JP4588541B2 - 水素製造方法および水素製造装置 - Google Patents

Description

本発明は、水素生産能力を有する微生物および有機性基質を用いた水素製造方法に関する。

水素は化石燃料と異なり、燃焼しても炭酸ガスや硫黄酸化物等環境問題より懸念される物質を発生しない究極のクリーンエネルギー源として注目され、単位質量当たりの熱量は石油の３倍以上であり、燃料電池に供給すれば電気エネルギーおよび熱エネルギーに高い効率で変換できる。

水素の生産は従来より化学的製法として、天然ガスやナフサの熱分解水蒸気改質法等の技術が提案されている。この方法は高温高圧の反応条件を必要とすること、そして製造される合成ガスにはＣＯ（一酸化炭素）が含まれるため燃料電池用燃料として使用する場合には燃料電池電極触媒劣化防止のため、技術的課題解決難度の高いＣＯ除去を行うことが必要となる。

一方、微生物による生物的水素生産方法は常温常圧の反応条件で行うことができ、そして発生するガスにはＣＯが含まれないためその除去も不要である。

このような観点から、微生物による生物的水素生産は燃料電池用燃料供給方法のより好ましい方法として、注目されている。

生物的水素生産方法には大別して光合成微生物を使用する方法と非光合成微生物（主に嫌気性微生物）を使用する方法に分けられる。

前者の方法は水素発生に光エネルギーを用いるため、その低い光エネルギー利用効率により広大な集光面積を要し、水素発生装置の価格問題や維持管理の難しさ等、解決しなければならない課題が多く実用的なレベルではない。

後者の非光合成微生物（主に嫌気性微生物）における水素発生に関する代謝経路は色々な経路が知られている（グルコースのピルビン酸への分解経路での水素を発生する経路、ピルビン酸からアセチルＣｏＡを経て酢酸が生成する過程での水素を発生する経路、そしてピルビン酸由来の蟻酸より直接水素を発生する経路等）。

これまで非光合成微生物を使用する従来の水素製造方法では、有機性廃棄物を基質として水素を発酵させる方法において、発酵させる前に予め有機性廃棄物の酸化還元電位を遅滞なく進行する範囲に調整する方法が示されている（特許文献１参照）。

また、本発明者らは、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を用いた水素の製造方法として、反応液のｐＨを５．０〜９．０に保持し、有機性基質の供給を行う水素製造方法を提供していた（特許文献２参照）。
特開平７−３１９９８ ＷＯ２００４／０７４４９５Ａ１

蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を用いた上記水素製造方法において、これまで水素製造時の蟻酸イオン等の有機性基質濃度に関する記載はなく、また反応液のｐＨを特定範囲に保持するだけでは、連続的な水素製造において水素生産量を増大させることは不充分であることが判ってきた。

本発明は上記の問題点を解決するため、連続的な水素製造時において微生物による水素生産量が格別優れている水素製造方法および水素製造装置を提供することを目的とする。

本発明者等は上記の水素製造方法を種々の観点より考察し、鋭意検討を行った結果、生物細胞内の蟻酸より水素が生成する代謝経路を主として利用する系において、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を含む反応液中の有機性基質濃度を２５０ｍＭ以下に制御することにより、微生物の水素生産能力を効率的に保持することができ、連続的な水素製造時において微生物による水素生産量を増大させることが可能であることを見出し、さらに研究をすすめ本発明を完成した。

すなわち、本発明は
（１）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を含む反応液に、有機性基質を供給することからなる水素製造方法において、反応液中の有機性基質濃度を２５０ｍＭ以下となるように制御することを特徴とする水素製造方法、
（２）前記有機性基質が蟻酸および／または蟻酸塩であることを特徴とする前記（１）に記載の水素製造方法、
（３）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を含む反応液に有機性基質を供給して水素を製造する水素製造装置において、反応液中の有機性基質濃度の制御を行うための有機性基質供給ポンプが、有機性基質充填原料タンクと反応容器との間に設置されていることを特徴とする微生物を用いる水素製造装置、および
（４）前記（３）に記載の水素製造装置が搭載されていることを特徴とする燃料電池システム、
に関する。

本発明によれば、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物の水素生産能力を効率的に保持することができ、連続的な水素製造時の微生物による水素生産量を増加させることが可能となる。
従来の技術において、一般的に固体高分子型燃料電池の燃料として水素を用いる場合には、一酸化炭素（ＣＯ）を除去するシステム（ＣＯ変成器、ＣＯ除去器等）を用いて、ＣＯは１０ｐｐｍ以下に維持する必要があったが、本発明の微生物を用いた水素生産方法では主に水素と二酸化炭素からなるガスを生成し、基本的に一酸化炭素を生成しない。そのため、本発明の方法では、ＣＯを除去する改質器の設置が不要となり低コストで実施でき、また燃料電池の寿命を延長することができる。

また、従来の都市ガスを用いた水素発生装置の改質方法では、６００℃以上の改質温度が必要となり、メタノールを用いた改質方法でも数百℃の改質温度が必要となるのに対して、本発明の反応容器の温度は常温で用いることが可能であるので、クリーンでかつ低コストで水素を製造できる。さらに、通常、従来の方法では、改質器の立ち上げ、終了時に時間がかかるものの、本発明の方法では有機性基質の供給と同時に水素生産可能であるので水素の生産までの取り扱いが容易で時間を短縮でき、このような水素製造システムは燃料電池システムの一部としても好ましく用いることができる。

図１に、本発明の水素製造方法に用いる反応液中の有機性基質濃度を制御することが可能な水素製造装置を含む燃料電池システム構成図を一例として示す。以下、本発明の水素製造方法を図１に基づき説明する。

図１の有機性基質の入った原料タンク２から有機性基質供給ポンプ３により、有機性基質を反応容器１へ供給する。反応容器１には蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物と培地成分を含む反応液が充填されている。有機性基質を反応容器１へ供給することにより、反応液中の微生物が水素を含むガスを生産する。本発明は、蟻酸より水素が生成する微生物の代謝経路を主として利用する生物的水素製造方法に関する発明であり、微生物が水素を生産する場合に、反応液中の有機性基質濃度を制御することにより、連続的な水素製造時において、微生物による水素生産量を増加させることが可能となる。

本発明において使用される有機性基質とは、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、かつ水素生産能力を有する微生物が、水素を発生（生産）するために利用し得る有機性化合物をいう。有機性基質としては、特に限定されないが、例えば、蟻酸、または蟻酸塩、あるいは微生物内代謝経路において蟻酸に変換される糖類（例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース等）等の化合物が挙げられる。本発明で用いる有機性基質としては、蟻酸または蟻酸塩であることが好ましい。さらに蟻酸または蟻酸塩の中でも、水に対する溶解度の高い化合物、例えば蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、蟻酸カルシウム、または蟻酸アンモニウムが好ましく、さらに、コストの面から蟻酸、蟻酸ナトリウムまたは蟻酸アンモニウムを用いることが好ましい。前記有機性基質は、１種または２種以上を混合して使用することができる。
蟻酸塩を用いた場合には、反応液中に蓄積する陽イオンを取り除くために、例えばイオン交換樹脂等を用いることも可能である。

反応液中の有機性基質濃度、例えば蟻酸または蟻酸塩濃度の検出方法としては、例えば、酵素を利用した電極を用いた有機性基質センサー（例えば、蟻酸センサーまたはグルコースセンサー等）を用いる方法、超音波と導電率により測定する超音波液体濃度計を用いる方法、反応液から抽出した上清から高速液体クロマトグラフィーを用いて分析する方法、反応液から抽出した上清を、酵素試薬を用いて分析する方法等が挙げられる。また、キャピラリー電気泳動法により蟻酸等の有機性基質濃度を検出することも可能である。中でも有機性基質センサー（好ましくは、蟻酸センサーまたはグルコースセンサー等）による方法が、反応液中の有機性基質（蟻酸または蟻酸塩等）濃度を連続的に検出することが容易であるために好ましい。

反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度は、２５０ｍＭ以下に保持することが好ましい。該濃度以下に保持することにより、連続的な水素製造時において微生物による水素生産量を増大させ、微生物の水素生産能力を保持し得る。さらに、有機性基質が微生物に及ぼす水素生産能の低下等の影響を少なくするために、該有機性基質濃度は、１００ｍＭ以下に保持することが好ましく、５０ｍＭ以下に保持することがさらに好ましい。反応液中の有機性基質濃度が２５０ｍＭより高濃度の場合には、微生物の連続的な水素生産能力を低下させるため、好ましくない。連続的な水素製造時において微生物による水素生産量を考慮した場合、蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度が低すぎると、単位時間あたりの水素生産量が減少するために、反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度は２ｍＭ以上であることが好ましい。したがって、反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度を２〜２５０ｍＭの範囲に制御することが好ましい。

連続的、あるいは半連続的な水素製造を行うためには、反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度を検出しながら、図１の有機性基質充填原料タンク２から有機性基質供給ポンプ３により、反応容器１への有機性基質の供給量を制御することが必要である。このため、反応液中の有機性基質濃度の制御を行うための有機性基質供給ポンプは、有機性基質充填原料タンクと反応容器との間に設置されることが好ましい。該間に設置することにより、有機性基質の供給量の制御が容易となる。前記制御は、蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度制御装置１８等により行われることが好ましい。蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度制御装置１８には、発生ガスフローメータ４および図１では簡略化している各種センサー類１７が接続され、反応液内の各種データを検出することが可能である。各種センサー類には、例えば有機性基質センサー（蟻酸センサー等）の他、ｐＨ、酸化還元電位（ＯＲＰ）、微生物濃度、温度、反応容器内の液量等を検出することが可能なセンサーを用いることが好ましい。これらのセンサー類によって検出されるデータにより、反応液への有機性基質、培地成分または微生物等の供給量を制御することが可能となる。蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度制御装置１８は有機性基質供給ポンプ３、培地成分供給ポンプ１２、反応溶液排出バルブ１４および微生物供給ポンプ１５等に接続され、検出されたデータからフィードバックすることによって、反応液を連続的な水素生産に適した状態に保持することが可能となる。

反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度を制御するためのフローチャートの一例を図２に示す。反応液中の蟻酸または蟻酸塩等の有機性基質濃度を２５０ｍＭ、あるいは設定濃度以下に制御するためには、たとえば有機性基質を供給または停止する方法が挙げられる。その他、微生物による水素発生（生産）の条件を保持するために、反応容器内の液量の制御、反応液中のＰＨ、温度、酸化還元電位（ＯＲＰ）、微生物濃度を制御することも好ましい（フローチャート未記載）。

常に反応液内のこれらの条件が把握できるようにするため、センサー類１７を反応容器に取り付けることが好ましい。これにより、それぞれのパラメータを一定の範囲内で制御することが可能となる。

反応容器１内の反応液中のｐＨは約５．０〜９．０の範囲で制御されることが好ましい。特に約５．０〜９．０の範囲内で、ある一定のｐＨ近辺で制御することが好ましい。この場合、ある一定のｐＨの近辺とは、ｐＨ設定値の±約０．５の範囲内、より好ましくは、±約０．２の範囲内をいい、この範囲内のｐＨで反応を行うことが水素発生量を安定させることができるために好ましい。

上記の有機性基質の供給から、微生物が水素ガスを含むガスを発生（生産）する段階は、恒温槽７内にて一定温度の雰囲気で行うことが好ましい。水素の発生反応の反応温度は、用いる微生物種にもよるが、一般的に、常温微生物を用いた場合、約２０℃〜４５℃の条件が好ましく、さらに好ましくは約３０℃〜４０℃の範囲が微生物のライフの面から好ましい。

反応液としては、還元状態下の培養液を用いることが好ましい。嫌気的条件に準じて、酸化還元電位は約−１００ｍＶ（ミリボルト）〜−６００ｍＶであることが好ましく、さらに約−２００ｍＶ〜−６００ｍＶであることがより好ましい。

微生物濃度については、約１０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）の微生物濃度の水素発生用反応液を用いることが好ましい。反応液の粘性が高くなるという観点から、微生物濃度は約１０％（ｗ／ｗ）〜７０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）が好ましい。さらには、微生物濃度は約２０％（ｗ／ｗ）〜７０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）がより好ましい。この微生物濃度範囲で水素を生産することで、実用化に必要な水素生産量を得ることが可能となる。

さらに、反応容器１内では、微生物と有機性基質との反応性を向上させるために、攪拌装置８を用いて、攪拌することが好ましい。攪拌動力として、通常モーター９等が用いられる。有機性基質は有機性基質補給口１０から、補給することが可能である。

培地成分の入ったタンク１１、培地成分供給ポンプ１２、培地成分補給口１３、反応液排出口（サンプリング口）１４を設置することができる。微生物は、微生物の入ったタンク１６から微生物供給ポンプ１５により供給することが可能である。また、培地成分の入ったタンク１１の培地成分は培地成分補給口１３から、補給することができる。

本発明で使用される微生物は、蟻酸脱水素酵素遺伝子（Ｆ．Ｚｉｎｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８３， ｐｐ４６５０−４６５４， Ｊｕｌｙ １９８６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）およびヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｒ．Ｂｏｅｈｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９０） ４（２）， ２３１−２４３）を有する微生物であり、主として嫌気性微生物である。本発明に係る微生物細胞内の蟻酸より水素を生成する代謝経路は、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステム（以下、ＦＨＬシステムとする。）であり、多くの微生物が有している。

本発明で使用される具体的な嫌気性微生物の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物―例えばエシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ１１７７５、ＡＴＣＣ４１５７等）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属微生物―例えばクレブシェラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ１３８８３、ＡＴＣＣ８０４４等）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物―例えばエンテロバクター アエロギネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１３０４８、ＡＴＣＣ２９００７等）そしてクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物―例えばクロストリジウム ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＡＴＣＣ２５７５２、ＡＴＣＣ１７７９５等）等が挙げられる。

さらには、本発明の微生物を用いた水素製造方法において、水素生産能力が向上した組み換え微生物を用いることが好ましい。このような水素生産能力を向上させる方法としては、ＦＨＬシステムの生成を強化する遺伝子を高発現させる方法、あるいは、ＦＨＬシステムの生成に関する抑制遺伝子を不活性化させる方法等が挙げられる。ここで、高発現とは、目的遺伝子（例えば、ｆｈｌＡ遺伝子等）の発現量が増加されていることを意味し、目的遺伝子をニケ以上有することや、目的遺伝子が一つであってもプロモーターの改変等により発現量が増加されていることなども含む。

このような組み換え微生物の例としては、ＦＨＬシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現された微生物、および、ＦＨＬシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現、かつＦＨＬシステムの生成に関する抑制遺伝子が不活性化されていることを特徴とする微生物等が挙げられ、例えばエシェリキア・コリ（ＡＴＣＣ２７３２５）の形質転換体であり、Ｗ３１１０／ ｆｈｌＡ−ｐＭＷ１１８と命名された、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている微生物（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２９２）、または、Ｗ３１１０ △ｈｙｃＡ ／ ｆｈｌＡ−ｐＭＷ１１８と命名された、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている微生物（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２９１）等が、本発明の水素製造方法に好適に使用され得る。

本発明で使用される反応容器１内の反応液に用いる成分は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地をもちいることが出来る。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、廃糖蜜等を、窒素源としては、無機態窒素源（例えばアンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩等）または有機態窒素源（例えば尿素、アミノ酸類、タンパク質等）を用いることができ、それぞれ単独もしくは混合して用いることができる。またミネラル源として、おもにＮａ、Ｋ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓ等を含むもの、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、トリプトン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等各種ビタミン等の栄養素を反応液に添加することもできる。

反応液中には、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子発現によって誘起される酵素のユニット機能の発現、維持のためには微量な金属成分を含むことが好ましい。必要な微量金属成分は微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン、ニッケル等が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキス等の天然栄養源を用いる場合には相当程度含まれている。そのため、必ずしも添加を必要とはしない。

反応液中には、消泡剤を加えることが好ましい。消泡剤については、公知なものが用いられる。具体的にはシリコーン系、ポリエーテル系の消泡剤が用いられる。

本発明に用いる微生物は、好気的条件で培養して微生物を増殖させる第１工程と、増殖した微生物を嫌気的条件下の培養液中で培養して、微生物に水素発生能力を付与する第２工程により水素発生（生成）能力を付与しておくことが好ましい。

上記第１工程における好気的条件下での微生物の培養は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクト−ス、スクロース、セルロース、廃糖蜜またはグリセロール等が挙げられる。窒素源としては、上記反応液で使用する窒素源を同様に用いることができる。またミネラル源としては、主にＮａ、Ｋ、Ｐ、ＭｇまたはＳ等を含むもの、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウムまたは塩化ナトリウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、アンピシリンナトリウムまたはカナマイシン等の抗生物質や、トリプトン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸またはビオチンもしくはチアミン等各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。

好気的条件下での培養の条件として、温度域は、約２０℃〜４５℃、好ましくは約２５℃〜４０℃で培養を行うことが好ましい。ｐＨ域は、ｐＨ約４．０〜１０．０、好ましくは約５．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。通常、培養開始時の炭素源濃度は約０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、さらに好ましくは約１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は、約０．２５日〜７日間である。なお、該培養は、通常、通気攪拌、振盪等の条件下で行う。これら微生物の好気的条件における培養は公知であるので、それらに従って行ってよい。また、第１工程の培養終了時の微生物培養液中の濃度（ｗ／ｗ％）は、培養開始時に比較して約２〜１０００倍程度とするのがよい。

第２工程は、第１工程で得られた微生物を、嫌気的条件下で培養することにより行われる。第１工程で培養された微生物は、好ましくは培養液から一旦分離して回収し第２工程に使用される。すなわち、好気的条件下で増殖させた微生物を、水素発生の阻害になる成分（例えば、エタノール、酢酸、乳酸等）を含む第１工程の培養液から分離して第２工程を行うことが好ましい。

分離の方法としては、遠心分離、膜分離等による公知の方法が用いられる。好気的培養された微生物を分離回収しないで使用した場合、好気的条件での培養時に生成した細胞内外に存在する代謝産物が、水素生産能力を有する微生物を培養するのに悪影響を及ぼすために好ましくない。

嫌気的条件下での培養液中での微生物濃度は、水素生産能力を発現する微生物を得るために、約０．１〜８０質量％（湿潤状態菌体質量基準）が好ましい。さらに好ましくは、水素生産能力を有する微生物を効率的に得るために約１〜８０質量％（湿潤状態菌体質量基準）であることが好ましい。

嫌気的条件下とは、培養液中の酸化還元電位が約−１００ｍＶ〜−５００ｍＶ、さらに好ましくは約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶであることから確認できる。培地の嫌気状態を調整する方法としては、加熱処理や減圧処理あるいは窒素ガス等のバブリングにより溶存ガスを除去する方法が挙げられる。培養液中の溶存ガス、特に溶存酸素の除去を行う方法としては、約１３．３３×１０^２Ｐａ以下、好ましくは約６．６７×１０^２Ｐａ以下、より好ましくは約４．００×１０^２Ｐａ以下の減圧下で約１〜６０分間、好ましくは約５〜６０分間程度、脱気処理する方法が挙げられる。また、必要に応じて還元剤を水溶液に添加することができる。用いる還元剤としては、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンまたは硫化ソーダ等が挙げられる。これらの１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることも可能である。

嫌気的条件下での微生物の培養は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。炭素源または窒素源としては、好気的条件下での微生物の培養液と同じものを使用できる。またミネラル源としては、おもにＮａ、Ｋ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓ等を含む、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、塩化カルシウム、四ホウ酸ナトリウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、アンピシリンナトリウムまたはカナマイシン等の抗生物質や、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸または、ビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。

また蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子発現によって誘起される酵素のユニット機能の発現のためには微量な金属成分を含むことが好ましい条件である。必要な微量金属成分としては微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン、ニッケル等が挙げられる。これらの金属を含む化合物としては、例えばモリブデン酸ソーダ無水物、亜セレン酸ソーダ五水和物、七モリブデン酸（６−）アンモニウム、硫酸ニッケルアンモニウム、亜セレン酸ナトリウム等が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキス等の天然栄養源には相当程度含まれている。そのため、必ずしも添加を必要とはしない。

嫌気的条件下での培養の条件として、温度域は、約２０℃〜４５℃、好ましくは約２５℃〜４０℃であることが好ましい。ｐＨ域は、ｐＨ約４．０〜１０．０、好ましくは約５．０〜８．０であることが好ましい。通常、培養開始時の炭素源濃度は約０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、さらに好ましくは約１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。

嫌気的条件下で微生物を培養するための装置は、培養する容器に水素センサーが載置されていることが好ましい。さらに、容器からのガスの排出工程には発生ガスの検出機器、例えばフローメータが載置されていることが好ましい。これにより、ガスの発生速度が確認できる。このガス発生速度の増加の割合が小さくなった場合に、第２工程における嫌気条件下での水素生産能力を有する微生物の培養反応は終点に到達したと確認することが可能となる。

微生物が生産したガスはガス分離装置５にて水素リッチなガスに分離され、燃料電池６の燃料極に供給される。ガス分離装置５は反応容器１で発生した主に水素および二酸化炭素を主成分とするガスから、水素リッチなガスを分離する。分離する方法としては、膜分離法、吸着法等、一般的な方法が用いられる。

燃料電池６では、燃料極に供給された水素ガスと、空気極に供給された空気中の酸素とから、発電することが可能となる。

以下、実施例により具体的に本発明を説明するが、本発明はこれによりなんら制限されるものではない。

〔実施例１〕
組み換え大腸菌 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２９１、Ｗ３１１０△ｈｙｃＡ/ｆｈｌＡ−ＰＭＷ１１８による水素生産。

上記に示した組み換え大腸菌を表１で示される組成の培養液にアンピシリンナトリウムを５０ｍｇ／Ｌとなるように添加し、好気的条件下、３７℃で一晩振盪培養（前培）を行った。

次に、一晩振盪培養（前培）を行った上記培養液より大腸菌を一部採取し、下表２で示される組成の培養液に加え、嫌気性条件下３７℃で１２時間の振盪培養（本培）を行った。なお、嫌気性条件下での培養時に、培養液のｐＨは６．０を保つように、適時５Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加を行った。

ついで、本培養液を遠心分離機にかけ（５０００回転、１５分）、上澄み液を除去し、水素生産能力を有する微生物を得た。本微生物を遠心分離により分離後、下表３の組成で示される還元状態にある反応液３００ｍｌ（ミリリットル）に懸濁した（微生物濃度約４０質量％ 湿潤状態菌体質量基準）。

今回の実施例に用いた装置の概略図を図１に示す。
上記で作成した微生物懸濁反応液を反応容器１へ注液し、培地成分の入ったタンク１１には表３で示される反応液を注液した。
また有機性基質を入れる原料タンク２には、２６Ｍ（モーラー モル/リットル）の蟻酸を注液した。

反応液中の蟻酸イオン濃度の測定は、吸光度測定法に従い、反応液排出口（サンプリング口）１４から採取し、遠心分離した反応液の上清を蟻酸測定キットを用いて行った。測定キットとして、Ｆ−キット蟻酸（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いた。

水素生産は、蟻酸を供給することにより開始した。水素生産量は、発生ガスフローメータ４（コフロック製 ＭＯＤＥＬ３８１０）により、ガス流量を検出し、水素発生量に換算し、水素発生速度を得た。なお、発生したガス組成は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所製 ＧＣ１４Ｂ）により、５０容積％の水素と残余のガスを含んでいることが確認出来た。
蟻酸の供給を開始後、反応液中の蟻酸濃度の測定を１０分間隔で行った。
その測定結果により、反応液中の蟻酸濃度を得た。

また、蟻酸の供給量（ｍｏｌ／ｍｉｎ）と発生ガスフローメータ４の値から得られる水素ガスの発生量（ｍｏｌ／ｍｉｎ）のそれぞれの値、およびそれらの差分からも、補助的に反応液中の蟻酸濃度の変動を観測した。
液中の蟻酸濃度から、有機性基質供給ポンプ３で蟻酸濃度の供給量を制御しながら、反応液中の蟻酸濃度が２５０ｍＭになるように制御を行い、６時間での積算水素生産量の測定を行った。

〔実施例２〜７〕
反応液中の蟻酸濃度を、２００ｍＭ（実施例２）、１００ｍＭ（実施例３）、５０ｍＭ（実施例４）、１０ｍＭ（実施例５）、５ｍＭ（実施例６）、２ｍＭ（実施例７）、３００ｍＭ（比較例１）、１ｍＭ（比較例２）で制御する以外は、実施例１と同様の方法で、培養、水素生産の評価を行った。

図３は、実施例１〜７、比較例１、２の結果から、反応液中の一定濃度以下に制御を行った蟻酸濃度と水素生産量の関係を示している。

この結果より、反応液中の蟻酸濃度を２５０ｍＭ以下に制御することで、水素生産量が大きく増加することが判明した。

本発明によれば、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物の水素生産能力を効率的に保持することができ、連続的な水素生産時の微生物による水素生産量を増加させることが可能となる。

図１は、本発明の水素製造装置を用いた燃料電池システムの概略構成図である。 図２は、本発明の有機性基質濃度制御装置のフローチャートである。 図３は、本発明の水素製造装置を用いた反応液中の蟻酸濃度と水素生産量（６ｈｒの積算量）の関係を示した図である。

符号の説明

１：反応容器
２：有機性基質充填原料タンク
３：有機性基質供給ポンプ
４：発生ガスフローメータ
５：ガス分離装置
６：燃料電池
７：恒温槽
８：攪拌装置
９：モーター
10：有機性基質補給口
11：培地成分の入ったタンク
12：培地成分供給ポンプ
13：培地成分補給口
14：反応液排出口（サンプリング口）
15：微生物供給ポンプ
16：微生物の入ったタンク
17：各種センサー類
18：有機性基質濃度制御装置

Claims (6)

1. 蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を、蟻酸及び蟻酸塩を含まない培養液中で、好気的条件で培養して増殖させる第１工程と、増殖した微生物を嫌気的条件の蟻酸及び蟻酸塩を含まない培養液中で培養して、微生物に水素生成能力を付与する第２工程と、水素生成能力を付与された微生物を含む反応液に有機性基質を供給し、反応液中の有機性基質濃度を２５０ｍＭ以下となるように制御して水素を製造する第３工程とを備えることを特徴とする水素製造方法。
2. 有機性基質が蟻酸および／または蟻酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の水素製造方法。
3. 第３工程で使用する反応液が、還元状態下の培養液である請求項１又は２に記載の水素製造方法。
4. 蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物がエシェリキアコリである請求項１〜３のいずれかに記載の水素製造方法。
5. 第１工程で使用される蟻酸及び蟻酸塩を含まない培養液が、
   (a) グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、スクロース、セルロース、廃糖蜜、及びグリセロールからなる群より選ばれる炭素源、アンモニア、アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、及びタンパク質からなる群より選ばれる窒素源、並びにリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、及び塩化ナトリウムからなる群より選ばれるミネラル源からなる培養液であるか、又は
   (b) 上記(a)の成分に加えて、抗生物質、トリプトン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、及びビタミンからなる群より選ばれる成分からなる培養液である
   請求項１〜４のいずれかに記載の水素製造方法。
6. 第２工程で使用される蟻酸及び蟻酸塩を含まない培養液が、
   (a) グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、スクロース、セルロース、廃糖蜜、及びグリセロールからなる群より選ばれる炭素源、アンモニア、アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、及びタンパク質からなる群より選ばれる窒素源、並びにリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、塩化カルシウム、四ホウ酸ナトリウム、リン酸水素二アンモニウム、七モリブデン酸（６−）アンモニウム、硫酸ニッケルアンモニウム、及び亜セレン酸ナトリウムからなる群より選ばれるミネラル源からなる培養液であるか、又は
   (b) 上記(a)の成分に加えて、抗生物質、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、及びビタミンからなる群より選ばれる成分からなる培養液である
   請求項１〜５のいずれかに記載の水素製造方法。

Images