JP4701099B2 - 液体の反応方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体の反応方法、該方法に用いられる反応容器、及び反応容器の蓋体に関し、より詳しくは、核酸やタンパク質等の生化学的試料の分析に用いられるハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応を行う方法、該方法に用いられる反応容器、及び該反応容器の蓋体に関する。

核酸やタンパク質等の生化学的試料の分析において、ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応等の各種反応はマイクロプレートを用いて行われる方法が一般的である。具体的には、マイクロプレートの各ウェルに試料を分注し、ウェルの開口部をアルミ製シートやポリプロピレン製シート等のプレートシールで密閉し、恒温槽で反応させる方法が行われてきた。

一方、本発明者らは、従来行われてきた一定の温度条件とは逆に、ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応等の生体高分子反応を、温度差を形成させた反応溶液中で行うことにより、反応を効率的に行わせることができ、該反応を用いた試料の検出において検出感度を著しく高めることができることを見いだし、既に提案している（特許文献１、特願２００５−３２５１０１号及び特願２００５−１７５０３１号参照。）。

しかしながら、一定の温度条件及び温度差を形成させた温度条件のいずれにおいても、反応後、プレートシールの内側に結露が生じ、測定値のばらつきが大きいといった問題が生じた。

従来の恒温槽での反応後の結露発生の問題を解決するために、例えば、特許文献２は、ウェルをプレートシールでシールした後、該シールに断熱材を重ねて、断熱材でマイクロプレートを覆い、恒温室で反応させる方法を提案している。しかしながら、温度差を形成させた温度条件で反応を行った場合、特許文献２記載の方法を適用しても、プレートシールの内側に水滴が付着し、測定値のばらつきが観察された。
国際公開第２００５／１０６０３１号パンフレット 特開２００２−２２７４９号公報

本発明は、液体の反応を利用した試料の分析において検出感度を高めることができ、更に測定値のばらつきを著しく低減することのできる液体の反応方法、該方法に用いられる反応容器、並びに反応容器の蓋体を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、マイクロプレートのウェル等の反応容器の試料収納部の開口部に吸水性部材を載せた状態でシールし、反応させることにより、測定値のばらつきが抑えられ、更に検出感度を著しく向上させることができることを見出した。

即ち、本反応容器は、液体の反応に用いられる反応容器であって、液体を収納する試料収納部が設けられた容器本体部と、該試料収納部の上部に設置される吸水性部材と、該吸水性部材の上部に設置される反応容器の蓋体本体と、を備えることを特徴とする。

前記吸水性部材が前記蓋体本体の下面に接合されていてもよい。
前記吸水性部材が濾紙又は吸水性シートであることが好ましい。
前記反応容器としては特に限定されないが、マイクロプレートが好適である。

本反応容器の蓋体は、液体の反応に用いられる反応容器の蓋体であって、蓋体本体と、該蓋体本体の下面に設けられた吸水性部材とを具備することを特徴とする。

本発明の液体の反応方法は、反応容器の試料収納部に液体を収納する工程と、前記試料収納部の上部に吸水性部材を設置し該吸水性部材の上部に前記反応容器の蓋体本体を設置する工程と、前記液体の加熱により反応を行う工程と、含む液体の反応方法であって、前記反応を、前記反応容器の下部を加熱し、前記反応容器の蓋体の上部を冷却又は反応容器下部の加熱温度よりも低い温度で加熱して行うことを特徴とする。

本発明方法は、本反応容器を用いて行うことができる。

前記反応が、抗原抗体反応又はハイブリダイゼーション反応であることが好ましい。
前記反応は、固相に固定化された分子と液相にある分子との反応に特に好適に用いられる。前記固相に固定化された分子が抗体であり、前記液相にある分子が抗原である、あるいは前記固相に固定化された分子が抗原であり、前記液相にある分子が抗体であることが好ましい。または、前記固相に固定化された分子、及び前記液相にある分子が共にポリヌクレオチドであることが好適である。

前記反応を、前記反応容器の下部を加熱し、前記反応容器の蓋体の上部を冷却又は反応容器下部の加熱温度よりも低い温度で加熱して行うことにより、検出感度を更に高めることができる。

本発明によれば、簡便に液体の反応の効率を向上させることができ、また、該反応を利用した核酸、抗原又は抗体等の試料の分析において検出感度を著しく高めることができるとともに、測定値のばらつきをなくすことができる。

以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。

図１は、本反応容器の蓋体１０の一例を示す断面概略説明図である。図１において、符号１０は本反応容器の蓋体であり、液体を反応させる反応容器の為の蓋体として用いられる。図１において、１２は蓋体本体であり、該蓋体本体の蓋体本体１２の下面（蓋体本体１２の反応容器側）に吸水性部材１４が設けられている。

前記蓋体本体１２は、従来公知の反応容器の蓋を広く使用可能であり、特に限定されず、反応容器に応じて適宜選択すれば良い。前記蓋体本体１２としては、例えば、アルミ箔、各種高分子フィルム等を単独又はラミネートして使用することが好ましい。また、公知のマイクロプレート用のプレートシール、例えば、アルミ製シート、ポリプロピレン製シート等を用いてもよい。

前記吸水性部材１４は、吸水性を有する部材であれば特に限定されないが、吸水性シートを用いることが好ましく、例えば、濾紙、フェルト、布、木綿、麻、パルプ、絹、ナイロンメンブレンなどの合成プラスチックなどが挙げられるが、濾紙がより好ましい。

前記吸水性部材１４は、前記蓋体本体１２の下面に接合されていることが好ましく、粘着剤や接着剤等を用いて前記蓋体本体１２の下面に一体的に接合されていることがより好ましい。例えば、前蓋体本体１２としてプレートシール等の粘着性シートを用い、蓋体本体１２に吸水性部材１４を貼付してもよい。

図２は、本反応容器の一例を示す断面概略説明図である。図２において、符号２０は、本反応容器であり、試料や試薬等の液体を収納する試料収納部２４が設けられた容器本体部２２と、反応時に前記試料収納部２４の上部に設置される吸水性部材２６と、反応時に前記吸水性部材２６の上部に設置される反応容器の蓋体本体２８と、を具備する。

図２では、容器本体２２としてマイクロプレートを用いた場合の例を示したが、本発明において、前記反応容器本体２２としては液体を収納するための１又は複数の試料収納部２４を有する反応器具であれば特に限定されない。なお、図２では、試料収納部２４として１列に６個のウェル（穴）を有するマイクロプレートを示したが、ウェル等の試料収納部２４の数は特に限定されないものである。
前記反応容器としては、例えば、マイクロプレート、試験管、マイクロアレイ等が挙げられるが、ポリスチレン製等のマイクロプレートがより好適に用いられる。

前記吸水性部材２６及び前記蓋体本体２８としては、それぞれ、前記本蓋体において述べた前記吸水性部材１４及び蓋体本体１２が同様に用いられる。
本反応容器２０において、前記吸水性部材２６は蓋体本体２８に接合されていることが好ましい。前記吸水性部材２６及び蓋体本体２８は、図２に示した如く別体となっていてもよく、粘着剤や接着剤等を用いて一体的に接合されていてもよい。前記吸水性部材２６及び前記蓋体本体２８として、前述した本蓋体１０が好適に用いられる。

次に、本発明の液体の反応方法について説明する。本発明の液体の反応方法は、反応容器の試料収納部に試料や試薬等の液体を収納する工程（ステップ１００）と、前記試料収納部の上部に吸水性部材を設置し該吸水性部材の上部に前記反応容器の蓋体本体を設置する工程（ステップ１０２）と、前記液体の加熱により反応を行う工程（ステップ１０４）と、含むことを特徴とする。

本発明の反応方法において、前述した本反応容器２０が好適に用いられる。
前記ステップ１０２は、前記試料収納部の上部に吸水性部材を設置した後、該吸水性部材の上部に前記反応容器の蓋体本体を設置してもよく、予め蓋体本体の下部に吸水性部材を接合させた蓋体を用いてもよい。

本発明の反応方法は、あらゆる液中での反応に適用可能であるが、特に、抗原と抗体による抗原抗体反応やポリヌクレオチドによるハイブリダイゼーション反応に効果的である。ハイブリダイゼーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法において、本発明方法を利用してハイブリダイゼーション反応を行うことにより、遺伝子の検出感度を著しく向上させることができる。前記ハイブリダイゼーション反応としては、特に限定はないが、ＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅反応（特許第３２６７５７６号公報、特許第３３１０６６２号公報、国際公開第０２／３１１９２号公報、特開２００２−３５５０８１号公報、国際公開第０３／０２９４４１号公報等参照。）が特に遺伝子の検出感度の向上が著しく好適である。

本発明方法は、従来の恒温条件での反応、並びに反応溶液に温度差を形成させた条件での反応（特許文献１、特願２００５−３２５１０１号及び特願２００５−１７５０３１号参照。）のいずれに対しても適用可能であり、検出感度の向上及びばらつきの解消の効果が得られるが、温度差を形成させた反応溶液中で行うことがより効果的であり好ましい。

前記反応溶液に温度差を形成させる方法としては、特に限定されないが、反応容器の下部を加熱し上部を冷却することが好ましい。反応容器の上部と下部の温度差は、特に限定されないが、上部を下部より５℃以上、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上低く設定し、反応容器内の反応溶液中に上下に温度差、例えば、温度勾配を設けることが好適である。
反応容器の下部を加熱し上部を冷却する方法は特に限定されないが、反応容器の下部を加熱可能な加熱手段を備え且つ上部を冷却可能な冷却手段を備えた温度制御装置を用いることが好ましい。

図７は、本発明方法を実施するために好適に用いられる温度制御装置の一例を示す概略説明図である。図７において、符号４０は温度制御装置で、反応容器を収納する容器収納部４２と、該反応容器を加熱する加熱手段４４と、該反応容器を冷却する冷却手段４６とを有している。図７において、符号４８は基台であり、該基台４８の上面に前記加熱手段４４が設けられている。該加熱手段４４の上部には前記容器収納部４２及び該容器収納部の側壁４９が設けられており、前記容器収納部４２の上部には冷却手段４６が設けられている。
前記加熱手段４４及び冷却手段４６は温度を制御できることが好ましい。図６及び７に示した如く、前記加熱手段４４及び冷却手段４６ともに平面で、それぞれ反応容器の底面及び蓋体本体の上面と接する構造であることが好ましい。

本発明方法は、固相に固定化された分子（第１の分子）と液相にある分子（第２の分子）との反応にも好適に用いられる。
前記固相とは不溶性担体であり、例えば、マイクロプレート、ビーズ、試験管、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられるが、ポリスチレン等のマイクロプレートが好ましい。

以下、固相に固定化された分子と液相にある分子との反応を行う場合の本発明方法について、図３〜図６を用いて説明する。
図３〜図６は、本発明方法の一例を示す断面概略説明図であり、図２に示した本反応容器を用いた場合の例を示した。なお、図３〜図６は図２の反応容器を用いた場合の例を示したが、本発明方法に用いられる反応容器としては、所定の反応が可能な反応器具であれば特に限定されないものである。

図３は、第１の分子を固定化した固相の一例を示す断面概略説明図であり、固相としてマイクロプレートを用いた場合の例を示した。
図３に示した如く、まず、第１の分子３２が所定の固定化部位、例えば底部２５に固定化されたマイクロプレート２２のウェル２４等の固相を準備する。

第１の分子を固相に固定化する方法は特に限定されず、公知のいずれの方法も適用できる。本発明において、固定化とは、第１の分子を直接固相に固定してもよく、第１の分子をその他の分子等を介して間接的に固相に固定してもよい。なお、図３〜図５は、マイクロプレートの底部に第１の分子を固定化させた場合の例を示したが、固定化部位は特に限定されないものである。

図４は、本発明の前記ステップ１００の一例を示す断面概略説明図であり、図中、符号３２は固相に固定化された第１の分子、符号３４は第２の分子、及び符号３６は反応溶液（液相）である。図４に示した如く、固相としてマイクロプレートのウェルを用いる場合、該マイクロプレートのウェルを反応容器の試料収納部として用いることが可能である。
図４に示した如く、前記準備したマイクロプレート２２のウェル２４に、第２の分子３４を含む又は含む可能性のある反応溶液３６を添加する（ステップ１００）。図４中、ウェル２４ａは第２の分子を含まない試料を添加した場合を示し、ウェル２４ｂ〜２４ｆは第２の分子を含む試料を添加した場合を示した。

なお、図３〜図６はマイクロプレートを反応容器及び固相として用いる場合の例を示したが、反応容器と固相を別途用意する場合も本発明に含まれるものである。例えば、固相としてビーズや磁気粒子等を用い、該固相に第１の分子を固定化させ、反応容器の試料収納部に添加してもよい。

図５は、本発明のステップ１０２の一例を示す断面概略説明図である。
図５に示した如く、反応容器の試料収納部、例えば、マイクロプレート２２のウェル２４中の液体と蓋体本体２８との間に吸水性部材２６が位置する状態で、蓋体本体２８により前記マイクロプレート２２をシールし（ステップ１０２）、その後、所定の温度条件にて反応を行う（ステップ１０４）。
前記ステップ１０２は、反応容器の試料収納部２４の上部に吸水性部材２６を載せた後、該試料収納部２４を蓋体本体２８でシールしてもよく、予め蓋体本体２８の下面に吸水性部材２６を一体的に接合させた蓋体を用いて試料収納部２４をシールしてもよい。また、前記本蓋体１０を用いて前記試料収納部２４をシールすることが好適である。

図６は、本発明のステップ１０４の一例を示す断面概略説明図であり、図７に示した温度制御装置を用いた場合の例を示した。図６において、温度制御装置４０は図７と同様に構成されている。図６に示した如く、温度制御装置４０の容器収納部４２に前記シールした反応容器２０を載置し、加熱手段４４によりマイクロプレート２２の下面全面を均一に加熱し且つ冷却手段４６により蓋体本体２８の上面全面を均一に冷却する条件下で所定時間反応を行うことが好ましい。
なお、図６では、図７の温度制御装置を用いて液体を加熱させる方法を示したが、本発明において液体の加熱の方法は特に限定されず、恒温槽等の従来公知の温度制御装置を用いる場合も本発明に含まれるものである。

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。

（実施例１）
０．１ｍＭの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）溶液（溶媒メタノール）を緩衝液［０．１Ｍ グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）］で１００倍希釈し、蛍光試料（４−ＭＵ；０．００１ｍＭ）として用いた。
マイクロプレートプレート（ＮＵＮＣ社製、フルオロヌンクモジュールプレートＦ１６）の各ウェル（全９６ウェル）に前記蛍光試料を１００μＬずつ加え、マイクロプレートの重さを測定した。また、パーキンエルマー社製１４２０ ＡＲＶＯＳＸマルチラベルカウンターを用いて各ウェルの蛍光強度を測定し、蛍光強度の平均値、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を計算した。蛍光強度の測定結果を表１に示す。

一面に濾紙（Whatman社製、3MM Chr）を貼付したアルミシールを準備し、該濾紙貼付アルミシールを、濾紙が内面となるように前記マイクロプレート上に設置し、マイクロプレートをシールした。
図７と同様の温度制御装置を用いて、マイクロプレートの下面を５５℃、上面を２０℃に制御した条件下で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、マイクロプレートからアルミシールを剥がし、マクロプレートの質量測定を行った。その後、マイクロプレートで被覆し遮光しながら１０分間静置した後、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の測定結果を表２及び表３に、マイクロプレートの質量測定の結果を表４に、それぞれ示す。

（実施例２）
濾紙貼付アルミシールの代わりに結露吸収シート（リンテックコマース（株）製、ＨＧＫ−０１Ｓ）を貼ったアルミシールを用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。マイクロプレートの質量測定の結果を表４に、蛍光強度の測定結果を表５〜７にそれぞれ示す。

（比較例１）
濾紙貼付アルミシールの代わりにアルミシール（ビーエム機器（株）製、ＴＡ−Ｉ）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。マイクロプレートの質量測定の結果を表４に、蛍光強度の測定結果を表８〜１０にそれぞれ示す。

（比較例２）
濾紙貼付アルミシールの代わりに透明断熱フィルム（大幸（株）製、ＩＫ−０１）を貼ったアルミシールを用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。マイクロプレートの質量測定の結果を表４に、蛍光強度の測定結果を表１１〜１３にそれぞれ示す。

表１〜表１３に示した如く、本発明方法を用いることにより、検出感度を高めることができ、更に測定値のばらつきを著しく低減することができた。

本蓋体の一例を示す断面概略説明図である。 本反応容器の一例を示す断面概略説明図である。 第１の分子を固定化した固相の一例を示す断面概略説明図である。 本発明の反応方法のステップ１００の一例を示す断面概略説明図である。 本発明の反応方法のステップ１０２の一例を示す断面概略説明図である。 本発明の反応方法のステップ１０４の一例を示す断面概略説明図である。 本発明の反応方法に好適に用いられる温度制御装置の一例を示す断面概略説明図である。

符号の説明

１０：本蓋体、１２、２８：蓋体本体、１４、２６：吸水性部材、２０：反応容器、２２：容器本体、マイクロプレート、２４，２４ａ〜２４ｆ：試料収納部、ウェル、２５：ウェルの底部、３２：第１の分子（固相に固定化された分子）、３４：第２の分子（液相にある分子）、３６：液相（反応溶液）、４０：温度制御装置、４２：容器収納部、４４：加熱手段、４６：冷却手段、４８：基台、４９：温度制御装置の側壁。

Claims (9)

1. 反応容器の試料収納部に液体を収納する工程と、前記試料収納部の上部に吸水性部材を設置し該吸水性部材の上部に前記反応容器の蓋体本体を設置する工程と、前記液体の加熱により反応を行う工程と、含む液体の反応方法であって、前記反応を、前記反応容器の下部を加熱し、前記反応容器の蓋体の上部を冷却又は反応容器下部の加熱温度よりも低い温度で加熱して行うことを特徴とする液体の反応方法。
2. 液体を収納する試料収納部が設けられた容器本体部と、該試料収納部の上部に設置される吸水性部材と、該吸水性部材の上部に設置される反応容器の蓋体本体と、を備える反応容器を用いることを特徴とする請求項１記載の反応方法。
3. 前記吸水性部材が前記蓋体本体の下面に接合されていることを特徴とする請求項２記載の反応方法。
4. 前記吸水性部材が濾紙又は吸水性シートであることを特徴とする請求項２又は３記載の反応方法。
5. 前記反応容器がマイクロプレートであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の反応方法。
6. 前記反応が、抗原抗体反応又はハイブリダイゼーション反応であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の反応方法。
7. 前記反応が、固相に固定化された分子と液相にある分子との反応であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の反応方法。
8. 前記固相に固定化された分子が抗体であり、前記液相にある分子が抗原である、あるいは前記固相に固定化された分子が抗原であり、前記液相にある分子が抗体であることを特徴とする請求項７記載の反応方法。
9. 前記固相に固定化された分子、及び前記液相にある分子が共にポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項７記載の反応方法。

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