JP4712694B2 - 哺乳動物細胞中で分泌型組換えタンパク質を高生産させるための分子シャペロンの使用方法 - Google Patents
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Description
本願は、2003年6月27提出の米国仮出願第60/483,505号の利益を主張するものであり、この仮出願はそのまま本明細書に文献援用される。
原核細胞においても真核細胞においても、分子シャペロンタンパク質は、ジスルフィド結合交換反応を触媒し、新規合成タンパク質の正しいフォールディングを支援する。この知見に基づき、これらの品質管理タンパク質に関して多くの研究が行われ、様々な使用法が提案されてきた。例えば、細菌、酵母および昆虫細胞発現系でのpDI(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ)活性の増大は、タンパク質の溶解性およびフォールディングに有効であり、場合によっては、異種タンパク質の分泌を増加させ得る(1〜7)。さらに他の研究で、分子シャペロン免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP、グルコース調節タンパク質とも称される)およびヒト熱ショックタンパク質70(Hsp 70)が昆虫細胞の発現系における組換えタンパク質の発現に有効であることが示されている(5、8〜12)。
いた。
本発明の1つの態様では、組換えタンパク質を高発現するための哺乳動物宿主細胞が提供され、この哺乳動物細胞は、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質を有し、カルネキシン、カルレティキュリン、Erp57、Hsp40およびHsp70からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種の発現ベクターで形質転換されている。
本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞のDNAに組み込まれる。
本発明の別の実施形態において、組換えタンパク質産物は、ビクニン、第VIII因子、IL2SA、またはそれらの断片を含む。
本発明の第2態様では、目的の組換えタンパク質またはその断片を高発現させるための哺乳動物宿主細胞を生産する方法を提供し、この方法は、目的の組換えタンパク質またはその断片の発現をコードする遺伝物質を有する哺乳動物細胞を得るステップと、カルネキシン、カルレティキュリン、Erp57、Hsp40およびHsp70からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種の発現ベクターで哺乳動物細胞を形質転換するステップとを含む。
本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞DNAに組み込まれる。
本発明の別の実施形態において、組換えタンパク質産物は、ビクニン、第VIII因子、IL2SA、またはそれらの断片を含む。
rp57、Hsp40またはHsp70をコードするDNAを含んでなる発現ベクターを用いて実施される。
本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞DNAに組み込まれる。
本発明の別の実施形態において、組換えタンパク質産物は、ビクニン、第VIII因子、IL2SA、またはそれらの断片を含む。
本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞DNAに組み込まれる。
本発明の別の実施形態において、組換えタンパク質産物は、ビクニン、第VIII因子、IL2SA、またはそれらの断片を含む。
本発明の別の実施形態において、導入は、カルレティキュリンをコードするDNAを含
んでなる第1のシャペロン発現ベクターと、Erp57をコードするDNAを含んでなる第2のシャペロン発現ベクターとを用いて実施される。
本発明の別の実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞DNAに組み込まれる。
本発明の別の実施形態において、組換えタンパク質産物は、ビクニン、第VIII因子、IL2SA、またはそれらの断片を含む。
本発明の別の実施形態において、シャペロンタンパク質はカルレティキュリンおよびErp57を含む。
本発明の1つの実施形態においては、組換えタンパク質産物を高発現させるための哺乳動物宿主細胞が提供され、この哺乳動物細胞は、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質を含み、カルネキシン、カルレティキュリン、Erp57、Hsp40およびHsp70からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種の発現ベクターでさらに形質転換されている。
用語「哺乳動物宿主細胞」とは、核酸配列でトランスフェクションされているか、または核酸配列でトランスフェクション可能であり、その結果、選択された目的遺伝子を発現し得る哺乳動物細胞を指して用いられる。この用語は、親細胞の子孫を包含し、子孫は、選択された遺伝子が存在する限り、形態または遺伝学的構成が元の親と同一であるか否かを問わない。
易に入手できる。
al)、「Basic Methods in Molecular Biology」、エルゼビア社(Elsevier)、1986年;およびチューら(Chu et al)、Gene、1981年、第13巻、p.197を参照されたい。そのような技術は、1種以上の外来DNA部分を適当な宿主細胞に導入するのに用い得る。
本発明の実施に用いるポリヌクレオチド、遺伝物質、組換えDNA分子、発現ベクターなどは、例えば、サムブルックら(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor(ニューヨーク)、1989年;本明細書に文献援用)により記載されたものなどの標準クローニング法を用いて単離し得る。あるいは、本発明の組換えタンパク質産物をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野では周知の標準技術、例えば自動DNA合成装置などを用いて合成し得る。例えば、本発明の1つの実施形態では、図1に示すプライマーを用いたRT−PCRにより、カルネキシンタンパク質をコードするDNA配列を合成する。
トランスフェクション後、細胞は、DNA構築物によって一過性の形質転換状態または安定な形質転換状態に保持され得る。複数のDNA構築物の導入および複数のDNA構築物を含む細胞の選択は、同時に、より好ましくは連続的に、実施し得る。遺伝物質または発現ベクターで安定に形質転換された細胞株を確立する技術は当技術分野では周知である(「Current Protocols in Molecular Biology」)。一般に、トランスフェクション後、DNA構築物を含む細胞を増殖培地により選択するが、例えば、薬剤選択を行うか、または必須栄養素を欠乏させて、DNA構築物上の選択マーカーもしくはDNA構築物と共にトランスフェクションされた選択マーカーによって該栄養素を補足することによって選択する。哺乳動物培養細胞は、通常、市販の血清含有培地または無血清培地で培養する。使用される特定の宿主細胞に適した培地の選択は当業者のレベルの範囲内である。
ッセイなどの方法で測定し得るが、それらの方法には限定されない。
本明細書において、用語「ビクニン」とは、少なくとも1つのクニッツ(Kunitz)ドメインを有する任意のタンパク質を指す。クニッツドメインについては、例えば、ラスコウスキーら(Laskowski et al)、Ann Rev Biochem、1980年、第49巻、p.593−626、および米国特許第5,914,315号(1999年6月22日)などの文献に記載されている。1つの好ましい実施形態において、本明細書に使用されている用語「ビクニン」とは、図5に示すアミノ酸配列を指す。他のビクニンタンパク質およびその断片は、米国特許出願番号第09/144,428号、同第09/974,026号、同第09/218,913号および同第09/441,966号、ならびに国際出願公開公報第97/33996号として公開されたPCT出願番号US97/03894号および国際出願公開公報第00/37099号として公開された同US99/04381号に記載されており、これらの特許文献は本明細書に文献援用される。
さらに別の好ましい実施形態において、第VIII因子を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞はBHK細胞である。
さらに別の好ましい実施形態において、IL2SAタンパク質を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞はCHO細胞である。
タンパク質をコードする発現ベクターでさらに形質転換される。
また本発明は、目的の組換えタンパク質またはその断片を高発現させるための哺乳動物宿主細胞を作出する方法を提供し、この方法は、目的の組換えタンパク質またはその断片の発現をコードする遺伝物質を有する哺乳動物細胞を得るステップと、カルネキシン、カルレティキュリン、Erp57、Hsp40およびHsp70からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種の発現ベクターで該哺乳動物細胞を形質転換するステップとを含む。
本発明の別の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードするDNAを含んでなる発現ベクターでさらに形質転換される。
ップとを含む。
すべてのシャペロン配列は、ヒトcDNAライブラリーからクローニングし、次いで、ヌクレオチド配列を確認した。ヒトcDNAライブラリーからRT−PCRにより3種のERシャペロンを表すDNA配列をクローニングした。これらの反応に用いたRT−PCRプライマーは、Genbankから得た適切な配列を用いて全コード領域を増幅するように設計した。各5’および3’プライマー対は、PCR産物を発現ベクターpCI−neo(プロメガ(Promega)社)にクローニングし易いようにEcoRI(5’プライマー)またはXbaI(3’プライマー)制限部位(図1)を含む。
CAT GGC CAA AGおよびR−Hsp70=5’GAA AGG CCC CTA ATC TAC CTC CTC Aとを用いて、RT−PCRにより、完全長のヒトHsp70 cDNA断片を得た。Hsp70のプライマー配列は、ヒトの熱ショックタンパク質(Hsp70)遺伝子に関して先に公開された配列[9]に由来するものとした。F−Hsp70およびR−Hsp70プライマーには、それぞれEcoRIまたはXbaI配列を含めた。所望のPCR断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、ヌクレオチドの塩基配列決定により確認した。次いで、この完全長のヒトHsp70 cDNA断片をpCI−neoベクターのEcoRIおよびXbaIクローニング部位に挿入してpCI−neo−Hsp70ベクターを作製した。pCI−neo−Hsp70ベクターを大腸菌で増殖させた後、ベクター配列を単離、精製した。pCI−neo−Hsp70プラスミドDNAをABI社のPRISM(登録商標)310型ジェネティック・アナライザで配列決定した。ヒトHsp70の配列を図2Dに示す。
組換えビクニンタンパク質を分泌するCHO細胞株(米国特許出願番号第09/441654号、本明細書に文献援用)を、ERシャペロン、カルネキシン(CNX)、カルレティキュリン(CRT)、Erp57またはHsp70の種々の組合せで重トランスフェクションした後、G418で選択した。細胞集団を取得し、カリクレインアッセイでスクリーニングした(米国特許出願番号第09/441,654号、本明細書に文献援用)。手短に述べれば、ビクニン標準液または培養液を系列希釈し、等容量のカリクレインと共に37℃で30分インキュベーションした後、発色基質N−ベンゾイル−Pro−Phe−Arg−pNAを加えた。反応液を15分インキュベーションしてから、50%酢酸を加えた。放出されたp−ニトロアニリドの量を405nmで測定した。次いで、ビクニン力価が最も高い集団から単細胞をクローニングし、数週間かけて増殖させた。コントロールのCF9−20細胞に比べて一貫して高いビクニン力価(2〜4×)を示すクローンを保持し、さらなる分析のために振盪フラスコで増殖させた。これらのクローンを、振盪フラスコ環境下での増殖中に示されたビクニン力価および増殖特性に基づいてさらに限定した。振盪フラスコの段階で数回詳細に分析した後、最終候補クローンを選択した。
した。
安定な第VIII因子産生細胞(MWCB1)(米国特許第4,965,199号;ATCC番号 CRL 8544)を、10:1比のシャペロン発現ベクターとpPUR(ピューロマイシン耐性遺伝子を含むベクター)でトランスフェクションした。約4×106個のMWCB1細胞を、6ウエルプレート中で、DMRIE−C(商標)試薬およびOPTI−MEM(登録商標)培地(米国メリーランド州所在のライフ・テクノロジー(Life Technology)社)を用いて合計5μgのDNAでトランスフェクションした。トランスフェクション3日後に、6ウエルプレートに100,000個の細胞を播種し、次いで、1〜2μg/mlのピューロマイシンの存在下、2%FBSを含むOPTI−MEM培地で2週間培養して選択した。ピューロマイシン耐性コロニーを手作業で採取し、96ウエルプレートに播種し、薬剤不在下で増殖させた。COATEST(登録商標)キット(イタリア国所在のクロモジェニックス(Chromogenix)社)を用い、製造業者の指示に従って、個々のクローン集団を第VIII因子の生産についてスクリーニングした。高生産クローンを6ウエルディッシュからT75フラスコまで順次増殖させた後、安定性および生産性をテストするために振盪フラスコの状態にした。次いで、カルネキシン(CNX)、カルレティキュリン(CRT)、Erp57、Hsp40およびHsp70シャペロンを個別に、または2種組合せて、細胞をトランスフェクションした。CNX、CRTおよびErp57、Hsp70、ならびにHsp40でトランスフェクションしたクローンでは第VIII因子の生産性に有意な2〜4倍の増大が観察されたのに対し、空のベクターコントロール(PCI−Neo)は、親株のMWCB1細胞に比べて差が認められなかった(表2)。
高レベルのビクニンを発現する組換えCHO細胞(実施例2に記載)と、高レベルの組換え第VIII因子(rFVIII)を発現する組換えBHK細胞(実施例3に記載)を、pHyg(ハイグロマイシン耐性を与えるプラスミド)およびpBiPで重トランスフェクションした。トランスフェクション条件および選択条件は実施例2と同じとした。ハイグロマイシン選択および限界希釈法によるクローニングの後、クローンをビクニン生産性およびrFVIII活性について評価した。コントロールベクター(pHyg)のみでトランスフェクションした細胞由来のクローンと、pBiPでトランスフェクションした細胞由来のクローンの固有生産率には有意な差がなかった。
IL2SA(IL2選択的アゴニスト;米国特許第6,348,192号、全体を本明細書に文献援用)を生産するCHO細胞株、39−19−H42(ATCC寄託株 PTA−8をクローニングしたバリアント)をPCI−GSおよびPCI−neo−Hsp70で同時にトランスフェクションした。4×106個の細胞を、DMRIE−C試薬およびOPTI−MEM培地(米国メリーランド州所在のライフ・テクノロジー社)を用い、製造業者の指示に従って、6ウエルプレート中で、2.5μgのプラスミドDNAでトランスフェクションした。トランスフェクション3日後に、細胞を150mmの96ウエルプレートに播種し、次いで、10μMのMSX(メチオニンスルホキシミン)および250μg/mlのG418の存在下、2%の透析済FBSを含むグルタミン欠乏DME:F12(1:1)培地で2週間培養して選択した。単細胞コロニーを採取し、96ウエルに再播種した。これらのコロニーを、高濃度のMSX(20μM)およびG418(400μg/ml)でさらに1週間選択培養した。3週間の選択培養後、150mmプレートからのプールが得られる。このプールとクローンを徐々に振盪フラスコまで増殖させ、ELISAを用いてIL2生産性についてスクリーニングした。フローサイトメーターを用いたFACS分析によりGSおよびHsp70タンパク質の発現を確認した。「GS陽性」細胞を、5.6mMのグルタミン酸と4g/Lのグルコースを追加したグルタミン非含有
培地で培養した。これらのクローンの倍加時間は24〜84時間の間でさまざまであった。親株とクローンの生産性の比較を表3に示す。いずれの単細胞クローンにおいても、プールまたは親株と比較して、力価全体では2〜4倍、固有生産率では2〜3倍の増大が観察された。
Claims (5)
- ベビーハムスター腎(BHK)細胞株における組換え第VIII因子の収量を増加させる方法であって、
改変BHK細胞株を形成するために、第1のBHK細胞株に、配列番号13のヌクレオチド配列からなるHsp70であるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種のシャペロンタンパク質発現ベクターを挿入するステップと、
前記改変BHK細胞株から、組換え第VIII因子産物の収量が増加した少なくとも1種の第2の細胞株を選択するステップと
を含んでなり、
前記第1のBHK細胞株には前記組換えVIII因子の発現をコードする遺伝物質があらかじめ導入されていることを特徴とする方法。 - 第1のBHK細胞のDNAに前記組換え第VIII因子の発現をコードする遺伝物質が組み込まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記BHK細胞が、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むベクターでさらに形質転換される、請求項1に記載の方法。
- ピューロマイシンの存在下で選択が実施される、請求項1に記載の方法。
- CHO細胞株における組換えIL2SAタンパク質の収量を増加させる方法であって、
改変CHO細胞株を形成するために、第1のCHO細胞株に、配列番号13のヌクレオチド配列からなるHsp70であるシャペロンタンパク質をコードするDNAを含んでなる少なくとも1種のシャペロンタンパク質発現ベクターを挿入するステップと、
前記改変CHO細胞株から、組換えIL2SAタンパク質の収量が増加した少なくとも1種の第2の細胞株を選択するステップと
を含んでなり、
前記第1のCHO細胞株の細胞DNAには前記組換えIL2SAの発現をコードする遺伝物質があらかじめ組み込まれており、
第2の細胞株が、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードするDNAを含んでなる発現ベクターでさらに形質転換されることを特徴とする方法。
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SG11202107877WA (en) | 2018-06-21 | 2021-08-30 | NanoMed Holdings Pty Ltd | Platinum-based amphiphile prodrugs |
MX2023005954A (es) | 2020-11-19 | 2023-09-04 | Zevra Denmark As | Procesos para preparar citrato de arimoclomol e intermediarios del mismo. |
CN116964213A (zh) | 2021-03-10 | 2023-10-27 | 住友制药株式会社 | 融合蛋白的制造方法 |
JPWO2022191252A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008012A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods for increasing secretion of overexpressed proteins |
JP2003501014A (ja) * | 1999-05-28 | 2003-01-14 | フォトゲン インク | 増強タンパク質安定化の方法およびその安定化タンパク質の生産に有用な細胞株の製造方法 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4649132A (en) | 1983-03-31 | 1987-03-10 | Scripps Clinic And Research Foundation | Treatment of Factor VIII inhibitors |
US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
US4912040A (en) * | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
US5149637A (en) | 1987-04-06 | 1992-09-22 | Scripps Clinic & Research Foundation | Recombinant Factor VIIIC fragments |
US5002874A (en) * | 1987-09-17 | 1991-03-26 | Genetics Institute, Inc. | Genetically engineered eucaryotic host cells capable of expressing modified forms of eIF-2α |
GB2237288A (en) * | 1989-10-18 | 1991-05-01 | Celltech Ltd | Amplification of a heterologous gene in recombinant eukaryotic host cells |
DE4113750A1 (de) * | 1991-04-26 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
US6291205B1 (en) | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
US5455338A (en) * | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
JP3656277B2 (ja) | 1995-05-17 | 2005-06-08 | 味の素株式会社 | 組換えdna法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法 |
WO1997033996A2 (en) * | 1996-03-11 | 1997-09-18 | Bayer Corporation | Human bikunin |
FR2755446B1 (fr) | 1996-11-04 | 1999-01-08 | Inst Curie | Lignees cellulaires stables exprimant la proteine cftr ou un mutant de cette proteine, outil de selection de molecules ayant un effet sur le transport intracellulaire de ces proteines |
US6136599A (en) * | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
JP3819239B2 (ja) | 1998-12-22 | 2006-09-06 | バイエル アクチェンゲゼルシャフト | 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法 |
US6348192B1 (en) * | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
US6476194B1 (en) * | 1999-06-29 | 2002-11-05 | National Research Council Of Canada | Method for folding unfolded proteins |
JP2003050104A (ja) | 2001-08-07 | 2003-02-21 | Kyocera Corp | 画像形成装置における光学センサ装置 |
KR100476347B1 (ko) * | 2002-09-30 | 2005-03-16 | 한국과학기술원 | 샤페론 단백질의 발현량을 조절함으로써 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법 |
US7244616B2 (en) | 2003-06-27 | 2007-07-17 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells |
US7226781B1 (en) * | 2003-07-24 | 2007-06-05 | Belyaev Alexander S | Chaperone expression genomes |
TWI567593B (zh) | 2014-12-18 | 2017-01-21 | 明基電通股份有限公司 | 能夠自動切換操作模式的多功能滑鼠裝置及其方法 |
US9703894B2 (en) | 2015-09-25 | 2017-07-11 | International Business Machines Corporation | Stored data with temporal proximity analysis for very large scale data with very low built in latency |
-
2004
- 2004-03-03 US US10/792,571 patent/US7244616B2/en not_active Expired - Lifetime
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2007
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-
2010
- 2010-06-23 JP JP2010143013A patent/JP5117542B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-25 US US13/115,417 patent/US8192985B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-05-04 US US13/464,543 patent/US8409857B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-03-06 US US13/786,614 patent/US20130189776A1/en not_active Abandoned
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-
2014
- 2014-06-06 US US14/298,437 patent/US9284591B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008012A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods for increasing secretion of overexpressed proteins |
JP2003501014A (ja) * | 1999-05-28 | 2003-01-14 | フォトゲン インク | 増強タンパク質安定化の方法およびその安定化タンパク質の生産に有用な細胞株の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1641825B1 (en) | 2014-09-03 |
CA2529369A1 (en) | 2005-02-03 |
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