JP4678828B2

JP4678828B2 - 生体物質処理装置および方法

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Publication number: JP4678828B2
Application number: JP2004536867A
Authority: JP
Inventors: シーベンコッテン、グレゴル; ミュラー−ハルトマン、ヘルベルト; リーメン、グデュラ; クラウス、グンテル
Original assignee: ロンザ・ケルン・アーゲー
Priority date: 2002-09-16
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: DE50312452D1; DK1543102T3; US7704727B2; ATE458806T1; WO2004027015B1; AU2003269825A1; EP1543102B1; CN100334192C; JP2005538730A; US20060160221A1; EP1543102A1; CN1694952A; WO2004027015A1; DE10243086A1

Description

本発明は、生体物質処理装置に関し、前記装置は、外部に対して少なくとも閉じることができ、かつ、前記生体物質を受けるための内部空間を含むチャンバーを少なくとも含み、前記チャンバーが、前記チャンバーの前記内部空間に接触した状態で配置され、かつ、電場発生に供する電極を少なくとも１つ含む生体物質処理装置に関する。さらに、本発明は、生体物質処理方法に関し、前記生体物質を、チャンバーの内部空間に導入し、前記チャンバーは、外部に対して少なくとも閉じることができ、かつ、前記チャンバーの内部空間に接触した状態で配置され、電場発生に供する電極を少なくとも一つ含むチャンバーであって、前記生体物質を導入後、前記電極と前記チャンバーの内部空間に接触するさらなる電極とに電圧を印加することにより、前記内部空間に前記電場を発生させる方法に関する。

例えば、ＤＮＡｓ、ＲＮＡｓまたはタンパク質といった生物活性分子を、生体細胞に転移させることは、これらの分子の生物学的機能を分析するための重要な手段である。エレクトロポレーションは、前記細胞に異質分子を転移させるための好ましい方法である。この方法は、化学的方法とは違って、その他の生物活性分子の同時輸送に依存されない。エレクトロポレーションの間、短時間の電流フローにより、異質分子は、前記細胞に適合させた緩衝液または細胞培地から前記細胞に導入される。前記細胞膜が、短時間の電気パルスの働きにより、前記異質細胞を透過させる。前記細胞懸濁液は、通常、いわゆるキュベット、すなわち、上方が開いており、底辺近くの側壁に配置され、電界の印加に使用する２つの平行かつ向かい合って配列する電極を含む小さな容器に準備される。前記細胞膜に一時的に現れた“孔”を通して、前記生物活性分子を、最終的にそれらの機能を発揮する細胞質にはじめに到達させ、分析される。また、特定の条件では、前記分子は、その後、前記細胞核に入る。

また、強い電場、すなわち、高電流密度を有するショートパルスを一時的に印加することにより、細胞、細胞誘導体、細胞よりも小さい粒子（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒｔｉｃｌｅ）および／または小胞を融合できる。このいわゆるエレクトロフュージョンの間、まず、例えば、前記細胞の膜を、不均一な交流電場により密接に接触させる。次に、電場パルスの印加により、前記膜部分の相互作用を誘導し、最終的には細胞融合を誘導する。なお、類似の装置、例えば、エレクトロポレーションに使用する装置は、エレクトロフュージョンに使用できる。

上記の容器は既知であり、金属製の電極が挿入されたキュベットの形で、エレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンに主に使用される。この目的で使用される容器は、主に、底部が閉じ、かつ、上方が開いており、その内部空間は、２組の平行および向かい合って配列される側壁により形成される。前記内部空間は、細胞の懸濁液、すなわち、通常、処理される細胞を懸濁させる水性緩衝液または細胞培地を入れる役割をする。このようなキュベットは、主に、電圧印加用であって、一対の向かい合って配列する側壁の底部付近に配置される電極を一対含む。放電の間、電流は、前記細胞懸濁液を通って双方の電極間を流れ、前記細胞への核酸またはその他の分子の導入を可能にし、また、選択条件により、細胞融合を誘導する。前記電極は、主に、金属製であり、中でも、アルミニウムがしばしば使用されている。

例えば、電場における細胞処理用チャンバーとしては、生体細胞を含む懸濁液を受けるための内部空間を含み、少なくとも２つの電極が、それぞれ、前記内部空間に突き出るチャンバーが知られている（例えば、特許文献１参照）。通常、これらの電極は、前記電極間に電場を発生させるために電圧を印加する役割を果たし、前記細胞を前記電場にさらす。前記チャンバーが細胞融合に供するとしても、細胞への核酸の転移、すなわち、いわゆるエレクトロポレーションに使用してもよい。前記チャンバーの内部空間は、全ての面が密封されており、前記内部空間を囲む壁面の1つの領域は、針またはカニューレによって穴をあけることができる。すなわち、前記壁の領域は、穴をあけることができるアセチルセルロース製の薄膜を部分的に含んでいてもよい。前記細胞懸濁液を前記チャンバー内に注ぎ、この貫通可能な薄膜を通じてそこから除去できる。これは、無菌状態下で前記細胞の処理ができることから、有利である。しかしながら、前記細胞の処理後、前記チャンバーを、付随的、かつ、不十分にしか洗い流すことができないため、処理された細胞の大部分が、前記チャンバーの内部空間に常にとどまっていることになる。

電場で細胞を処理するためのチャンバーとしては、以下のものが知られている（例えば、特許文献２参照）。前記チャンバーにおいて、前記内部空間は、内部ボディーと、前記内部ボディーの縦軸と同等の距離で囲む外部ケーシングとによって制限される。前記内部空間に突き出る電極は、同等のリードを有するマルチスレッドのスクリューの形で内部ボディーを囲む。前記チャンバーは、前記細胞濁液導入用の密封可能な導入ライン、および、前記細胞懸濁液除去用の密封可能な排出ラインを有する。すなわち、このチャンバーは、流入型チャンバーとしても同様に使用できる。この場合、規定量の細胞懸濁液を、前記チャンバーに圧入するか、吸入させ、ついで、電気処理を行い、最終的には、前記チャンバー内に配置した細胞懸濁液を前記チャンバーの外に押出すかまたは吸出し、新たな量の細胞懸濁液に置き換える。前記細胞の電気処理後、間隙を通じて内部空間に圧入できる洗浄液で、前記内部空間を洗い流すことができる。しかしながら、この形態では、前記細胞の電気処理後、洗浄液の使用を伴わない、すなわち、前記細胞の生育力の保護下での、前記チャンバーの効果的な水洗は、不可能である。なぜなら、高流量で、前記電極の全表面に沿って、前記溶液を流すことはできないためである。

さらに、電場中で細胞を処理するためのチャンバーが知られている（例えば、特許文献３参照）。前記チャンバーにおいて、前記細胞懸濁液を受けるための内部空間を形成する壁面は、内部電極および外部電極を含む。前記チャンバーは、前記細胞懸濁液を導入するための開口部、および、処理された細胞を除去するための排出用開口部を含み、前記細胞懸濁液を導入するための開口部は、プラグによって閉じられる。規定量の懸濁液を、ピペットを用いて前記内部空間に導入し、その後、電気的に処理する。追加の正確な量の溶液を導入することにより、前記細胞懸濁液を、前記排出用開口部を通じて、前記内部空間の外に押し下げる。前記チャンバーの構成および、内部電極および外部電極の形での電極の配置のため、高流量で処理された細胞を洗い流すことは実現不可能である。

小胞を電気的に処理するためのチャンバーであって、環状の接管によって形成されるチャンバーが開示されている（例えば、特許文献４参照）。小胞を含む懸濁液の保持用内部空間は、前記接管から間隔を置いた内部管によって形成される。前記接管と内部管との間に配置される単離物質は、内部空間を外部から入手可能にさせる２つの通路により取り除く。前記電極は、それぞれ円板で構成され、前記円板は、接管の上部と底部とに配置され、前記内部空間の底板および上板をそれぞれ形成する。また、この装置において、管状構造の前記内部空間および頂部および底部に位置する電極のため、効果的な流量で、処理された小胞を完全に洗い流すことは実現不可能である。

エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンのための現在知られているすべての装置および方法の欠点は、処理された細胞および小胞を、前記チャンバーから完全に除去できない点であり、すなわち、比較的多くの生体物質の損失となる。特に、使用した電圧パルスが非常に強い磁場強度を有する場合、すなわち、前記電場が、高い電流密度を有する場合、細胞物質は、前記電極、主として、陰極にしばしば堆積される。さらに、激しいガス発生がしばしば起こり、泡を形成し、結果として処理された細胞の完全な除去を妨げる。
独国特許発明第３３２１２３９号明細書（DE 33 21 239 C2）独国特許発明第３３１７４１５号明細書（DE 33 17 415 C2）独国特許発明第３５２２６１０号明細書（DE 35 22 610 C2）米国特許第４８４９０８９号明細書

それゆえ、冒頭に記載したように、上記した欠点を回避し、できる限り外部から密封されるチャンバーから処理された細胞の回収を可能にする装置および装置を提供することにより、本発明によって前記問題を解決する。

本発明によれば、前記問題は、前記電極に近接して配置される少なくとも一つの開口部を含む少なくとも１つの導入ラインを含むチャンバーを含む装置によって解決される。この特徴的な配置により、たとえ、密閉状態かつ無菌状態下であったとしても、前記チャンバーの内部空間を効果的に洗い流すことができ、特に、前記電極の重要な領域を、まず、前記溶液によって洗い流すことができる。すなわち、前記チャンバーの内部表面に付着する生体物質を効果的に除去でき、使用した物質をほぼ完全に除去できる。これは、主に、ほんの少量でしか入手できない貴重な物質の使用に有益である。

その結果、前記導入ラインを管状に設計した場合、すなわち、その縦方向の範囲に比べてより小さい断面を有する場合、有効である。それゆえ、この構成により、前記導入ライン内およびその開口部で高流量を実現できる。

本発明の好ましい形態において、前記導入ラインの内径が、前記電極に向かって減少してもよい。また、これにより、前記導入ラインの開口部での高流量をもたらし、そのため、効果的なすすぎ操作につながる。それゆえ、前記内径は、前記導入ラインの全長にわたって、徐々に、連続して減少してもよいし、または、前記開口部近くの領域に限定してもよい。後者の場合、前記開口部は、ノズル状に設計してもよい。

本発明のさらなる形態において、溶液を受けるための、壁で覆われている少なくとも１つのリザーバーが、前記導入ラインを介して前記内部空間と少なくとも接続可能であるものを提供する。これは、前記細胞が、細胞培地ではなく、細胞の電気処理に最適な緩衝液中で処理される場合に特に有利である。この場合において、前記処理の終了後、直ちに、前記細胞を適合させた溶液で前記緩衝液を希釈することが条件である。前記リザーバーが、前記内部空間に直接接続できるため、処理の間に使用した緩衝液の希釈をすばやくかつ簡単に行うことができる。

前記チャンバーを洗い流すための溶液を保持するリザーバーは、前記内部空間に接続でき、前記チャンバーの内部空間および前記リザーバーが、分離ユニットによって互いに分離してもよく、前記溶液は、前記分離ユニットを通じて前記チャンバーの前記内部空間に選択的に導入できる。これは、主に、前記リザーバーが、前記内部空間と堅く連結される場合、前記溶液が、前記細胞の処理が終了するまで、前記内部空間に入ることはないため、有利である。それゆえ、前記分離ユニットは、バルブ、または、圧力を加えることにより破壊できる脆い膜であってもよい。この形態において、前記チャンバーを、無菌状態下で主に重要である外部からの簡単な操作によって洗い流してもよい。

無菌状態下で行う臨床応用のために、外部に対して少なくとも無菌状態で密封されるチャンバーを提供する。前記チャンバーは、プレフィルされ閉じたユニットの形で輸送すべきである場合、例えば、生物活性分子を溶解した緩衝液を有する場合、前記チャンバーは、加えて、耐水性および/または耐ガス性であってもよい。

本発明の特に有利な形態において、前記リザーバーを形成する壁面が、弾力性および/または変形可能な物質を含んでいてもよい。これにより、前記リザーバー内に配置した溶液に外部から圧力を加え、そのため、高流量での前記導入ラインに前記溶液の流入を可能にする。また、その他の形態において、負の圧力によって前記溶液を前記リザーバーから吸い取る場合、流出する溶液に応じて前記壁面を収縮できる。

本発明によれば、前記リザーバーは、前記チャンバーに少なくとも接続可能であればよい。例えば、前記リザーバーは、前記チャンバーと接続し、１つの構成要素を形成してもよい。これにより、双方の部品を、１つのユニットとして輸送および使用できる。また、前記チャンバーと接続部材、好ましくは、ルアーロックを介して接続可能でもよく、これにより双方の部品を分離して輸送および保管できる。後者の場合において、すでに現在、使用者が有している様々なリザーバーを、本発明のチャンバーに使用できる。本発明の有利な形態において、前記チャンバーおよび前記リザーバーは、外部に対して少なくとも無菌的に密封されるユニットを形成する。

本発明の特に有利な形態において、少なくとも一つの壁の領域を有するチャンバーを提供し、前記壁の領域は、セルフシールであって、かつ、穴をあける（好ましくはカニューレによって）ことができ、および/または、接続部材、好ましくはルアーロックを含む少なくとも一つの導入ラインを備える。例えば、細胞またはその他の生体物質の懸濁液を、無菌状態下で、このような壁の領域または特別な接続部材を通じて、前記チャンバーの内部空間に導入できる。

生体物質の回収をさらに改良できる。前記チャンバーが、より小さい断面を有する場合、および/または、前記チャンバーが、サーペント型または螺旋状等を形成する場合、前記内部空間内において前記溶液は高流量となる。

本発明の別の形態において、前記チャンバーは、少なくとも１つの分割部材によって様々なサブユニットに分割されてもよい。この場合、前記分割部材は、バルブまたはフィルターを含んでいてもよい。

処理された生体物質を受けるために、容器を準備する。前記容器は、前記チャンバーの排出用開口部に少なくとも接続可能であり、例えば、前記チャンバーと接続し、１つの構成要素を形成するか、または、接続部材、好ましくはルアーロックを介して前記チャンバーと接続可能である。仕切部材は、前記チャンバーと前記容器との間に配置してもよい。前記仕切部材は、バルブまたはフィルター素子が好ましい。前記フィルター素子の材質は、より大きな粒子および複合体を保持する一方で、前記処理された生体物質が前記フィルターを透過できるものを選択することが適当である。このようにして、電気的処理の間に生じた好ましくない組成物が、最終生成物に存在することを回避できる。これは、臨床用途で主に重要である。

本発明の有利な形態において、前記容器は、セルフシールであり、かつ、穴をあけることが（好ましくは、カヌーレにより）できる壁の領域を少なくとも１つ含む。また、前記容器は、接続部材、好ましくはルアーロックを含む少なくとも１つの排出口を備えていてもよい。双方の形態は、前記容器から処理された生体物質の容易かつ無菌除去を可能にする。また、前記容器は、例えば、シリンジまたは輸液ポットであってもよく、例えば、臨床分野において、処理された生体物質を治療するヒトに直接投与できる。

容器およびチャンバーは、ともに輸送および保管できるように、外部に対して無菌で密封されるユニットを形成していてもよい。

前記チャンバーおよび/または前記容器の壁の領域であって、セルフシールであり、かつ、穴をあけることができる壁の領域は、合成物質、例えば、ポリシロキサン、エラストマーまたはゴム、若しくはプラスチック製の薄膜を含む。前記薄膜は、例えば、アセチルセルロース製であってもよい。

本発明の好ましい形態において、前記チャンバーは、２つの向かい合って配列する電極を含み、前記電極は、互いに前記内部空間に接触して取り付ける。

また、さらなる電極を、前記チャンバーの前記内部空間に導入できる。

特に好ましくは、前記電極または前記複数の電極が、導電性合成物質、好ましくは、導電性物質をドープしたプラスチック物質を含み、ゆえに、生体細胞に対して毒性を示す金属イオンが、前記電極から放出されない。これは、生体細胞、特に、真核細胞を処理する場合、細胞の生存率の観点から有利である。

本発明によれば、前記問題を以下の方法によって解決する。つまり、前記電場を発生させた後、前記生体物質を前記チャンバーの前記内部空間を溶液によってほとんど完全に洗い流し、前記溶液を、少なくとも１つの電極に沿って前記チャンバーの導入ラインを介して誘導する方法である。すなわち、前記チャンバーの内部表面、特に、電極領域に付着した生体物質を、効果的に除去し、ほぼ完全に前記物質を回収できる。

それゆえ、前記溶液が、高流量で前記電極に沿って誘導できる条件において有利である。

生体物質、特に、生体細胞は、陰極に付着する傾向があるので、本発明の方法の好ましい形態において、前記溶液を、まず前記陰極に沿って誘導する。

前記方法のさらなる形態において、前記生体物質を、セルフシールであり、かつ、穴をあけることができる壁の領域を通じて、シリンジ等により、前記チャンバーの前記内部空間に導入する。

前記方法の有利な形態において、分離ユニットは、外部からの機械による衝撃によって開き、前記分離ユニットは、前記チャンバーの前記内部空間を、前記溶液を保持するリザーバーから分離し、前記リザーバーは、前記導入ラインを介して前記チャンバーと接続されるか、または、接続可能である。このように、溶液およびチャンバーは、前記溶液によって内部空間の不要な汚染物質を伴うことなく、輸送および保管できる。すなわち、前記内部空間を、無菌条件下で選択的に洗い流すことができるため有利である。さらに、前記溶液を、電気処理後、すぐに前記内部空間に導入できるため、前記生体物質にはあまり適していないが、電気処理に適している緩衝液を、結果的には前記溶液により希釈できる。それゆえ、前記分離ユニットは、少なくとも一方向への外部からの機械による衝撃により開くことができるバルブか、または、外部から圧力を加えることにより破壊できる脆い部材であってもよい。前記脆い部材としては、合成物質製であることが好ましく、例えば、ポリビニレン、ポリステロール、ポリエチレンまたはセルロース製の薄膜が好ましい。また、前記合成物質は、水蒸気に対する透過性が低く、機械的破壊性に優れるフルオロハロカーボンで覆われていてもよい。

前記方法の有利な形態において、さらに、生体物質および溶液を、それぞれ、前記チャンバーの外部開口部に少なくとも接続可能な容器に導入することを提供する。この容器を用いることによって、前記処理された物質を、非常に簡単な方法で、直接、さらなる使用に備えることができる。

本発明のさらなる形態において、前記溶液を保持するリザーバーは、少なくとも一部が、伸縮性、または、変形可能な壁面によって形成され、前記壁面に外部から圧力を加える。このようにすれば、加圧下で、前記溶液が前記チャンバー内をすすぐことにより、前記方法の効率をさらに改善できる。さらに、加圧により、無菌条件下で前記分離ユニットを容易に破壊でき、前記溶液を保持するリザーバーから前記チャンバーの内部空間を分離する分離ユニットを開けてもよいため、有利である。

また、前記チャンバーと前記容器との間に配置される仕切部材、特に、バルブまたはフィルターを通じて、前記容器に前記生体物質を洗い流すことにより、選択的な洗い流しおよび/または摂動成分の除去を実現してもよい。

特に臨床分野において、セルフシールであり、かつ、穴をあけることができる壁の領域を通じて、シリンジ等を用いて、前記容器から、処理された生体物質を除去する点で有効である。この結果、必須の無菌性が得られ、加えて、前記処理された物質の簡単かつ直接使用を確実にする。
前記方法のさらなる形態において、前記生体物質は、生物活性分子、好ましくは、核酸を、前記電場の発生によって転移させるか、または、前記電場の発生によって融合させる生体細胞、好ましくは真核細胞、細胞誘導体、細胞よりも小さい粒子（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒｔｉｃｌｅ）または小胞を含む。

前記生体物質を添加する前に、前記生物活性分子を、緩衝液中に溶解し、前記チャンバーの内部空間に導入してもよい。この方法によれば、使用者は、ただ生体物質を添加すればよいので、前記方法を極めて容易にする。

本発明のある形態において、前記生体細胞への前記生物活性分子の転移は、１２０Ａ/ｃｍ²以下、好ましくは８０Ａ/ｃｍ²以下の電流密度により実施されるか、または、２〜１０ｋＶ＊ｃｍ^-1の電界強度、かつ、１０〜２００μｓの持続時間を有する電圧パルスにより実施される。

本発明のさらなる形態において、前記生体細胞への前記生物活性分子の転移は、継続的な前記電圧パルスに続いて、２〜１４Ａ/ｃｍ²、好ましくは５Ａ/ｃｍ²の電流密度、および、１〜１００ｍｓ、好ましくは５０ｍｓの持続時間を有する電流によって実施される。

（図面の詳細な説明）
本発明を、以下の図面の例によってさらに詳細に説明する。
図１には、それぞれ、本発明の方法の異なる工程に関して、本発明の装置の特有の形態の側面図、部分透視図および部分断面図を示す。
図２には、互いに９０°回転させた、本発明の装置のさらなる形態の２種類の断面図を示す。
図３には、本発明のさらなる形態の正面断面図を示す。
図４には、図３の形態の後方断面図を示す。
図５には、本発明の装置のさらなるその他の形態の正面断面図を示す。
図６には、サーペント型のチャンバーを含む本発明の装置の一部の正面断面図を示す。
図７には、Ｕ型のチャンバーを有する本発明の形態の配置図を示す。
図８には、本発明のさらなる形態の配置図を示す。

（本発明の詳細な説明）
図１には、それぞれ、本発明の方法の異なる工程に関して、本発明の装置の特有の形態の側面図、部分透視図および部分断面図を示す。この特に有利な形態において、本発明の装置は、全ての方向において、無菌的に密封され、かつ、防水処理されたユニットであり、完全に無菌条件下での細胞の処理が可能になるユニットである。

図１ａには、本発明の装置の底部領域の断面図を示す。前記装置のこの領域は、内部空間２を含むチャンバー１を有し、前記内部空間２は、生体物質、例えば、生体細胞の懸濁液を入れる役割を果たす。２つの共面電極３、４は、この内部空間２に挿入され、前記内部空間２は、前記チャンバー１の底部領域の２つの側面において前記電極と接する。上部領域において、前記チャンバー１は、フィルター５を含む。なお、この図において、前記フィルター５は、単に一部分を示す。前記フィルター５は、前記内部空間２を前記装置の他の部分から分離する。前記内部空間２は、例えば、核酸等の生物活性分子を含む緩衝液６を保持できる。例えば、遺伝子治療のために、前記緩衝液６に溶解した分子を、前記チャンバー１内に存在させていてもよい。使用者は、前記チャンバー１の内部空間２に患者から回収した細胞を単に導入するだけで、その後、電場を生じることによって前記細胞内にＤＮＡが誘導される。

図１ｂには、図１ａに示した本発明の装置の横方向からの斜視図を示し、前記装置は、図１ａに対して９０°回転させたものである。この図において、前記電極３は、前記内部空間２の底部領域を覆う。この図から、チャンバー１が、電極３、４の直近に位置する開口部８を有する導入ライン７を含むことが分かる。チャンバー１は、リザーバー９に連結して１つの構成要素を形成する。前記リザーバー９は、前記チャンバー１の内部空間２を洗い流すための溶液１０を含む。前記チャンバー１および前記リザーバー９は、分離ユニット１１によって互いに分離する。この分離ユニット１１は、例えば、バルブ状のロック、脆い膜であってもよい。加えて、前記チャンバー１は、容器１２に連結して１つの構成要素を形成する。前記容器１２は、前記フィルター５によって前記チャンバー１の内部空間２から分離する。前記容器１２および前記リザーバー９は、外部に対して無菌密封され、かつ、耐水性であるチャンバー１と互いにユニットを形成する。前記チャンバー１２は、さらに、穴をあけることができる壁の領域１３を含み、そこを通じて、シリンジ１５のカニューレ１４を、内部空間２に挿入してもよい。前記シリンジ１５は、例えば、生体細胞の懸濁液１６を含んでいてもよく、前記カニューレ１４を通して内部空間２に注入できる。矢印２２の方向に圧力を加えることにより、前記細胞の懸濁液を前記内部空間２に圧入し、その後の電気処理に利用できる。前記細胞は、例えば、遺伝子治療のための適当なＤＮＡでトランスフェクトさせるべき患者から採取した一次細胞であってもよい。ついで、前記電極３、４に電圧を印加することにより、前記内部空間２内に適当な電場を発生させ、前記細胞、特に前記核に直接ＤＮＡを効果的に転移できる。

図１ｃには、図１ｂに示した本発明の装置であって、前記生体物質を電気的に処理した後、チャンバー１の前記内部空間２を洗い流す場合を示す。この図により、前記リザーバー９の壁面１７が、変形できる弾性物質、例えば、弾性プラスチック物質製であることが分かる。前記壁面１７に圧力を加えることにより、前記壁面１７を、矢印１８の方向に変形させ、その後、前記リザーバー９内の溶液１０に圧力を加える。この圧力によって、リザーバー９とチャンバー１との間の分離ユニット１１を開けることができる。あるいは、前記分離ユニット１１を、外部からの別の操作によって開けてもよい。導入ライン７を介してチャンバー１の前記内部空間２に溶液１０は到達する。導入ライン７の開口部８は電極３、４の近く（近傍）に配置されるため、これらの電極３、４は、特に、高流量の溶液１０によって集中的に洗い流される。この結果、前記流量は、壁面１７に加える圧力によって明確に増加できる。内部空間２内のデッド・ボリュームを回避するために、チャンバーの壁面１９の内部表面を、丸みを帯びた形状にデザインし、内部空間２を最適に洗い流すことができるようする。この手段により、処理された細胞を、溶液１０にほとんど完全に懸濁できる。電極３、４の双方の近くに開口部８を配置することによって、これらを均一に洗い流し、両電極間の距離が短い場合であっても、乱流を生じさせるため、すすぎ操作において有利である。あるいは、前記開口部を、一方の電極、好ましくは前記陰極付近に配置してもよい。本発明の装置の特に有利な構成の結果、壁面および電極に付着した細胞を回収でき、強い磁場強度を用い、泡を形成した場合であっても、細胞の懸濁液の入手を確実にする。

図１ｄには、図１ｂに示す本発明の装置であって、前記チャンバー１の内部空間２の溶液１０により洗い流した後の装置を示す。前記装置を１８０°回転させ、前記処理された細胞を含む溶液１０は、フィルター５を通して容器１２に到達できる。この状態を図１ｅに示す。あるいは、洗い流す前に、本発明の装置をすでに１８０°回転させていてもよい。この場合、まず、重力とは反対に前記チャンバー１の内部空間２を押すために、若干高い圧力を溶液１０に加えなければならない。前記フィルター５を用いて、より大きな分子を、前記内部空間２に保持することで、前記処理された細胞の懸濁液への摂動の影響を回避できる。チャンバー１としては、また、容器１２が、貫通可能な壁の領域２０を有し、前記壁の領域を通じて、前記細胞の懸濁液を、シリンジ２１により前記容器１２外に除去できる。したがって、漏斗形状の容器１２が効果的である。なぜならば、近い将来堆積する細胞を、底部領域に集め、濃縮物として回収できるからである。その結果、処理された細胞の滅菌懸濁液を、早く、濃縮され、簡単な方法で、患者に投与できる。

図２には、互いに９０°回転させた、本発明の装置のさらなる形態の２種類の断面図を示す。図示する装置は、内部空間２６を有するチャンバー２５を含み、前記内部空間２６は、細胞および/または生物活性分子を溶解した懸濁液２７を含む。前記チャンバー２５は、さらに、平面を有する２つの平坦な電極２８、２９を含み、前記電極２８、２９は、前記チャンバー２５の向かい合う壁面に互いに並行に配置される。図２ａでは、切断面の後方に配置される電極２８だけが見える。前記チャンバー２５は、チャンバー２５の向かい合う末端に配置される２つの接続部材３０、３１を有する。細胞懸濁液２７の導入は、接続部材３１を通じて、好ましくは、接続部材３１の厚みに一致する長さを有するカニューレを有する容器から実施されるため、細胞が導入された場合、内部空間２６にデッド・ボリュームができない。前記カニューレは、前記内部空間２６を外部に対して密封する膜などを貫通してもよい。リザーバー３２は、接続部材３０と接続でき、前記リザーバー３２は、例えば、シリンジなどであってもよい。前記リザーバー３２は、その壁面を変形できるように弾性および可塑性であってもよく、その他の形態において、容器４０により前記内部空間２６内に発生させた負の圧力によって、前記溶液を前記リザーバー３２から吸い取る。前記リザーバー３２のカニューレ３３は、接続部材３０のくぼみ３４に挿入できる。前記くぼみ３４は、例えば、プラグ若しくはバルブまたはカニューレ３３によって貫通できる脆い膜によって導入ライン３６への通路が閉鎖されることにより密封されていてもよい。すなわち、溶液３５を、リザーバー３２から、チャンバー２５の導入ライン３６に移動できる。前記溶液３５は、導入ライン３６の開口部３７を通じて内部空間２６に達し、前記電極２９は、前記溶液３５によって激しく洗い流される。電極２９は、細胞をエレクトロポレートする間、細胞物質がまず付着する陰極であり、通常の装置ではほとんど除去できない。図２ａから分かるように、前記チャンバー壁面３９の内部表面３８は、曲線状であるため、デッド・ボリュームを回避できる。このように、内部空間２６を効果的に、確実に洗い流すことができる。その後、溶液３５によって希釈される前記細胞の懸濁液２７を、容器４０によって受ける。これにより、ある形態では、細胞のすすぎおよび除去が２つの工程で達成される。あるいは、前記容器４０により内部空間２６内に発生させた負の圧力によって、前記溶液を、リザーバー３２から内部空間２６を通じて電極２８、２９に沿って容器４０に吸い取る。これにより、すすぎおよび除去を１つの工程で実施する。容器４０のカニューレ４１は、例えば、シリンジなどであってもよく、前記カニューレ４１を、接続部材３０のように、前記接続部材３１のくぼみ４２に挿入する。前記接続部材３０、３１は、例えば、シリンジまたは輸液ポットに一般的に既知の方法で接続できるルアーロックであってもよい。また、前記接続部材３０、３１は、例えば、貫通できるゴム栓であってもよい。

図３には、本発明のさらなる形態の正面断面図を示す。この図において示す装置は、内部空間４６と２つの共面電極４７，４８を含むチャンバー４５を含む。このチャンバー４５は、さらに、２つの平行な導入ライン４９、５０を含み、これらは、前記チャンバー４５の側面に配置される。前記導入ライン４９、５０を通じて、前記内部空間４６を洗い流すめの溶液を導入してもよい。また、前記導入ライン４９、５０を用いて、例えば、前記内部空間４６に生体物質を導入し、その後、前記溶液に注入してもよい。前記導入ラインは、管状の排水口、すなわち、長円の排水用チャネル５９を介する。なお、図４に詳細に示す。排出用開口部５１は、導入ライン４９、５０の間に配置され、導入ライン４９、５０を通じて、チャンバー４５の内部空間４６の内容物を回収できる。これにより、前記チャンバーの内容物は、図４に詳細に記載するように長円のドレインパイプライン６０に流入する。図３に関して、仕切部材６１は、内部空間４６と前記ドレインパイプライン６０との間に配置され、前記仕切部材６１は、例えば、フィルター膜であってもよい。

図４には、図３の形態の側面断面図を示す。このように、チャンバー４５は、より多くの量の受け入れに適するように、縦方向に延びた設計となっていることが分かる。電極４８と同様に電極４７（この図では図示せず）は、チャンバー４５の全長に沿って延びており、若干の高さを有している。導入部分において、排水用チャネル５９は、リザーバーと接続でき、溶液を、前記排水用チャネル５９を通して前記リザーバーから導入ラインに誘導する。なお、この図において、導入ラインは図示していない（図３における４９および５０を参照）。前記導入ラインも同様に、前記チャンバー４５の全長に沿って縫い目状に延びる。前記導入ラインは、排水用チャネル５９よりも小さい断面を有するため、前記排水用チャネル５９を溶液で満たした場合、前記チャンバー４５の全長に沿った一定の圧力を生じる。排出部分において、前記排水用チャンネル５９と並行に延びる前記ドレインパイプライン６０は、前記溶液によって洗い流される前記処理された生体物質を受ける容器と接続できる。

図５には、図３および４の装置に一般的に対応する本発明のさらにその他の形態を示し、この形態では、１つの導入ライン５２のみを備える。ここで、前記開口部５３は、電極５４の近傍に配置され、前記電極５４は、陰極であることが好ましい。チャネル６２によって溶液を前記導入ライン５２に供給し、前記処理された物質を含む溶液を、区切部材６４およびチャネル６２をそれぞれ通じて回収できる。

図６には、サーペント状のチャンバー５５を含む本発明の装置の一部の断面図を示す。この図には図示していないが電極を、切断面の正面および背面に配置してもよい。前記チャンバー５５は、管状の導入ライン５６および管状のドレイン５７を含み、これらは、前記サーペント状の内部空間５８の末端に配置される。導入ライン５６および内部空間５８は、それぞれ、より小さい断面を有するため、内部空間５８および前記電極の表面に高流量をもたらす。なお、この図において、前記電極は図示していない。すなわち、前記チャンバーを、極めて効果的および完全に洗い流すことができる。前記導入ライン５６の内部断面は、前記内部空間５８内の前記溶液の流量が増加するように、内部空間５８の向かって狭まっていてもよい。

図７には、Ｕ字型のチャンバー６５を有する本発明のさらなる形態を示す。この形態において、この図では図示していない前記電極を、切断面の正面および後方に配置してもよい。前記溶液を、導入ライン６７を介して前記内部空間６６に導入する。チャンバー６５のより小さい断面により、高流量を実現できる。前記処理された生体物質を含む溶液を、ドレインパイプライン６８を介してチャンバー６５から押出すか、または吸い取る。

図８には、図７の形態に一般的には対応する本発明のその他の形態を示す。この形態において、前記チャンバー７５の導入ライン７６は、より多くの量を処理できるために、前記ドレインパイプライン７７よりも著しく大きな断面を有する。

図１は、それぞれ、本発明の方法の異なる工程に関して、本発明の装置の特有の形態の側面図、部分透視図および部分断面図を示す。図２は、本発明の装置のさらなる形態であって、互いに９０度回転させた２種類の断面図を示す。図３は、本発明のさらなる形態の正面断面図を示す。図４は、図３の形態の後方断面図を示す。図５は、本発明の装置のさらなるその他の形態の正面断面図を示す。図６は、サーペント型のチャンバーを含む本発明の装置の一部の正面断面図を示す。図７は、Ｕ型のチャンバーを有する本発明の形態の配置図を示す。図８は、本発明のさらなる形態の配置図を示す。

符号の説明

１チャンバー
２内部空間
３電極
４電極
５フィルター
６緩衝液
７導入ライン
８開口部
９リザーバー
１０溶液
１１分離ユニット
１２容器
１３壁の領域
１４カニューレ
１５シリンジ
１６懸濁液
１７壁面
１８矢印
１９チャンバーの壁
２０壁の領域
２１シリンジ
２２矢印
２５チャンバー
２６内部空間
２７懸濁液
２８電極
２９電極
３０接続部材
３１接続部材
３２リザーバー
３３カニューレ
３４くぼみ
３５溶液
３６導入ライン
３７開口部
３８表面
３９チャンバーの壁
４０容器
４１カニューレ
４２くぼみ
４５チャンバー
４６内部空間
４７電極
４８電極
４９導入ライン
５０導入ライン
５１排出用開口部
５２導入ライン
５３開口部
５４電極
５５チャンバー
５６導入ライン
５７ドレイン
５８内部空間
５９排水用チャネル
６０ドレインパイプライン
６１区切部材
６２チャネル
６３チャネル
６４区切部材
６５チャンバー
６６内部空間
６７導入ライン
６８ドレインパイプライン
７５チャンバー
７６導入ライン
７７ドレインパイプライン

Claims

生体物質処理装置であって、
外部に対して少なくとも閉じることができ、かつ、前記生体物質を受けるための内部空間を含むチャンバーを少なくとも含み、
前記チャンバーは、前記チャンバーの前記内部空間に接触した状態で配置され、かつ、電場発生に供する電極を少なくとも１つ含み、
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）は、前記電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）に配置される少なくとも１つの開口部（８、３７、５３）を含む導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）を少なくとも一つ含み、
溶液を受けるための少なくとも１つのリザーバー（９、３２）が、壁（１７）で形成され、前記リザーバーが、前記導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）を介して前記内部空間（２、２６、４６、５８、６６）に接続し、
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の前記内部空間（２、２６、４６、５８、６６）および前記リザーバー（９、３２）が、外部からの機械的な衝撃により壊すことができるように設計される分離ユニット（１１）により互いに分離し、
前記分離ユニット（１１）が、バルブまたは圧力を加えることにより破壊できる脆い膜である、生体物質処理装置。
前記導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）が、管状に設計される請求項１記載の装置。
前記導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）の内径が、前記電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）に向かって減少する請求項１または２記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、外部に対して少なくとも無菌密封される請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
前記リザーバー（９、３２）を形成する前記壁（１７）が、弾性物質または可塑性物質を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
前記リザーバー（９、３２）が、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と接続して１つの構成要素を構成するか、または、接続部材（３０、３１）を介して前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と接続する請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）および前記リザーバー（９、３２）が、外部に対して少なくとも無菌密封されるユニットを形成する請求項６記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、少なくとも一つの壁の領域（１３）を含み、前記壁の領域が、セルフシールであり、かつ、貫通可能であり、または、接続部材（３０、３１）を含む少なくとも一つの導入口を備える壁の領域である請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、サーペント型または螺旋状を形成する請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、少なくとも１つの分割部材によって数個のサブユニットに分割されている請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
前記分割部材が、バルブまたはフィルター（５）を含む請求項１０記載の装置。
容器（１２、４０）が、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の排出用開口部（５１）と少なくとも接続可能である請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
前記容器（１２、４０）が、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と接続して１つの構成要素を形成するか、または、接続部材（３０、３１）を介して前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と接続可能である請求項１２記載の装置。
区切部材（６１、６４）が、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と前記容器（１２、４０）との間に配置される請求項１２又は１３記載の装置。
前記区切部材（６１、６４）が、バルブまたはフィルターである請求項１４記載の装置。
前記容器（１２、４０）が、少なくとも１つの壁の領域（２０）を有し、前記壁の領域が、セルフシールであり、かつ、貫通できる壁の領域であるか、または、接続部材（３０、３１）を含む少なくとも一つの導入口を備える壁の領域である請求項１２から１５のいずれか一項に記載の装置。
前記容器（１２、４０）が、シリンジまたは輸液ポットである請求項１２から１６のいずれか一項に記載の装置。
前記容器（１２、４０）および前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、外部に対して無菌密封されるユニットを形成する請求項１２から１７のいずれか一項に記載の装置。
セルフシールされ、かつ、貫通できる前記壁の領域（１３、２０）が、合成物質を含む請求項８から１８のいずれか一項に記載の装置。
前記壁の領域（１３、２０）が、ポリシロキサン、エラストマーまたはゴムを含む請求項１９記載の装置。
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）が、前記内部空間（２、２６、４６、５８、６６）と接触して配置され、２つの向かい合って配列する電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）を含むか、または、さらなる電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）を、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の内部空間（２、２６、４６、５８、６６）に導入できる請求項１から２０のいずれか一項に記載の装置。
前記電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）または前記複数の電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）が、導電性合成物質を含む請求項１から２１のいずれか一項に記載の装置。
前記電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）または前記複数の電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）が、導電性物質をドープしたプラスチック物質を含む請求項２２記載の装置。
生体物質処理方法であって、
前記生体物質を、外部に対して少なくとも閉じることができ、かつ、チャンバーの内部空間に接触した状態で配置され、電場発生に供する電極を少なくとも一つ含むチャンバーの内部空間に導入し、
前記生体物質を導入後、前記電極と前記チャンバーの内部空間に接触するさらなる電極とに電圧を印加することにより、前記内部空間に前記電場を発生させ、
前記電場を発生させた後、前記生体物質を、溶液によって、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の内部空間（２、２６、４６、５８、６６）からほとんど完全に洗い流し、
前記溶液を、前記溶液を含むリザーバー（９、３２）から、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）を介して、少なくとも１つの電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）に沿って導入し、
前記リザーバー（９、３２）は、前記導入ライン（７、３６、４９、５０、５２、５６、６７、７６）を介して前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）に接続されたリザーバーであって、
前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の前記内部空間（２、２６、４６、５８、６６）を前記リザーバー（９、３２）から分離する分離ユニット（１１）を、外部からの機械的な衝撃により開き、
前記分離ユニット（１１）が、少なくとも一方向における外部からの機械的な衝撃により開くことができるバルブであるか、または、前記分離ユニット（１１）が、外部からの圧力によって破壊できる脆い膜である、生体物質処理方法。
前記溶液を、加圧下で、前記電極（３、４、２８、２９、４７、４８、５４）に沿って導入する請求項２４記載の方法。
前記溶液を、陰極に沿って導入する請求項２４または２５記載の方法。
前記生体物質を、セルフシールであり、かつ、貫通可能である壁の領域（１３、２０）を通じて、シリンジにより、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の内部空間（２、２６、４６、５８、６６）内に導入する請求項２４、２５または２６記載の方法。
前記生体物質および前記溶液を、それぞれ、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の排出用開口部（５１）に少なくとも接続可能な容器（１２、４０）に導入する請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
前記溶液を含むリザーバー（９、３２）が、弾性または変形可能な壁（１７）によって少なくとも部分的に形成され、前記壁（１７）に外部から圧力を加える請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
前記生体物質を、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）と容器（１２、４０）との間に配置される区切部材（６１、６４）を通じて前記容器（１２、４０）内に洗い流す請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
前記区切部材（６１、６４）が、バルブまたはフィルター（５）である請求項３０記載の方法。
前記処理された生体物質を、セルフシールであり、かつ、貫通可能である壁の領域（１３、２０）を通じて容器（１２、４０）から除去する請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
前記生体物質が、前記電場の発生によって生物活性分子を転移させるか、又は、前記電場の発生によって生物活性分子を融合させた生体細胞、細胞誘導体、細胞よりも小さい粒子（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒｔｉｃｌｅ）又は小胞を含む請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
前記生体物質を加える前に、前記生物活性分子を緩衝液に溶解させ、前記チャンバー（１、２５、４５、５５、６５、７５）の前記内部空間（２、２６、４６、５８、６６）に導入する請求項３３記載の方法。
前記生体細胞への前記生物活性分子の転移を、１２０Ａ/ｃｍ²以下の電流密度により実施するか、または、２〜１０ｋＶ＊ｃｍ^-1の電界強度、かつ、１０〜２００μｓの持続時間を有する電圧パルスにより実施する請求項３３または３４記載の方法。
前記生体細胞への前記生物活性分子の転移を、継続的な前記電圧パルスに続いて、２〜１４Ａ/ｃｍ²の電流密度、および、１〜１００ｍｓの持続時間を有する電流によって実施する請求項３５記載の方法。