CN116670294A - 控制乙醇生产的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于控制通过气态底物微生物发酵生产乙醇的方法。更具体地讲，提供了一种通过加入维生素和低细胞停留时间来控制乙醇生产率的方法。根据该方法，以增加乙醇比生产率的量加入维生素B1、B5和B7。细胞停留时间保持在低水平。

Description

控制乙醇生产的方法和组合物
本申请要求2020年12月8日提交的美国临时申请号63/122,580的权益，其整体通过引用结合到本文中。
提供了一种通过加入维生素控制乙醇生产率的方法。更具体地讲，以增加乙醇比生产率的量加入维生素B1、B5和B7，并且约15小时或更少的细胞停留时间提供约10克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率。
背景技术
生物燃料是汽油的重要替代品。生物燃料包括乙醇，它已成为全世界的主要燃料。微生物可从一氧化碳(CO)通过气态底物发酵产生乙醇和其它化合物。CO通常以合成气形式作为气态底物的一部分提供到发酵中。碳质物质气化产生包括一氧化碳和氢的发生气、合成气体(synthesis gas)或合成气(syngas)在本领域众所周知。通常，这样的气化方法涉及碳质材料的部分氧化或缺氧性氧化(starved-air oxidation)，其中向气化过程提供亚化学计量的氧，以促进产生一氧化碳。
发酵在确定成分的液体培养基中进行。这些培养基一般包括对改善发酵性能重要的各种大量营养物和微量营养物源。与较不常见底物(例如气态底物)结合使用的培养基需要明确确定成分的培养基来优化性能。厌氧发酵也需要明确确定成分的培养基。
美国专利号7,285,402描述了已知用于气态底物厌氧发酵产生乙醇的培养基。培养基中的各种组分和组分进料速率有效提供高水平的乙醇生产率。更具体地讲，USPN 7,285,402描述了包括硫胺素(维生素B1)、泛酸盐(维生素B5)和生物素(维生素B7)的培养基。然而，USPN 7,285,402没有认识到或描述维生素组合和维生素进料速率如何能够作为控制来调节培养性能和提供较高的体积生产率。
美国专利号9,701,987描述了在含CO的底物发酵期间增加维生素B浓度，以增加2,3-丁二醇生产。更具体地讲，USPN 9,701,987描述了将维生素B浓度提高到远高于细胞需要的浓度，以增加2,3-丁二醇生产。然而，乙醇的产量不受影响。因此，仍非常需要利用优化B维生素组合和细胞停留时间的方法和培养基组合物，其在经济上增加乙醇比生产率，从而改善工业竞争力。
发明内容
本发明提供了一种用于控制通过气态底物微生物发酵生产乙醇的方法。更具体地讲，该方法提供增加了气态CO发酵产乙酸菌的乙醇比生产率。增加添加到产乙酸菌发酵的维生素B5的速率和保持细胞停留时间少于约15小时增加了乙醇比生产率。
在一个方面，发酵方法包括将含CO的气态底物提供到包含发酵液的发酵器；将维生素B1、B5和B7提供到发酵液，其中维生素B5的进料速率为约25至约150微克/克产生的细胞或更小；并且用一种或多种产乙酸菌以约15小时或更少的细胞停留时间使含CO的气态底物发酵，以提供约10克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率。在另一个方面，以维生素B7进料速率至少2倍的进料速率提供一定量的维生素B5，并且以维生素B1进料速率至少2倍的进料速率提供该量的维生素B5。
附图说明
为了能够详细了解本公开的上述特征，可通过参考实施方案拥有以上简单概括的本公开的更具体描述，其中一些在附图中说明。然而，应注意到，附图只说明本公开的典型实施方案，因此不应认为是其范围的限制，因为本公开可容许其它同样有效的实施方案。
图1说明利用永达尔梭菌(Clostridium ljungdalii)的发酵中乙醇生产率，其中维生素B7和维生素B1进料随着增加维生素B5进料保持在较低的基础水平。
图2显示利用永达尔梭菌(Clostridium ljungdalii)、使维生素B5进料在较低的基础水平，而使维生素B7和维生素B1进料增加的发酵中乙醇生产率。
图3说明利用永达尔梭菌(Clostridium ljungdalii)的发酵中乙醇比生产率和细胞停留时间之间的关系。
图4说明利用自产乙醇梭菌(Clostridium authoethanogenum)发酵，其中维生素B7和B1进料随着增加维生素B5进料而保持在较低的基础水平。
具体实施方式
以下描述不应以限制意义理解，而只为了描述示例性实施方案的一般原理作出。本公开的范围应参考权利要求确定。
定义
除非另外定义，否则对于本公开在整个本说明书使用的以下术语限定如下，且可包括以下限定定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“约”是指在现实情况下(例如，在实验室、试验工厂或生产设施)遇到的那个量的变化。例如，在由“约”修饰时，在混合物或量中利用的成分或测量的量包括在生产工厂或实验室内在实验条件测量中变化和通常采用的谨慎程度。例如，在由“约”修饰时，产物的组分的量包括在工厂或实验室在多个实验中批次之间的变化，和在分析方法中固有的变化。无论是否由“约”修饰，所述量包括这些量的相当值。本文所述和由“约”修饰的任何量也可在本公开中用作未由“约”修饰的量。
术语“发酵器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置/生物反应器，包括批式反应器、半批式反应器、连续反应器、连续搅拌罐反应器(CSTR)、鼓泡塔反应器、外循环回路反应器、内循环回路反应器、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、气升反应器、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器、气升发酵器或适合气体-液体接触的其它容器或其它装置。
术语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等旨在包括过程的生长阶段和产物生物合成阶段二者。在一个方面，发酵指CO转化成乙醇。
如本文所用生产率表示为乙醇比生产率，以克乙醇/天/克细胞(克/天/克细胞)为单位。
乙醇比生产率的控制
本方法用维生素控制和提高通过产乙酸菌发酵含CO的底物的乙醇比生产率。此外，方法包括保持约15小时或更少的细胞停留时间(CRT或XRT)。在这个方面，方法提供约10克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率，在另一个方面，约12克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率，在另一个方面，约14克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率，在另一个方面，约10至约16克/天/克细胞的乙醇比生产率，在另一个方面，约10至约14克/天/克细胞，在另一个方面，约10至约12克/天/克细胞，在另一个方面，约10至约16克/天/克细胞，在另一个方面，约10至约14克/天/克细胞，在另一个方面，约12至约16克/天/克细胞，何在另一个方面，约12至约14克/天/克细胞。
维生素B1、B5和B7以一定的进料速率水平和相对于彼此一定的进料速率水平提供到发酵液中。在这个方面，提供的维生素B5的量为维生素B7量的至少约2倍，在另一个方面，维生素B7的量的至少约2.5倍，在另一个方面，维生素B7的量的至少约3倍，在另一个方面，维生素B7的量的至少约3.5倍，在另一个方面，维生素B7的量的至少约4倍，在另一个方面，维生素B7的量的至少约4.5倍，和在另一个方面，维生素B7的量的至少约5倍。在另一个方面，提供的维生素B5为维生素B1量的至少约2倍，在另一个方面，维生素B1的量的至少约2.5倍，在另一个方面，维生素B1的量的至少约3倍，在另一个方面，维生素B1的量的至少约3.5倍，在另一个方面，维生素B1的量的至少约4倍，在另一个方面，维生素B1的量的至少约4.5倍，和在另一个方面，维生素B1的量的至少约5倍。
在另一个方面，进入发酵液的维生素B5的进料速率保持在约150微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约125微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约100微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约95微克/克产生的细胞或更小，在另一个方面，约90微克/克产生的细胞或更小。维生素B5的范围可包括约25至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约125微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约100微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约90微克/克产生的细胞，在另一个方面，约30至约95微克/克产生的细胞，在另一个方面，约35至约90微克/克产生的细胞，在另一个方面，约80至150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约90至125微克/克产生的细胞，和在另一个方面，约90至约100微克/克产生的细胞。
在另一个方面，进入发酵液的维生素B7的进料速率保持在约150微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约125微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约100微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约95微克/克产生的细胞或更小，在另一个方面，约90微克/克产生的细胞或更小，在另一个方面，约75微克/克产生的细胞或更小，在另一个方面，约50微克/克产生的细胞或更小，在另一个方面，约30微克/克产生的细胞或更小。维生素B7的范围可包括约5至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约125微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约100微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约90微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约95微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约90微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约75微克/克产生的细胞，在另一个方面，约15至约50微克/克产生的细胞，和在另一个方面，约15至约30微克/克产生的细胞。
在另一个方面，进入发酵液的维生素B1的进料速率保持在约150微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约125微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约100微克/克产生的细胞或更小的进料速率，在另一个方面，约95微克/克产生的细胞或更小，和在另一个方面，约90微克/克产生的细胞或更小。维生素B1的范围可包括约5至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，15至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约150微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约125微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约100微克/克产生的细胞，在另一个方面，约25至约90微克/克产生的细胞，在另一个方面，约30至约95微克/克产生的细胞，在另一个方面，约35至约90微克/克产生的细胞。
方法包括保持约15小时或更少的细胞停留时间，在另一个方面，约12小时或更少，在另一个方面，约10小时或更少，在另一个方面，约9小时或更少，在另一个方面，约8小时或更少，在另一个方面，约7小时或更少，在另一个方面，约6小时或更少，和在另一个方面，约5小时或更少。细胞停留时间的范围可包括约5至约15小时，在另一个方面，约5至约12小时，在另一个方面，约5至约10小时，在另一个方面，约6至约10小时，在另一个方面，约7至约10小时，在另一个方面，约8至约10小时，在另一个方面，约9至约10小时。
生物反应器设计和操作
发酵器设计的说明描述于美国序列号13/471,827和13/471,858，二者提交于2012年5月15日；美国序列号13/473,167，提交于2012年5月16日；和美国序列号16/530,481及16/530,502，二者提交于2019年8月2日，其均通过引用结合到本文中。
发酵应合乎需要在发生所需发酵的适合条件下进行(例如，CO转化成乙醇)。要考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、搅拌速率(如果使用搅拌罐反应器)、接种体水平和避免产物抑制的乙酸浓度。在这个方面，方法包括在以下范围的反应条件：
压力：约0至约500psi；
温度：约30℃至约42℃；
培养基pH：约4至约6.9；
搅拌速率：约100至约2000rpm；
营养供给如本文中所述。
含CO的气态底物
含CO的气态底物可包括任何包含CO的气体。在这个方面，含CO的气体可包括合成气、工业煤气及其混合物。在相关的方面，除CO外，气态底物还可包括氮气(N2)、二氧化碳(CO2)、甲烷气体(CH4)、合成气及其组合。
合成气可从任何已知源提供。在一个方面，合成气可源自碳质物质气化。气化涉及在限制氧供应下生物质的部分燃烧。产生的气体可包含CO和H2。在这个方面，合成气包含至少约10摩尔％CO，在一个方面，至少约20摩尔％，在一个方面，约10至约100摩尔％，在另一个方面，约20至约100摩尔％CO，在另一个方面，约30至约90摩尔％CO，在另一个方面，约40至约80摩尔％CO，和在另一个方面，约50至约70摩尔％CO。合适的气化方法和装置的一些实例提供于美国序列号61/516,667、61/516,704和61/516,646，所有这些均提交于2011年4月6日；和美国序列号13/427,144、13/427,193和13/427,247，所有这些均提交于2012年3月22日，所有这些均通过引用结合到本文中。
在另一个方面，方法具有支持从气态底物(例如，含高体积CO的工业煤气)生产醇的适用性。在一些方面，包含CO的气体从含碳废物得到，例如工业废气，或从其它废物气化得到。因此，这些方法代表用于捕集不然会排入环境的碳的有效方法。工业煤气的实例包括在铁类金属产品制造、非铁类产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产、焦炭制造和气体重整期间产生的气体。
在另一个方面，H2可由工业废气或其它废物的气化供应。因此，这些方法代表用于捕集不然会排入环境的H2的有效方法。工业煤气的实例包括在铁类金属产品制造、非铁类产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造期间产生的气体。H2的其它来源可包括例如H2O电解和生物产生的H2。
根据含CO的底物的组成，含CO的底物可直接提供到发酵过程，或者可进一步改变，以包括适合的H2:CO摩尔比。在一个方面，提供到发酵器的含CO的底物具有约0.2或更大的H2:CO摩尔比，在另一个方面，约0.25或更大，和在另一个方面，约0.5或更大。在另一个方面，提供到发酵器的含CO的底物可包含约40摩尔％或更多CO加H2和约30摩尔％或更少CO，在另一个方面，约50摩尔％或更多CO加H2和约35摩尔％或更少CO，和在另一个方面，约80摩尔％或更多CO加H2和约20摩尔％或更少CO。
在一个方面，含CO的底物包含CO和H2。在这个方面，含CO的底物包含至少约10摩尔％CO，在一个方面，至少约20摩尔％，在一个方面，约10至约100摩尔％，在另一个方面，约20至约100摩尔％CO，在另一个方面，约30至约90摩尔％CO，在另一个方面，约40至约80摩尔％CO，和在另一个方面，约50至约70摩尔％CO。
某些气流可包含高浓度CO和低浓度H2。在一个方面，为了达到较高的醇生产和/或总碳捕集效率，可合乎需要地优化底物流的组成。在另一个方面，在料流通到生物反应器之前，可提高底物流中H2的浓度。
根据本公开的特定方面，可组合和/或共混来自两种或更多种源的料流，以产生合乎需要和/或优化的底物流。例如，包含高浓度CO的料流(例如，来自钢厂转化炉的排气)，可与包含高浓度H2的料流(例如，来自钢厂焦炉的废气)组合。
根据含CO的气态底物的组成，也可合乎需要地在引入发酵之前处理它，以去除任何不想要的杂质，例如尘粒和化学杂质(如氰化物、氧)。例如，可用已知方法过滤或洗涤气态底物。
产乙酸菌
本方法包括在发酵生物反应器中用产乙酸菌进行发酵。可用产乙酸菌的实例包括梭菌属(Clostridium)的那些，如永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株，包括在WO2000/68407、EP 117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 1998/00558及WO 2002/08438中所述的那些；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌株(DSMZ的DSM 10061和DSM 19630，德国)，包括在WO 2007/117157和WO 2009/151342中所述的那些；拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)(P11，ATCC BAA-622)；美国专利申请号2007/0276447中所述的食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)；科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)；和德雷克氏梭菌(Clostridiumdrakei)。可使用两种或更多种微生物的混合培养物。
培养基组成和培养基进料速率控制
根据一个方面，通过向反应器容器加入合适的培养基开始发酵过程。反应器容器中所含的液体可包括任何类型的合适营养培养基或发酵培养基。营养培养基包括有效容许待使用的微生物生长的维生素和矿物质。可能不总是需要灭菌。
在另一个方面，用于产乙酸菌的各种培养基组分的浓度如下：
过程操作保持在约4至约6.9的pH，在另一个方面，约5至约6.5，在另一个方面，约5.1至约6，和在另一个方面，约5.2至约6。培养基包含小于约0.01g/L酵母提取物和小于约0.01g/L碳水化合物。
组合物可包括NH4 +、P、K、Fe、Ni、Co、Se、Zn或Mg源的一种或多种。每种这些元素的源可为如下。
NH4 +：氮可由选自氢氧化铵、氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵及其混合物的氮源提供。
P：磷可由选自磷酸、磷酸铵、磷酸钾及其混合物的磷源提供。
K：钾可由选自氯化钾、磷酸钾、硝酸钾、硫酸钾及其混合物的钾源提供。
Fe：铁可由选自氯化亚铁、硫酸亚铁及其混合物的铁源提供。
Ni：镍可由选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍及其混合物的镍源提供。
Co：钴可由选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴及其混合物的钴源提供。
Se：硒可由Na2SeO3、C3H6NO2Se及其混合物提供。
Zn：锌可由ZnSO4提供。
W：钨可由选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾及其混合物的钨源提供。
Mg：镁可由选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁及其混合物的镁源提供。
S：组合物也可包含硫。硫可由选自半胱胺酸、硫化钠、NaHS、NaH2S及其混合物的硫源提供。
发酵
在接种时，确立初始进料气体供应速率，以有效供应初始微生物种群。分析排出气体，以确定排出气体的内容物。用气体分析结果控制进料气体速率。在这个方面，该方法提供约0.1克/升的最小细胞密度。
在一个方面，可将营养物加到培养物，以提高细胞生长速率。适合的营养物可包括酵母提取物的非碳水化合物部分。
在达到所需水平时，从反应器抽取液相和细胞材料，并用培养基补充。与开始细胞密度比较，这种发酵方法有效提高细胞密度。在这个方面，方法提供约2至约50克/升的平均细胞密度，在另一个方面，约2至约30克/升，在另一个方面，约2至约20克/升，在另一个方面，约2至约10克/升，和在另一个方面，约2至约6克/升。
控制方法，可以为自动分析和控制系统，可促进将气态底物转化成有用最终产物(如乙醇)的生物过程。控制方法包括采样、样品分析和使用该分析结果调节发酵过程。
采样：可直接从生物反应器抽取发酵液。可将从排放流或用于抽取发酵液的其它流的样品管线流体连接到在线测量的适合的分析装置。来自一个或多个反应器用于在线分析的采样系统可包括适合的导管(如，管或管道)阀、泵和致动器，以容许在所需的时间对所需的生物反应器自动采样，以及用于冲洗(净化)样品管线的适合装置。
在一个方面，方法包括对渗透液进行分析，渗透液由于膜分离过滤而不含或实质上不含细菌细胞。可从细胞分离系统获得渗透液流，并可将那种渗透液流用于分析。可用碳过滤避免干扰后续分析。
可连续或间歇测量发酵液，例如周期性，各连续测量之间的时间段通常为0.1秒至10分钟，在一个方面，0.1秒至5分钟，在一个方面，每0.1秒至每120秒，在一个方面，每0.5秒至每60秒，和在另一个方面，每秒至每10秒。
样品分析：在一个方面，方法包括测定发酵液中羧酸和羧酸盐的浓度。方法包括用选自近红外线光谱(NIR)、气相色谱、高压液相色谱、质谱及其组合的分析装置测定羧酸和羧酸盐的浓度。在一个方面，NIR测量渗透液中的羧酸和/或羧酸盐。NIR可以是线内(in-line)的，它容许连续测量。在一个方面，可用的NIR频率可包括约800至2200nm，在另一个方面，约1280至约2184nm，在另一个方面，约1640至约1724nm，在另一个方面，约1630至约1910nm，和在另一个方面，约870至约2184nm。
使用样品分析调节发酵过程：在一个方面，从培养液形成渗透液，且方法通过调节含CO的气态底物的气体流速来保持在渗透液中约1至约3g/L的羧酸浓度。可使用气体控制器调节气态底物加入速率，以达到酸浓度目标设定点。可利用的自动控制系统进一步描述于美国申请序列号17/122,366，其整体通过引用结合到本文中。
实施例
实施例1：维生素进料速率对永达尔梭菌的影响
将含CO、CO2和H2的合成气连续引入含永达尔梭菌(实验1-4)与含本文中所述微量金属和盐的液体培养基的搅拌罐生物反应器中。用专用的进料管线提供维生素。
用活跃生长的永达尔梭菌(实验1-4)启动含发酵培养基的New BrunswickBioflow反应器。在实验开始时，将反应器的搅拌速率设定到800rpm，然后在整个实验期间保持此搅拌速率。基于培养物的H2和CO吸收量，增加进入反应器的进料气流。在整个实验中将生物反应器中的温度保持在约38℃。间隔地对进入生物反应器的气体进料和来自生物反应器的废气以及生物反应器中的发酵液进行采样，例如，分别约每天一次、二小时一次和四小时一次对进料气体、废气及发酵液进行采样。分析以上样品的各种气体组分的消耗或生产、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光密度(细胞密度)。在整个实验期间，将反应器的未激发体积保持在3000至3250ml之间。此外，通过用质量流量控制器将进入反应器的气流保持在所需的气体流速。进料合成气组成为23％H2、35％CO、29％CO2和13％N2。
在以下反应器运行中，使用专用料流将维生素生物素、硫胺素和泛酸盐进料到反应器。保持稳态条件大于细胞停留时间5倍的一段时间。在数据收集阶段开始之前，细胞团基本上被替换了5次。在收集数据组后，调节维生素进料速率，重复调节阶段，并收集下一个数据组。调节阶段是指培养平衡变化所需的一些时间。在这个实验中，容许培养至少3天的调节阶段。在开始实验之前，将细胞再循环系统(CRS)附接到反应器上。在实验期间，培养基进料速率为3.0至6.0ml/min，且通过CRS，从反应器抽取0–5ml/min的渗透液。
下表描述了维生素进料速率和乙醇比生产率(SEP)。
实验1：泛酸盐(B5)、生物素(B7)和硫胺素(B1)进料全部增加。
如表中所示，乙醇比生产率随着全部三种维生素的进料速率增加而增加。
实验2：泛酸盐(B5)、生物素(B7)和硫胺素(B1)进料全部增加到高于实验1中的水平。
如表中所示，乙醇比生产率随着全部三种维生素的进料速率增加到较高的水平而增加。
实验3：生物素(B7)和硫胺素(B1)进料保持在较低的基础水平，而泛酸盐(B5)进料增加。
实验3的结果显示于图1中。通过使维生素B5进料速率从约20微克/克产生的细胞增加到约108微克/克产生的细胞，同时保持维生素B1和维生素B7进料速率低于20微克/克产生的细胞，乙醇比生产率增加约42％。
实验4：较低的泛酸盐(B5)进料基础水平与增加生物素(B7)和硫胺素(B1)进料。
实验4的结果显示于图2中。保持维生素B5进料速率持续低于约30微克/克细胞，同时增加维生素B1和维生素B7进料速率，不会增加乙醇比生产率。
实施例2：低细胞停留时间对永达尔梭菌的影响
将含CO、CO2和H2的合成气连续引入含永达尔梭菌与含本文中所述微量金属和盐的液体培养基的搅拌罐生物反应器中。
用活跃生长永达尔梭菌以1至1.5g/L细胞密度启动含发酵培养基的大型搅拌罐生物反应器，其中进料气体组成为30％CO、21.4％CO2、15.6％H2和33％N2，开始启动的搅拌速率为280rpm。通过气流控制器将进入反应器的进料气流保持在所需的气体流速，以符合生物CO需求。在25小时的时候开始细胞净化，并设定6％细胞净化率，直至启动结束。在整个实验期间，将反应器的未激发体积保持在158至162L之间，并将温度保持在38.5℃。通过OD探针在650nm测量OD来监测生长。
从接种生物反应器到稳态大约花40个小时。搅拌速率渐增至560rpm。在稳态期间，用自动分析和控制系统控制进料气体流速。间隔地采取进料气体、排出气体、渗透液和发酵液的样品，例如每2分钟采样进料气体和排出气体，并且每分钟采样羧酸和乙醇浓度。然后用自动分析和控制系统分析样品。系统自动调节进料气体流速，以使渗透液中的总羧酸浓度保持在1.5g/L。
保持稳态条件50天(1200小时)的一段时间。在稳态开始，将细胞停留时间设定到12.5小时。用专用的进料管线提供维生素，且以95微克/克产生的细胞进料泛酸盐。将细胞停留时间进一步降低到7小时。当细胞停留时间降低时，观察到乙醇比生产率增加。图3说明乙醇比生产率和细胞停留时间之间的关系。
实施例3：维生素进料速率和低细胞停留时间对自产乙醇梭菌的影响
用自产乙醇梭菌进行发酵试验，生物素(B7)和硫胺素(B1)进料保持在较低的基础水平，而泛酸盐(B5)进料增加。
结果显示于图4中。通过使维生素B5进料速率从约48微克/克产生的细胞增加到约82微克/克产生的细胞，同时保持维生素B1和维生素B7进料速率低于30微克/克产生的细胞，然后进一步低于20微克/克产生的细胞，并使细胞停留时间从约13.5小时减少到9.8小时，乙醇比生产率增加约24％。
虽然已通过具体实施方案、实施例及其应用描述了本文公开的公开内容，但本领域的技术人员可在不脱离权利要求阐明的本公开的范围下对其作出很多修改和变化。

Claims (12)

1.一种发酵方法，所述发酵方法包括：
将含CO的气态底物提供到包含发酵液的发酵器；
将维生素B1、B5和B7提供到发酵液，其中维生素B5的进料速率为约25至约150微克/克产生的细胞或更小；并且
用一种或多种产乙酸菌以约15小时或更少的细胞停留时间使含CO的气态底物发酵，
其中所述方法提供约10克/天/克细胞或更大的乙醇比生产率。
2.权利要求1的发酵方法，其中以维生素B7进料速率至少2倍的进料速率提供一定量的维生素B5，并且以维生素B1进料速率至少2倍的进料速率提供该量的维生素B5。
3.权利要求1的发酵方法，其中所述产乙酸菌为产乙酸梭菌(Clostridium)。
4.权利要求3的发酵方法，其中所述产乙酸梭菌选自永达尔梭菌(Clostridiumljungdhalii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatiii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)及其混合物。
5.权利要求1的发酵方法，其中所述含CO的气态底物具有约0.2或更大的H2/CO摩尔比。
6.权利要求1的发酵方法，其中所述方法将维生素B1以小于100微克/克产生的细胞的进料速率提供到发酵液中。
7.权利要求1的发酵方法，其中所述方法将维生素B7以小于100微克/克产生的细胞的进料速率提供到发酵液中。
8.权利要求1的发酵方法，其中所述发酵液具有0.01g/L或更小的酵母提取物。
9.权利要求1的发酵方法，其中所述发酵液具有0.01g/L或更小的碳水化合物。
10.权利要求1的发酵方法，其中从培养液形成渗透液，且所述方法通过调节含CO的气态底物的气体流速来保持在渗透液中约1至约3g/L的羧酸浓度。
11.权利要求10的发酵方法，其中通过选自近红外线光谱(NIR)、气相色谱、高压液相色谱、质谱及其组合的分析技术来测量羧酸浓度。
12.权利要求9的发酵方法，其中所述含CO的气态底物的气体流速通过自动分析和控制系统来调节。
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