06405 コネチカット州, ブランフォード，ハリソンアベニュー 45，アパートメント１番 (72)発明者ウェント，グレゴリー，ティー. アメリカ合衆国 06443 コネチカット州, マディソン，スコットランドアベニュー 25

Claims

【特許請求の範囲】１．分離媒体中の荷電粒子を空間的変動および時間的変動を有する電位に曝す工程を含む荷電粒子を分離媒体における分離の方向に沿って分離する方法であって、前記空間的変動が分離の方向に沿って配置された複数のポテンシャルウェル(p otential wells)を含むものであり、そして前記時間的変動は、荷電粒子が前記ポテンシャルウェルの最低部分に誘引されるオン状態および荷電粒子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態との間の反復変動を含むものである、前記方法。２．曝す工程の前に、さらに、荷電粒子を分離媒体中にローディングする工程を含む、請求項１に記載の方法。３．前記の各ポテンシャルウェルが、隣接ポテンシャル最高部分に対して偏心的に配置されているポテンシャル最低部分を有するものであり、前記ポテンシャル最低部分が、分離の方向にあるポテンシャル最高部分に、その他の前記隣接ポテンシャル最高部分よりも接近している、請求項１に記載の方法。４．前記電位が電場を発生させるものであり、該電場が分離の方向に実質的に平行である、請求項１に記載の方法。５．前記電位が分離の方向に垂直な方向に実質的に一様である、請求項１に記載の方法。６．前記ポテンシャルウェルが固定空間位置にある、請求項１に記載の方法。７．前記電位の前記空間的変動が、ポテンシャル最高部分とポテンシャル最低部分の交替(alternating)を含み、前記の各ポテンシャルウェルが１つの前記ポテンシャル最低部分および２つの前記隣接ポテンシャル最高部分を含むものである、請求項１に記載の方法。８．前記電位の前記空間的変動が一般的に鋸歯形である、請求項７に記載の方法。９．前記電位の前記時間的変動が、前記電位の前記空間的変動が存在するオン状態および前記電位の前記空間的変動が存在しないオフ状態の２つの状態間の反復交替(alternations)を含むものである、請求項１に記載の方法。１０．前記電位の前記時間的変動が、前記オン状態、ポテンシャル最低部分が前記オン状態におけるものよりも狭くて深い第３の状態、および前記オフ状態の少なくとも３つの状態間の反復交替を含む、請求項１に記載の方法。１１．前記電位の前記時間的変動が、前記オン状態、該オン状態中に１回以上点在し、電位が実質的に高移動性の対イオンのみに作用するのに十分な短いパルス幅で反転する第３の状態、および前記オフ状態の少なくとも３つの状態間の反復交替を含む、請求項１に記載の方法。１２．前記オフ状態の持続時間が、荷電粒子が分離方向にある隣のポテンシャルウェルのみに拡散することができるような時間である、請求項１に記載の方法。１３．前記オフ状態の持続時間が、荷電粒子のいくつかが１以上のポテンシャルウェルを横切って拡散することができるような時間である、請求項１に記載の方法。１４．前記オン状態の持続時間が、前記の各ポテンシャルウェルに存在する実質的に全ての荷電粒子を、前記の各ポテンシャルウェルのポテンシャル最低部分に誘引し、トラップするのに十分な時間である、請求項１に記載の方法。１５．荷電粒子の分離中、前記時間的変動が一定振動数を有する、請求項１に記載の方法。１６．荷電粒子の分離中、前記時間的変動が変化する振動数を有する、請求項１に記載の方法。１７．前記分離媒体が、分離される粒子がその分離媒体に懸濁された場合、該粒子が荷電し、異なる拡散率を有するようなものであり、荷電粒子はその異なる拡散率にしたがって分離されるものである、請求項１に記載の方法。１８．分離媒体が液体である、請求項１７に記載の方法。１９．分離媒体がゲルまたは気体である、請求項１７に記載の方法。２０．分離媒体が、分離される粒子が荷電し、異なる拡散率を有するような複数のその他の分離媒体と比較して、比較的高い電気的分解電圧を有する、請求項１７に記載の方法。２１．分離媒体が、分離される粒子が荷電し、異なる拡散率を有するような複数のその他の分離媒体と比較して、比較的高い破壊電界(electric breakdown fiel d)を有する、請求項１７に記載の方法。２２．荷電粒子が生体高分子である、請求項１に記載の方法。２３．生体高分子が１本鎖または２本鎖ＤＮＡである、請求項２２に記載の方法。２４．荷電粒子をローディングした後、該荷電粒子を前記の変動電位に曝す前に、さらに、荷電粒子を誘引し、トラップするローディングゾーンポテンシャルウェル中に荷電粒子を誘引し、トラップする工程を含む、請求項１に記載の方法。２５．前記時間的変動が、荷電粒子の分離に必要な時間を最小にするように選択される、請求項１に記載の方法。２６．前記空間的変動および時間的変動が、荷電粒子の分離に必要な時間を最小にするように選択される、請求項１に記載の方法。２７．（ａ）分離媒体を含有することが可能な１以上の分離レーン；および（ｂ）前記の１以上の分離レーンに電位を生じさせることが可能なように位置が定められており、ここで該電位は時間変動振幅(time-varying amplitude)をもつ定在的空間パターン(stationary spatial pattern)を有するものである、複数の電極を含む、荷電粒子の分離装置。２８．前記定在的空間パターンが前記の１以上の分離レーンに沿って配置された複数のポテンシャルウェルを含むものであり、ここで前記の各ウェルはポテンシャル最低部分を有し、そして前記時間変動振幅は、荷電粒子が前記ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引されるオン状態および荷電粒子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態間の反復変動を含むものである、請求項２７に記載の装置。２９．前記の各ポテンシャルウェルが隣接ポテンシャル最高部分に対して偏心的に配置されたポテンシャル最低部分を有するものであり、前記ポテンシャル最低部分が、前記の分離の方向にあるポテンシャル最高部分に、他の方向にある前記隣接ポテンシャル最高部分よりも接近している、請求項２８に記載の装置。３０．前記の各ポテンシャルウェルが、前記の分離の方向に沿って空間的サイズＬを有するものであり、前記の各ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分が、前記の分離の方向にある最も近接した前記隣接ポテンシャル最高部分から距離Ｒのところに配置されている、請求項２８に記載の装置。３１．Ｒが、荷電粒子の合計分離時間Ｔ_totを最小にするように選択される、請求項３０に記載の装置。３２．ＬおよびＲが、選択された製造技術において製造することができる最小のサイズに拘束され、前記分離媒体において適用することができる最大のポテンシャルに拘束される合計分離時間Ｔ_totを最小にする距離である、請求項３０に記載の装置。３３．Ｒ／Ｌが実質的に一定になるように選択される、請求項３０に記載の装置。３４．Ｒ／Ｌが約0.3未満になるように選択される、請求項３０に記載の装置。３５．ＬおよびＲが、荷電粒子の分離中、荷電粒子のそれぞれがその他の荷電粒子の実質的に全てから独立して移動するのに十分な大きさで選択される、請求項３０に記載の装置。３６．ＬおよびＲは、前記ポテンシャルウェルの前記最低部分が約0.1μｍよりも大きくなるように選択される、請求項３０に記載の装置。３７．前記の１以上の分離レーンが、いずれの横断面寸法よりも大きい長さを有する、請求項２７に記載の装置。３８．前記の１以上の分離レーンの前記長さが、約10cm未満である、請求項３７に記載の装置。３９．前記の１以上の分離レーンの前記横断面寸法が、約100μｍ未満である、請求項３７に記載の装置。４０．さらに、スラブとして配置された分離媒体を含むものであり、分離媒体の該スラブが前記の１以上の分離レーンとして機能する、請求項２７に記載の装置。４１．さらに、仕切られた横断面を有する１以上の通路を含むものであり、前記の１以上の分離レーンのそれぞれが、前記の１以上の通路の１つの中にある、請求項２７に記載の装置。４２．装置が、さらに、第１および第２の基板を含み、前記の各通路が前記第１の基板によっておよび前記第２の基板の表面にあるチャンネルによって仕切られている、請求項４１に記載の装置。４３．装置が、さらに、第１および第２の基板を含み、前記の各通路が前記第１の基板によって、前記第２の基板によって、および前記第２の基板の表面に配置されたチャンネル壁によって仕切られている、請求項４１に記載の装置。４４．前記の１以上の通路が、実質的にまっすぐである、請求項４１に記載の装置。４５．前記の１以上の通路が、前記の１以上の通路の１末端にある広いスペースから、前記の１以上の通路の他の末端にある狭いスペースに集まっている、請求項４１に記載の装置。４６．さらに、１以上のローディング口を含むものであり、各ローディング口は前記の１以上の分離レーンの１つに連通し、前記の１つの分離レーンにローディングするための荷電粒子を受けるように適合されている、請求項２７に記載の装置。４７．前記の１以上のローディング口がローディングゾーンにあり、前記の１以上の分離レーンが、前記ローディングゾーン中の前記の１以上の分離口に流体を連通させるのに十分なスペースから、より近接したスペースへの前記の分離方向に集まっている、請求項４６に記載の装置。４８．前記の１以上の分離レーンが、荷電粒子を観察領域に導くことができるように配置されており、前記観察領域は、前記荷電粒子の蛍光標識によって放出される光および前記蛍光標識による蛍光発光を励起するのに十分な光を実質的に透過するものである、請求項２７に記載の装置。４９．マイクロ製造技術を用いる方法によって作られた、請求項２７に記載の装置。５０．さらに、前記の１以上の分離レーン中の分離媒体を温度制御するための手段を含む、請求項２７に記載の装置。５１．（ａ）分離媒体を含有することが可能な１以上の分離レーン：および（ｂ）前記の１以上の分離レーン中に電位を生じさせることが可能なように位置を定められており、ここで該電位は時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有するものであ、前記空間パターンは実質的に鋸歯形であり、複数の電極を含む、荷電粒子の分離装置。５２．さらに、各分離レーンに液体分離媒体を含有する、請求項５１に記載の装置。５３．さらに、第１および第２の基板を含むものであり、前記の１以上の分離レーンは前記第１および前記第２の基板の間に形成されており、前記電極は前記基板の１つの表面上または前記基板の両方の表面上に作られている、請求項５１に記載の装置。５４．前記の複数の電極の各電極が、実質的に線状であり、前記の１以上の分離レーンのそれぞれに対して実質的に垂直である、請求項５１に記載の装置。５５．前記の複数の電極が、第１の複数のサブ電極および第２の複数のサブ電極を含むものであり、各サブ電極は約Ｌの距離で周期的に間隔があけられており、第１および第２の複数のサブ電極は、約Ｒのオフセット(offset)で互いにかみ合わされている、請求項５１に記載の装置。５６．さらに、第１および第２の電極パッドを含むものであって、前記電極パッドは外部接触を作るために設けられており、ここで前記第１の複数のサブ電極は前記第１の電極パッドと電気的に接触しており、前記第２の複数の細部電極は前記第２の電極パッドと電気的に接触している、請求項５５に記載の装置。５７．Ｒ／Ｌが約0.3未満である、請求項５５に記載の装置。５８．Ｌが約100μｍ未満である、請求項５５に記載の装置。５９．Ｒが約30μｍ未満である、請求項５５に記載の装置。６０．前記電極が、さらに、第３の複数のサブ電極を含むものであって、前記第３の複数のサブ電極は、前記第１のおよび前記第２の複数のサブ電極のオフセットで互いにかみ合わされており、ここで前記複数の電極は、前記第３の複数のサブ電極が存在しない場合よりも狭くて深いポテンシャル最低部分を、前記の各鋸歯形ポテンシャルウェルの位置に発生させることが可能である、請求項５５に記載の装置。６１．さらに、前記の１以上の分離レーン中に荷電粒子をローディングするための手段を含む、請求項５１に記載の装置。６２．さらに、荷電粒子上のあらゆる標識を検出するための手段を含むものであり、その手段は、分離レーン内で荷電粒子を分離した後、その標識を検出することが可能なように位置が定められている、請求項５１に記載の装置。６３．さらに、前記の１以上の分離レーン中の分離媒体を温度制御するための手段を含む、請求項５１に記載の装置。６４．前記の１以上の分離レーンおよび前記の複数の電極が、互いに空間的に固定されている、請求項２７または５１に記載の装置。６５．さらに、前記の１以上の分離レーンおよび前記の複数の電極を支えるためのハウジングを含む、請求項６４に記載の装置。６６．（ａ）１以上の分離レーン中に分離媒体を含有するための手段；および（ｂ）前記の１以上の分離レーン中に、時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有する電位を生じさせるための手段を含む、分離の方向に沿って荷電粒子を分離する装置。６７．前記定在的空間パターンが、前記の１以上の分離レーンに沿って配置された複数のポテンシャルウェルを含むものであって、前記の各ポテンシャルウェルは隣接ポテンシャル最高部分に対して偏心的に配置されているポテンシャル最低部分を有しており、前記ポテンシャル最低部分は、前記の１以上の分離レーンに沿った前記の分離の方向にあるポテンシャル最高部分に、その他の方向にある前記隣接ポテンシャル最高部分よりも近接しており、ここで前記時間変動振幅は、荷電粒子が前記ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引されるオン状態および荷電粒子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態間の反復変動を含むものである、請求項６６に記載の装置。６８．さらに、前記の分離レーンに含有された流体分離媒体を含む、請求項６６に記載の装置。６９．さらに、前記の１以上の分離レーンに荷電粒子をローディングするための手段を含む、請求項６６に記載の装置。７０．さらに、前記の１以上の分離レーン中で分離された荷電粒子のあらゆる標識を検出するための手段を含む、請求項６６に記載の装置。７１．さらに、前記の１以上の分離レーン中の分離媒体を温度制御するための手段を含む請求項６６に記載の装置。７２．（ａ）荷電生体高分子を分離媒体中にローディングする工程；および（ｂ）前記分離媒体中の前記荷電生体高分子を、時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有する電位に曝す工程を含む、分離の方向に沿って荷電生体高分子を分離する方法。７３．前記電位の前記定在的空間パターンが、前記の分離の方向に沿って配置された複数のポテンシャルウェルを含む、請求項７２に記載の方法。７４．前記のポテンシャルウェルのそれぞれが、前記ポテンシャルウェルのポテンシャル最低部分が分離の方向にある隣接ポテンシャル最高部分により近接する一般的に偏心的な形状を有するものである、請求項７３に記載の方法。７５．前記電位の前記定在的空間パターンが、分離の方向に沿って一般的に鋸歯形である、請求項７２に記載の方法。７６．前記電位の前記定在的空間パターンおよび前記時間変動振幅が、荷電生体高分子が分離中、複数回、前記の分離の方向に沿って固定された位置にトラップされるようなものである、請求項７２に記載の方法。７７．前記電位の前記時間変動振幅は、荷電生体高分子断片が前記の分離の方向に沿って固定された前記位置にトラップされるオン状態および荷電生体高分子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態間の反復変動を含む、請求項７６に記載の方法。７８．前記荷電生体高分子断片が、少なくとも、第１の型の荷電生体高分子断片および第２の型の荷電生体高分子断片を含むものであり、ここで前記第１および前記第２の型は、前記分離媒体において異なる拡散率を有し、それによって荷電生体高分子断片の前記第１および前記第２の型がそれらの異なる拡散率にしたがって分離される、請求項７２に記載の方法。７９．前記分離媒体が液体である、請求項７２に記載の方法。８０．前記分離媒体がゲルまたは気体である、請求項７２に記載の方法。８１．生体高分子が、１本鎖または２本鎖ＤＮＡである、請求項７２に記載の方法。８２．前記１本鎖ＤＮＡが5000塩基未満の長さであり、または前記２本鎖ＤＮＡが5000塩基対未満の長さである、請求項８１に記載の方法。８３．前記１本鎖ＤＮＡが1000塩基未満の長さであり、または前記２本鎖ＤＮＡが1000塩基対未満の長さである、請求項８１に記載の方法。８４．（ａ）分離媒体において異なる拡散率を有する少なくとも２つの型の荷電粒子を分離媒体中にローディングする工程；および（ｂ）前記分離媒体中の荷電粒子を、時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有する電位に曝す工程を含んでなり、前記電位の前記定在的空間パターンが、分離の方向に沿って配置された複数のポテンシャルウェルを含むものであって、前記の各ウェルはポテンシャル最低部分を有し、前記時間変動振幅は、荷電粒子が前記のポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引されるオン状態および荷電粒子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態間の反復変動を含むものである、分離の方向に沿って荷電粒子を分離する方法。８５．前記ポテンシャルウェルが、前記分離媒体の破壊電界(electric breakdow n field)または電気分解電圧によって制限される、請求項８４に記載の方法。８６．さらに、（ａ）前記オン状態ｔ_onの持続時間を、ほぼ、前記の各ポテンシャルウェル内の実質的に全ての荷電粒子を、前記ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引するのに十分な最小時間になるように選択する工程；および（ｂ）前記オフ状態ｔ_offの持続時間を、ほぼ、前記の少なくとも２つの型の荷電粒子を、観察上区別するのに十分に分離するために必要な合計時間Ｔ_totを最小にする時間になるように選択する工程を含む、請求項８４に記載の方法。８７．前記ｔ_onが、荷電粒子が前記分離媒体中を荷電粒子の電荷、前記ポテンシャルウェル中の電場、および荷電粒子の前記拡散率に正比例した速度で移動するモデルにしたがって決定される、請求項８６に記載の方法。８８．前記Ｔ_totが、実験的観察によって決定される、請求項８６に記載の方法。８９．前記Ｔ_totが、前記の少なくとも２つの型の荷電粒子のそれぞれが、分離中、前記ポテンシャルウェル間をランダムウォーク(random walk)するモデルにしたがって決定され、荷電粒子が１つの前記ウェルから別のウェルヘランダムステップ(random step)する確率は、前記荷電粒子が、ｔ_off中に、前記の１つのウェルのポテンシャル最低部分から、前記の別のウェルの最も近いポテンシャル最高部分へ拡散する確率によって得られるものである、請求項８６に記載の方法。９０．前記Ｔ_totが、前記電位中の荷電粒子の拡散についての正確な方程式を解くことによって決定される、請求項８６に記載の方法。９１．前記ｔ_offが、荷電粒子の前記分離中に、系統的に増加または減少する、請求項８６に記載の方法。９２．第１の型および第２の型のような前記の少なくとも２つの型の粒子のそれぞれが、ピークおよび幅を有する濃度プロフィールにしたがって前記ポテンシャルウェル中に分散されるものであり、前記第１および第２の型に対する前記濃度プロフィールの前記ピークそれぞれの間隔が、前記第１および前記第２の型に対する前記濃度プロフィールのそれぞれの前記幅よりも多きい場合、前記の少なくとも２つの型の粒子を観察上区別することができるものである、請求項８６に記載の方法。９３．前記の各ポテンシャルウェルが、前記の分離の方向に沿って空間的サイズＬを有するものであり、前記各ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分が、最も近い隣接ポテンシャル最高部分から距離Ｒの位置に定められている、請求項８４に記載の方法。９４．Ｒ／Ｌが実質的に一定である、請求項９３に記載の方法。９５．Ｒ／Ｌが約0.3未満である、請求項９３に記載の方法。９６．Ｒが、前記の少なくとも２つの型の荷電粒子を観察上区別するのに十分に分離するために必要な合計時間Ｔ_totを最小にするように選択される、請求項９３に記載の方法。９７．Ｒが、約10μｍ未満になるように選択される、請求項９３に記載の方法。９８．ＬおよびＲが、荷電粒子のそれぞれが荷電粒子の分離中にその他の荷電粒子の実質的に全てと独立に移動するように十分に大きいものである、請求項９３に記載の方法。９９．ＬおよびＲが、前記ポテンシャルウェルの前記最低部分が約0.1μｍよりも大きくなるようなものである、請求項９３に記載の方法。１００．ＬおよびＲが、選択されたマイクロ製造技術において製造することができる最小サイズに拘束され、前記分離媒体において適用することができる最大ポテンシャルに拘束されるＴ_totを最小にするための同時最適化にしたがって選択される、請求項９３に記載の方法。１０１．前記同時最適化が、Ｔ_totの最小値を見つけるために前記最小サイズ拘束によって決定された最小値からＲを系統的に変化させるものである、請求項１００に記載の方法。１０２．（ａ）ＤＮＡ混合物を、ＤＮＡが荷電される分離媒体にローディングする工程；および（ｂ）前記分離媒体中の前記ＤＮＡ混合物を、時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有する電位に曝す工程を含む、配列決定反応において生じたＤＮＡ混合物を分離する方法。１０３．（ａ）ＤＮＡ混合物を、ＤＮＡが荷電される分離媒体にローディングする工程；および（ｂ）前記分離媒体中の前記ＤＮＡ混合物を、時間変動振幅をもつ定在的空間パターンを有する電位に曝す工程を含む、酵素的切断によって生じたＤＮＡ混合物を分離する方法。１０４．（ａ）１つの表面上に横断面寸法よりも大きな長さ寸法の１以上のチャンネルを有する実質的に平坦な第１の基板；（ｂ）前記の１以上のチャンネルが液体またはゲル分離媒体を含有することが可能な１以上の分離レーンを形成するように、前記第１の基板に並置された実質的に平坦な第２の基板；（ｃ）第１および第２の電極パッド；ならびに（ｄ）前記の１以上の分離レーンに電位を生じさせることが可能であり、実質的に直線状であり、前記の１以上の分離レーンに実質的に垂直に配置された複数の電極を含むものであり、ここで、前記の複数の電極が、第１の複数のサブ電極および第２の複数のサブ電極を含むものであって、複数の各サブ電極は約Ｌの距離で実質的に周期的に間隔があけられており、第１および第２の複数のサブ電極は、約Ｒのオフセットで互いにかみ合わされており、前記第１の複数のサブ電極は前記第１の電極パッドと電気的に接触しており、前記第２の複数のサブ電極は前記第２の電極パッドと電気的に接触しており、それによって、前記の１以上の分離レーンに生じさせることが可能な前記電位が実質的に鋸歯形を有するものである、荷電粒子の分離装置。１０５．前記の１以上の分離レーンの前記長さ寸法が約10cm未満であり、前記の１以上の分離レーンの前記横断面寸法が約100μm未満である、請求項１０４に記載の装置。１０６．Ｒ／Ｌが約0.3未満である、請求項１０４に記載の装置。１０７．Ｌが約100μm未満であり、Ｒが約30μm未満である、請求項１０４に記載の装置。１０８．さらに、前記の１以上の分離レーンに荷電粒子をローディングするための手段を含む、請求項１０４に記載の装置。１０９．さらに、荷電粒子上のあらゆる標識を検出するための手段を含むものでり、その手段は分離レーン内で荷電粒子を分離した後、標識を検出することが可能なように位置が定められている、請求項１０４に記載の装置。１１０．さらに、前記の１以上の分離レーン中の分離媒体を温度制御するための手段を含む、請求項１０４に記載の装置。１１１．（ａ）実質的に平坦な第１の基板；（ｂ）前記第１の基板が並置された実質的に平坦な第２の基板；（ｃ）液体またはゲル分離媒体を含有し、横断面寸法よりも大きな長さ寸法を有することが可能な１以上の分離レーンが、前記第２の基板に前記第１の基板を並置することによって形成されるように、前記第２の基板の表面に設けられた複数のチャンネル壁；（ｄ）第１および第２の電極パッド；ならびに（ｅ）前記の１以上の分離レーンに電位を生じさせることが可能であり、実質的に直線状であり、前記の１以上の分離レーンに実質的に垂直に配置された複数の電極を含むものであり、ここで、前記の複数の電極が、第１の複数のサブ電極および第２の複数のサブ電極を含むものであって、複数の各サブ電極は約Ｌの距離で実質的に周期的に間隔があけられており、第１および第２の複数のサブ電極は、約Ｒのオフセットで互いにかみ合わされており、前記第１の複数のサブ電極は前記第１の電極パッドと電気的に接触しており、前記第２の複数のサブ電極は前記第２の電極パッドと電気的に接触しており、それによって、前記の１以上の分離レーンに生じさせることが可能な前記電位が実質的に鋸歯形を有するものである、荷電粒子の分離装置。１１２．前記の１以上の分離レーンの前記長さ寸法が約10cm未満であり、前記の１以上の分離レーンの前記横断面寸法が約100μm未満である、請求項１１１に記載の装置。１１３．Ｒ／Ｌが約0.3未満である、請求項１１１に記載の装置。１１４．Ｌが約100μm未満であり、Ｒが約30μm未満である、請求項１１１に記載の装置。１１５．さらに、前記の１以上の分離レーンに荷電粒子をローディングするための手段を含む、請求項１１１に記載の装置。１１６．さらに、荷電粒子上のあらゆる標識を検出するための手段を含むものであり、その手段は分離レーン内で荷電粒子を分離した後に、標識を検出することが可能なように位置が定められている、請求項１１１に記載の装置。１１７．さらに、前記の１以上の分離レーン中の分離媒体を温度制御するための手段を含む、請求項１１１に記載の装置。１１８．電位に曝された分離媒体において分離の方向に沿って荷電粒子を分離するための最適パラメーターを選択する方法であって、（ａ）荷電粒子の拡散率および分離媒体の１以上の電気的破壊パラメーターを入力する工程；（ｂ）前記電位のオン状態の第１の最適時間を計算する工程であって、前記電位は、分離の方向に沿って配置された複数のポテンシャルウェルを含む定在的空間パターンを有するものであって、ここで、前記の各ウェルはポテンシャル最低部分を有するものであり、そして前記電位は、荷電粒子が前記ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引されるオン状態および荷電粒子が前記分離媒体中に拡散することができるオフ状態の少なくとも２つの状態間の反復変動を含む時間変動振幅を有するものであり、；（ｃ）前記電位の前記オフ状態の第２の最適時間を荷電粒子の合計分離時間を最小にする時間として計算する工程；および（ｄ）前記第１および第２の最適時間を出力する工程を含む前記方法。１１９．荷電粒子がＤＮＡ分子であり、前記入カエ程がＤＮＡ分子の長さを入力し、前記入力長さからＤＮＡ分子の拡散率を計算する工程を含む、請求項１１８に記載の方法。１２０．前記第１の最適時間を計算する前記工程が、前記の各ポテンシャルウェル内の実質的に全ての荷電粒子を前記ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分に誘引するのに十分な最小時間を計算する工程を含むものであって、ここで前記最小時間は、荷電粒子が、荷電粒子の電荷、前記ポテンシャルウェル中の電場および荷電粒子の前記拡散率に正比例した速度で前記分離媒体中を移動するモデルにしたがって決定されるものである、請求項１１８に記載の方法。１２１．前記第２の最適時間を計算する前記工程が、各荷電粒子が分離中に前記ポテンシャルウェル間をランダムウォークするモデルにしたがって前記合計分離時間を計算する工程を含むものであり、そして荷電粒子が１つの前記ウェルから別の前記ウェルヘランダムステップする確率が、前記荷電粒子が、前記オフ状態中に、前記の１つのウェルのポテンシャル最低部分から、前記の別のウェルの最も近接したポテンシャル最高部分へ拡散する確率によって得られるものである、請求項１１８に記載の方法。１２２．前記第２の最適時間を計算する前記工程が、前記電位における荷電粒子の拡散についての正確な方程式を解くことによって前記合計分離時間を計算する工程を含む、請求項１１８に記載の方法。１２３．前記オフ状態の前記第２の最適時間を計算する前記工程が、合計分離時間の最小値を見つけるために、最小値から前記オフ状態の時間を系統的に増大させる工程を含む、請求項１１８に記載の方法。１２４．前記の各ポテンシャルウェルが前記の分離の方向に沿って空間的サイズＬを有し、前記の各ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分が最も近接した隣接ポテンシャル最高部分から距離Ｒのところに配置されており、さらに、合計分離時間を最小にするＲの値を計算する工程を含む、請求項１１８に記載の方法。１２５．前記の各ポテンシャルウェルが前記の分離の方向に沿って空間的サイズＬを有し、前記の各ポテンシャルウェルの前記ポテンシャル最低部分が最も近接した隣接ポテンシャル最高部分から距離Ｒのところに配置されており、さらに、合計時間を最小にするＬおよびＲの値を計算する工程を含む、請求項１１８に記載の方法。１２６．前記同時最適化が、合計分離時間の最小値を見つけるために、Ｒを最小値から系統的に増大させるものである、請求項１２５に記載の方法。１２７．請求項１１８の方法を実施するコンピューターシステム。１２８．請求項１１８の方法を実施するためのプラグラムを包含するコンピューターで読み取り可能な媒体。１２９．さらに、前記装置の最適パラメーターを選択するために請求項１２８に記載のコンピューターで読み取り可能な媒体を含む、請求項２７、５１、６６、１０４、または１１１の装置。