JP4589005B2 - ピロロピリダジン化合物および増殖性疾患治療におけるその使用方法 - Google Patents

Description

本願は、米国特許法119（e）に基づく特許仮出願60/368,249（2002年３月28日出願）および60/402,118（2002年８月８日出願）の優先権利益を主張し、その内容を参考のために本願に組み込む。
本願は、ピロロピリダジン化合物、その化合物の製造方法および増殖性疾患その他の疾患の治療におけるその使用方法に関する。

プロテインキナーゼは、リン酸基がＡＴＰから基質タンパク質表面に存在するチロシン、セリン、スレオニンまたはヒスチジン残基に転移するのを触媒する類の酵素である。プロテインキナーゼは、通常の細胞成長において明らかな役割を担っている。成長因子受容体タンパク質の多くはプロテインキナーゼとして機能する細胞内領域を有しており、この機能を通じてシグナル伝達を達成している。成長因子とその受容体との相互作用は細胞成長の規制において通常必要な事象であるが、基質タンパク質のリン酸化はしばしば細胞成長の変調に関連している。

ヒトの上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４と呼ばれる、四つの異なる受容体チロシンキナーゼよりなる。これらはまた、ｅｒｂ１、ｅｒｂ２等とも呼ばれる。ＨＥＲ１はまた一般に上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦｒ）とも呼ばれる。ＨＥＲ３の例外を除けば、これら受容体はリン酸受容タンパク質のチロシン残基に特異的なプロテインキナーゼ活性を本質的に有している。ＨＥＲキナーゼ類は上皮由来のガン細胞のみならず大抵の上皮細胞中で発現されている。また、肉腫や横紋筋肉腫のような間葉起源のガン細胞中においても発現されている。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２のような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は細胞増殖に必要とされ、乾癬やガンのような病気と関連している。標的細胞におけるこれらキナーゼ阻害によるシグナル伝達の中断は抗増殖性および治療効果を有することが知られている。

受容体チロシンキナーゼの酵素活性は、過剰発現やリガンドが関与する二量化により刺激され得る。ＨＥＲ受容体ファミリーについては、ヘテロ二量体のみならずホモ二量体の形成が示されている。ホモ二量化の例は、ＥＧＦファミリーリガンド（ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α、ベータセルリン、ヘパリン結合性ＥＧＦおよびエピレグリンが含まれる）の一つによって生じるＨＥＲ１の二量化である。四つのＨＥＲ受容体キナーゼ間のヘテロ二量化はリガンドのヘレグリン（ニューレグリンとも呼ばれる）ファミリーのひとつとの結合により促進される。そのヘテロ二量化には、ＨＥＲ２とＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＨＥＲ４の組み合わせ等が含まれ、たとえ一方の受容体（ＨＥＲ３）が酵素的に不活性である場合でも受容体二量体のチロシンキナーゼ活性を有意に刺激する。ＨＥＲ２のキナーゼ活性はまた種々の細胞タイプにおいて受容体単独の過剰発現によっても活性化されることが示された。受容体ホモ二量体またはヘテロ二量体の活性化は受容体および他の細胞内タンパク質におけるチロシン残基のリン酸化をもたらす。そして微小管関連タンパクキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）やホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）を含む細胞内シグナル経路の活性化がこれに続く。これら伝達経路の活性化が細胞増殖やアポトーシス阻害につながることが示されている。また、ＨＥＲキナーゼシグナル阻害は細胞の増殖および生存を阻害することが示された。

多発性嚢胞腎として記載された病気の上皮嚢胞の異常な成長において、ＥＧＦ受容体の規制逸脱が役割を担っている〔Du,J.,Wilson,P.D., Amer.J.Physio., 269（2 Pt 1）,487（1995）; Nauta,J., et al., Pediatric Research, 37（6）,755（1995）; Gattone,V.H. et al., Developmental Biology, 169（2）,504（1995）; Wilson,P.D.et al., Eur.J.Cell Biol., 61（1）,131,（1993）〕。本発明の化合物は、ＥＧＦ受容体の触媒的機能を阻害し、その結果該疾患の治療に有用である。

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は成長因子から細胞核への細胞内シグナル伝達カスケードの主要経路である。この経路は二つの段階のキナーゼを含む；ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）とその基質のＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク）キナーゼ（ＭＡＰＫ）である。ＭＡＰキナーゼファミリーには異なるイソフォームが存在する。〔総説としてはSeger,R.; Krebs,E.G. FASEB, 9,726（1995）参照〕。本発明の化合物はこれらキナーゼの一方または両方を阻害することができる；ＭＥＫ、ＭＡＰキナーゼキナーゼおよびその基質のＥＲＫ、ＭＡＰキナーゼである。ＥＲＫ（細胞外規制キナーゼ）、p42ＭＡＰＫは細胞の増殖と分化に必須であることが分かった。ＭＥＫ若しくはＥＲＫの過剰発現および／または過剰活性化は種々のヒトのガンに関連していることが分かった〔例えば、Sivaraman,V.S. et al., C.C.J.Clin.Invest., 99,1478（1997）〕。ＭＥＫ阻害は細胞内のＥＲＫ活性化およびこれに続くＥＲＫ基質の活性化を妨げ、細胞成長刺激の阻害やras-転換細胞表現型の反転をもたらす〔Dudley,D.T. et al., Proc.Nat.Acad.Sci., 92,7686（1995）〕。

キナーゼのrafファミリーメンバーは、ＭＥＫ上のセリン残基をリン酸化する。rafファミリーメンバーとして、a-raf、b-rafおよびc-rafという三つのセリン／スレオニンキナーゼがある。raf遺伝子の突然変異はヒトのガンでは希であるが、c-rafはrasガン遺伝子で活性化されて多くのヒト腫瘍において突然変異する。従って、c-rafのキナーゼ活性阻害はrasにより媒介される腫瘍の成長を抑制する方法を提供する〔Campbell,S.L., Oncogene,17,1395（1998）〕。

細胞質タンパク質チロシンキナーゼのSrcファミリーは多様なシグナル経路〔Schwartzberg,P.L., Oncogene,17,1463（1998）〕に関与する少なくとも八つの構成メンバー（Src、Fyn、Lyn、Yes、Lck、Fgr、HckおよびBlk）を有する。このチロシンキナーゼファミリーの原型的なメンバーがｐ６０^ｓｒｃ（Src）である。Srcは多くの細胞型における増殖と遊走に関与している。限定的な研究ではあるが、乳ガン、結腸ガン（〜９０％）、膵臓ガン（＞９０％）および肝臓ガン（＞９０％）においてSrc活性の上昇が示されている。またSrc活性の大きな増加は転移（＞９０％）および予後不良と関係している。アンチセンスSrcメッセージはヌードマウスにおいて結腸ガンの成長を遅らせ〔Staley et al., Cell Growth & Differentation, 8, 269（1997）〕、Src阻害剤が腫瘍成長を遅らせ得ることを示唆する。細胞増殖における役割の他、Srcは低酸素症応答を含むストレス応答経路で作用する。
以前の研究によれば、遺伝工学的にアンチセンスSrcメッセージを発現する結腸ガン細胞はヌードマウスにおいて血管新生低下を示し、Src阻害剤が抗増殖性であると同時に抗血管新生的であることを示唆した〔Ellis, et al., J.Biol.Chem., 273,1052（1998）〕。

ガンにおける役割とは別に、Srcは骨粗鬆においてもまた役割を有するようである。遺伝子的にsrc産生の欠如したマウスにおいて、骨吸収不全と骨粗鬆症が見られた〔Soriano,P., Cell, 64,693（1991）; Boyce,B.F., J.Clin.Invest., 90,1622（1992）〕。この欠陥は破骨細胞活性の欠如により特徴づけられる。破骨細胞は通常、Srcを高レベルで発現しているので、Srcキナーゼの阻害は骨粗鬆症治療に有効かも知れない〔Missbach,M., Bone, 24,437（1999）〕。

ＥＧＦｒに加えて他のＲＴＫが存在し、例えばＦＧＦｒ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の受容体；flk-1（ＫＤＲとしても知られる）、flt-1、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）の受容体；およびＰＤＧＦｒ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の受容体等が含まれる。新たな血管形成は、血管新生として知られるが、腫瘍成長のためには必須である。天然の二つの血管新生阻害剤、アンジオスタチンとエンドスタチンは種々の固形ガンの成長を劇的に阻害する〔O'Reilly,M.S., Cell, 79,315（1994）；O'Reilly,M.S., Nature Medicine, 2,689（1996）；O'Reilly,M.S., Cell, 88,277（1997）〕。ＦＧＦもＶＥＧＦも血管新生を刺激することが知られており、これらの受容体においてキナーゼ活性を阻害するとこれら成長因子の血管新生効果を阻止することになる。更には、受容体チロシンキナーゼtie-1およびtie-2もまた血管新生で役割を果たしている〔Sato,T.N., Nature, 376,70（1995）〕。ＦＧＦｒ、flk-1、flt-1、tie-1またはtie-2のキナーゼ活性を阻害する化合物は、血管新生に対する効果により腫瘍成長を抑制し得る。

ＰＤＧＦは平滑筋細胞（ＳＭＣ）に対する強力な成長因子かつ化学遊走因子であり、血管形成後の冠動脈再狭窄は、部分的には、上昇したＰＤＧＦレベルに応答してＳＭＣの増殖が拡大されたことによるものである。従って、ＰＤＧＦｒのキナーゼ活性を阻害する化合物は再狭窄の治療に有用かも知れない。加えて、ヒト神経膠腫のいくつかではＰＤＧＦもＰＤＧＦｒも過剰発現されているので、ＰＤＧＦｒ活性を抑制し得る低分子化合物は抗ガン治療において有用な可能性がある〔Nister,M., J.Biol.Chem., 266,16755（1991）；Strawn,L.M., J.Biol.Chem.,269,21215（1994）〕。

更に、炎症の応答においては、多数のサイトカインが関与しており、例えばIL-1、IL-6、IL-8およびＴＮＦ-α等が含まれる。IL-1やＴＮＦ-α等の過剰産生は広範な疾患に関わっており、とりわけ炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、エンドトキシンショック、骨粗鬆症、アルツハイマー症、鬱血性心不全等が含まれる〔Henry et al., Drugs Fut., 24:1345-1354（1999）；Salituro et al., Curr.Med.Chez., 6:807-823（1999）〕。ヒト患者において、例えばＴＮＦ-αのモノクローナル抗体（エンブレル）〔Rankin etal., Br.J.Rheumatol., 34:334-342（1995）〕や、可溶性ＴＮＦ-α受容体-Fc融合タンパク質（エタネルセプト）〔Moreland et al., Ann.Intern.Med., 130:478-486（1999）〕のようなサイトカインのタンパク性拮抗剤が慢性炎症疾患治療に有効であることを示す証拠がある。

マイトジェンや感染性微生物、トラウマ等の外部刺激に応答し、多くの細胞においてＴＮＦ-αの生合成が行われる。ＴＮＦ-α産生における重要な媒介物としてマイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ、および特にp38キナーゼがある。これらキナーゼは多様なストレス刺激、限定されないが例えば、前炎症性サイトカイン、エンドトキシン、紫外線、浸透圧衝撃等に応答して活性化される。p38の活性化には、p38アイソザイムに特徴的なThr-Gly-Tyrのモチーフ中のThrおよびTyr残基に対して、上流ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ３とＭＫＫ６）による二重のリン酸化が必要である。

p38には、p38α、p38β、p38γおよびp38δの四つのアイソフォームが知られている。αおよびβアイソフォームは炎症性細胞で発現され、ＴＮＦ-α産生の主媒介物である。細胞中のp38αおよびβ酵素を阻害するとＴＮＦ-α発現レベルが低下する。また、炎症性疾患の動物モデルに対してp38αおよびβの阻害剤を投与することによって、当該阻害剤がそのような疾患の治療に有効であることが示された。従って、p38酵素はIL-1およびＴＮＦ-αによって媒介される炎症プロセスで重要な役割を果たしている。報道によればp38キナーゼおよびIL-1やＴＮＦ-αのようなサイトカインを阻害する化合物で炎症性疾患の治療に有用なものが以下の国際特許出願に開示されている；ＷＯ００／１２４９７（p38キナーゼ阻害剤としてのキナゾリン誘導体）；ＷＯ００／５６７３８（同じ目的のピリジンおよびピリミジン誘導体）；ＷＯ００／１２４９７（p38キナーゼ阻害剤間の関係について議論している）；ＷＯ００／１２０７４（p38阻害剤として有用なピペラジンおよびピペリジン誘導体）。

要約すれば、数々のキナーゼ酵素によって通常なされるシグナル伝達の厳しい規制は、腫瘍細胞においてはしばしば失われている。よって、これらキナーゼを調節する化合物は異常な細胞増殖に関連した疾病の治療上極めて望ましい。更には、炎症応答に関連したサイトカインを調節する化合物は炎症性疾患の治療上極めて望ましい。

発明の要約
有利なことには、本発明は、ガンを含む増殖性疾患および炎症性疾患治療のための組成物および方法を提供する。該方法は下式Ｉのキナーゼ阻害剤の有効量を投与することからなり、該阻害剤には式Ｉの塩、溶媒和物、プロドラッグ、その立体異性体を含み、および任意で少なくともひとつの追加的治療薬を含んでもよい。その治療は、好ましくは哺乳類に対して、更に好ましくはそれを必要とするヒトに対してなされる。

さらに具体的には、本発明は式Ｉの化合物

およびそのエナンチオマー、ジアステレオマー、薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび溶媒和物を提供し、

式中、Ｒ_１はＨ、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、ハロゲン、ＯＲ_１'、ＯＣ（Ｏ）Ｒ_１'、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ_１'、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''、ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ_１'''およびＯＳ（Ｏ）_２ＮＲ_１'Ｒ_１''よりなる群から選択され、ここでＲ_１'およびＲ_１''はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロ、およびシクロアルキルよりなる群から選択される；Ｒ_１'およびＲ_１''はまた一緒になってシクロアルキル、アリールおよびヘテロシクロ基のひとつを形成してもよい；Ｒ_１'''は、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロおよびシクロアルキルよりなる群から選択される；

Ｒ_２はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、アラルキル、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｒ_１''ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である。
Ｒ_１およびＲ_２は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロ基を形成してもよい；

Ｘは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_２'よりなる群から選択され；Ｒ_２'は、Ｈ、アルキル、アラルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、ＳＯ_２ＮＲ_１'Ｒ_１''、Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''およびＳＯ_２Ｒ_１'''よりなる群から選択され；但し、ＸがＳの場合は、Ｒ_２はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルよりなる群から選択される；

Ｒ_３は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロ、アリール、アラルキル、アシル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ハロゲン、アミン、置換アミン、ＯＲ_３'、ＣＨ_２ＯＲ_３'、ＣＨ_２ＮＲ_３'Ｒ_３''、ＣＨ_２ＳＲ_３'、ＯＣ（Ｏ）Ｒ_３'、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ_３''、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_３'Ｒ_３''、ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ_３'およびＯＳ（Ｏ）_２ＮＲ_３'Ｒ_３''よりなる群から選択され；ここでＲ_３'およびＲ_３''はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、シクロアルキルおよびアリールよりなる群から選択される；Ｒ_３'およびＲ_３''は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロを形成してもよく；Ｒ_３がカルボアルコキシ、アシルまたはカルボキサミドの場合は任意で１個または２個の置換基を有していてもよく、当該置換基はＨ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、シクロアルキルおよびアリールよりなる群から選択され、またこれら置換基は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロを形成してもよい；

Ｒ_２およびＲ_３は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロ基を形成してもよい；
Ｒ_４は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、アラルキル、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１''Ｒ_１'ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である；

Ｙは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_４'よりなる群から選択され；ＮＲ_４'は、Ｈ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ_１'Ｒ_１''、Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''およびＳ（Ｏ）_２Ｒ_１'''よりなる群から選択され；ＹがＳの場合は、Ｒ_４は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルよりなる群から選択され；ＹがＮＲ_４'の場合は、Ｒ_４'はＲ_３と一緒になってヘテロシクロ環を形成してもよい；

Ｒ_５は、Ｈ、ハロゲン、シアノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロ、アリール、アラルキル、アシル、置換アルキレン基、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１''Ｒ_１'ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である；
Ｚは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_５'よりなる群から選択され；Ｒ_５'は、Ｈ、アルキル、アラルキルおよびヘテロシクロよりなる群から選択され；Ｚが原子価結合の場合は、Ｒ_５はＨ、ハロゲン、置換アルキレン、シアノよりなる群から選択され、更にＺがＳの場合は、Ｒ_５はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルよりなる群から選択される；そして、

Ｒ_６は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロ、アシル、カルボアルコキシおよびカルボキサミドよりなる群から選択され、当該カルボアルコキシ、アシルおよびカルボキサミド基は任意で１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、該置換基はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロよりなる群から選択される。
本発明はさらに、上記式Ｉの化合物、その塩、溶媒和物若しくは立体異性体と少なくともひとつの薬学的に許容される担体よりなる薬学的組成物を提供する。また、その薬学的組成物は任意で少なくとも一つの他の治療薬を追加的に含んでいてもよい。
本発明はまた、上記式Ｉの化合物、その塩、溶媒和物若しくは立体異性体と、任意で少なくとも一つの他の追加的治療薬を必要とする患者に投与することよりなる、増殖性または炎症性疾患の治療方法を提供する。

定義
限られた特別な例を除いて、以下の定義を本明細書中において適用する。
特に指定しない限り、ここで用いる「低級アルキル」、「アルキル」または「アルク（alk）」の語は、単独で、またはアラルキル、ハロアルキルのように組み合わせた形で用いる場合、直鎖および分枝鎖を有する炭化水素を包含し、通常のアルキルまたはアルクの場合炭素数１から１２が好ましく、低級アルキルの場合は炭素数１から４が好ましい。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、若しくはイソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、4,4-ジメチルペンチル、オクチル、2,2,4-トリメチルペンチル、ノニル、ウンデシル、ドデシル等が含まれる。各アルキル基は任意で１個から４個の置換基で置換されていてもよく、該置換基にはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアミノ、スルホネート、スルファミド、シアノグアニジン、オキソ、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ＳＯｎ（ｎは０、１または２）および／またはアシル基等が含まれる。

他に指定しない限り、ここで用いる「シクロアルキル」の語は、単独で、または組み合わせた形で用いる場合、飽和環状炭化水素基および部分的に不飽和（１個または２個の二重結合）の環状炭化水素基を含み、少なくとも一つの環状構造と、その環を形成する総数３個から７個、好ましくは３個から６個の炭素原子を含む。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が包まれる。シクロアルキルは任意でアルキル基の場合と同様に置換されていてもよい。

ここで用いる「アリール」の語は、単独で、または例えばアリールオキシのように組み合わせた形で用いる場合、例えばフェニル、インデニル、インダニル、ナフチル（1-ナフチルおよび2-ナフチルを含む）等の、環部分に６個から１０個の炭素原子を有する単環性若しくは二環性芳香族基をいう。

アリール基は置換可能な炭素上で、水素、ハロ、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、ハロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルコキシ、アルケニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキニル、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボアルコキシ、アシル、ヒドロキシルアミン、スルホネート、スルファミン、シアノグアニジン、ＳＯｎ（ｎは０、１または２）、カルボキサミド、一置換アミノ、二置換アミノより選択される１個、２個若しくは３個の置換基により任意に置換されていてもよく、ここでアミノ置換基は独立してアルキル、アラルキル、アリール、アシルまたはカルボアルコキシである。

ここで用いる「アラルキル」の語は、上記で定義されたアリール基であって、例えばベンジル基のようにアルキル部分上で直接置換するものをいう。アラルキルはアリールまたはアルキル置換基として記載されたいずれの置換基により任意に置換されていてもよい。

特に指摘しない限り、ここで用いる「低級アルケニル」または「アルケニル」の語はそれ自身若しくは組み合わせた形式において、炭素数２から１２、好ましくは２から５の直鎖若しくは分枝鎖であり、正常鎖では１個から６個の二重結合を含み、例えばビニル、2-プロペニル、3-ブテニル、2-ブテニル、4-ペンテニル、3-ペンテニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、2-ヘプテニル、3-ヘプテニル、4-ヘプテニル、3-オクテニル、3-ノネニル、4-デセニル等であって、これらはアルキル基の場合と同様に任意で置換されていてもよい。

特に指摘しない限り、ここで用いる「低級アルキニル」または「アルキニル」の語はそれ自身若しくは組み合わせた形式において、炭素数２から１２、好ましくは２から８の直鎖若しくは分枝鎖であり、正常鎖では１個の三重結合を含み、例えば2-プロピニル、3-ブチニル、2-ブチニル、4-ペンチニル、3-ペンチニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、2-ヘプチニル、3-ヘプチニル、4-ヘプチニル、3-オクチニル、3-ノニニル、4-デシニル、3-ウンデシニル、4-ドデシニル等であって、これらはアルキル基の場合と同様に任意で置換されていてもよい。

アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルにおける正常な炭素鎖は任意でひとつ以上のヘテロ原子により遮断されていてもよい。
ここで用いる「アシル」の語は、式Ｃ（Ｏ）Ｒの基をいい、ここでＲは水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロシクロまたはアラルキル基を表す。
ここで用いる「カルボアルコキシ」の語は、式Ｃ（Ｏ）ＯＲの基をいい、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロシクロまたはアラルキル基を表す。
ここで用いる「カルボキサミド」の語は、式Ｃ（Ｏ）ＮＲ_２の基をいい、ここでＲは同一若しくは異なって、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロシクロまたはアラルキル基を表す。あるいは二つのＲ基は一緒になり窒素原子とともにヘテロシクロを形成してもよい。

ここで用いる「ヘテロシクロ」、「ヘテロサイクリック」および「ヘテロサイクル」は任意で置換されていてもよい芳香環若しくは非芳香環であって、例えば、４から７員性の単環、７から１１員性の二環、または１０から１５員性の三環で少なくともひとつの炭素環中に少なくともひとつのヘテロ原子を含む。ヘテロ原子を含む各ヘテロシクロ環は窒素原子、酸素原子および硫黄原子より選択される１個、２個、３個もしくは４個のヘテロ原子を含むことができ、窒素および硫黄のヘテロ原子は任意で酸化を受けていてもよく、また窒素原子は任意で四級化されていてもよい。ヘテロシクロ基はいずれのヘテロ原子または炭素原子で結合してもよい。

適当な単環ヘテロシクロ基の例としては、ピロリジニル、ピロリル、ピラゾリル、オキセタニル、ピラゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、オキサジアゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、2-オキソピペラジニル、2-オキソピペリジニル、2-オキソピロリジニル、2-オキサゼピニル、アゼピニル、4-ピペリドニル、ピリジル、N-オキソピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、テトタヒドロチオピラニルスルホン、チアモルホリニルスルホン、1,3-ジオキソランおよびテトラヒドロ-1,1-ジオキソチエニル、ジオキサニル、イソチアゾリジニルチエタニル、チエタニル、チイラニル、トリアジニル、トリアゾリル等が含まれる。

適当な二環性ヘテロシクロ基の例としては、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチエニル、キヌクリジニル、キノリニル、キノリニル-N-オキシド、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフリル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、フロピリジニル（例えば、フロ[2,3-c]ピリジニル、フロ[3,1-b]ピリジニル、フロ[2,3-b]ピリジニル等）、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロキナゾリニル（3,4-ジヒドロ-4-オキソキナゾリニル等）、ベンズイソチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンゾジアジニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズピラゾリル、ジヒドロベンゾフリル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾチオピラニル、ジヒドロベンゾチオピラニルスルホン、ジヒドロベンゾピラニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、ピペロニル、プリニル、ピリドピリジル、キナゾリニル、テトラヒドロキノリニル、チエノフリル、チエノピリジル、チエノチエニル、ベンゾキソジアゾール、ベンゾチオジアゾール等が含まれる。

好ましい態様としては、ヘテロシクロ中の少なくともひとつのヘテロ原子が窒素原子である。
ヘテロシクロ基の適切な置換基の例には、上記のアルキル基若しくはアリール基の置換基、またはアルキル基自体のひとつまたはそれ以上が含まれる。さらに、アリール基およびエポキシドやアジリジンのようなより小さなヘテロシクロ基もまた含まれる。
ここで用いる「ヘテロ原子」の語は、酸素、硫黄および窒素を含み、窒素および硫黄のヘテロ原子は任意で酸化を受けていてもよく、また窒素のヘテロ原子は任意で四級化されていてもよい。

ここで用いる「ハロゲン」または「ハロ」の語は、単独でまたは他の語の一部として、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
「任意で置換された低級アルキル」や「任意で置換されたアリール」のように用いられる「任意の置換基」の表現は、上述した置換基で置換された、または置換されていないアルキル、アリールその他の基をいう。さらに、ひとつより多い置換基で任意に置換されると記載された場合は、複数の置換基は上述した置換基の中からそれぞれ独立して選択されることを意図する。

ここで用いられる「約」の語は、量、大きさ、剤形、媒介変数およびその他の数量および特性が正確でなくまたその必要がなく、おおよそであってより大きく若しくは小さいことを意味し、そして望むべくは、耐性、変換因子、概数、測定誤差等および当業者に知られたその他の因子を反映する。一般的には、量、大きさ、剤形、媒介変数およびその他の数量および特性は、そのような記載の有無にかかわらず「約」または「おおよそ」である。

発明に係る化合物
本発明に従って、下式Ｉの化合物が提供される。

式Ｉの化合物において、Ｒ_１はＨ、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、ハロゲン、ＯＲ_１'、ＯＣ（Ｏ）Ｒ_１'、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ_１'、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''、ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ_１'''およびＯＳ（Ｏ）_２ＮＲ_１'Ｒ_１''よりなる群から選択される。ここでＲ_１'およびＲ_１''はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロ、およびシクロアルキルよりなる群から選択され、または一緒になってシクロアルキル、アリールおよびヘテロシクロ基を形成してもよく、いずれも任意で置換されていてもよい。Ｒ_１'''は、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロまたはシクロアルキルである。

Ｒ_２はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、アラルキル、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｒ_１''ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である。
Ｒ_１およびＲ_２は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロ基を形成してもよく、いずれも任意で置換基を有していてもよい。

Ｘは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_２'を表し、Ｒ_２'は、Ｈ、アルキル、またはアラルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、ＳＯ_２ＮＲ_１'Ｒ_１''、Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''、ＳＯ_２Ｒ_１'''である。但し、ＸがＳの場合は、Ｒ_２はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルからのみ選択される。
Ｒ_３は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロ、アリール、アラルキル、アシル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ハロゲン、アミン、置換アミン、ＯＲ_３'、ＣＨ_２ＯＲ_３'、ＣＨ_２ＮＲ_３'Ｒ_３''、ＣＨ_２ＳＲ_３'、ＯＣ（Ｏ）Ｒ_３'、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ_３''、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_３'Ｒ_３''、ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ_３'およびＯＳ（Ｏ）_２ＮＲ_３'Ｒ_３''よりなる群から選択される。Ｒ_３'およびＲ_３''はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、シクロアルキルまたはアリールである。Ｒ_３'およびＲ_３''は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロを形成してもよく、いずれも任意で置換されていてもよい。

Ｒ_３がカルボアルコキシ、アシルまたはカルボキサミドの場合は任意で１個または２個の置換基を有していてもよく、当該置換基はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、シクロアルキルまたはアリールである。またこれら置換基は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロを形成してもよく、いずれも任意で置換されていてもよい。
Ｒ_２およびＲ_３は一緒になってシクロアルキル、アリールまたはヘテロシクロ基を形成してもよく、いずれも任意で置換されていてもよい。
Ｒ_４は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、アラルキル、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１''Ｒ_１'ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である。

Ｙは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_４'よりなる群から選択され、Ｒ_４'は、Ｈ、アルキル、アラルキル、ヘテロシクロ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ_１'Ｒ_１''、Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_１''およびＳ（Ｏ）_２Ｒ_１'''より選択される。ＹがＳの場合は、Ｒ_４は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルからのみ選択され得る。
さらに加えて、Ｙが一級若しくは二級アミンの場合は、Ｒ_３と一緒になって、任意で置換されてもよいヘテロシクロ環を形成することができる。

Ｒ_５は、Ｈ、ハロゲン、シアノ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロ、アリール、アラルキル、アシル、置換アルキレン基、Ｒ_１'ＯＣ（Ｏ）、Ｒ_１'Ｃ（Ｏ）、Ｒ_１''Ｒ_１'ＮＣ（Ｏ）、Ｒ_１'''Ｏ（Ｏ）_２Ｓ、Ｒ_１'Ｒ_１''Ｎ（Ｏ）_２ＳおよびＲ_１'''（Ｏ）ｎＳよりなる群から選択され、ここでｎは１または２の整数である。
Ｚは、原子価結合、Ｏ、ＳおよびＮＲ_５'よりなる群から選択され、Ｚが原子価結合の場合は、Ｒ_５はＨ、ハロゲン、置換アルキレンおよびシアノからのみ選択され、更にＺがＳの場合は、Ｒ_５はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロおよびアラルキルからのみ選択され得る。Ｒ_５'は、Ｈ、アルキル、アラルキルまたはヘテロシクロである。

最後にＲ_６は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロ、アシル、カルボアルコキシおよびカルボキサミドよりなる群から選択される。当該カルボアルコキシ、アシルおよびカルボキサミド基は任意で１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、該置換基はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アラルキルまたはヘテロシクロである。
本発明には、式Ｉの化合物の塩、溶媒和物、立体異性体、エナンチオマー、ジアステレオマーもまた包含される。

式Ｉの化合物はすべての立体異性体が、混合物または純粋な若しくは実質上純粋な形態のいずれもが考慮される。式Ｉの化合物はその非芳香族炭素若しくは窒素原子上、およびその置換基中の炭素原子上も含めて、いずれにおいても不斉中心を有することができる。そのため、式Ｉの化合物はエナンチオマー、ジアステレオマーまたはその混合物として存在し得る。その製造工程においてはラセミ体、エナンチオマーまたはジアステレオマーを出発物質として使用できる。ジアステレオマーまたはエナンチオマーが得られた場合は慣用的な方法、例えばクロマトグラフィーまたは分別結晶によりこれらを分離することができる。

本発明における好ましい化合物は、式ＩにおいてＺが原子価結合、Ｒ_５がシアノの化合物である。
いくつかの好ましい態様においては、Ｒ₃はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであって好ましくはメチルである。
いくつかの好ましい態様においては、ＹがＮである。さらに好ましい態様ではＸが原子価結合、ＯまたはＮＲ_２'であり、Ｒ_２'はＲ_１'Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_２'または-Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１'が好ましい。
本発明のいくつかの態様に従うと、Ｒ_１'およびＲ_１''は独立してアルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルである。

別の好ましい化合物は、Ｒ_４がフェノキシアニリンである式Ｉの化合物である。また、ＹがＮＲ_４'であってＲ_４'が上記の定義の化合物、またはＹがＯであってＲ_４がアリール若しくはヘテロアリールである化合物も好ましい。
本発明における他の好ましい化合物は、式ＩでＺが原子価結合、Ｒ_５がシアノ、Ｒ₃がメチルの化合物である。さらにこれら化合物は以下の置換基をひとつ以上有するものが好ましい；ＹがＮ；Ｒ_１'およびＲ_１''は独立してアルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル；Ｒ_４がアルキル、アリールまたはヘテロアリール；Ｘが原子価結合、ＯまたはＮＲ_２'；そして、Ｒ_２がＲ_１'Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）ＮＲ_１'Ｒ_２'または-Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１'。
式Ｉの化合物で追加的に好ましいものは、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がシアノ、ＹがＮＲ_４'であってＲ_４がひとつ以上の置換基を有するフェニル若しくはヘテロアリール基のものが含まれる。
さらに好ましい化合物は以下の実施例に示される。

化合物の製造方法
一般に、式Ｉの化合物は式IIのピロールを反応させて製造される；

式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ₃は既に定義したとおりであり、塩基の存在下アミノ化試薬
と反応させて式IIIのアミノ化ピロールを製造する：

式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ₃は既に定義したとおりである。
式IIIの化合物は閉環条件下で、式Ｒ_６Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＺＲ_５のカルボニルまたは式（ＲＯ）_２ＣＲ_６ＣＨ_２ＺＲ_５のアセタールと反応させて式IVの化合物を得る。ここで、Ｒはアルキル基であり、Ｚ、Ｒ_５およびＲ_６は既に定義したとおりである。

式IVの4-オキソ-ピロロピリダジンは、ＰＯＣｌ_３やＰＯＣｌ₅のような脱離基を与える試薬と反応させ式Ｖの化合物を得る；

式中、Ｌは脱離基である。
式Ｖの化合物と式ＨＹＲ_４の化合物を反応させて、上記式Ｉの化合物を得る。ここでＹおよびＲ_４は既に定義したとおりである。

式Ｉの化合物は下記反応スキームに記載された工程に従って製造できる。これら反応を行うための適切な試薬および手順は以下の記載および実施例に表される。スキーム中の保護および脱保護は一般的に当業者に知られた方法により行われる〔例えば、T.W.Green & P.G.M.Wuts, Protecting Group in Organic Synthesis,第三版, Wiley（1999）参照〕。スキームＡからＤにおいては、特に断らない限り、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ₃、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は上記の定義通りである。変数ＬおよびＬ'は脱離基を表す。添字のａ、ｂが付加した変数は、その親変数と同じ範囲内でそれぞれ独立に選択される。例えば、Ｒ_２ａ、Ｒ_２ａ'およびＲ_２ａ''は、それぞれＲ_２、Ｒ_２'およびＲ_２''と同じ範囲を占めるが必ずしも同一ではない。

スキームＡ

式IIのピロールは、特許協力条約（ＰＣＴ）公開番号ＷＯ00/71129、継続中の米国（ＵＳ）特許出願US 09/573829、US 01/49982およびUS 10/036293に記載された方法により入手することができる（いずれも参考のためそのまま本明細書に組み込んだ）。
式IIのピロールを適切な溶媒中塩基で処理しアミノ化試薬を加えると式IIIのアミノピロールを与える。適切な塩基としては、水素化ナトリウム（ＮａＨ）、ｎ−ＢｕＬｉ、ｔ−ＢｕＬｉ、ＮａＯＨ、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）およびリチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＨＭＤＳが含まれる。適切な溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＣＨ_３ＣＮおよびトルエンが含まれる。適切なアミノ化試薬としては、2、4-ジニトロアミノフェノール、ＮＨ_２ＯＳＯ_３ＨおよびＣｌＮＨ_２が含まれる。アミノ化試薬としてはＣｌＮＨ_２または2、4-ジニトロアミノフェノールが好ましい。塩基としては、ＮａＨまたはＬＤＡが、反応溶媒としてはＤＭＦまたはＴＨＦが好ましい。より好ましくは、塩基はＮａＨ、反応溶媒はＤＭＦ、アミノ化試薬は2、4-ジニトロアミノフェノールである。

式IIIの化合物とアセタールとを縮合させ、続いて適切な溶媒中で塩基により環化させると式IVのピロロピリダジンを得る。適切な塩基としてはＮａＯＨ、ＬＤＡ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、1,8-ジアゾシクロ[5,4,0]ウンデク-7-エン（ＤＢＵ）およびＫ_２ＣＯ_３が含まれる。適切な反応溶媒としては、ＴＨＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＤＭＦおよびトルエンが含まれる。好ましい塩基はＤＢＵ、ＤＩＰＥＡまたはＬＤＡであり、好ましい反応溶媒はトルエンまたはＤＭＦである。より好ましくは、塩基はＤＢＵまたはＤＩＰＥＡであり、反応溶媒はトルエンである。あるいは、式IVの化合物は以下のスキームＨ、ＪおよびＫの反応により得られる。

式IVの化合物の４位オキソ基の脱離基への変換は、例えばＳＯＣｌ_２、ＰＯＣｌ_３またはＰＯＣｌ_５等の適切なハロゲン化試薬により達成できる。より好ましい試薬は、ＰＯＣｌ_３である。
式Ｖの化合物を反応溶媒中塩基の存在下で式ＨＹ-Ｒ_４の試薬で処理すると式VIの化合物を与えるが、これはＲ_６がＨである式Ｉの化合物である。適切な塩基としてはＮａＨ、Ｅｔ_３Ｎ、ＤＩＰＥＡ、Ｋ_２ＣＯ_３またはＮａ_２ＣＯ_３が含まれ、適切な反応溶媒としては、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２またはＣＨ_３ＣＮが含まれる。好ましい塩基はＮａＨ、Ｅｔ_３ＮまたはＫ_２ＣＯ_３であり、好ましい溶媒はＣＨ_３ＣＮまたはＤＭＦである。より好ましくは塩基はトリエチルアミンであり溶媒はアセトニトリルである。

スキームＢ

式VIにおいてＸが原子価結合、Ｒ_２がＣＯ_２Ｒ_２'、ＺＲ_５がＣＮ、Ｒ_６が水素である式VIａの化合物を塩基を用いて鹸化することによりスキームＢに示される式VIIのカルボン酸を得る。適切な塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨおよびＢａ（ＯＨ）_２である。好ましい塩基はアルカリ金属の水酸化物であり、より好ましい塩基はＮａＯＨである。
式VIにおいてＲ_２ＸがＲ_２ａ'Ｒ_２ａ''ＮＣ（Ｏ）、ＺＲ_５がＣＮ、Ｒ_６が水素である式VIIIの化合物は、反応溶媒中で式VIIの化合物と縮合剤および式ＮＨ_２Ｒ_２ａ'Ｒ_２ａ''のアミンとを反応させて得られる。適切な縮合試薬としてはＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ〔ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート〕、ＣＤＩ（N,N'-カルボニルジイミダゾール）、ＤＣＣ（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＨＢＴＵ（O-ベンゾトリアゾール-1-イルN,N,N',N'-テトラエチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＯＡｔ（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール）、ＨＯＢｔ（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＥＤＣ〔1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド〕が含まれる。好ましい縮合試薬はＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰまたはＥＤＣである。さらに好ましい縮合試薬はＨＯＢｔとＰｙＢＯＰである。

式VIにおいてＸＲ_２がＲ_２ａ'ＯＣ（Ｏ）、ＺＲ_５がＣＮ、Ｒ_６が水素である式IXの化合物は、式VIIの化合物を式Ｒ_２ａ'ＯＨのアルコールと酸若しくは塩基と処理することにより得られる。適切な酸としてはＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＴｓＯＨ、10-カンファースルホン酸（ＣＳＡ）およびp-トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴｓ）が含まれる。より好ましい酸は塩酸である。
式VIにおいてＸＲ_２がＲ_２ａ'ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_２ａ''、ＺＲ_５がＣＮ、Ｒ_６が水素である式Ｘの化合物は、式VIIの化合物をアジド化試薬（Ｎ_３源）で処理し、続いて式Ｒ_２ａ'ＯＨのアルコールを加えることにより得られる。適切なアジド化試薬としては、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）およびＮａＮ_３が含まれる。好ましい試薬はＤＰＰＡである。

スキームＣ

スキームＣに示されるとおり、式ＩにおいてＸＲ_２がＮＨ（Ｒ_２ａ'）_２である式XIIの化合物は式Ｘの化合物を経由して得られる。ここでは、式Ｘの化合物上のカルボアルコキシ部分が切断可能な保護基として機能している。式XIの中間化合物は式Ｘの化合物のカルボアルコキシ部分を除去すれば得られる。好ましくは、そのカルボアルコキシ部分はt-ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ）またはベンジルオキシカルボニル基ＣｂｚまたはＺ）である。これらおよびその他の保護基切断のための好ましい条件はGreen and Wuts（上記）に開示されている。好ましくは、脱保護反応は酸による切断または水素化反応である。
式XIIの化合物は、式Ｒ_２ａ'ＣＨＯのアルデヒドと還元試薬を適切な溶媒中で用いて、式XIの化合物を還元的アミノ化することにより得られる。適切な還元試薬としてはＮａＢＨ_４、ＬｉＢＨ_４、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）、水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＨ）およびＮａＮＨ（ＯＡｃ）_３が含まれる。好ましい還元試薬はＮａＮＨ（ＯＡｃ）_３またはＮａＢＨ_４である。より好ましい還元試薬はＮａＮＨ（ＯＡｃ）_３である。適切な反応溶媒としては1,2-ジクロロエタン、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＴＨＦおよびＣＨ_３ＣＮが含まれる。好ましい反応溶媒は1,2-ジクロロエタンおよびＣＨ_２Ｃｌ_２であり、さらに好ましくはその還元は1,2-ジクロロエタン中がよい。

あるいは、式XIIの化合物の製造は式XIの化合物を塩基と式Ｒ_２ａ'Ｌの試薬で処理することにより達成される。適切な塩基としてはＫ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｅｔ_３Ｎ、ＤＩＰＥＡ、Ｃｓ_２ＣＯ_３、ＤＢＵおよびピリジンが含まれる。好ましくは、塩基はＫ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｅｔ_３Ｎよりなる群から選択される。さらに好ましくは塩基は炭酸水素ナトリウムである。

スキームＤ

式XVの化合物はスキームＤに記載された方法により製造される。ＸＲ_２がＲ_２'ＯＣ（Ｏ）である式VIの化合物のネット還元により式XIIIのアルデヒドが得られる。ネット還元を行うための適切な手段としては、還元試薬による反応、または強力な還元試薬と弱い酸化剤との連続反応が含まれる。適切な還元試薬は当業者に一般的に知られており、また例えば
Advanced Organic Chemistry 第３版, Part B: Reactions and Synthesis, Francis A.Carey, Richard J.Sundberg, Plenum Publishing Corp.,NY（1993）；March's Advanced OrganicChemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 第５版,Wiley-InterScience, John Wiley & Sons,Inc.,NY（2001）等の参考文献中に見出せる（参考までに引用した）。

酸化剤と還元剤の適切な組み合わせとしては、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ-Ｈ）とＭｎＯ_２が含まれる。好ましくは、ネット還元はＤＩＢＡＬ−Ｈ、ＬＡＨ、ＮａＢＨ_４またはＬｉＢＨ_４のような還元試薬と、ＭｎＯ_２、ＳＯ_３−ピリジン、ＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ、遊離ラジカル）、Dess-Martinperiodinate、ＴＰＡＰ（テトラプロピルアンモニウムパールテネート）とＮＭＯ（N-メチルモルホリン-N-オキシド）との組み合わせのような酸化剤との連続反応によって達成される。さらに好ましくは、その還元は最初ＤＩＢＡＬ−Ｈにより中間化合物を生成し、それからＭｎＯ_２によって酸化され式XIIIの化合物を得るものである。

適切な反応溶媒中で酸化剤で処理し、連続して適切な反応溶媒中で塩基および式Ｒ_２ａ'Ｌの試薬を用いてエーテル化をすることにより式XVの化合物を得る。これは式VIにおいてＸＲ_２がＯＲ_２ａ'の化合物である。適切な酸化剤としては、m-クロロ過安息香酸（ｍ-ＣＰＢＡ）およびＨ_２Ｏ_２が含まれる。適切な塩基としては、ＮａＨ、Ｅｔ_３Ｎ、ＤＩＰＥＡおよびＫ_２ＣＯ_３が含まれる。適切な反応溶媒としては、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＣＨ_３ＣＮが含まれる。より好ましくは、酸化剤はm-クロロ過安息香酸（ｍ-ＣＰＢＡ）、塩基はＮａＨ、反応溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはＤＭＦである。

スキームＥ

式Ｖの化合物の5-メチル基のハロゲン化はハロゲン化試薬で処理すれば達成される。適切なハロゲン化試薬としては、塩化スルフリル、Ｎ-ヨードスクシンイミド、Ｎ-ブロモスクシンイミド、Ｎ-クロロスクシンイミド、塩化オキザリルが含まれるが、これらに限定はされない。ハロゲン化は、例えばＮ_２のような不活性気体中、触媒の存在下で行われ、式XVIのハロゲン化ピロール中間体を与える。好ましくは、触媒は過酸化ジベンゾイル、2,2'-アゾビスイソブチロニトリルまたは光照射である。

式XVIのピロールを塩基の存在下で式ＨＳＲ_3ａ'のチオール、式ＨＯＲ_3ａ'のアルコール中間体、または式ＨＮＲ_3ａ'Ｒ_3ａ''の一級若しくは二級アミンで処理すると式XVIIのピロールを与える。適切な塩基としてはＮａＨＣＯ_３、ジイソプロピルエチルアミンＤＢＵ、ＫＨＣＯ_３、およびトリエチルアミンが含まれる。好ましい塩基はＮａＨＣＯ_３またはトリエチルアミンである。アセトニトリルはこの反応に対して適切な反応溶媒である。
式XVIIのピロールを室温下、塩基の存在のもとで式ＨＹＲ_４の試薬で処理すると式XVIIIの化合物を与える。好ましい塩基はＮａＨＣＯ_３またはトリエチルアミンである。アセトニトリルはこの反応に対して適切な反応溶媒である。式XVIIのピロールを塩基の存在下で式ＨＹＲ_４の試薬とともに加熱してもまた式XVIIIの化合物を与える。

スキームＦ

式VIにおいてＲ_３が-ＣＨ_２ＳＲ_3ａ'に該当する化合物XIXを酸化すると化合物XXのスルホキシド（n=1）、または化合物XXのスルホン（n=2）を与える。適切な酸化剤としては、m-クロロ過安息香酸（ＭＣＰＤＡ）、ｔＢｕ-ＯＯＨ、Ｈ_２Ｏ_２、ＮａＩＯ_４およびジメチルジオキシランが含まれる。好ましい酸化剤はＭＣＰＤＡである。反応混合物に加える酸化剤の当量数が硫黄原子の最終酸化状態を決定する。式XXの化合物（n=1または2）を、過剰の式ＨＯＲ_3ｂ'のアルコール、または式ＨＮＲ_ｂａ'Ｒ_3ｂ''の一級若しくは二級アミンとともに加熱すると式XXIの化合物を与える。

スキームＧ

スキームＢに由来する式VIIの化合物は、塩基の存在下でリン酸エステルとウィティヒ（Wittig）反応が進行し式XXIIの化合物を与える。当業者によく知られた適切なリン酸エステルを用いることができる。好ましいリン酸エステルはメチルジエチルホスホノアセテートである。ウィティヒ反応については、ジクロロエタン等が適切な反応溶媒である。適切な塩基としてはＫＨ、Ｋ_２ＣＯ_３、N-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム、ＮａＨが含まれ、ＮａＨが好ましい。
式XXIIの化合物のＲ_２置換基中の二重結合を触媒の存在下で水素化することにより、式XXIIIの化合物を得ることができる。適切な触媒としては、ＰｔＣｌ_２、パラジウム炭素Ｐｄ/Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）_２、およびラネーＮｉが含まれる。好ましい触媒は、Ｐｄ/Ｃである。

式XXIIIのエステルは、当業者によく知られた方法（例えば上記Green and Wuts）により加水分解することができ、好ましくはＮａＯＨによる塩基性加水分解である。続いて、縮合試薬の存在下で得られた酸をアミンと縮合させると式XXIVのアミドが得られる。適切な縮合試薬は当業者によく知られており、例えばThe Practice of Peptide Synthesis、第二版、Bodanszy, Miklos編Springer-Velag（1993）（参考までに組み込んだ）に記載されたものが含まれる。好ましい縮合試薬はN,N'-ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。

スキームＨ

スキームＨは式IVの化合物（スキームＡ参照）の合成の別経路を表す。式IIIのピロールと式Ｒ_６Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＺＲ_５の試薬を縮合させ、続いて適切な溶媒中で塩基による環化反応を行うと式IVの中間体が得られる。適切な塩基としては、ＤＢＵ、ＮａＨ、ＢｕＬｉ、Ｅｔ_３Ｎ、ＤＩＰＥＡが含まれる。適切な反応溶媒としては、トルエン、ＴＨＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＤＭＦ、トルエンとＣＨ_３ＣＮが含まれる。好ましい塩基は、ＮａＨ、ＤＢＵまたはＤＩＰＥＡであり、好ましい溶媒はＤＭＦ、トルエンまたはＴＨＦである。式Ｒ_６Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＺＲ_５の試薬で、特にＲ_６が置換酸素、窒素若しくはアルキル基でＺＲ_５がニトリルのものは市販品から購入するかまたは当業者により容易に合成される。

スキームＩ

スキームＩに示すように、式VIの化合物でＺＲ_５がニトリル基である式XXVの化合物（上記スキームＡ参照）は触媒と水素の存在下で還元され式XXVIの化合物を与える。適切な触媒としてはＰｔＣｌ_２、Ｐｄ/Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）_２、およびラネーＮｉが含まれる。好ましい触媒はパラジウム炭素である（Ｐｄ/Ｃ）。
式XXVIの化合物は式Ｒ_５ａＬの試薬（式中Ｌは脱離基で、例えばハロゲン）と組み合わせると、塩基の存在下で式XXVIIの化合物を与える。適切な塩基としては、ＫＨ、Ｋ_２ＣＯ_３、N-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウムおよびＮａＨが含まれる。式Ｒ_５ａＬの試薬は市販品から容易に入手できる。

付け加えると、式XXVIの化合物は塩基の存在下で、式（Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ））_２ＯまたはＲ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ）-Ｌ'（式中Ｌ'は脱離基で、例えばハロゲン）の試薬と反応させても式XXVIIの化合物を与える。適切な塩基としては、ＮａＨＣＯ_３、ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ、ＫＨＣＯ_３、トリエチルアミンが含まれる。好ましい塩基はトリエチルアミンである。式Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ）-Ｌ'また（Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ））_２Ｏの試薬は市販品から容易に入手できるか、または当業者であれば合成することができる。

スキームＪ

スキームＪは、式IVにおいてＲ_６が水素でＺＲ_５がニトリルである式XXXの化合物の合成を示す。式IIIのピロールを高沸点のプロトン性溶媒中で活性中間体と反応させると式XXIXの中間体が得られる。好ましくは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やジメチルアセタミドが用いられる。
塩基の存在下で式XXIXの中間体をアセトニトリルと反応させると環化反応が進行して式XXXの化合物が得られる。適切な塩基としては、ＫＨ、ＮａＨ、sec-ブチルリチウム、および好ましくはN-ブチルリチウムが含まれる。上記のスキームＡに示したとおり、式XXXの化合物は、Ｒ_６が水素でＺＲ_５がニトリルである式Ｉの化合物を合成するための中間体である。

スキームＫ

式XXXIVおよびXXXVの化合物の合成をスキームＫに示す。式XXXIVおよびXXXVの化合物はＲ_６が水素でＺＲ_５がニトリルである式IV（上記スキームＡ参照）の中間体である。式XXXIのピロールを式XXXIIの活性中間体とともに高沸点溶媒中で処理すると、式XXXIIIの中間体が得られる。適切な溶媒としては、ニトロベンゼン、トルエンで、好ましくはトルエンであるがこれらに限定されることはない。
式XXXIIIの中間体を高沸点溶媒中でさらに加熱すると環化反応が進行して式XXXIVおよび式XXXVの中間体が得られる。適切な溶媒としては、ＤＭＦ、ＤＭＡ、N-メチルピロリジノン、好ましくはDowtherm（商標）、または高圧容器中のトルエンが含まれるが、これらに限定はされない。

スキームＬ

式XXXVIの化合物の合成をスキームＬに示す。式XXIの化合物（スキームＦに由来）をジイソプロピルエチルアミンまたはトリエチルアミンのような塩基の存在下で、スキームＬに記載したように、式Ｘ'Ｃ（Ｏ）Ｘ'若しくはＸ'Ｃ（Ｏ）ＯＣ（Ｏ）Ｘ'の活性中間体で、加熱しながら若しくは加熱せずに処理すると式XXXVIの化合物が得られる。適切な溶媒としては塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフランまたは酢酸エチルが含まれるがこれらに限定はされない。
上記のスキームＫに示されたように式XXXIVおよびXXXVの化合物は、Ｒ_６が水素でＺＲ_５がニトリルである式Ｉの化合物を合成するための中間体である。式XXXIIの活性中間体および関連する該構造の試薬は市販品から容易に入手できるか、当業者によって調製される。

以下のスキーム１から５は、本発明化合物を調製するための好ましい方法をいくつか要約したものである。スキーム１から５においては特に示さない限り、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_２'、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は上記のとおりであり、Ｌは脱離基を現す。添え字のａ、ｂが付いた変数はその親の変数と同じ範囲内であるが独立して選択されることを意味する。

スキーム１

式VIの3-シアノピロロピリダジンはスキーム１に従って調製される。式IIのピロールは特許協力条約（ＰＣＴ）公開番号ＷＯ00/71129、係属中の米国（ＵＳ）特許出願US 09/573829、ＰＣＴ出願番号US01/49982およびUS 10/036293に記載された方法により入手することができる（いずれも参考のためそのまま本明細書に組み込んだ）。

式IIのピロールをＤＭＦのような反応溶媒中で水素化ナトリウムのような塩基で処理し、続いて2,4-ジニトロアミノフェノールのようなアミノ化試薬を加えると式IIIのアミノピロールが得られる。1,1-ジエトキシプロピオニトリルのようなアセタールと縮合させ、続いてトルエンのような溶媒中でＤＢＵまたはジイソプロピルエチルアミンのような塩基を用いて塩基による環化反応を誘導し式IVの3-シアノピロロピリダジンを得る。その後、ＰＯＣｌ_３やＰＯＣｌ_５のようなクロロ化試薬を用いると式Ｖの4-クロロ化合物へと変換することができる。次いで、トリエチルアミンのような塩基の存在下、アセトニトリルのような溶媒中で式Ｖの化合物を式ＨＹ-Ｒ_４の試薬で処理すると、式VIの化合物が得られる。これは式ＩにおいてＸＲ_２がＣ（Ｏ）ＯＥｔ、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨの化合物である。

スキーム２

スキーム２に示すとおり、式VIの化合物はＮａＯＨのような塩基で鹸化されて式VIIのカルボン酸を与える。式Ｉの化合物においてＸＲ_２がＣ（Ｏ）ＮＨＲ_２'、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨである式VIIIの化合物は、ジクロロメタンのような溶媒中で式VIIの化合物とＥＤＣのような縮合剤およびＮＨＲ_２ａ'Ｒ_２ａ''のようなアミンとで処理すると調製することができる。式Ｉの化合物においてＸＲ_２がＣ（Ｏ）ＯＲ_２'、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨである式IXの化合物は化合物VIIを塩酸のような酸および式Ｒ_２'ＯＨのようなアルコールとで処理することにより調製される。式Ｉの化合物においてＸＲ_２がＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ_２'、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨである式Ｘの化合物は、ＤＰＰＡのような試薬で処理し、続いて式Ｒ_２'ＯＨのようなアルコールを加えると調製できる。

スキーム３

スキーム３に示すように、式Ｉの化合物においてＸＲ_２がＮＨＲ_２ａ'、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨである式XIIの化合物は、化合物Ｘのカルボアルコキシ基が切断可能な保護基（例えば、Ｒ_２'がt-ブチルまたはベンジル）である場合、当該化合物Ｘから調製することができる。脱保護、即ち、それぞれに対して酸分解または水素化反応により式XIの化合物が得られる。その後、1,2-ジクロロエタンのような反応溶媒中で式Ｒ_２ａ'ＣＨＯのアルデヒドとＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３のような還元剤とを用いて、当該式XIの化合物の還元的アミノ化を行うことにより式XIIの化合物が得られる。あるいは、式XIの化合物をＮａＨＣＯ_３のような塩基および式Ｒ_２ａ'Ｌの試薬で処理することにより式XIIの化合物の調製が達成される。

スキーム４

式XVの化合物はスキーム４に示す方法により調製される。ジクロロメタンのような溶媒中でＤＩＢＡＬ−Ｈのような還元剤を用いて式VIの化合物を還元し、続いてＭｎＯ_２のような酸化剤で酸化することにより式XIIIのアルデヒドが得られる。ジクロロメタンのような溶媒中で式XIIIの化合物をm-ＣＰＢＡのような過酸で処理し、続いてテトラヒドロフランやＤＭＦのような溶媒中水素化ナトリウムのような塩基と式Ｒ_２ａ'Ｌの試薬でエーテル化を行って式XVの化合物を得る。これは、式ＩにおいてＸＲ_２がＯＲ_２ａ'、Ｚが原子価結合、Ｒ_５がＣＮ、Ｒ_６がＨの化合物である。

スキーム５

スキーム５に示されるように、式ＩにおいてＲ_６がＨ、ＺＲ_５がニトリルである式XXVの中間体を水素、トリフルオロ酢酸およびＰｄ/Ｃのような触媒の存在下で還元すると式XXVIの化合物が得られる。式XXVIの化合物をトリエチルアミンのような塩基の存在下で、式Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ）-Ｃｌまたは（Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ））_２Ｏの中間体で処理すると式XXVIIの化合物が得られる。式Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ）-Ｃｌおよび（Ｒ_５ｂ-Ｚ_ｂ-Ｃ（Ｏ））_２Ｏの中間体は市販品から容易に入手できるか、当業者により合成される。
式Ｉの化合物の溶媒和物（例えば、水和物）もまた本発明の範囲内に含まれる。溶媒和の方法は当業者に知られている。従って、即時の発明化合物は遊離または溶媒和の形態であってもよい。

式Ｉの化合物は塩として、特に薬学的に許容される塩として存在してもよい。例えば、少なくともひとつの塩基性中心を有する式Ｉの化合物は酸付加塩を形成し得る。例えば、無機の強酸、例えば硫酸、リン酸、ハロゲン化水素酸のような鉱酸；有機の強酸、例えば酢酸のような炭素数１から４の置換（例えばハロゲン）若しくは無置換のアルキルカルボン酸；例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テレフタル酸のような飽和若しくは不飽和のジカルボン酸；例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、酒石酸、クエン酸のようなヒドロキシカルボン酸；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン等）；安息香酸；有機のスルホン酸、例えばメタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸のようなＣ_１-Ｃ_４アルキルまたはアリールの置換（例えばハロゲン）若しくは無置換のスルホン酸、との塩が形成される。望むならば追加的な塩基中心を有する酸付加塩もまた形成される。

少なくともひとつの酸性基（例えばカルボン酸）を有する式Ｉの化合物は塩基との塩を形成し得る。適切な塩基付加塩としては、例えばアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩のような金属塩、具体的にはナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩；アンモニア若しくは有機アミンとの塩、例えばモルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、モノ、ジ若しくはトリ低級アルキルアミン（具体的にはエチル、t-ブチル、ジエチル、ジイソプロピル、トリエチル、トリブチル、ジメチルプロピルアミン）の塩；例えばモノ、ジ若しくはトリエタノールアミンのようなモノ、ジ若しくはトリヒドロキシ低級アルキルアミンの塩がある。

さらには対応する分子内塩を形成してもよい。薬学的使用には不適な塩であっても、例えば式Ｉの化合物の遊離体または薬学的に許容される塩を単離し精製するために用いられるものもまた本発明の範囲内に含まれる。
塩基性基を含む式Ｉの化合物の好ましい塩としては、一塩酸塩、酸性硫酸塩、メタンスルホン酸塩、リン酸塩、硝酸塩等が含まれる。
酸性基を含む式Ｉの化合物の好ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩および薬学的に許容される有機アミンの塩が含まれる。

化合物の使用方法
本発明のピロロピリダジンがプロテインキナーゼの阻害剤であることが発見された。より具体的には、ある種のピロロピリダジンは受容体チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼの効力を阻害し、ガンや炎症性疾患のような、過度の増殖、血管新生、血管透過性亢進、炎症と関連する疾患状態の治療上価値ある財産である。特に、式Ｉの化合物、その塩、溶媒和物および立体異性体は、その抗増殖性および／または抗血管新生メカニズムによって、初期の再発性固形ガンの成長阻止が期待される。固形ガンとしては、例えば、膀胱、扁平上皮細胞、頭、結腸直腸、食道、婦人科（例えば卵巣）、膵臓、胸、前立腺、肺、外陰部、皮膚、脳、尿生殖器、リンパ系（例えば甲状腺）、胃、喉頭、肺等のガンが含まれる。本発明のある態様においては、必要とする患者に、上記式Ｉの化合物の治療上有効量を投与することよりなる増殖性または炎症性疾患の治療方法が提供される。

該方法は、任意で、少なくとも一つの他の治療薬の投与を含むことができる。他の治療薬とは、例えば血管新生阻害剤、抗エストロゲン、プロゲストロゲン、アロマターゼ阻害剤、抗ホルモン、抗プロゲストロゲン、抗アンドロゲン、LHRH作動剤および拮抗剤、テストステロン-５α-ジヒドロリダクターゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、抗浸潤薬、成長因子阻害剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗ガン抗生物質、白金誘導体、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、および生物的応答修飾剤、リノマイド、インテグリンαvβ3機能阻害剤、アンジオスタチン、ラゾキシン、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、リュープロリド、フィナステリド、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼ、プラスミノーゲンアクチベーター受容体機能阻害剤、成長因子抗体、成長因子受容体抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、プリン、アデノシン同族体、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ナイトロゲンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロフホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エポチロン同族体、ディスコデルモライド同族体、エロイテロビン同族体、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、フラボピリドール、生物学的応答修飾剤。より好ましい態様においては、追加的治療薬は、エルビタックス（TM）、タキソール、パラプラチンおよびイフェックスより選択される。

より一般的には、式Ｉの化合物は種々のガンの治療に有効である。そのガンとしては、限定はされないが以下のものが含まれる：
上皮性悪性腫瘍で膀胱、胸、直腸、腎臓、肝臓、肺、小細胞肺ガンを含み、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、前立腺および皮膚（扁平上皮細胞ガンを含む）のガンを含み；
リンパ系統の造血器腫瘍で、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーケットリンパ腫を含み；
骨髄系統の造血器腫瘍で、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、前骨髄球性白血病を含み；
間葉由来の腫瘍で、線維肉腫と横紋筋肉腫を含み；中枢および末梢神経系の腫瘍で、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含み；およびその他の腫瘍、黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラト、甲状腺濾胞性ガン、カポシ肉腫を含む。

式Ｉの化合物はプロテインキナーゼ活性の発現率の高い腫瘍、例えば結腸、肺、前立腺、胸、膵臓等の腫瘍の治療に特に有用である。本発明化合物、又はその組み合わせよりなる組成物を投与することにより、哺乳類宿主の腫瘍の発達が抑制される。
式Ｉの化合物はまた、成長因子受容体を経由するシグナル伝達経路に関連した、腫瘍以外の疾患の治療においても有用である。例えば、一般細胞増殖の規制においてキナーゼ類が主要な役割を果たしているために、キナーゼ阻害剤は可逆的な細胞増殖抑制剤として機能し、異常な細胞増殖で特徴づけられるいずれの疾患の治療においても有用かも知れない；例えば、良性前立腺肥大、家族性大腸ポリープ症、神経線維腫症、アテローム動脈硬化、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成または血管手術後の再狭窄、肥厚性瘢痕の形成、炎症性大腸疾患、移植拒絶、エンドトキシンショック、真菌感染症等である。

加えて、式Ｉの化合物はアポトーシスを誘導若しくは阻害する可能性がある。種々のヒト疾患において、アポトーシス応答は異常である。式Ｉの化合物はアポトーシスの修飾剤としてガン（限定はされないが、上記のものを含む）、ウィルス感染（限定されないが、ヘルペス、ポックスウィルス、ＥＢウィスル、シンドビスウィルス、アデノウィルス等を含む）、ＨＩＶ感染患者のＡＩＤＳ進行の阻止、自己免疫病（限定されないが、ＳＬＥ、自己免疫性糸球体腎炎、関節リウマチ、乾癬、炎症性大腸炎、自己免疫性糖尿病が含まれる）、神経変性病（限定されないが、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、小脳変性症を含む）、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、虚血性障害、不整脈、アテローム性動脈硬化、毒性−アルコール関連肝臓疾患、血液病（限定されないが、慢性貧血、再生不良性貧血を含む）、筋骨格系の変性疾患（限定されないが、骨粗鬆症、関節炎を含む）、アスピリン感受性鼻副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎疾患、ガン痛等の治療に有用である。

プロテインキナーゼの阻害剤として、本発明化合物は不適切なキナーゼ活性に関連した状態の治療に有用である。そのような状態としては、細胞内シグナルの結果変化したサイトカインレベル、特に、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αのようなサイトカインの過剰産生に関連した疾患が含まれる。例えば、本発明化合物は次の治療または予防に有用である；ＩＬ−１関連疾患、例えば関節リウマチ、骨粗鬆症、脳梗塞、内毒素血症および／または毒素性ショック症候群、エンドトキシン誘導の炎症反応、炎症性大腸疾患、結核、アテローム性動脈硬化、筋肉変性、悪液質、乾癬性関節炎、ライター症候群、痛風、外傷性関節炎、風疹関節炎、急性滑膜炎、糖尿病、膵臓β細胞病、アルツハイマー病；

ＩＬ−４媒介疾患もしくは状態、例えば喘息で生じるアレルギー性炎症過程；ＩＬ−８媒介疾患もしくは状態、例えば、大量の好中球浸潤で特徴づけられる乾癬、炎症性大腸疾患、喘息、心臓若しくは腎臓の再灌流障害、成人呼吸窮迫症候群、血栓症、糸球体腎炎；ＴＮＦ媒介疾患もしくは状態、例えば、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、その他の関節炎状態、敗血症、敗血性ショック症候群、成人呼吸窮迫症候群、脳マラリア、慢性肺炎症性疾患、珪肺症、肺サルコイソシス、骨吸収疾患、再灌流障害、移植片宿主反応、同種移植の拒絶反応、感染による発熱と筋肉痛、感染後の悪液質、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ又は悪性腫瘍、メロイド形成、瘢痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸炎、パイレシス、ウィルス感染例えばＨＩＶ、ＣＭＶ、インフルエンザ、ヘルペス；動物のウィルス感染例えばレンチウィルス感染、限定はされないがウマ伝染性貧血ウイルスを含む；またはレトロウィルス感染、猫免疫不全ウィルス、ウシ免疫不全ウィルス、イヌ免疫不全ウィルスを含む。

p38により媒介される病気には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、クローン病、例えばアルツハイマー病や脳梗塞のような神経性の疾患、炎症性骨疾患等が含まれる。p38により媒介される病気に関する更なる議論はＰＣＴ出願US01/49982および米国出願US 10/036293中で見ることができる（いずれも参考までに本願に組み込んだ。）。

本発明化合物のようなプロテインキナーゼ活性の阻害剤は、炎症性疾患、自己免疫疾患、破壊性骨疾患、増殖性疾患、血管新生疾患、感染症、神経変性疾患、ウィルス性疾患、アレルギー、心筋虚血、心臓発作における再灌流／虚血、器官ハイポシア、血管肥厚化、心肥大、トロンビンによる血小板凝集を含む状態、およびプロスタグランディンエンドパーオキシダーゼ・シンターゼ−２関連状態の予防や治療に有用であるが、これらに限定はされない。
予防または治療され得る炎症性疾患としては、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、アレルギー、成人呼吸窮迫症候群が含まれるがこれらに限定はされない。

予防または治療され得る自己免疫疾患としては、糸球体腎炎、関節リウマチ、全身性エリタマトーデス、強皮症、慢性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性胃炎、糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少、血小板減少症、アトピー性皮膚炎、慢性活性肝炎、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、移植対宿主病が含まれるがこれらに限定はされない。
予防または治療され得る破壊性骨疾患としては、骨粗鬆症、変形性関節炎、多発性ミエローマ関連骨疾患が含まれるがこれらに限定はされない。

予防または治療され得る増殖性疾患としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポシ肉腫、多発性骨髄腫が含まれるがこれらに限定はされない。
予防または治療され得る血管新生疾患としては、血管腫、乾癬、カポシ肉腫、眼性血管新生、未熟性網膜症、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化、ガン成長と転移、心筋虚血、末梢性虚血、脳虚血、障害性創傷治癒、女性の生殖疾患、器官低酸素症、障害性潰瘍治癒が含まれるがこれらに限定はされない。
予防または治療され得る感染性疾患としては、敗血症、敗血性ショック、細菌性赤痢が含まれるがこれらに限定はされない。
本発明化合物により予防または治療され得る神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳虚血、外傷による神経変性が含まれるがこれらに限定はされない。

予防または治療され得るウィルス性疾患としては、急性肝炎感染（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎を含む）、ＨＩＶ感染、ＣＭＶ感染が含まれるがこれらに限定はされない。
式Ｉの化合物はまた未分化胚芽細胞の着床を妨げ、よって哺乳類の避妊剤としても使用される。
加えて、本発明のプロテインキナーゼ阻害剤はプロスタグランディンエンドパーオキシダーゼ・シンターゼ−２（ＰＧＨＳ−２）またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）と呼ばれる、誘導前炎症性タンパクの発現阻害を示す。従って、本発明化合物の適切な投与によって予防または治療され得る状態としては、浮腫、無痛覚、発熱と痛み、例えば神経筋肉痛、頭痛、ガンによる痛み、歯痛、関節痛等を追加することができる。

内科的腫瘍学の分野では、ガン患者の治療において異なる薬物を組み合わせて使用することは通常よく行われている。従って、式Ｉの化合物は他の成分、例えば抗増殖剤、抗血管新生剤および／または血管透過性抑制剤と任意に組み合わせることができる。更には、本発明化合物の投与と併せ外科療法、放射線若しくは化学療法を任意に併用することもできる。従って、式Ｉの化合物は単独で投与する他、他の一つ若しくはより多くの薬物、物質および／または治療法と組み合わせることができる。
このような結合治療は、独立した治療単位を同時に、連続してまたは分離して適用することができる。同時に投与しない場合は、その構成単位の治療はいずれの順で適用してもよい。固定用量で製剤化する場合は、そのような組み合わせの製品においては本発明化合物を以下に示す用量の範囲内で用い、他の薬学的な活性成分をその認められた用量の範囲内で使用する。薬学的な活性成分の用量範囲は、Physician's Desk Reference、第55版、、Medical Economics Company （2001）で見出すことができる。式Ｉの化合物はまた、結合剤が適当でない場合には、既知の抗ガン剤や細胞毒性薬および放射線照射を含む療法と連続して使用することができる。

一般には化学療法薬には三つの大きな種類がある；
（1）抗血管新生薬、例えば、リノマイド、インテグリンαvβ3機能の阻害剤、アンジオスタチン、ラゾキシン等；

（2）細胞毒性薬、例えば、抗エストロゲン（タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン等）、プロゲストロゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、エキセメスタン）、抗ホルモン、抗プロゲストロゲン、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド；ニルタミド；ビカルタミド；酢酸シプロテロン；（R）-2,3,4,5-テトラヒドロ-1-（lH-イミダゾール-4-イルメチル）-3-（フェニルメチル）-4-（2-チエニルスルホニル）-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-7-カルボニトリル、メシル酸塩；N-[5-[[[5-（1,1-ジメチルエチル）-2-オキサゾリル]メチル]チオ]-2-チアゾリル]-4-ピペリジンカルボキサミド、ヘミ L-酒石酸塩、セタキシマブ；係属中の米国出願10/025,116に開示された分子（参考までに組み込んだ）；ＬＨＲＨ作動薬および阻害薬（例えば、酢酸ゴセレリン、リュープロリド）；テストステロン５α−ジヒドロリダクターゼ（例えば、フィナステリド）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、抗浸潤薬（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害薬およびウロキナーゼ・プラスミノーゲンアクチベータ受容体機能の阻害剤）および成長因子阻害剤（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子で成長因子抗体、成長因子受容体抗体、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／スレオニン阻害剤を含む）；および

（3）抗増殖剤／抗新生物薬およびその組み合わせで、内科腫瘍学で使用されるように、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートのような抗葉酸薬、5-フルオロウラシルのようなフルオロピリミジン、プリンおよびアデノシン同族体、シトシンアラビノシド）；インターカレーティング抗腫瘍抗生剤（例えば、ドキソルビシンのようなアントラシクリン、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシン、マイトマイシン-Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン）；白金誘導体（例えばシスプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレア、チオテファン）、抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、タキソール、タキソテールのようなタキソイドおよびエポチロン同族体のようなより新しい微小管薬、ディスコデルモライド同族体、エロイテロビン同族体）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えばエトポシド、テニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン）；細胞周期阻害剤（例えばフラボピリドール）；および生物学的応答修飾剤。特別な化合物としては、N-[5-[[[5-（1,1-ジメチルエチル）-2-オキサゾリル]メチル]チオ]-2-チアゾリル]-4-ピペリジンカルボキサミド、ヘミ L-酒石酸塩が含まれる。

式Ｉの化合物および式Ｉの化合物よりなる組成物は治療を受ける状態に適したいずれの方法によっても投与することができ、部位特異的な治療の必要性や輸送される薬物量に依存する。該化合物は０．０５から２００mg/kg/dayの用量範囲で、好ましくは１００mg/kg/day以下の量を、一度に若しくは２から４回に分けて投与することができる。
皮膚関連疾患については一般に局所投与が、ガン若しくは前ガン状態の場合は全身投与が好ましいが、他の投与経路も考慮される。例えば、該化合物および該組成物は経口的には、例えば錠剤、カプセル、顆粒、粉剤、シロップを含む液剤で；局所的には、例えば液剤、懸濁剤、ゲル、軟膏で投与され；舌下的に；口腔的に；非経口的に、例えば、皮下注、静注、筋肉注、胸骨内注で、または輸液技術により（例えば、無菌注射用水溶液若しくは非水溶液または懸濁液）；吸入スプレーのように経鼻的に；クリーム剤又は軟膏のように局所的に；坐剤のように経直腸的に；またはリポソームによって投与され得る。

非毒性の薬学的に許容される担体、ビークル、希釈剤を含む用量単位製剤が投与される。該化合物および該組成物は即時放出又は徐放性製剤の形態で投与される。即時放出又は徐放性は適切な薬学的組成物により、特に徐放性の場合は皮下埋め込みやオスモティックポンプのような道具を利用して達成される。すぐに利用できる該化合物および該組成物の投与および製剤化の更なる技術については、"Remington's Pharmaceutical Sciences"、第18版、（1990, Mack Publishing Co.,Easton,PA）中で見い出せる。

略号：以下の略号を用いる。
Δ＝加熱
Ａｃ＝アセチル
ＡｃＯＨ＝酢酸
ａｑ．＝水性の
ＡＴＰ＝アデノシントリホスフェート
ＢＯＰ＝ベンゾトリアゾール-l-イルオキシトリス（ジメチルアミノ）-ホスホニウム
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン
ＤＢＵ＝1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＥ＝ジクロロエタン
ＤＥＡＤ＝ジエチルアゾジカルボキシレート
ＤＩＢＡＬ−Ｈ＝水素化ジイソブチルアルミニウム
ＤＩＰＥＡ＝N,N-ジイソプロピルエチルアミン

ＤＭＡ＝ジメチルアセタミド
ＤＭＥ＝1,2-ジメトキシエタン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ＝ジフェニルホスホリルアジド
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ＥＤＣ＝1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド・塩酸塩
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
Ｅｔ＝エチル
Ｅｔ_２Ｏ＝ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＧＳＴ＝グルエチチオンＳ−トランスフェラーゼ
ｈ＝時間
ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＡｃ＝1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ＝1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
Hunigの塩基＝N,N-ジイソプロピルエチルアミン
ＫＯtＢｕ＝カリウムtert-ブトキシド

ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ＬＤＡ＝リチウムジイソプロピルアミド
ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク
ｍＣＰＢＡ＝m-クロロ過安息香酸
Ｍｅ＝メチル
ＭｅＩ＝ヨウ化メチル
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭＳ（ES）＝電子スプレー質量分析
ｎ−ＢｕＬｉ＝ｎ−ブチルリチウムn-butyllithium
Ｐｄ／Ｃ＝パラジウム炭素
Ｐｈ＝フェニル
ＰｈＣＨ_３＝トルエン

ｐＴＳＡ＝パラトルエンスルホン酸
ＲＴ＝保持時間
ｒｔ＝室温
ｓａｔ．＝飽和
ｔ−Ｂｕ＝tert-ブチル
ＴＣＡ＝トリクロロ酢酸
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＝トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン・塩酸塩
Ｔｓ＝トシル
ＴｓＣｌ＝塩化トシル
ＴｓＯＨ＝トシル酸

以下の実施例は本発明をより詳細に記述するために提供される。これらの例は説明のためであって、本発明を限定するものではない。特に記さない限り、温度はすべて摂氏（℃）で表す。ＨＰＬＣカラムを提供するYMC Co.,Ltdは日本、京都に存在し、Waters Co. in Milford, MA.を通じて接触できる。

実施例１
3-シアノ-4-（シクロヘキシルアミノ）-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（lE）の調製

A.3-メチル-lH-ピロール-2,4-ジカルボン酸ジエチルエステル（1A）の調製

エチルイソシアノアセテート（38.1mL、0.34mol）およびＤＢＵ（50.8mL、0.34mol）をＴＨＦ（400mL）に溶解し、50℃でアセトアルデヒド（9.5mL、0.17mol）をＴＨＦ（100mL）に溶解し25分間かけて加えた。反応混合物を55℃で17時間撹拌してから25℃に冷却し酢酸（20mL）をゆっくりと加えた。得られた混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル（800mL）に溶解してＨＣｌ（1N、3x300mL）で洗浄した。水性の洗浄液を合一して酢酸エチル（3x200mL）で抽出し、有機層を合一してＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（3x200mL）、水（100mL）、食塩水（100mL）で洗浄してから減圧下で濃縮し暗褐色のオイルを得た。このオイルを酢酸エチル／ヘキサン（1:1）を用いてシリカゲルパッドを通して溶出し、減圧下で濃縮して化合物1A（16g、収率42%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ：3.536min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 226.0[M+H]^＋

B.1-アミノ-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸ジエチルエステル（1B）の調製

ＮａＨ（鉱油中60%懸濁、213mg、5.33mmol）をＤＭＦに懸濁し、０℃で化合物1A（l.Og、4.44mmol）を少しずつ加えた。反応混合物を０℃で５分間撹拌してから25℃に加温し更に１時間撹拌した。反応混合物を10℃に冷却し2,4-ジニトロアミノフェノール（972mg、4.88mmol）を２回に分けて加えた。得られた混合物を25℃に加温し、12時間撹拌してから水（40mL）およびジクロロメタン（50mL）上に注ぎ、二層を分液した。水層をジクロロメタン（3x20mL）で抽出してから有機層を合一し、ＮａＯＨ（1N、3x20mL）、水（20mL）、食塩水（20mL）で洗浄しＭｇＳＯ_４上で乾燥して、濾過をしてから減圧下で濃縮した。得られた赤褐色残渣を高真空化で更に12時間濃縮し、化合物2Bを800mg得た（収率75%）。これは更に精製を行わずに続いて用いた。
ＨＰＬＣ：3.488min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 241.17[M+H]^＋.

C.3-シアノ-1,4-ジヒドロ-5-メチル-4-オキソピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（1C）の調製

l-アミノ-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸ジエチルエステル（1.08g、4.50mmol）をトルエン（15mL）に溶解し、1,1-ジエトキシプロピオニトリル（2.02mL、1.93g、13.5mmol）とＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ（171mg、0.90mmol）を加えた。反応混合物を12時間加熱環流してから25℃に冷却した。ＤＢＵ（0.81mL、0.822g、5.40mmol）を加えて得られた暗褐色混合物を１時間80℃に加熱し、室温にまで冷却した。反応混合物をジクロロメタン（50mL）とＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液（50mL）上に注ぎ分液した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を合一して水洗しＭｇＳＯ_４上で乾燥して濾過し減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10-30%メタノール／ジクロロメタン）で精製して441mg（40%）の化合物1Cを褐色の固体として得た。
ＨＰＬＣ：3.383min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 246.09[M+H]^＋.

D.4-クロロ-3-シアノ-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（1D）の調製

化合物1C（370mg、1.51mmol）を入れた15mL丸底フラスコにＰＯＣｌ_３（1mL）を加え、75℃で２時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し得られた黄色残渣をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、ピペットを用いてこれをＮａＨＣＯ_３飽和水溶液中に０℃で加えた。不均一混合物を０℃で10分間撹拌してから室温にまで加温しさらに１時間撹拌した。混合物を分液漏斗に注ぎ二層を分液した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を合一してＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（1x20mL）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し濾過して減圧下に濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（20mL）に溶解しシリカパッドを通してそのシリカパッドをＥｔＯＡｃ（100mL）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し化合物1Dを黄色固体として得た。これは更に精製を行うことなく続いて用いた。
ＨＰＬＣ：4.160min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.

E.3-シアノ-4-（シクロヘキシルアミノ）-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（1E）の調製
化合物1D（20mg、0.076mmol）をアセトニトリル（1mL）に溶解し、ＮＥｔ_３（32μL、0.228mmol）とシクロヘキシルアミン（10μL、0.084mmol）を加えて反応混合物を25℃で撹拌した。24時間後、シクロヘキシルアミン10μＬを追加して反応混合物をさらに1.5時間撹拌し、その後、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（20mL）およびジクロロメタン上に注いだ。二層を分液し、水層をジクロロメタン（2x10mL）で抽出した。合一した有機層を水洗し（20mL）、ＭｇＳＯ_４上で乾燥して濾過し減圧下で濃縮し、18mg（75%）の化合物1Eを黄色固体として得た。これは更に精製することなく続いて用いた。
ＨＰＬＣ:4.60min （保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 327.2[M+H]^＋.

実施例２
3-シアノ-5-メチル-4-フェノキシピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステルの調製

化合物1D（18mg、0.068mmol）をアセトニトリル（0.5mL）に溶解し、Ｅｔ_３Ｎ（21μL、0.205mmol）およびフェノール（7mg、0.075mmol）を室温で加えた。反応混合物を24時間撹拌して、ジクロロメタン（10mL）およびＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（10mL）上に注いだ。二層を分液し、水層をジクロロメタン（3x5mL）で抽出し、合一した有機層を水洗し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し濾過して減圧下で濃縮し、化合物2（15mg、収率68%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ：4.35 min （保持時間）で100% （YMC S5 ODS カラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 340.0[M+NH_４]^＋.

実施例３
6-（メトキシメチル）-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[l,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（3C）の調製

A.3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（3A）の調製

化合物1D（26 mg, 0.10 mmol）をＤＭＦ（2 mL）に溶解し、Ｋ_２ＣＯ_３（138 mg, 1.00 mmol）およびp-フェノキシアニリン（20 mg, 0.11 mmol）を25℃で加えた。反応混合物を12時間撹拌してからジクロロメタン（15mL）で希釈し水（10 mL）および食塩水（10 mL）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し濃縮して得られた残渣をメタノール中で粉砕し、目的化合物31mg（収率76%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ： 4.62min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 413.12[M+H]^＋.
化合物3Aはまた以下の様にしても得られる：1D（1.00g、3.79mmol）をＴＨＦ（10mL）に溶解し、4-フェノキシアニリン（0.84g、4.53mmol）およびトリエチルアミン（1.06mL、7.58mmol）を加えた。反応混合物を60℃で３日間加熱し、その後室温にまで戻してＭｅＯＨ（50mL）で希釈した。得られた固体を濾取しメタノールで洗浄して乾燥し1.50g（収率96%）の3Aを黄色粉末として得た。

B.6-（ヒドロキシメチル）-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[l,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（3B）の調製

化合物3A（41mg、0.10mmol）をＴＨＦ（2mL）に溶解し、-78℃に冷却してＤＩＢＡＬ−Ｈ（1.5Mトルエン溶液、0.13mL、0.20mmol）を加えた。-78℃で反応混合物を６時間撹拌し、０℃に戻してからさらに２時間撹拌した。反応混合物にメタノール（3mL）およびＮａＨＣＯ_３（3mL）飽和水溶液を加えて反応を停止させ、これをジクロロメタン（20mL）中に注いだ。二層を分液し、水層をジクロロメタン（2x15mL）で抽出し、合一した有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過して減圧下に濃縮した。調製用ＨＰＬＣ（YMC S5 ODS 20x100mm、溶出0.1%TFA含有30-100%水性メタノールで15min、流速20mL/min）で精製して化合物3B 33mg（収率90%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ：3.98min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 371.19[M+H]^＋.

C.6-（メトキシメチル）-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（3C）の調製
化合物3B（9.0mg、0.025mmol）をＤＭＦ：ＴＨＦ（１：１）の混合溶媒（1mL）に溶解し、０℃でt-ＢｕＯＫ（1.5MＴＨＦ溶液、0.025mL、0.038mmol）を加えた。0℃で45分間撹拌の後、ヨウ化メチル（2μL、0.025mmol）を加えて反応混合物を１時間撹拌し、25℃に加温してさらに３時間撹拌した。この時点で反応は認められなかった。そこで、反応混合物をもう一度0℃に冷却しt-ＢｕＯＫ（1.5MＴＨＦ溶液、0.25mL、0.38mmol）を追加し、混合物を30分間撹拌してからヨウ化メチル（20μL、0.25mmol）を追加した。０℃でさらに２時間撹拌後、ＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液（10mL）とジクロロメタン（10mL）を加えて反応を停止させた。二層を分離し、水層をジクロロメタンで抽出し合一した有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過して濃縮した。調製用ＨＰＬＣ（YMC S5 ODS 20x100mm、0.1%TFA含有30-100%水性メタノールで15min溶出、流速20mL/min）で精製して目的物を黄色の半固体として得た。
ＨＰＬＣ：4.27min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm, 0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 385.21[M+H]^＋.

実施例４
4-[（2-クロロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-3-シアノ-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸の調製

4-[（2-クロロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-3-シアノ-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（59mg、0.123mmol、実施例１の記載に従って調製）をＴＨＦ（1mL）に溶解しＮａＯＨ（1Ｎ、1mL）を加えた。反応混合物を25℃で72時間撹拌しＮａＨＣＯ_３（30mL）とＥｔＯＡｃ（30 mL）との混合液上に注いだ。二層を分離して、水層をpH=2に酸性化しジクロロメタン（2x20mL）で抽出した。有機層を合一して水、食塩水で洗浄しＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過して減圧下に濃縮し、20mg（収率36%）の化合物4を得た。これはさらに精製することなく、続けて使用した。
^１Ｈ-ＮＭＲ（DMSO-d₆）δ：8.99（s,1H）, 8.18（s,1H）, 8.03（s,1H）, 7.97（s,1H）, 7.75（d,1H）, 7.29（d,1H）, 2.78（s,3H）.
ＨＰＬＣ：4.04min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.

実施例５
4-[（2-クロロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-3-シアノ-5-メチル-N-（2-メチルプロポキシ）ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボキサミドの調製

化合物4（20mg、0.442mmol）をＴＨＦ：ジクロロメタン（１：１）の混合溶媒（1mL）に溶解し、イソプロピルヒドロキシルアミン・ＨＣｌ（7mg、0.053mmol）、Hunigの塩基（18μL、0.106mmol）およびＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（28mg、0.0531mmol）を加えた。反応混合物を１時間撹拌し、減圧下に濃縮して10%ＨＣｌ（15mL）とＥｔ_２Ｏ（15mL）で希釈した。二層を分離して有機層を1NＮａＯＨ、食塩水で洗浄しＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過して減圧下で濃縮した。水層に1NＮａＯＨを加えて塩基性とし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、最初の抽出の合一有機層に加えた。調製用ＨＰＬＣ（YMC S5 ODS 20x100mm、溶出0.1%TFA含有30-100%水性メタノールで15min、流速20mL/min）で精製して1.1mgの化合物5を得た。
ＨＰＬＣ：3.68min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm, 0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 524.02[M+H]^＋.

実施例６
3-シアノ-4-[[5-[（メトキシアミノ）カルボニル]-2-メチルフェニル]アミノ]-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸の調製

3-シアノ-4-[[5-[（メトキシアミノ）カルボニル]-2-メチルフェニル]アミノ]-5-メチルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（160mg、0.393mmol、実施例１の記載に従って調製）をＴＨＦ（2mL）に溶解し、1NＮａＯＨ（4mL）を加えた。反応混合物を25℃で２日間撹拌してから、1Mクエン酸で中和しジクロロメタン上に注いだ。有機層を分離し、水層を抽出して有機層を合一しＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し濾過して減圧下で濃縮した。残渣を調製用ＨＰＬＣ（YMC S5 ODS 20x100mm、溶出0.1%TFA含有30-100%水性メタノールで15min、流速20mL/min）で精製して36mg（収率39%）の化合物6を得た。
ＨＰＬＣ：3.33min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm, 0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 380.24[M+H]^＋.

実施例７
3-シアノ-4-[[5-[（メトキシアミノ）カルボニル]-2-メチルフェニル]アミノ]-5-メチル-N-[（1S）-1-フェニルエチル]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボキサミドの調製

化合物6（19mg、0.05mmol）をＤＭＦ（2mL）に溶解し、ＥＤＣ（14.4mg、0.075mmol）、ＨＯＢｔ（10.1mg、0.075mmol）およびＤＩＰＥＡ（12.9mg、0.10mmol）を加えて反応混合物を25℃で30分間撹拌した。（S）-メチルベンジルアミン（7.3mg、0.06mmol）を加えて反応混合物をさらに25℃で16時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈して水中に注いだ。分液して有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し濾過して減圧下で濃縮した。残渣を調製用ＨＰＬＣ（YMC S5 ODS 20x100mm、溶出0.1%TFA含有30-100%水性メタノールで15min、流速20mL/min）で精製して21mg（収率87%）の化合物7を黄色の半固体として得た。
ＨＰＬＣ： 3.79min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 483.36[M+H]^＋.

実施例８
6-ホルミル-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリルの調製

化合物3B（266mg、0.72mmol）をジクロロエタン（30mL）に溶解し、ＭｎＯ_２（200mg、2.0mmol）を加えた。反応混合物を60℃で３時間加熱し、25℃に冷却してからジクロロメタンで希釈しセライトで濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製して238mg（収率90%）の化合物8を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ： 3.37min（保持時間）で100%（ YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）: m/z 369.08[M+H]^＋.

実施例９
3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸の調製

化合物3A（1.50 g, 3.64 mmol）をＴＨＦ（50mL）に溶解し、ＮａＯＨ（1 M, 20.0mL）とＥｔＯＨ（25 mL）を加えた。反応混合物を80℃に加熱しＴＨＦを留去し、１時間後には反応混合物は均一になった。更に加熱を６時間継続し、その後室温にまで冷却してＨＣｌ（1 M, 20.0 mL）で中和した。生じた固体を濾取し水洗して乾燥し化合物9（1.33 g、収率95%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ： 1.84min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）: m/z 489.0[M+H]^＋.

実施例10
アミド・ライブラリーの調製：3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]-N-フェニルピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボキサミドの調製

化合物9（11.5mg、0.030mmol）とＨＯＡｔ（6.1mg、0.045mmol）をＴＨＦ（0.60mL）に溶解し、アニリン（14mg、0.15mmol）をＴＨＦ（0.15mL）に溶解して加え、続いてＥＤＣ（11.5mg、0.06mmol）をクロロホルム（0.30mL）に溶解して加えた。反応混合物を終夜60℃に加熱し、その後室温にまで冷却してＭｅＯＨ（0.4mL）を加え希釈した。得られた混合物を、SCX/SAXカートリッジ（500mg/500mg） SCX SAX シリカ結合イオン交換カートリッジ（United Chemical Technologies,Inc., Bristol, PA）を通してＭｅＯＨで溶出し、続いて溶媒を減圧下に留去して13.2 mg（96% yield）の化合物10を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ： 2.05min（保持時間）で100%（YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 460.0 [M+H]^＋.
上記工程を用いて、アニリン反応体をその他のアミンに置き換えることにより６８個のアミド化合物のライブラリーを作製した。化合物は上記方法の他、調製用ＨＰＬＣ（島津 VP-ODS 20.0x50.0mmカラム、溶出0.1%TFA含有25-90%MeOH/H₂0で7min、流速10mL/min、検出220nm）を用いて精製した。

実施例11
6-アミノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（11B）の調製

A.[3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-イル]カルバミン酸フェニルメチルエステル（11A）の調製

化合物9（192mg、0.50mmol）を無水ジオキサン（4mL）に溶解しＮ_２ガス雰囲気下で、トリエチルアミン（0.140mL、1.00mmol）とＤＰＰＡ（0.216mL、1.00mmol）を加えて混合物を終夜撹拌した。ベンジルアルコールを加えて、混合物を75℃で４時間加熱し、減圧下で濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物11Aを黄色オイル（172mg、収率70%）として得た。
ＨＰＬＣ：4.01min（保持時間）で100%（ YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 490.0 [M+H]^＋.

B.6-アミノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（11B）の調製
化合物11A（40mg、0.082mmol）をＭｅＯＨ（4mL）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（12mg）を加えて反応混合物を水素下（１気圧）で30分間撹拌した後、ＨＣｌ（4Mジオキサン溶液、0.1mL）を加えた。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して32mg（塩酸塩として定量的収率）の化合物11Bをオレンジ色固体として得た。
ＨＰＬＣ：2.90min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）: m/z 356.0[M+H]^＋.

実施例12
N-[3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノlピロロ[l,2-b]ピリダジン-6-イル]アセタミドの調製

化合物11B（塩酸塩、32mg、0.082mmol）をＴＨＦ（2mL）に溶解し、無水酢酸（11mg、0.11mmol）、次いでトリエチルアミン（33mg、0.33mmol）を加えて反応混合物を室温で30分間撹拌した。ＭｅＯＨで反応を停止させ、反応混合物を更に30分間撹拌し減圧下で濃縮しシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（40−50%ＥｔＯＡｃ／ジクロロメタン）で精製して、化合物12を黄色オイル（30mg、収率92%）として得た。
ＨＰＬＣ：3.46min（保持時間）で100%（YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 398.0 [M+H]^＋.

実施例13
3-（アミノメチル）-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸の調製

化合物9をＭｅＯＨとＴＨＦ（2:1、v/v）の混合溶媒（6ml）に溶解しＴＦＡ（30mg）次いでＰｄ／Ｃ（10mg）を加えた。反応混合物を水素下（１気圧）で終夜撹拌してから、セライトパッドで濾過した。濾液を減圧下で濃縮し残渣にＭｅＯＨを何度か加えて共沸により過剰のＴＦＡを除去した。その結果、化合物13を黄色固体（35mg、定量的）として得た。
ＨＰＬＣ：2.96min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 389.0[M+H]^＋.

実施例14
3-[（アセチルアミノ）メチル-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸の調製

化合物13（10mg、0.02mmol）をＴＨＦに溶解し、トリエチルアミン（1滴,約10mg）、続いて無水酢酸（1滴、約10mg）を加えた。反応溶液を室温で10分間撹拌し減圧下で濃縮した。残渣をＴＨＦに再溶解し、ＮａＯＨ（1M溶液、2滴）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌しＨＣｌ（1M溶液）で中和して、調製用ＨＰＬＣ（島津VP-ODS 20.0x50.0mm、0.1%TFA含有25-90%ＭｅＯＨ/Ｈ_２Ｏで7min溶出、流速10mL/min、検出220nm）で精製して、化合物14を黄色固体として得た（7mg、収率81%）。
ＨＰＬＣ：3.46min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）: m/z431.0[M+H]^＋.

実施例15
N-[3-シアノ-5-メチル-4-[（4-フェノキシフェニル）アミノ]ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-イル]-N'-メチルウレアの調製

化合物9（19mg、0.05mmol）、トリエチルアミン（0.014mL、0.10mmol）およびＤＰＰＡ（0.022mL、0.10mmol）を無水ジオキサン（1mL）に溶解し、Ｎ_２下で12時間撹拌した。その後反応溶液を80℃に１時間加熱し25℃にまで放冷した。メチルアミン（2.0MＴＨＦ溶液、0.30mL、0.60mmol）を加えて反応溶液を25℃で１時間撹拌し、減圧下で濃縮しシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（50-70%ＥｔＯＡｃ／ジクロロメタン）で精製して化合物15（15mg、収率73%）を黄色固体として得た。
ＨＰＬＣ：3.44min（保持時間）で100% （YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）:m/z 413.0[M+H]^＋.

実施例16
3-シアノ-5-ヒドロキシメチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）ピロロ[l,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（16C）の調製

A.5-ブロモメチル-4-クロロ-3-シアノ-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（16A）

化合物1D（79mg、0.30mmol）、ＮＢＳ（59mg、0.33mmol）および過酸化ベンゾイル（5mg、0.02mmol）をＣＣ（2mL）ｌ中に懸濁し、77℃で３時間撹拌した。室温にまで冷却後、反応混合物をショートシリカゲルカラム（ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、化合物16（102mg、収率99%）を黄色固体として得た。

B. 4-クロロ-3-シアノ-5-ヒドロキシメチル-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（16B）

化合物16A（102mg、0.30mmol）をＴＨＦに溶解し、水（3mL）を滴下した。反応溶液を３日間室温で置いてから50℃で３時間加熱した。室温にまで冷却してから反応溶液にＮａＨＣＯ_３を加えた。溶液を濃縮して乾固し、ＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて再溶解し、ろ過した。濾液を濃縮して化合物16Bを黄色固体（84mg、100%）として得た。これをさらに精製することなく次の工程に供した。
C.3-シアノ-5-ヒドロキシメチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（16C）
化合物16B（84mg、0.30mmol）、4-フェノキシアニリン（72mg、0.39mmol）およびトリエチルアミン（0.083mL、0.60mmol）をＴＨＦ（2.5mL）に溶解し、70℃で30分間加熱した。室温にまで冷却してから反応混合物を約0.5mLに濃縮し、ＭｅＯＨ（2mL）を加え希釈して濾過した。固体をＭｅＯＨで洗浄し乾燥して化合物16Cを黄色固体（118mg、収率92%）として得た。
ＨＰＬＣ；2.12min（保持時間）で92% （PrimeSphere 5uC18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）；m/z 429.0[M+H]^＋.

実施例17
3-シアノ-5-メトキシメチル-4-（4-フェノキシ-フェノキシアミノ）ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（17B）の調製

A. 4-クロロ-3-シアノ-5-メトキシメチル-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（17A）

化合物16A（31mg、0.09mmol）をＭｅＯＨ-ＣＨ_２Ｃｌ_２（1：1）の混合溶媒（2mL）に溶解し、ＮａＨＣＯ_３を加えた。反応液を３時間室温に保ってから70℃で１時間加熱した。室温にまで冷却し濃縮乾固しＣＨ_２Ｃｌ_２に再溶解して濾過をした。濾液を濃縮して化合物17Aを黄色固体（26mg、収率98%）として得た。
B.3-シアノ-5-メトキシメチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（17B）
化合物17Bは16Cの実施例と同様にして調製した。
ＨＰＬＣ：2.24min（保持時間）で96%（PrimeSphere 5u C18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 443.0[M+H]^＋.

実施例18
3-シアノ-5-ホルミル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル（18）の調製

化合物16C（21.4mg、0.05mmol）をクロロホルム（1mL）に溶解し、活性化ＭｎＯ_２（<5ミクロン、17mg、0.20mmol）を加えた。反応液を55℃で終夜加熱した。室温に冷却しシリカゲルカラムのフラッシュキュロマトグラフィー（0-2%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製し化合物18を黄色固体（20mg、収率94%）として得た。
ＨＰＬＣ：2.20min（保持時間）で94% （PrimeSphere 5uC18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 427.0[M+H]^＋.

実施例19
1-[3-シアノ-5-メチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-イル]-3-（2-モルホリン-4-イルエチル）-ウレア（19-1）および5-メチル-6-（5-オキソ-4,5-ジヒドロ-テトラゾール-1-イル）-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル（19-2）の調製

化合物9（115mg、0.30mmol）、トリエチルアミン（0.063mL、0.45mmol）およびＤＰＰＡ（0.097mL、0.45mmol）をジオキサン（5mL）に溶解し、終夜拡販した。翌日、ＴＭＳアジド（0.080mL、0.60mmol）を加えて反応温度を80℃とし、同温度で２時間加熱した。室温にまで冷却して4-（2-アミノエチル）モルホリン（0.079mL、0.60mmol）を加えた。反応液を室温で１時間撹拌してから、濃縮しシリカゲルカラムのフラッシュキュロマトグラフィー（3−6%ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製し化合物19-1および19-2の混合物を黄色オイルとして得た。このオイルをＭｅＯＨから再結晶し化合物19-1を黄色固体（116mg、収率76%）として得た。

化合物19-1
ＨＰＬＣ：97% at 3.11 min （retention time） （YMC S5 ODS カラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで4min溶出、流速4mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 512.0[M+H]^＋.
上記再結晶の母液をＳＣＸカートリッジ（500mg）に通してＭｅＯＨ（5mL）で溶出し、溶出液を濃縮して化合物19-2を黄色固体（9mg、収率7%）として得た。
化合物19-2
ＨＰＬＣ：94% at 1.93 min （retention time） （PrimeSphere 5u C18-HCカラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 424.0 [M+H] +.

実施例20−144
上記に記載した工程に準じて、本発明化合物をさらに調製した。表１から表２２に、代表的化合物の名前と構造、保持時間、および該化合物の調製にあたって基本とした工程の実施例番号を示した。これら表において保持時間の決定に用いたクロマトグラフィー関係の条件は次の通りである：
ＬＣＭＳ＝YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで4min.、流速4mL/min、検出220nm.
ＬＣＭＳ*＝YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで2min.、流速4mL/min、検出220nm.
ＬＣＭＳ-1＝PrimeSphere 5u C18-HCカラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで2min.、 流速5mL/min、検出220nm.
ＬＣ＝YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで4min.、流速4mL/min、検出220nm.
ＬＣ*＝YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで4min.、流速4mL/min、検出220nm.

表中、化合物の分子量はＭＳ（ES）により決定し、式m/zで表した。

実施例145
6-ヒドロキシ-l-メチル-エチル-5-メチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル

化合物3A（124mg、0.30mmol）をＴＨＦ（5mL）に溶解し、０℃に冷却してＭｅＭｇＢｒの3Mエーテル溶液（0.40mL、1.20mmol）をゆっくりと加えた。反応を室温にまで加温しその後50℃で１時間撹拌した。室温にまで戻して、ＥｔＯＡｃ（20mL）およびＮＨ_４Ｃｌ（20mL）飽和水溶液を加えて反応を停止させた。得られた二層を分液し、有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し濃縮してオレンジ色のオイルを得た。この未精製オイルをシリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（14-17%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製して化合物145を黄色固体（76mg、64%）として得た。
ＨＰＬＣ：1.97min（保持時間）で97% （Phenom-Prime S5 C18カラム、4.6x30mm、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 399[M+H]^＋.

実施例146
6-ヒドロキシ-5-メチル-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-3-カルボニトリル

50%（wt）Ｈ_２Ｏ_２水（0.0115mL、0.20mmol）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（2mL）の混合液を-5℃に冷却し、ＢＦ_３・ＯＥｔ_２を加えた。反応混合物を-5℃で40分間撹拌してから化合物145をＣＨ_２Ｃｌ_２（3mL）に溶解して加えた。反応を10分間-5℃に保ってから、ＮａＳＯ３の水溶液（2g, 10 mL）を加えて反応を停止させた。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、二層を分液した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（2x10mL）で抽出し、合一したＣＨ_２Ｃｌ_２層を減圧下に濃縮し褐色のオイルを得た。この粗生成物をシリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（10%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、化合物146を黄色固体（32mg、収率64%）として得た。
ＨＰＬＣ：1.89min（保持時間）で90%（Phenom-Prime S5 C18 カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）: m/z 357[M+H]^＋.

実施例147
5-メチル-6-（2-モルホリン-4-イルエトキシ）-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピラジン-3-カルボニトリル

化合物146（8.9mg、0.025mmol）、ＰＰｈ_３（13.1mg、0.05mmol）および4-（2-ヒドロキシエチル）-モルホリン（6.6mg、0.05mmol）を無水ＴＨＦ（0.3mL）に溶解し、Ｎ_２下０℃に冷却してＤＥＡＤ（8.7mg、0.05mmol）を加えた。反応液を０℃で５分間、次いで室温にまで加温して２時間撹拌してから、濃縮乾固してシリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（1-5%ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、化合物147を黄色オイル（10mg、収率85%）として得た。
ＨＰＬＣ：1.69min（保持時間）で96% （Phenom-Prime S5 C18 カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 470[M+H] ^＋.

実施例148
5-シアノ-7-オキソ-6-（4-フェノキシフェニル）-6,7-ジヒドロ-9H-8-オキサ-2a,3,6-トリアザ-ベンゾ[cd]アズレン-1-カルボン酸エチルエステル

化合物16C（26mg、0.061mmol）およびＤＩＰＥＡ（63mg、0.485mmol）をＣＨ_２Ｃｌ_２（6mL）に溶解し-50℃に冷却してトリホスゲン（30mg、0.101mmol）を加えた。反応液を徐々に10℃にまで１時間で加温し、ＭｅＯＨを加えて反応を停止させ減圧下で濃縮乾固し、シリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（1-2%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、化合物148を黄色固体（16mg、収率58%）として得た。
ＨＰＬＣ：2.09min（保持時間）で91% （Phenom-Prime S5 C18 カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 455[M+H]^＋.

実施例149
5-アジドメチル-3-シアノ-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル

化合物148（21mg、0.05mmol）をＴＨＦ（0.6mL）に溶解し、ＤＰＰＡ（22mg、0.08mmol）、続いてＤＢＵ（9mg、0.06mmol）を加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、濃縮してシリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（0.5−１%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、化合物149を黄色オイル（14mg、収率63%）として得た。
ＨＰＬＣ：2.16min（保持時間）で99% （PrimeSphere 5u C18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 454[M+H]^＋.

実施例150
5-アミノメチル-3-シアノ-4-（4-フェノキシ-フェニルアミノ）-ピロロ[1,2-b]ピリダジン-6-カルボン酸エチルエステル

化合物149（12mg、0.026mmol）をＴＨＦとＭｅＯＨ（1:2）の混合液（3mL）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（5mg）を加えた。反応液を水素風船により室温で30分間水素化を行って、濾過した。濾液を濃縮して8を黄色固体（9mg、収率80%）として得た。更なる精製は不要であった。
ＨＰＬＣ：1.71min（保持時間）で92% （PrimeSphere 5uC18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 428[M+H]^＋.

実施例151
5-シアノ-7-オキソ-6-（4-フェノキシ-フェニル）-6,7,8,9-テトラヒドロ-2a,3,6,8-テトラアザ-ベンゾ[cd]アズレン-l-カルボン酸エチルエステル

化合物150（7mg、0.016mmol）およびＤＩＰＥＡ（17mg、0.13mmol）をＣＨ_２Ｃｌ_２（1.5mL）に溶解し、-70℃に冷却してトリホスゲン（9.5mg、0.032mmol）を加えた。反応液を１時間で徐々に-5℃にまで加温し、ＭｅＯＨ（0.5mL）を加えて反応を停止させ、濃縮乾固してシリカゲル・フラッシュクロマトグラフィー（6−8%ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出）で精製し、9を黄色固体（6mg、収率81%）として得た。
ＨＰＬＣ：1.97min（保持時間）で98% （PrimeSphere 5uC18-HC カラム、4.6x30mm、0.1%TFA含有10-90%水性メタノールで2min溶出、流速5mL/min、検出220nm）.
ＭＳ（ES）：m/z 454[M+H]^＋.

実施例152−367
上記に記載した工程に準じて、本発明化合物をさらに調製した。表２３から表６４に、代表的化合物の名前と構造、保持時間、および該化合物の調製にあたって基本とした工程の実施例番号を示した。これら表において保持時間の決定に用いたクロマトグラフィー関係の条件は次の通りである：
ＬＣ＝YMC S5 ODSカラム、3.6x50mm、0.1%TFA含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで2min.、流速5mL/min、検出220nm.
ＬＣ*＝YMC S5 ODSカラム、4.6x50mm、0.2%リン酸含有10-90%ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏで4min.、流速4mL/min、検出220nm.
表中、化合物の分子量はＭＳ（ES）により決定し、式m/zで表した。

実施例368
ＶＥＧＦＲ-2およびＦＧＦＲ-1キナーゼ試験

ＶＥＧＦＲ-2またはＦＧＦＲ-1キナーゼ試験においては、合成基質ポリGlu:Tyr（4:1）、ＡＴＰ、ＡＴＰ-γ^３３ＰおよびＭｎ^＋＋および／またはＭｇ^＋＋を含む緩衝液、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミンおよびトリス緩衝液を含むインキュベーション混合物を用いた。酵素の添加により反応を開始し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を体積基準で30％加えることにより反応を停止させた。本発明の阻害剤はＤＭＳＯで10ｍＭ濃度とした。試験は96ウェルフォーマットで行った。化合物はＤＭＳＯで1：500次いで水で1：10に希釈し、ＤＭＳＯの最終濃度は10％とした。10％ＤＭＳＯの96ウェルフォーマットにおけるＢ−Ｈ列には10μＬのアリコットを加えた。Ａ列には、試験条件の5倍高い濃度で20μＬの阻害剤溶液アリコットを加えた。混合のための10ピペッティングフェイスにより10μＬのアリコットを各列に移し、Ｆ列からは10μＬのアリコットを捨てた。Ｇ列は化合物なしの対照、列Ｈは化合物なしおよび酵素なしの対照とした。酵素および基質はTomtec Quadra stationを用いて加えた。

プレートを粘着性のプレートトップで覆って、27℃で60分間インキュベートし、ＴＣＡを加えて20分氷冷し酸沈殿させた。TomtecまたはPackerd FilterMateハーベスターを用いて沈殿をUniFilter-96, GF/Cマイクロプレートに移した。Packard TopCount Microplate Scintillation Counterを用い続いてUniFilterマイクロプレートの乾燥ウェルにMicroscint-20カクテルを加えて取り込まれた放射線活性を定量し、活性を決定した。
試験した式Iの化合物はＩＣ_５０が80μM以下でＶＥＧＦＲ-2およびＦＧＦＲ-1キナーゼを阻害した。

実施例369
ＨＥＲ1、ＨＥＲ2またはＨＥＲ4キナーゼ試験
20mMトリスHCl緩衝液pH7.5、10mMＭｎＣｌ_２、0.5mMジチオトレイトール、ウシ血清アルブミン0.1mg/ml、ポリGlu/Tyr（4:1）0.1mg/ml、1μMＡＴＰおよび4μMCi/ml[γ−^３３Ｐ]ATPを含むキナーゼ緩衝液中で興味ある化合物を試験した。ポリGlu/Tyr（4:1）はホスホリル基の受容体として作用する合成ポリマーであり、Sigma Chemicalsより購入した。キナーゼ反応は酵素の添加により開始され、反応混合物を26℃で１時間インキュベートした。該反応はＥＤＴＡを50mMにまで添加することによって停止され、タンパクはトリクロロ酢酸を5％にまで添加することにより沈殿させることができる。沈殿したタンパクは濾過によりPackard Unifilterプレート上に回収され、TopCountシンチレーションカウンターにより取り込まれた放射能量が測定される。

リコンビナントＨＥＲ１，ＨＥＲ４の調製のため、受容体の細胞質シークエンスがＧＳＴ融合タンパクとして昆虫細胞中に発現され、アッフィニティークロマトグラフによって精製された。ＨＥＲ２の細胞質シークエンスはバキュロウィルスの発現ベクター・pBlueBac4（Invitrogen社）にサブクローニングされ昆虫細胞中に未標識タンパクとして発現された。そのリコンビナントタンパクはイオン交換クロマトグラフにより部分的に精製された。
本化合物はＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４キナーゼをＩＣ_５０0.001−25μMの範囲で阻害する。好ましい化合物は0.001−5.0μMのＩＣ_５０を有する。より好ましい化合物は0.001−1.0μMのＩＣ_５０を有する。最も好ましい化合物は0.001−0.1μMのＩＣ_５０を有する。
ＨＥＲＧ活性で化合物をスクリーニングするためにはＨＥＲＧカリウムチャネル試験を用いることができる〔Caballero R, et al.、「カンデサルタンおよびイプロサルタンが心再分極に含まれるヒトクローン化カリウムチャネルに及ぼす直接の影響」、Molecular Pharmacology, 59（4）,825-36,（2001）参照〕。従って、好ましい化合物はＨＥＲＧ試験活性が弱い。

リコンビナントＨＥＲ１の調製のため、受容体の細胞質シークエンスがＧＳＴ融合タンパクとして昆虫細胞中に発現され、アッフィニティークロマトグラフによって精製された。ＨＥＲ２の細胞質シークエンスはバキュロウィルスの発現ベクター・pBlueBac4（Invitrogen社）にサブクローニングされ昆虫細胞中に未標識タンパクとして発現された。そのリコンビナントタンパクはイオン交換クロマトグラフにより部分的に精製された。
式Ｉの試験化合物は、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２キナーゼを阻害し、ＩＣ_５０は１００μM以下であった。

実施例370
ＭＥＫ-ＥＲＫキナーゼカスケードアッセイ
上記実施例388のin vitroウェルプレート試験を修正して適用した。各ウェルには、30μL試験緩衝液〔トリス塩酸、pH7.5、ＭｇＣｌ_２、ＤＴＴ、ＢＳＡ、ミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）、ＡＴＰおよび[γ-^３３Ｐ]ＡＴＰ〕、10μL阻害剤希釈液若しくはＤＭＳＯ溶媒のみ、および10μL酵素混合物（5-10ngＭＥＫ-ＥＥおよび100-200ngＥＲＫ）を含ませた。試験における最終濃度は、20mMトリス塩酸、pH7.5、10mMＭｇＣｌ_２、0.3mMＤＴＴ、ＢＳＡ 50μg、ミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ） 50μg、10μMＡＴＰおよび [γ-^３３Ｐ]ＡＴＰ200nCiであった。プレートを室温で60分間インキュベートしてから、300mMＥＤＴＡおよび25μgを含む停止溶液を添加して反応を停止させた。試料はＡＴＰを含むＴＣＡ（最終濃度ＴＣＡ3.2%、ＡＴＰ2.3mM）で沈殿化させた。Packard Filter Mate 196ハーベスターを用いて試料をPackard GF/C 96-well Unifilterプレートへ移した。光下で乾燥させた後、ウェル中の残渣の放射能をPackard Top Countマイクロプレートカウンターで測定した

この試験はカスケードアッセイなのでＭＥＫおよびＥＲＫの両方の阻害剤が区別されない。ヒットしたものがＭＥＫ阻害（ＥＲＫ欠損キナーゼとＭＥＫを用いる）によるものかＥＲＫ阻害（活性化ＥＲＫとＭＢＰを用いる）によるものか決定するためには更なるin vitro試験が必要とされる。いずれにせよ、式Ｉの試験化合物は、ＭＥＫおよび／またはＥＲＫを阻害し、ＩＣ_５０は１０μM以下であった。

実施例371
p38キナーゼの発生
ヒトp38α、βおよびγアイソザイムのｃＤＮＡをＰＣＲによりクローン化した。これらｃＤＮＡをｐＧＥＸ発現ベクター（Pharmacia）にサブクローン化した。ＧＳＴ-p38融合タンパクをE.Coli中で発現させ、グルタチオンアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフにより菌ペレットから精製した。p38融合タンパクは構成上活性なＭＫＫ６とインキュベートすることにより活性化される。活性p38はアフィニティークロマトグラフによりＭＫＫ６から分離される。構成上活性なＭＫＫ６は、Raingeaud et al.、Mol.Cell.Biol., 1247-1255（1996）に従って入手できた。

実施例372
ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣによるＴＮＦ−αの産生
ヘパリン化したヒト全身血を健康な提供者より入手した。Ficoll-Hypaque密度勾配遠心法によりヒト全身血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、試験メディウム（10%ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩメディウム）中５×１０^６／mlの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液50μlを試験化合物50μL（0.2%ＤＭＳＯ含有試験メディウム中４×濃度）とともに９６ウェル組織培養プレート中ＲＴで５分間培養した。細胞懸濁液にＬＰＳ（200ng/mlストック）100μlを添加しプレートを６時間37℃で培養した。培養の後、培養液を集めて-20℃で保存した。メディウム中のＴＮＦ−α濃度を標準ＥＬＩＺＡキット（Pharmingen San Diego,CA）を用いて定量した。ＴＮＦ−α濃度と試験化合物のＩＣ_５０値（ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α産生を５０％阻害する化合物の濃度）を線形回帰分析により計算した。

実施例373
p38試験
Ｖ底９６ウェルプレートを用いて試験を行った。試験用緩衝液（50mMトリスpH 7.5、10mMＭｇＣｌ_２、50mMＮａＣｌおよび1mMＤＴＴ）に酵素、基質（ＭＢＰとＡＴＰ）および試験化合物をそれぞれ添加した各20μlからなる最終体積60μlで試験した。菌で発現させた活性化p38を基質との反応開始前に、試験化合物とともに10分間、前培養した。反応は25℃で45分間培養し、0.5MＥＤＴＡの5μlを各試料に添加することにより反応を停止させた。Skatron Micro 96 Cell ハーベスター（Skatron, Inc.）を用いて、反応混合物をあらかじめ湿らせたフィルターマット上に吸着しＰＢＳで洗浄した。フィルターマットを１分間電子レンジで乾燥し、MeltilLex A シンチレーションワックス（Wallac）で処理してMicrobetaシンチレーションカウンターModel 1450 （Wallac）でカウントした。阻害データはPrism（GraphPad Software）を用いて非線形最小二乗回帰法により分析した。試験における試薬の最終濃度は、ＡＴＰ、１μM；[γ-^３３Ｐ]ＡＴＰ、3nM；ＭＢＰ（Sigma、#M1891）、2μg／ウェル；p38、10nM；およびＤＭＳＯ、0.3%であった。

実施例374
ＬＰＳ刺激マウスによるＴＮＦ−αの産生
マウス（Balb/c雌性、6-8週齢、Harlan Labs；n=8/処理群）腹腔内にリポポリサッカライド（ＬＰＳ；E Coli株0111:B4、Sigma）を50μg/kgを滅菌生理食塩水に懸濁して投与した。90分後にＣＯ_２：Ｏ_２を吸入させてマウスを鎮静化させ血液サンプルを採取した。血清を分離して、市販のＥＬＩＳＡアッセイを用い製造者（R & D Systems, Minneapolis, MN）の指示に従ってＴＮＦ−α濃度を分析した。

試験化合物はＬＰＳ投与前のいろいろな時間に経口投与した。化合物は懸濁でまたは種々の溶媒若しくは可溶化試薬で溶液として投与した。
これまでに引用した出版物の開示は参考のために記載したものである。上記の本発明の好ましい態様や特別な例示は、決して本発明をそのような態様に限定する意図はない。以下のクレームの精神および範囲から逸脱することなく、本発明において種々の修飾をすることができる。

Claims (6)

1. 式Ｉ：
   

   

   〔式中、Ｒ_１はＨまたは非置換アルキル；
   Ｒ_２はＨ、非置換アルキル若しくは置換アルキル、Ｒ_１'Ｃ(Ｏ)−、Ｒ_１'Ｒ_１''ＮＣ(Ｏ)−およびＲ_１'ＯＣ(Ｏ)−よりなる群から選択され、ここでＲ_１'およびＲ_１''はそれぞれ独立して１）Ｈ、２）非置換アルキルまたは置換アルキル、３）シクロアルキル、４）アリールまたは置換アリール、および５）ヘテロシクロまたは置換ヘテロシクロよりなる群から選択され；
   Ｘは、原子価結合、Ｏ、およびＮＲ_２'よりなる群から選択され；Ｒ_２'は、Ｈであり；
   Ｒ_３は、非置換アルキルまたは置換アルキル；
   Ｒ_４は、非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロシクロおよび置換ヘテロシクロよりなる群から選択され；
   Ｙは、原子価結合、ＯおよびＮＲ_４'よりなる群から選択され；Ｒ_４'は、Ｈまたは非置換アルキルであり；
   Ｒ_５は、シアノまたは置換アルキルであり；
   Ｚは、原子価結合；そして、
   Ｒ_６は、Ｈである。〕
   の化合物、そのエナンチオマー、ジアステレオマー、薬学的に許容される塩または溶媒和物。
2. Ｒ_２がＨ、ヒドロキシ若しくはヘテロシクロで任意に置換されたアルキル、Ｒ_１'Ｃ(Ｏ)−、Ｒ_１'Ｒ_１''ＮＣ(Ｏ)−およびＲ_１'ＯＣ(Ｏ)−よりなる群から選択され、ここでＲ_１'およびＲ_１''がそれぞれ独立して、１）Ｈ、２）アルコキシ、カルボアルコキシ、アリール、アルキルアミノカルボニル、アミノカルボニル、シアノ、シクロアルキル、ハロ、ヘテロシクロおよびヒドロキシよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよいアルキル、３）シクロアルキル、４）アルコキシ、ジアルキルアミノ、ハロゲンおよびアリールオキシよりなる群から選択される置換基で任意に置換されたアリール、および５）カルボアルコキシ、非置換アルキル、アシル、アミノカルボニル、ヒドロキシ、アリールおよび非置換アラルキルより選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいヘテロシクロ、よりなる群から選択され、
   Ｒ_３が、アルコキシ、アミノおよびヒドロキシよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよいアルキル；
   Ｒ_４が、１）非置換アルキル、２）シクロアルキル、３）非置換アルキル、ハロゲン、アリールオキシ、アリール、非置換アラルキルおよびアリールカルボニルより選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいアリール、４）アミノ、非置換アルキルおよび非置換アラルキルより選択される置換基で置換されていてもよいヘテロシクロから選択される、請求項１に記載の化合物、そのエナンチオマー、ジアステレオマー、薬学的に許容される塩または溶媒和物。
3. Ｚが原子価結合、Ｒ_５がシアノである、請求項１〜２のいずれかに記載の化合物。
4. Ｒ_３がメチルである、請求項１〜２のいずれかに記載の化合物。
5. ＹがＮＨである、請求項１〜２のいずれかに記載の化合物。
6. Ｒ_４がフェノキシフェニルである、請求項１〜２のいずれかに記載の化合物。