TW202237852A - 用於控制乙醇生產的方法及組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於控制通過氣體基質之微生物發酵之乙醇生產的方法。更具體地，提供一種透過添加維生素及低細胞停留時間來控制乙醇生產率的方法。根據該方法，維生素B1、B5及B7的添加量可增加比乙醇生產率。細胞停留時間維持在低位準。

Description

用於控制乙醇生產的方法及組成物
本申請案主張提申日期2020年12月8日之美國臨時申請案號63/122,580之權益，其整體通過引用併入本案。
提供一種透過添加維生素來控制乙醇生產率的方法。更具體地，維生素B1、B5及B7的添加量可增加比乙醇生產率，及約15小時或更少的細胞停留時間提供約10克/天/克細胞或更高的比乙醇生產率。
發明背景
生物燃料是石油的重要替代品。生物燃料包括乙醇，其已成為世界各地主要的燃料。微生物可透過發酵氣體基質從一氧化碳(CO)產生乙醇及其它化合物。CO通常是作為合成氣形式之氣體基質的一部分提供至發酵反應中。將碳質材料氣化產生包括一氧化碳及氫之發生氣、合成氣(synthesis gas或syngas)是本技術領域公知的。通常，此一氣化過程涉及碳質材料的部分氧化或缺氧性氧化，其中於該氣化過程提供低於化學計量的氧，以促進一氧化碳的產生。
發酵在成份確定的液體培養基中進行。此等培養基通常包括各種在改良發酵性能方面很重要的常量及微量營養素。與較不常見的基質如氣體基質結合使用的培養基，需要成份明確確定的培養基，以便優化性能。厭氧發酵也需要成份明確確定的培養基。
美國專利案第7,285,402號描述已知可用於氣體基質的厭氧發酵以生產乙醇的培養基。該培養基中各種組份及組份進料速率能有效提供高位準的乙醇生產率。更具體地，USPN 7,285,402描述包括硫胺素(維生素B1)、泛酸鹽(維生素B5)及生物素(維生素B7)之培養基。然而，USPN 7,285,402沒有認知或描述到維生素的組合及維生素進料速率如何作為調節培養性能及提供較高的體積生產率之控制手段。
美國專利案第9,701,987號描述在含CO基質的發酵期間增加B維生素濃度，以增加2,3-丁二醇的生產。更具體地，USPN 9,701,987描述將B維生素濃度提高至遠高於細胞所需的濃度，以增加2,3-丁二醇的生產。然而，乙醇之生產不受影響。據此，仍非常需要具有優化的B維生素組合及細胞停留時間之方法及培養基組成物，其可從經濟上增加比乙醇生產率，從而改善產業競爭力。
發明概要
本發明提供一種用於控制通過氣體基質之微生物發酵之乙醇生產的方法。更具體地，該方法提供增加氣體CO發酵性產乙酸菌之比乙醇生產率。增加添加至產乙酸菌發酵反應中之維生素B5的速率及維持細胞停留時間少於約15小時，可增加比乙醇生產率。
在一個態樣中，一種發酵方法包含於包括一發酵液之一發酵槽中提供一含CO氣體基質；於該發酵液中提供維生素B1、B5及B7，其中維生素B5之進料速率為約25至約150微克/克產生的細胞或更低；及以一或多種產乙酸菌及約15小時或更少的細胞停留時間發酵該含CO氣體基質，以提供約10克/天/克細胞或更高之比乙醇生產率。在另一個態樣中，以維生素B7進料速率至少2倍的進料速率提供一數量的維生素B5，及以維生素B1進料速率至少2倍的進料速率提供該數量的維生素B5。
詳細說明
下列說明不應視為限制的意思，而僅是用於說明示範實施例之一般原理。本揭示之範疇應參考發明申請專利範圍而定。 定義
除非另有說明，否則此針對本揭示之說明書全篇中所使用的下列術語之定義如下，且可包括以下所定義的定義之單數或複數形式：
修飾任一數量之術語“約”意指在現實情況下，如在實驗室、試驗工廠或生產設施中遇到的數量之變異。例如，混合物中所使用的成份之數量或測量值，當經過“約”修飾後，包括在生產工廠或實驗室之實驗條件下測量時的變異及一般使用的謹慎程度。例如，產物中組份的數量當以“約”修飾時，包括工廠或實驗室之多個實驗中批次間的變異及分析方法中固有的變異。不管是否經過“約”的修飾，數量包括該等數量的相當值。本文中所述並由“約”修飾的任何量，也可在本揭示中用作為未被“約”修飾的數量。
術語"發酵槽"包括由一或多個容器及/或塔或管道佈置所構成之發酵裝置/生物反應器，其包括批式反應器、半批式反應器、連續式反應器、連續攪拌槽反應器(CSTR)、氣泡塔反應器、外部循環迴路反應器、內部循環迴路反應器、固定化細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、移動床生物膜反應器(MBBR)、氣升反應器、膜反應器，如中空纖維膜生物反應器(HFMBR)、靜態混合器、氣升發酵槽或適合氣-液接觸之其它容器或其它裝置。
術語“發酵”、“發酵過程”或“發酵反應”等等旨在包含過程之生長期及產物生合成期。在一個態樣中，發酵意指CO轉化成為乙醇。
本文中使用的生產率表示為比乙醇生產率，以乙醇之克數/天/細胞之克數(克/天/克細胞)為單位。 比乙醇生產率之控制
本方法使用維生素來控制及提高經由產乙酸菌發酵含CO基質之比乙醇生產率。此外，該方法包括將細胞停留時間(CRT或XRT)維持在約15小時或更少。在此態樣中，該方法提供約10克/天/克細胞或更高的比乙醇生產率，在另一個態樣中，約12克/天/克細胞或更高的比乙醇生產率，在另一個態樣中，約14克/天/克細胞或更高的比乙醇生產率，在另一個態樣中，約10至約16克/天/克細胞的比乙醇生產率，在另一個態樣中，約10至約14克/天/克細胞，在另一個態樣中，約10至約12克/天/克細胞，在另一個態樣中，約10至約16克/天/克細胞，在另一個態樣中，約10至約14克/天/克細胞，在另一個態樣中，約12至約16克/天/克細胞，及在另一個態樣中，約12至約14克/天/克細胞。
維生素B1、B5及B7以特定進料速率位準及相對於彼此之特定進料速率位準提供於發酵液中。在此態樣中，提供維生素B5的數量是維生素B7的數量之至少約2倍，在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約2.5倍，在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約3倍，在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約3.5倍，在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約4倍，在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約4.5倍，及在另一個態樣中，維生素B7的數量之至少約5倍。在另一個態樣中，提供維生素B5的數量是維生素B1的數量之至少約2倍，在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約2.5倍，在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約3倍，在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約3.5倍，在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約4倍，在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約4.5倍，及在另一個態樣中，維生素B1的數量之至少約5倍。
在另一個態樣中，維生素B5進入發酵液中的進料速率維持在約150微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約125微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約100微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約95微克/克產生的細胞或更低，及在另一個態樣中，約90微克/克產生的細胞或更低。維生素B5之範圍可包括約25至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約125微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約100微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約90微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約30至約95微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約35至約90微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約80至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約90至約125微克/克產生的細胞，及在另一個態樣中，約90至約100微克/克產生的細胞。
在另一個態樣中，維生素B7進入發酵液中的進料速率維持在約150微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約125微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約100微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約95微克/克產生的細胞或更低，在另一個態樣中，約90微克/克產生的細胞或更低，在另一個態樣中，約75微克/克產生的細胞或更低，在另一個態樣中，約50微克/克產生的細胞或更低，在另一個態樣中，約30微克/克產生的細胞或更低。維生素B7之範圍可包括約5至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約125微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約100微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約90微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約95微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約90微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約75微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約15至約50微克/克產生的細胞，及在另一個態樣中，約15至約30微克/克產生的細胞。
在另一個態樣中，維生素B1進入發酵液中的進料速率維持在約150微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約125微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約100微克/克產生的細胞或更低之進料速率，在另一個態樣中，約95微克/克產生的細胞或更低，及在另一個態樣中，約90微克/克產生的細胞或更低。維生素B1之範圍可包括約5至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，15至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約150微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約125微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約100微克/克產生的細胞，在另一個態樣中，約25至約90微克/克產生的細胞， 在另一個態樣中，約30至約95微克/克產生的細胞，及在另一個態樣中，約35至約90微克/克產生的細胞。
該方法包括維持約15小時或更少的細胞停留時間，在另一個態樣中，約12小時或更少，在另一個態樣中，約10小時或更少，在另一個態樣中，約9小時或更少，在另一個態樣中，約8小時或更少，在另一個態樣中，約7小時或更少，在另一個態樣中，約6小時或更少，及在另一個態樣中，約5小時或更少。細胞停留時間之範圍可包括約5至約15小時，在另一個態樣中，約5至約12小時，在另一個態樣中，約5至約10小時，在另一個態樣中，約6至約10小時，在另一個態樣中，約7至約10小時，在另一個態樣中，約8至約10小時及在另一個態樣中，約9至約10小時。 生物反應器之設計及操作
發酵槽之設計的說明在提申日期均於2012年5月15日之美國序列號13/471,827及13/471,858、提申請日期2012年5月16日之美國序列號13/473,167及提申日期均於2019年8月2日之美國序列號16/530,481及16/530,502中有描述，其等均通過引用併入本案。
發酵最好在適合期望的發酵能夠發生(如，CO變為乙醇)之條件下進行。需考慮的反應條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、攪拌速率(若使用攪拌槽反應器)、接種位準及避免產物抑制之乙酸濃度。在此態樣中，該方法包括在下列範圍內之反應條件： 壓力：約0至約500 psi； 溫度：約30℃至約42℃； 培養基pH：約4至約6.9； 攪拌速率：約100至約2000 rpm； 本文中所述的營養補充物。 含CO氣體基質
含CO氣體基質可包括任何包含CO之氣體。在此態樣中，含CO氣體可包括合成氣、工業氣體及其等之混合物。在相關的態樣中，除CO外，氣體基質還可包括氮氣(N 2)、二氧化碳(CO 2)、甲烷氣體(CH 4)、合成氣及其等之組合。
合成氣可由任何已知的來源提供。在一個態樣中，合成氣可源自碳質材料的氣化。氣化涉及在氧氣的供應受限的情況下生質的部分燃燒。所產生的氣體可包括CO及H 2。在此態樣中，合成氣將含有至少約10莫耳%的CO，在一個態樣中，至少約20莫耳%，在一個態樣中，約10至約100莫耳%，在另一個態樣中，約20至約100莫耳%的CO，在另一個態樣中，約30至約90莫耳%的CO，在另一個態樣中，約40至約80莫耳%的CO，及在另一個態樣中，約50至約70莫耳%的CO。合適的氣化方法及裝置之一些例子在提申日期均於2011年4月6日之美國序列號61/516,667、61/516,704及61/516,646，及提申日期均於2012年3月22日之美國序列號13/427,144、13/427,193及13/427,247中有提供，其等全部通過引用併入本案。
在另一個態樣中，該方法具有支持從氣體基質如高CO含量工業氣體生產醇之適用性。在一些態樣中，包括CO之氣體係源自含碳廢物，例如工業廢氣，或來自其它廢物的氣化。如此，該方法表現為用於補捉碳之有效方法，否則碳將被排放到環境中。工業氣體之例子包括鐵金屬產品製造、非鐵產品製造、石油精煉製程、煤炭氣化、生質氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產、焦炭製造及氣體重整期間產生的氣體。
在另一個態樣中，H 2可由工業廢氣或其它廢物的氣化供應。如此，該方法表現為用於補捉H 2之有效方法，否則H 2將被排放到環境中。工業氣體之例子包括鐵金屬產品製造、非鐵產品製造、石油精煉製程、煤炭氣化、生質氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產及焦炭製造期間產生的氣體。H 2之其它來源可包括例如H 2O電解及生物產生的H 2。
取決於該含CO基質的組成，該含CO基質可直接提供於發酵過程中或可進一步改質成包括適當的H 2對CO莫耳比。在一個態樣中，提供至該發酵槽之含CO基質具有H 2對CO之莫耳比為約­­0.2或更大，在另一個態樣中，約0.25或更大，及在另一個態樣中，約0.5或更大。在另一個態樣中，提供至該發酵槽之含CO基質可包括約40莫耳%或更多的CO加H 2及約30莫耳%或更少的CO，在另一個態樣中，約50莫耳%或更多的CO加H 2及約35莫耳%或更少的CO，及在另一個態樣中，約80莫耳%或更多的CO加H 2及約20莫耳%或更少的CO。
在一個態樣中，該含CO基質包括CO及H 2。在此態樣中，該含CO基質將含有至少約10莫耳%的CO，在一個態樣中，至少約20莫耳%，在一個態樣中，約10至約100莫耳%，在另一個態樣中，約20至約100莫耳%的CO，在另一個態樣中，約30至約90莫耳%的CO，在另一個態樣中，約40至約80莫耳%的CO，及在另一個態樣中，約50至約70莫耳%的CO。
某些氣體流可包括高濃度的CO及低濃度的H 2。在一個態樣中，為了達到更高的醇生產效率及/或總碳捕獲率，最好是可以優化該基質流之組成。在另一個態樣中，在使該流通過該生物反應器之前，可先增加該基質流中H 2的濃度。
根據本揭示之特定態樣，可結合及/或摻合來自二或多個來源之流，以產生理想及/或最佳化的基質流。例如，可結合含高濃度CO之流(如來自煉鋼轉爐之廢氣)與含高濃度H 2之流(如來自煉鋼焦爐之排氣)。
取決於該含CO氣體基質的組成，最好還可以在將其引入發酵之前，先進行處理以除去任何不想要的雜質，如灰塵粒子及化學雜質如氰化物、氧。例如，可使用已知的方法過濾或洗滌該氣體基質。 產乙酸菌
該方法包括在發酵生物反應器中使用產乙酸菌進行發酵。可使用的產乙酸菌之例子包括梭菌屬( Clostridium)，如俊達氏梭菌( Clostridium ljungdahlii)菌株，包括那些在WO 2000/68407、EP 117309、美國專利案號5,173,429、5,593,886及6,368,819、WO 1998/00558及WO 2002/08438中所述的；自產乙醇梭菌( Clostridium autoethanogenum)菌株(德國DSMZ之DSM 10061及DSM 19630)，包括那些在WO 2007/117157及WO 2009/151342中所述的；拉格利梭菌( Clostridium ragsdalei) (P11，ATCC BAA-622)；美國專利申請案號2007/0276447中所述的食一氧化碳梭菌( Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827)；克氏梭菌( Clostridium coskatii) (ATCC PTA-10522)及德雷克氏梭菌( Clostridium drakei)。可使用二或多種微生物之混合培養物。 培養基組成物及培養基進料速率之控制
根據一個態樣，該發酵方法從添加合適的培養基至反應器容器中開始。該反應器容器中所含的液體可包括任何類型之合適的營養培養基或發酵培養基。該營養培養基包括有效容許待使用的微生物生長之維生素及礦物質。不一定需要滅菌。
在另一個態樣中，用於產乙酸菌之各種培養基組份之濃度如下：
    元素 濃度  mg/L       進料速率 毫克/克產生的細胞
NH 4 + 164-6560 41-1640
Fe 1.7-68 0.425-17
Ni 0.07-2.81 0.017-0.702
Co 0.037-1.49 0.009-0.373
Se 0.027-1.1 0.006-0.274
Zn 0.116-4.64 0.198-5.95
W 0.8-32.1 0.26-8.03
K 39-1573 9.83-393.25
Mg 1.4-57.3 0.35-14.32
S 15-625 3.9-156.2
P 15-601 3.76-150.43
過程操作維持pH在約4至約6.9之範圍內，在另一個態樣中，約5至約6.5，在另一個態樣中，約5.1至約6，及在另一個態樣中，約5.2至約6。該培養基包括小於約0.01克/升的酵母萃取液及小於約0.01克/升的碳水化合物。
該組成物可包括NH 4 +、P、K、Fe、Ni、Co、Se、Zn或Mg中之一或多個來源。此等元素每一個之來源可如下。
NH 4 +：氮可由選自於由下列所構成之群組之氮源提供：氫氧化銨、氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨及其等之混合物。
P：磷可由選自於由下列所構成之群組之磷源提供：磷酸、磷酸銨、磷酸鉀及其等之混合物。
K：鉀可由選自於由下列所構成之群組之鉀源提供：氯化鉀、磷酸鉀、硝酸鉀、硫酸鉀及其等之混合物。
Fe：鐵可由選自於由下列所構成之群組之鐵源提供：氯化亞鐵、硫酸亞鐵及其等之混合物。
Ni：鎳可由選自於由下列所構成之群組之鎳源提供：氯化鎳、硫酸鎳、硝酸鎳及其等之混合物。
Co：鈷可由選自於由下列所構成之群組之鈷源提供：氯化鈷、氟化鈷、溴化鈷、碘化鈷及其等之混合物。
Se：砷可由Na 2SeO 3、C 3H 6NO 2Se及其等之混合物提供。
Zn：鋅可由ZnSO 4提供。
W：鵭可由選自於由下列所構成之群組之鵭源提供：鵭酸鈉、鵭酸鈣、鵭酸鉀及其等之混合物。
Mg：鎂可由選自於由下列所構成之群組之鎂源提供：氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂及其等之混合物。
S：該組成物還可包括硫。硫可由選自於由下列所構成之群組之硫源提供：半胱胺酸、硫化鈉、NaHS、NaH 2S及其等之混合物。 發酵
接種後，建立初始進料氣供應速率，以有效供應微生物之初始族群。分析排出氣體，以確定該排出氣體的內容物。使用氣體分析之結果控制進料氣速率。在此態樣中，該方法提供約0.1克/升之最小細胞密度。
在一個態樣中，可於培養物中添加營養素以提高細胞生長速率。合適的營養素可包括酵母萃取物之非碳水化合物部份。
到達期望位準時，從反應器中抽出液相及細胞材料，然後以培養基補充。相較於起始細胞密度，該發酵方法能有效地增加細胞密度。在此態樣中，該方法提供約2至約50克/升之平均細胞密度，在另一個態樣中，約2至約30克/升，在另一個態樣中，約2至約20克/升，在另一個態樣中，約2至約10克/升，及在另一個態樣中，約2至約6克/升。
控制方法，其可為自動分析及控制系統，可提高將氣體基質轉化成有用的終端產物如乙醇之生物過程。該控制方法包括採樣、樣品分析及使用分析結果來調整發酵過程。
採樣：可直接從生物反應器中抽出發酵液。可將從用於抽出發酵液之排放流或其它流而來之樣品管線，與適合線上測量之分析裝置流體連通。來自一或多個反應器之用於線上分析的採樣系統，可包括適合的導管(如，管子或管道)閥、泵及致動器，以容許在期望時間自動採取期望生物反應器的樣品，及用於沖洗(淨化)樣品管線之適合的裝置。
在一個態樣中，該方法包括在一滲透液上進行分析，該滲透液因通過膜分離的過濾而不含或實質上不含細菌細胞。可從細胞分離系統獲得一滲透液流，及該滲透液流可用於分析。碳過濾可用於避開干擾後續分析。
可連續或間歇地測量發酵液，例如周期地，各連續測量之間的時間間隔通常從0.1秒至10分鐘，在一個態樣中，從0.1秒至5分鐘，在一個態樣中，每0.1秒至每120秒，在一個態樣中，每0.5秒至每60秒，及在另一個態樣中，每秒至每10秒。
樣品分析：在一個態樣中，該方法包括測定該發酵液中羧酸及羧酸鹽之濃度。該方法包括使用選自於由下列所構成之群組之分析裝置測定羧酸及羧酸鹽之濃度：近紅外線光譜(NIR)、氣相層析法、高壓液相層析法、質譜儀及其等之組合。在一個態樣中，NIR測量該滲透液中之羧酸及/或羧酸鹽。該NIR可為聯機的，其容許連續測量。在一個態樣中，可用的NIR頻率可包括約800至2200 nm，在另一個態樣中，約1280至約2184 nm，在另一個態樣中，約1640至約1724 nm，在另一個態樣中，約1630至約1910 nm，及在另一個態樣中，約870至約2184 nm。
使用樣品分析結果調整發酵過程：在一個態樣中，從該培養液中形成一滲透液，及該方法透過調整該含CO氣體基質之氣體流速而將該滲透液中之羧酸濃度維持在約1至約3 g/L。可使用氣體控制器來調整該氣體基質添加速率，以達到酸濃度目標設定點。可使用的自動控制系統在美國申請案序列號17/122,366中有進一步說明，其整體通過引用併入本案。 範例 範例1：維生素進料速率對俊達氏梭菌之影響
將含CO、CO 2及H 2之合成氣連續地引入含俊達氏梭菌(實驗1-4)以及含本文中所述的微量金屬及鹽類之液體培養基之攪拌槽生物反應器中。使用專用的進料線提供維生素。
以活躍生長的俊達氏梭菌(實驗1-4)啟動含該發酵培養基之New Brunswick Bioflow反應器。在實驗開始時，將反應器的攪拌速率設定至800 rpm，然後在整個實驗期間維持此攪拌速率。根據培養物之H 2及CO吸收量，增加進入反應器之進料氣流。在整個實驗中將反應器之溫度維持在約38℃。間隔地對進入生物反應器之氣體進料及從生物反應器出來之廢氣及生物反應器中的發酵液進行採樣，例如，分別約每天、每二小時一次及每四小時一次對進料氣、廢氣及發酵液進行採樣。分析以上樣品之各種氣體組份的消耗或產生、培養液乙酸濃度、培養液乙醇濃度及培養物之光學密度(細胞密度)。在整個實驗期間，將反應器中未被激發的體積維持在3000至3250 ml之間。此外，使用質流控制器將進入反應器的氣流維持在所需的氣體流速。該進料合成氣組成為23% H 2、35% CO、29% CO 2及13% N 2。
在下列反應器的操作中，使用專用流於該反應器中饋入維生素生物素、硫胺素及泛酸鹽。保持穩態條件持續一段大於細胞停留時間的5倍之時間。在數據收集階段開始之前，細胞團基本上被替換了5次。在收集數據組之後，調整維生素進料速率，重複調整階段，及收集下一個數據組。調整階段意指培養平衡變化所需的時間。在此實驗中，容許培養至少3天的調整階段。在實驗開始之前，將細胞回收系統(CRS)接至反應器上。實驗期間，培養基進料速率為3.0至6.0 ml/min，及透過CRS，從該反應器中抽出0–5 ml/min的滲透液。
下表說明維生素進料速率及比乙醇生產率(SEP)。
實驗1：泛酸鹽(B5)、生物素(B7)及硫胺素(B1)進料全部增加。
泛酸鹽進料 (微克/克產生的細胞) 生物素進料 (微克/克產生的細胞) 硫胺素進料 (微克/克產生的細胞) SEP (克/天/克細胞)
23.1 18 44.6 8.07
42.1 32.7 81 9.8
64.5 50.2 124 10.7
如表中所示，比乙醇生產率隨著全部三種維生素之進料速率增加而增加。
實驗2：泛酸鹽(B5)、生物素(B7)及硫胺素(B1)進料均增加至高於範例1的位準。
泛酸鹽進料 (微克/克產生的細胞) 生物素進料 (微克/克產生的細胞) 硫胺素進料 (微克/克產生的細胞) SEP (克/天/克細胞)
29.3 22.8 56.5 9.3
54.9 42.7 105.7 9.9
81.4 63.6 156.7 11.9
如表中所述，比乙醇生產率隨著全部三種維生素之進料速率增加至更高的位準而增加。
實驗3：生物素(B7)及硫胺素(B1)進料保持在較低基礎位準，增加泛酸鹽(B5)進料。
泛酸鹽進料 (微克/克產生的細胞) 生物素進料 (微克/克產生的細胞) 硫胺素進料 (微克/克產生的細胞) SEP (克/天/克細胞)
19.33 17.76 13.36 7.95
37.91 17.42 13.10 8.64
55.49 17.00 12.79 10.03
72.34 16.62 12.50 10.33
108.13 19.87 14.95 11.25
125.67 20.55 14.76 11.15
實驗3之結果示於圖1中。藉由將維生素B5進料速率從約20微克/克產生的細胞增至約108微克/克產生的細胞，同時將維生素B1及維生素B7進料速率保持低於20微克/克產生的細胞，比乙醇生產率增加約42%。
實驗4：較低的泛酸鹽(B5)進料基礎位準及增加生物素(B7)及硫胺素(B1)進料。
泛酸鹽進料 (微克/克產生的細胞) 生物素進料 (微克/克產生的細胞) 硫胺素進料 (微克/克產生的細胞) SEP (克/天/克細胞) 生物素+硫胺素 (微克/克產生的細胞)
29.06 26.70 20.09 7.59 46.78
27.97 51.41 38.67 7.69 90.08
28.41 104.42 78.56 7.31 182.98
實驗4之結果示於圖2中。將維生素B5進料速率恆保持低於約30微克/克細胞，同時增加維生素B1及維生素B7進料速率，不會增加比乙醇生產率。 範例2：低細胞停留時間對俊達氏梭菌的影響
於含俊達氏梭菌以及含本文所述的微量金屬及鹽類之液體培養基之攪拌槽生物反應器中，連續地引入含CO、CO 2及H 2之合成氣。
以1至1.5 g/L細胞密度之活躍生長的俊達氏梭菌啟動含發酵培養基之大型攪拌槽生物反應器，在此進料氣組成為30% CO、21.4% CO 2、15.6% H 2及33% N 2，及開始啟動的攪拌速率為280 rpm。透過氣流控制器將進入反應器之進料氣流維持在所需的氣體流速，以符合生物的CO需求。在25小時的時候開始細胞淨化，及設定6%細胞淨化率直到該啟動結束。在整個實驗期間，將反應器中未激發的體積維持在158至162 L之間，及將溫度維持在38.5℃下。透過OD探針測量在650 nm下之OD來監測生長。
從接種該生物反應器至穩態大概花40個小時。將攪拌速率漸增至560 rpm。在穩態期間，使用自動分析及控制系統來控制進料氣流速。間隔採取進料氣、排氣、滲透液及發酵液之樣品，例如每2分鐘採取進料氣及排氣之樣品，及每分鐘採取羧酸及乙醇濃度之樣品。之後利用自動分析及控制系統分析樣品。該系統會自動調整進料氣流速，將該滲透液中之總羧酸濃度維持在1.5 g/L。
在穩態條件下維持50天(1200小時)。在該穩態開始時，將細胞停留時間設定至12.5小時。使用專用進料線提供維生素，且以95微克/克產生的細胞饋入泛酸鹽。將細胞停留時間進一步降低至7小時，當細胞停留時間降低時，觀察到比乙醇生產率增加。圖3描述比乙醇生產率與細胞停留時間之間的關係。 範例3：維生素進料速率及低細胞停留時間對自產乙醇梭菌的影響
以自產乙醇梭菌進行發酵試驗，生物素(B7)及硫胺素(B1)進料保持在較低基礎位準及增加泛酸鹽(B5)進料。
泛酸鹽進料 (微克/克產生的細胞) 生物素進料 (微克/克產生的細胞) 硫胺素進料 (微克/克產生的細胞) 細胞停留時間(小時)   SEP (克/天/克細胞)
48.47 29.54 23.10 13.45 8.08
58.08 26.65 20.84 13.27 8.24
62.90 23.04 18.01 12.44 8.51
68.78 25.19 19.70 11.36 9.39
70.67 21.62 16.91 11.22 9.70
81.90 18.79 14.69 9.81 9.98
結果示於圖4中。將維生素B5進料速率從約48微克/克產生的細胞增至約82微克/克產生的細胞，同時將維生素B1及維生素B7進料速率保持低於30微克/克產生的細胞，然後進一步低於20微克/克產生的細胞及將細胞停留時間從約13.5小時減少至9.8小時，比乙醇生產率增加約24%。
雖然通過具體實施例、範例及其應用來說明本揭示之內容，但在不逸離發明申請專利範圍中所述的揭示範疇之情況下，本領域之技術人員可製造許多修改及變化。
無
通過參考實施例，其中一些述於附圖中，可獲得以上簡單概述的揭示內容之更具體的說明，以便詳細了解本揭示之上述特性。然而應注意，附圖僅描述本揭示之典型實施例，因此不應被視為其範疇之限制，本揭示可允許其它同樣有效的實施例。
圖1描述使用俊達氏梭菌( Clostridium ljungdalii)，維生素B7及維生素B1進料保持在較低的基礎位準及增加維生素B5進料之發酵作用中的乙醇生產率。
圖2顯示使用俊達氏梭菌( Clostridium ljungdalii)，較低基礎位準的維生素B5進料及增加維生素B7與維生素B1進料之發酵作用中的乙醇生產率。
圖3描述使用俊達氏梭菌( Clostridium ljungdalii)之發酵作用中比乙醇生產率與細胞停留時間之間的關係。
圖4描述使用自產乙醇梭菌( Clostridium authoethanogenum)，B7及B1進料保持在較低基礎位準及增加B5進料之發酵作用。

Claims (12)

  1. 一種發酵方法，其包含： 提供一含CO之氣體基質至一包括一發酵液之發酵槽； 提供維生素B1、B5及B7至該發酵液，其中維生素B5之進料速率為約25至約150微克/克所產生的細胞或更低；及 以一或多種產乙酸菌及約15小時或更少的細胞停留時間來發酵該含CO之氣體基質， 其中該方法提供約10克/天/克細胞或更高之比乙醇生產率。
  2. 如請求項1的發酵方法，其中以維生素B7之進料速率的至少2倍的一進料速率來提供一數量的維生素B5，及以維生素B1之進料速率的至少2倍的一進料速率來提供該數量的維生素B5。
  3. 如請求項1的發酵方法，其中該產乙酸菌是產乙酸梭菌屬( Clostridium)。
  4. 如請求項3的發酵方法，其中該產乙酸梭菌屬是選自於由下列所構成之群組：俊達氏梭菌( Clostridium ljungdhalii)、自產乙醇梭菌( Clostridium autoethanogum)、食一氧化碳梭菌( Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌( Clostridium drakei)、克氏梭菌( Clostridium coskatiii)、拉格利梭菌( Clostridium ragsdalei)及其等之混合物。
  5. 如請求項1的發酵方法，其中該含CO之氣體基質具有約0.2或更高的H 2/CO莫耳比。
  6. 如請求項1的發酵方法，其中該方法以小於100微克/克所產生的細胞之進料速率來提供維生素B1至該發酵液中。
  7. 如請求項1的發酵方法，其中該方法以小於100微克/克所產生的細胞之進料速率來提供維生素B7至該發酵液中。
  8. 如請求項1的發酵方法，其中該發酵液具有0.01g/L或更少的酵母萃取物。
  9. 如請求項1的發酵方法，其中該發酵液具有0.01g/L或更少的碳水化合物。
  10. 如請求項1的發酵方法，其中從該發酵液中形成一滲透液，及該方法透過調整該含CO之氣體基質的氣體流速來將該滲透液中的一羧酸濃度維持在約1至約3克/L。
  11. 如請求項10的發酵方法，其中該羧酸濃度是藉由一選自於由下列所構成之群組之分析技術來測定：近紅外線光譜(NIR)、氣相層析法、高壓液相層析法、質譜法及其等之組合。
  12. 如請求項9的發酵方法，其中該含CO之氣體基質的氣體流速是藉由一自動分析及控制系統來調整。
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