JP4548701B2 - 破骨細胞形成を抑制する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
Karsenty, G., and Wagner, E. F. (2002) Dev Cell 2, 389-406 Manolagas, S. C. (2000) Endocr Rev 21, 115-137 Teitelbaum, S. L. (2000) Science 289, 1504-1508 Rodan, G. A., and Martin, T. J. (2000) Science 289, 1508-1514 Takayanagi, H. et al. (2000a) Arthritis Rheum 43, 259-269 Takayanagi, H. et al., J. Clin. Invest. 104, 137-46 (1999) Kong, Y.Y. et al., Nature 402, 304-9 (1999) Pettit, A.R. et al., Am J Pathol 159, 1689-99 (2001) Chambers, T. J. (2000) J Pathol 192, 4-13 Suda, T. et al. (1999) Endocrine Rev 20, 345-357 Lacey, D. L. et al. (1998) Cell 93, 165-176 Theill, L. E. et al. (2002) Annu Rev Immunol 20, 795-823 Yasuda, H. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95, 3597-3602 Kong, Y. Y. et al. (1999b) Nature 397, 315-323 Lagasse, E., and Weissman, I. L. (1997) Cell 89, 1021-1031 Yoshida, H. et al. (1990) Nature 345, 442-444 Tondravi, M. M. et al. (1997) Nature 386, 81-84 Franzoso, G. et al. (1997) Genes Dev 11, 3482-3496 Grigoriadis, A. E. et al. (1994) Science 266, 443-448 Johnson, R. S. et al. (1992) Cell 71, 577-586 Wang, Z. Q. et al. (1992) Nature 360, 741-745 Moore, K. J. (1995) Trends Genet 11, 442-448 Weilbaecher, K. N. et al. (2001) Mol Cell 8, 749-758 McGill, G. G. et al. (2002) Cell 109, 707-718 Darnay, B. G. et al. (1998) J Biol Chem 273, 20551-20555 Galibert, L. et al. (1998) J Biol Chem 273, 34120-34127 Wong, B. R. et al. (1998) J Biol Chem 273, 28355-28359 Kobayashi, N. et al. (2001) Embo J 20, 1271-1280 Lomaga, M. A. et al. (1999) Genes Dev 13, 1015-1024 Naito, A. et al. (1999) Genes Cells 4, 353-362 Matsuo, K. et al. (2000) Nat Genet 24, 184-187 Wagner, E. F., and Karsenty, G. (2001) Curr Opin Genet Dev 11, 527-532 Matsumoto, M. et al. (2000) J Biol Chem 275, 31155-31161 Wei, S. et al. (2002) J Biol Chem 277, 6622-6630 Wong, B. R. et al. (1999) Mol Cell 4, 1041-1049
(1)破骨細胞形成を促進または抑制する方法であって、破骨細胞前駆細胞におけるCa2+シグナル伝達をそれぞれ促進または抑制する工程を含む方法、
(2)破骨細胞前駆細胞におけるCa2+シグナル伝達を促進または抑制する工程が、該破骨細胞前駆細胞におけるカルシニューリンの発現または活性を促進または抑制する工程である、(1)に記載の方法、
(3)破骨細胞前駆細胞におけるCa2+シグナル伝達を促進または抑制する工程が、該破骨細胞前駆細胞におけるNFATc1の発現または活性を促進または抑制する工程である、(1)に記載の方法、
(4)該破骨細胞前駆細胞におけるAP-1の1つまたはそれ以上の成分の発現または活性を促進または抑制する工程をさらに含む、(1)に記載の方法、
(5)NFATc1の活性が、NFATc1およびAP-1成分との相互作用である、(3)に記載の方法、
(6)NFATc1の活性が、NFATc1およびDNAとの相互作用である、(3)に記載の方法、
(7)破骨細胞形成を抑制する方法であって、破骨細胞前駆細胞に、カルシニューリン阻害剤および/またはレフルノミドを接触させる工程を含む方法、
(8)破骨細胞形成を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるCa2+シグナル伝達を検出する工程、および
(b)該Ca2+シグナル伝達を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
(9)工程(a)が、被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるカルシニューリンの発現または活性を検出する工程であり、工程(b)が、該カルシニューリンの発現レベルまたは活性を抑制する化合物を選択する工程である、(8)に記載の方法、
(10)工程(a)が、被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるNFATc1の発現または活性を検出する工程であり、工程(b)が、該NFATc1の発現レベルまたは活性を抑制する化合物を選択する工程である、(8)に記載の方法、
(11)NFATc1の活性が、NFATc1およびAP-1成分との相互作用である、(10)に記載の方法、
(12)NFATc1の活性が、NFATc1およびDNAとの相互作用である、(10)に記載の方法、
(13)破骨細胞形成を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検化合物を含む試料の存在下、外来的にNFATc1を発現させた破骨細胞前駆細胞における破骨細胞形成を検出する工程、および
(b)該破骨細胞形成を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
(14)骨減少性疾患の治療のための医薬組成物であって、Ca2+シグナル伝達を抑制する少なくとも1つの化合物、および1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物、
(15)該化合物が、カルシニューリンの発現または活性を抑制する化合物である、(14)に記載の組成物、
(16)該化合物が、NFATc1の発現または活性を抑制する化合物である、(14)に記載の組成物、
(17)該化合物が、NFATc1およびAP-1成分との相互作用を阻害する化合物である、(16)に記載の組成物、
(18)該化合物が、NFATc1およびDNAとの相互作用を阻害する化合物である、(16)に記載の組成物、
(19)骨減少性疾患が、骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、パジェット病、および骨癌からなる群より選択される疾患である、(14)に記載の組成物、
(20)破骨細胞の製造方法であって、
(a)胚性幹細胞を培養して三次元的な細胞塊を形成させる工程、
(b)工程(a)で得られた細胞をM-CSF存在下で培養する工程、
(c)工程(b)で得られた細胞をM-CSFおよびRANKL存在下で培養する工程、
を含む方法、に関する。
また、本発明において「破骨細胞前駆細胞 (osteoclast precursor cell)」とは、破骨細胞に分化し得るマクロファージ単球系細胞を言い、より特定すれば、M-CSFに応答して増殖が促進される細胞を言う。破骨細胞前駆細胞は、骨髄または脾臓に含まれる細胞であってもよく、細胞株であってもよい。また、破骨細胞前駆細胞は造血幹細胞からin vitroで分化させることもできる(実施例8)。
(1)被検化合物存在下でCa2+ influxまたはCa2+ mobilizationを検出し、これを阻害するような化合物を選択する。例えばCa2+ chelatorなどは候補化合物となる。
(2)被検化合物存在下でカルシニューリンの活性を検出し、これを阻害する化合物を選択する。
(3)被検化合物存在下でNFATc1の発現を検出し、これを抑制する化合物を選択する。ここでNFATc1の発現を抑制する化合物は、(a)NAFTc1のmRNAの誘導の阻害、(b)NFATc1蛋白質の合成の阻害、(c)NFATc1蛋白質の安定性の阻害(分解の促進)を指標としてスクリーニングすることができる。
(4)被検化合物存在下でNFATc1の活性を検出し、これを抑制する化合物を選択する。NFATc1の活性を阻害する化合物は、(a)NFATc1の脱リン酸化の阻害、(b)NFATc1のリン酸化の促進、(c)NFATc1の核移行の阻害、(d)NFATc1のDNAとの結合の阻害、(e)NFATc1とAP-1成分との結合(好ましくはc-Fosおよび/またはc-Junとの結合)の阻害などを指標としてスクリーニングすることができる。例えばNFATc1とc-Fosとの結合は、NFATc1抗体およびc-Fos抗体を用いた免疫沈降-ウェスタンブロッティングにより検出することができる。また、例えばNFATc1とDNAとの結合は、NFATc1結合配列を含むオリゴヌクレオチドを用いたelectrophoretic mobility shift assay (EMSA) により測定することができる。NFAT/AP-1/DNA複合体における各成分の相互作用部位の情報を基に、この部位に結合する低分子化合物を設計することにより、効果的にNFATc1とAP-1成分、またはNFATc1とDNAとの相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能と考えられる。NFATc1とAP-1成分との相互作用の必須のアミノ酸は、本明細書に例示されている。
上記のスクリーニングは、当業者であれば標準的な技術を利用して実施することが可能である(例えば Edited by J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory 参照)。
(a)ES細胞を培養して三次元的な細胞塊を形成させる工程、
(b)工程(a)で得られた細胞をM-CSF存在下で培養する工程、
(c)工程(b)で得られた細胞をM-CSFおよびRANKL存在下で培養する工程、
を含む方法である。
実施例2〜11で用いたin vitro破骨細胞形成は以下のように行なった。C57BL/6マウス由来の非接着性骨髄細胞を撒種し (24ウェルプレート1ウェルあたり 5 x 104, 10 cmディッシュあたり 1.5 x 107)、10 ng/ml M-CSF (Genzyme) を含む 10% FBS (Sigma) 含有α-MEM (Gibco BRL) で2日間培養し、リンパ球を含む非接着細胞を洗い流した後、接着細胞をBMMとして使用した。Fos-/-マウスおよび TRAF6-/-マウスの単球/マクロファージ前駆細胞は脾臓から採取し、同様に10 ng/ml M-CSFと共に2日間培養した。これらの破骨細胞前駆細胞はさらに 100 ng/mlの可溶性RANKL (Peprotech) および 10 ng/ml M-CSF存在下で培養して破骨細胞を生成させた。特に記載しない限り、これらの試薬はこれらの濃度で使用した。カルシニューリン阻害剤 FK506 (Calbiochem) またはシクロスポリンA (Sigma) はRANKLと同時に加えた。3日後に、TRAP+ の多核 (>3核) 細胞を計数した。全てのデータは平均±s.e. (n=6) として表した。TRAP+ MNCは、以前記載 (Takayanagi, H. et al. (2000b) Nature 408, 600-605) したように、象牙質切片上での骨吸収活性と、カルシトニン受容体の発現を試験した。
M-CSFの存在下、RANKLで示した時間BMMを刺激した。Sapasolで単離した全RNA 5 mgを各レーンにロードした。ブロットには、マウスNFATc1 cDNA (Sherman, M. A. et al. (1999) J Immunol 162, 2820-2828) の230 bpのEcoRIおよびSmaI断片を[α-32P]dCTPでラベルしてハイブリダイズさせた。免疫染色には、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分固定し、0.2% triton Xで5分処理した。細胞を、順に 5% BSA/PBSで30分、PBST中の2μg/ml マウス抗NFATc1モノクローナル抗体 (7A6, Santa Cruz) で60分、その後、4μg/ml Alexa 488ラベルした抗マウスIgG抗体 (Molecular Probe) で60分インキュベートした。
RANKLにより選択的に活性化される未知の(1つまたは複数の)経路を同定するため、本発明者らはオリゴヌクレオチドアレイ (Affymetrix GeneChip) を用いて、RANKLにより誘導されるmRNAのゲノムワイドスクリーニングを行なった。骨髄細胞をM-CSF存在下で48時間培養して得られた、骨髄由来単球/マクロファージ前駆細胞 (Bone marrow-derived monocyte/macrophage precursor cells; BMMs) を、さらにM-CSF存在下で組み換えRANKLにより72時間刺激して破骨細胞に分化させた (Takayanagi, H. et al. (2000b) Nature 408, 600-605)。この過程において、RANKL添加の2、24、および72時間後に全RNAを抽出し、mRNAの発現プロフィールを未刺激のBMMの全RNAと比較した。RANKLに特異的でない経路を排除するため、M-CSF単独、またはIL-1およびM-CSFで刺激したBMMをネガティブコントロールとして用いた。これらのBMMでは破骨細胞は形成されなかった。
RANKLで刺激し、多核の破骨細胞への発達下にあるBMMにおけるNFATc1蛋白質の発現および細胞局在を調べた。免疫蛍光染色により、NFATc1蛋白質の発現はRANKLが媒介する破骨細胞形成の間、一定して増加し、蛋白質は次第に核に移行することが示された (図3)。この蛋白質は最初は主に細胞質で誘導され、24時間後に核に移行し始める (図3)。NFATc1の発現は、48時間後に観察されるTRAP+細胞の出現よりも早い。RANKL添加の72時間後では、ほぼ全てのTRAP+多核細胞 (MNCs) の核はNFATc1陽性であった (図3)。またこの蛋白質は細胞質にも発現していた。NF-κBなどの転写因子はRANKL刺激の直後に活性化され、破骨細胞形成の間、発現レベルは有意に変化しなかった (図1Bおよび (Takayanagi, H. et al. (2002) Nature 416, 744-749; Takayanagi, H. et al. (2000b) Nature 408, 600-605)) ことから、これらの転写因子機能は発現レベルが徐々に上昇することによってではなく、RANKLが誘導する破骨細胞分化の初期段階の活性化により誘導される核移行により調節されていることが示唆された。この文脈では、RANKLが誘導するNFATc1の上昇と付随する核移行は、破骨細胞分化における細胞事象を最も特徴づけるものでありうる。さらに、骨組織の組織学的試験によれば、NFATc1の発現は、破骨細胞マーカーであるTRAP陽性の巨細胞 (giant cell) (図4)、およびカテプシンKまたはMMP-9発現細胞 (非提示データ) と共在しており、in vivoでも破骨細胞においてNFATc1が発現することが確認された。
NFATc1の異所発現の効果を調べるため、NFATc1 cDNAおよびインターナルリボソーマルエントリーサイト (internal ribosomal entry site) - 増強緑色蛍光蛋白質 (EGFP) を保持するレトロウイルスベクター (pMX-NFATc1-IRES-EGFP) を構築した。レトロウイルスベクター pMX-NFATc1-IRES-EGFP は、マウス全長NFATc1 cDNAの2.7 kb EcoRI断片をpMX-IRES-EGFP (Nosaka, T. et al., EMBO J. 18, 4754-65 (1999)) の同じ部位に挿入して構築した。他のレトロウイルスベクター (pMX-c-Fos-IRES-EGFP, pMX-c-Jun-IRES-EGFP) は以前記載されている (Takayanagi, H. et al. (2002) Nature 416, 744-749)。レトロウイルスのパッケージングはこれらのpMXベクターとpPAMpsi2 (Sato, M. et al., FEBS Lett. 441: 106-110 (1998)) とを293T細胞にコリポフェクションして行なった。接種の2日後、BMMの感染効率をアッセイし、さらに破骨細胞形成アッセイのために、M-CSFと共にRANKLの存在下または非存在下で培養した。3日後、破骨細胞形成をTRAP染色および骨吸収アッセイにより評価した。
リンパ球では、NFATの核への移行はカルシニューリン依存的脱リン酸化により調節されていることがよく知られている (Crabtree, G. R., and Olson, E. N. (2002) Cell 109 Suppl, S67-79; Rao, A. et al. (1997) Annu Rev Immunol 15, 707-747)。免疫抑制剤 FK506またはシクロスポリンA (CyA) はカルシニューリンの脱リン酸化活性を特異的に阻害し、それによりNFATを不活性化させる (Liu, J. et al. (1991) Cell 66, 807-815)。NFATのカルシニューリン依存的活性化が破骨細胞形成に寄与するのかを調べるため、RANKLおよびM-CSFにより刺激される破骨細胞形成系にこれらのカルシニューリン阻害剤を添加した。FK506およびCyAは両者とも、BMMからのRANKL誘導破骨細胞形成を用量依存的に強く阻害した (図6)。破骨細胞形成に対する両薬剤の同じ阻害効果が、RANKLのみでも応答して破骨細胞に分化するマクロファージ細胞株であるRAW 264.7細胞でも観察されたことから (非提示データ)、カルシニューリン - NFAT経路は破骨細胞形成のためにRANKL誘導シグナル伝達に重要であることが示唆された。興味深いことに、FK506はNFATc1の核移行を阻害するのみならず、破骨細胞形成におけるNFATc1蛋白質レベルの特徴的な増加も抑制した (図7)。
ノーザンブロット解析により、NFATc1誘導はFK506によりmRNAレベルで抑制されることが示された (図8)。NFATには、自身のプロモーターへの結合を通してカルシニューリン依存的ポジティブフィードバック調節ループがあることが報告されている (Zhou, B. et al. (2002) J Biol Chem 277, 10704-10711)。本発明者らの結果は、NFATc1遺伝子のカルシニューリン依存的な自律増幅が、RANKLシグナル伝達の下流を作動させていることを示唆する。
カルシニューリンはIP3が媒介する小胞体からのCa2+放出とそれに続く原形質膜を通した細胞内へのCa2+流入により活性化されることが知られている (Crabtree, G. R., and Olson, E. N. (2002) Cell 109 Suppl, S67-79)。RANKLが誘導するカルシニューリンの活性化機構の手がかりを得るため、Ca2+の選択的キレーターであるBAPTA-AMで細胞を処理することによりCa2+の可動化を遮断した。
マウスのジーンターゲッティング戦略は、欠失が胚性致死の表現型となるような多機能遺伝子を解明するには限界がある。例えばNFATc1欠損マウスは正常な心臓弁および中隔を発達できずに発生のday 14.5より前に循環障害により死亡するため、骨細胞の発生におけるNFATc1の関与の詳細を評価することはできない (de la Pompa, J. L. et al. (1998) Nature 392, 182-186; Ranger, A. M. et al. (1998) Nature 392, 186-190)。さらに、NFATc1を欠失するマウスの胎生肝から造血細胞を得ることはほとんど不可能である。そこで本発明者らは、ES細胞由来の単球/マクロファージ前駆細胞が破骨細胞に効率良く分化することができる、ES細胞の新しい培養系を構築した。造血細胞の発生に適した微環境を維持するため、ES細胞塊 (embryoid body; EB) 形成による三次元培養を実現させた。
本発明者らは、G418濃度を増加させた選択により、NFATc1+/- ES細胞からNFATc1-/- ES細胞株を生成させた (Yoshida, H. et al. (1998) Immunity 8, 115-124)。NFATc1-/- ES細胞では、RANKLおよびM-CSF存在下での成熟破骨細胞の形成が完全に欠損していた (図12A)。さらに、RANKL刺激したNFATc1-/- ES細胞ではTRAP+ 細胞は全く見られなかった。しかしながら、NFATc1-/- ES細胞からのCD11b (Mac-1) または非特異的エステラーゼ (nonspecific esterase; NSE) 陽性の単球/マクロファージ前駆細胞の生成は、親細胞であるNFATc1+/- ES細胞からの生成と同レベルであった (図12B)。それに加え、NFATc1-/-前駆細胞のc-Fms (M-CSF受容体) およびRANKの発現は、NFATc1+/-前駆細胞のそれらに匹敵した (非提示データ)。これらの結果を合わせると、NFATc1はTRAP遺伝子の誘導および単球/マクロファージ前駆細胞から成熟した多核破骨細胞への分化に重要な役割を果たしていることが証明された。
本発明者らは、TRAP、カルシトニン受容体、カテプシンK、CAII、およびMMP-9を含む破骨細胞の最終分化において特異的にアップレギュレートされる遺伝子のプロモーター配列 (Anusaksathien, O. et al. (2001) J Biol Chem 276, 22663-22674; David, J. P. et al. (2001) J Cell Physiol 188, 89-97; Motyckova, G. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98, 5798-5803; Reddy, S. V. et al. (1995) J Bone Miner Res 10, 601-606) をスクリーニングした。すると、これらのプロモーターは全て複数のNFATc1部位を含んでおり、NFATc1はこれらの破骨細胞遺伝子を直接調節することが示唆された。この可能性を調べるため、RANKL刺激に応答することが知られているTRAPプロモーターまたはカルシトニン受容体プロモーター (P3プロモーター) (Anusaksathien, O. et al. (2001) J Biol Chem 276, 22663-22674; Matsumoto, M. et al. (2001) J Biol Chem 276, 33086-33092; Reddy, S. V. et al. (1995) J Bone Miner Res 10, 601-606) により駆動されるルシフェラーゼレポータープラスミドを構築した。
カルシニューリン - NFATc1経路、およびTRAF6経路およびc-Fos経路などの他の既知の必須のシグナル伝達経路の間の関係についてさらに手がかりを得るため、TRAF6またはc-Fos欠失マウス由来のBMMにおけるRANKLが誘導するNFATc1の発現を評価した。NFATc1蛋白質の誘導はc-Fos欠失細胞では完全に阻害され、TRAF6細胞では完全ではなかったものの非常に減少していた。さらにノーザンブロット解析により、TRAF6およびc-Fosの両者が、NFATc1 mRNAの正常な誘導に必須であることが実証された (図15A)。期待したように、NFATc1 mRNAの誘導は全面的にc-Fosに依存していたことから、NFATc1はAP-1の転写標的であることが示唆された。しかしながら、NFATc1の蛋白質発現とは違い、NFATc1 mRNAの誘導はTRAF6欠損BMMでも部分的に観察されたことから、TRAF6によるNFATc1発現の調節は転写レベルおよび転写後レベルの両方で行なわれていることが示唆された (図15B)。このように、調節機構に違いはあるものの、NFATc1はTRAF6経路およびc-Fos経路の両者の下流で誘導されることから、NFATc1は、破骨細胞形成に必須のこれら2つの経路を統合する役割を果たすことが示された。
実施例13〜18で用いたin vitro破骨細胞形成は以下のように行なった。C57BL/6マウス由来の非接着性骨髄細胞 (24ウェルプレート1ウェルあたり 5 x 104 細胞, 10-cmプレートあたり 1.5-2.0 107 細胞) を撒き、10 ng/ml M-CSF (Genzyme) を含む10 % FBS (Sigma) 含有α-MEM (Gibco BRL) 中で培養した。2日後、リンパ球を含む非接着細胞を洗い流した後、接着細胞をBMMとして用いた。BMMはさらに100 ng/ml可溶性RANKL (Peprotech) および10 ng/ml M-CSF存在下で培養し破骨細胞を形成させた。レフルノミドの効果を評価するため、レフルノミドの活性代謝物であるA77 1726 (Aventis Pharma) を、特に別記しない限りRANKLと同時に加えた。3日後、TRAP+の多核 (>3核) 細胞を計数した。全てのデータは平均±s.e. (n=6) で表した。TRAP+ MNCは、以前記載 (Takayanagi, H. et al., Nature 408, 600-5 (2000)) したように、象牙質切片上での骨吸収活性と、カルシトニン受容体の発現を試験した。
レフルノミドが破骨細胞分化に直接作用するのか、そしてもしそうならどのように作用するのかを調べるため、まずM-CSF存在下でRANKL刺激したマウス骨髄単球/マクロファージ (BMM) からのin vitro破骨細胞形成に対するレフルノミドの効果を調べた。図16Aに示したように、レフルノミドは酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ陽性の多核細胞 (TRAP+ MNC) の形成を、用量依存的 (1-100μM) に強く阻害した。これらの濃度では、レフルノミドはBMMの生存および増殖に有意な影響を与えなかった (図16A、17参照; 非提示データ)。また、やはりRANKLに応答して破骨細胞に分化するマクロファージである RAW 264.7のRANKLが誘導する破骨細胞形成においても、同様の阻害効果が観察された (非提示データ)。破骨細胞分化に対するレフルノミドの阻害効果はウリジンの過剰量の添加により回復したことから、この阻害はde novo (新規) のピリミジン生合成の遮断が原因であることが示唆された (図16A、17)。RANKL刺激において、レフルノミドの存在により破骨細胞形成の過程が阻害されるステージを調べた。図16Bに示したように、レフルノミドを初期ステージ、すなわちRANKL刺激の0〜24時間後の間に添加すると、TRAP+ MNCの形成はほぼ完全に阻害されたが、この薬剤をRANKL刺激の48時間後に添加してもそのような阻害は観察されなかった (図16B)。
上記の結果を基に、RANKLにより活性化される細胞内シグナル伝達経路にレフルノミドが干渉する機構を調べた。具体的には、RANKLはその受容体であるRANKへの結合を通して細胞にシグナルを伝達し、TRAF6などのTNF受容体関連因子 (TRAF) ファミリー蛋白質を活性化し、これがNF-κB経路、mitogen-activated protein kinase (MAPK) 経路、およびAkt経路を活性化する (Theill, L.E., Annu Rev Immunol 20, 795-823 (2002); Takayanagi, H. et al., Nature 408, 600-5 (2000); Wong, B.R. et al., Mol Cell 4, 1041-9 (1999); Takayanagi, H. et al., Nature 416, 744-49 (2002))。RANKLはまた、AP-1転写因子複合体において機能しうるc-Fosを誘導する (Takayanagi, H. et al., Nature 416, 744-49 (2002); Matsuo, K. et al., Nat Genet 24, 184-7. (2000); Karsenty, G. & Wagner, E.F., Dev Cell 2, 389-406. (2002))。RANKLは、TRAF6およびc-Fosに依存的な様式で、nuclear factor of activated T cells (NFAT) ファミリーのメンバーであるNFATc1遺伝子を選択的に誘導する。RANKLはまた、Ca2+シグナル伝達を生じさせ、カルシニューリンを介したNFATc1の活性化を起こす。この活性化は破骨細胞分化に必要かつ十分である (実施例1〜11参照)。
レフルノミドの分子標的を同定するため、レフルノミドの存在下または非存在下、BMMにおいてRANKLが誘導する遺伝子のゲノムワイドスクリーニングを行なった。まずレフルノミド (100μM) の存在下または非存在下、BMMをRANKL (100 ng/ml) およびM-CSF (10 ng/ml) で刺激し、24時間後にSepasol RNA extraction kit (Nakarai) を用いてBMMから全RNAを抽出した。全RNA (15μg) を用いて、逆転写によるcDNA合成と、それに続くin vitro転写によるビオチン化cRNA合成を行なった。cRNAを断片化した後、12,000のマウス遺伝子/ESTのプローブがディスプレイされているマウスU74Av2 GeneChip (Affiymetirix) に製造元のプロトコールに従ってハイブリダイゼーションを行なった。チップを洗浄後、SA-PEで染色し、Affymetrix Genechip scannerおよび付属の遺伝子発現ソフトウェアを用いて解析を行なった。
NFATc1、TRAF6、およびc-Fosを含む破骨細胞形成における必須分子の蛋白質発現をさらに解析した。レフルノミドはNFATc1の発現を強く阻害した (図20)。TRAF6およびc-Fosの誘導レベルも、特に後期ステージ (RANKL刺激の3日後) において低下したが、誘導はまだ観察できた。免疫染色でもやはり、レフルノミドの存在下RANKLで刺激したBMMにおけるNFATc1の発現はほとんど検出されないが、同じ条件でc-FosまたはTRAF6の発現は、低いレベルではあったが依然として観察された (図21)。
このように、レフルノミドによるde novoのピリミジン生合成の遮断は、RANKLシグナル伝達に複数のレベルで干渉し、破骨細胞形成に重要な蛋白質であるNFATc1の著しいダウンレギュレーションを引き起こした。そこで、RANKL誘導破骨細胞形成のレフルノミドによる抑制に対する、TRAF6、c-Fos、またはNFATc1の異所発現の効果を、実施例5と同様のレトロウイルスによる遺伝子導入により調べた。
関節炎において、T細胞は骨破壊を引き起こす幾つかの経路に関与している (Choy, E.H. & Panayi, G.S., N Engl J Med 344, 907-16 (2001))。関節炎滑膜では免疫系の異常な活性化によりTNF-αおよびIL-1などのマクロファージ由来の炎症性サイトカインが誘導され、それらは滑膜線維芽細胞でRANKLを強く誘導する (Takayanagi, H. et al., Arthritis Rheum. 43, 259-69 (2000); Takayanagi, H. et al., Nature 408, 600-5 (2000); Takayanagi, H. et al., Biochem Biophys Res Commun 240, 279-86. (1997))。骨関連疾患状態の誘導において、T細胞はこの滑膜炎の開始および増悪に関与している。この経路が重要であることは、これらのサイトカインの中和で関節炎性骨破壊に対して顕著な治療効果が観察されることから明確である (Feldmann, M. & Maini, R.N., Annu Rev Immunol 19, 163-96 (2001); Choy, E.H. & Panayi, G.S., N Engl J Med 344, 907-16 (2001))。さらに、RANKLを発現する活性化T細胞が破骨細胞形成に直接寄与する可能性がある (Kong, Y.Y. et al., Nature 402, 304-9 (1999))。その結果、滑膜線維芽細胞およびT細胞の両方により誘導されるRANKLレベルが、IFN-γまたはオステオプロテジェリン (osteoprotegerin; OPG) などの阻害因子によりカウンターバランスされるにはあまりにも上昇してしまう (Kong, Y.Y. et al., Nature 402, 304-9 (1999); Takayanagi, H. et al., Nature 408, 600-5 (2000))。幾つかの抗リウマチ薬は骨保護効果を持つが (Kremer, J.M., Ann Intern Med 134, 695-706 (2001); Jones, G. et al., Rheumatology (Oxford) 42, 6-13 (2003))、この骨破壊の複雑な機構のためT細胞依存的効果とT細胞非依存的効果とを切り分けることは困難である。そこで本発明者らは、T細胞なしで炎症性骨破壊を誘導するモデルの開発を行なった。
Claims (13)
- インビトロまたは非ヒトの破骨細胞形成を促進または抑制する方法であって、破骨細胞前駆細胞におけるNFATc1の発現をそれぞれ促進または抑制する工程を含む方法。
- インビトロまたは非ヒトの破骨細胞形成を促進する方法であって、破骨細胞前駆細胞にNFATc1発現ベクターを導入する工程を含む方法。
- インビトロまたは非ヒトの破骨細胞形成を抑制する方法であって、破骨細胞前駆細胞におけるNFATc1の発現を抑制する工程を含む方法。
- インビトロまたは非ヒトの破骨細胞形成を抑制する方法であって、破骨細胞前駆細胞にレフルノミドを接触させる工程を含む方法。
- レフルノミドを含むNFATc1発現抑制剤。
- レフルノミドを含む破骨細胞形成抑制剤。
- NFATc1発現ベクターからなる破骨細胞形成促進剤。
- 破骨細胞形成を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるNFATc1の発現または活性を検出する工程、および
(b)該NFATc1の発現レベルまたは活性を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。 - NFATc1の活性が、NFATc1およびAP-1成分との相互作用である、請求項8に記載の方法。
- NFATc1の活性が、NFATc1およびDNAとの相互作用である、請求項8に記載の方法。
- 破骨細胞形成を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検化合物を含む試料の存在下、外来的にNFATc1を発現させた破骨細胞前駆細胞における破骨細胞形成を検出する工程、および
(b)該破骨細胞形成を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。 - 骨減少性疾患の治療のための医薬組成物であって、レフルノミド、および1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 骨減少性疾患が、骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、パジェット病、および骨癌からなる群より選択される疾患である、請求項12に記載の組成物。
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