KR20220061149A - Clec16A 기능장애 또는 손실과 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Clec16A 기능장애 또는 손실과 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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하콘 하코나르손
라훌 팬디
마리나 배케이
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더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
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Abstract

CLEC16A 관련 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

Clec16A 기능장애 또는 손실과 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2019년 9월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/897,983호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 전체적으로 설명된 것처럼 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 자가면역 장애의 유전자 테스트 및 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 발명은 자가면역 장애의 치료에 유용한 스크리닝제에 대한 새로운 표적 및 생화학적 경로를 제공한다.
몇몇 출판물 및 특허 문서들이 본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 기술하기 위하여 명세서를 통해 인용된다. 이들 인용은 각각 전체적으로 제시된 것처럼 참조로 본원에 포함된다.
CLEC16A는 잘 확립된 자가면역 장애 감수성 유전자(susceptibility gene)이며 제1형 당뇨병(type-1 diabetes), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 원발성 부신 기능부전(primary adrenal insufficiency), 크론병(Crohn's disease), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis), 청소년 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 류머티스양 관절염(rheumatoid arthritis), 및 원형 탈모증(alopecia areata)을 포함한 여러 자가면역 질환과 관련되어, CLEC16A가 비정상적인 자가면역 반응의 마스터 조절자일 수 있음을 시사한다. 수많은 자가면역 및 염증성 장애 전반에 걸쳐 CLEC16A의 강력한 연관성에도 불구하고, 질환 발병에서 CLEC16A의 생리적 기능이나 그것의 역할에 대해서 알려진 것은 거의 없다. 몇몇 연구가 자가포식(autophagy) 과정에서 CLEC16A의 역할을 연구하였다. 이전의 연구는 CLEC16A의 손실이 미토파지(mitophagy)의 마스터 조절자인 파킨(Parkin)의 Nrdp1 표적화로 이어지고, 골지체-회합된 CLEC16A는 mTOR 활성의 조절을 통해 자가포식을 음성적으로 조절하는 것을 보였다. 이것이 어떻게 자가면역 기능에 관련되는지는 아직 측정되지 않았다.
제1형 당뇨병에 대한 본 발명자들의 이전의 연구에서, 보호성 CLEC16A 대립유전자가 더 높은 수준의 CLEC16A (이전에는 KIAA0350로서 알려져 있음)와 관련되었다. 본 발명자들은 또한 최근에 CLEC16A의 편재성 손실이 면역 세포에서 파괴된 미토파지를 초래한 것을 보였다.
대다수의 자가면역 및 기타 장애가 CLEC16A 손실 또는 기능장애와 관련된 것을 감안하면, 오작동하는 CLEC16A의 효과를 개선하는 새로운 치료법 및 치료제가 시급히 필요한 것이 분명하다.
본 발명은 전신적인 염증 반응 및 실질적인 중량 손실의 원인이 되는 지방분해 과정을 초래하는 강력한 사이토카인 반응을 포함하여, 지방포식(lipophagy) 및 소포체 (ER) 스트레스의 중요한 조절자로서 CLEC16A를 시사한다. CLEC16A가 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스(lupus) 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)을 포함하여 적어도 16가지의 자가면역 질환과 관련된 주요 자가면역 유전자이기 때문이다.
본 발명에 따르면, 비정상적인 CLEC16A 기능과 관련된 적어도 하나의 자가면역 장애의 치료를 위한 병용 요법이 제공된다. 한 측면으로 CD163, Bcl-2, Pax-5, V-cam1, CD8 및 FoxP3 중 하나 이상의 발현을 조절하는 작용제의 투여, 그로써 흉선의 수질 피질 비율을 변경시키고 흉선의 변성과 관련된 증상을 개선하는 것을 포함하는, 흉선의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, CD163, CD68, Bcl-2, CD40, Pax5, Vcam1, CD3, 및 GzmB 중 하나 이상의 발현을 조절하는 작용제의 투여, 그로써 비장의 백색 적색 펄프 비율을 변경시키고 비장의 변성과 관련된 증상을 개선하는 것을 포함하는, 비장의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법이 제공된다. 발명은 또한 CD163 발현 및/또는 면역 세포 침윤 및/또는 췌장의 선방 세포(acini cell) 변성을 조절하는 작용제의 투여, 그로써 자가면역 증상을 감소시키는 것을 포함하는, 췌장의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법을 개시한다.
상기 주지된 바와 같이, 발명은 미토파지 억제자/조절자, ER 억제자, JAK2 억제제 및 SOCS1 억제제 중 적어도 2가지를 포함할 수 있는 병용 요법을 포함한다. 특정 구체예에서, 작용제는 라파마이신(rapamycin) 및 토파시티닙(tofacitinib)이다. 다른 구체예에서, CLEC16A를 암호화하는 핵산이 대상체로부터 얻어지고 유전자 변경의 존재에 대해 평가된다.
도 1. 시간 경과에 따른 초기 체중으로부터의 퍼센트 체중. 마우스는 연구 중에 주당 3회 체중이 측정되었다.
도 2. Clec16a KO 수컷 및 암컷 마우스는 체지방 및 내장 지방의 완전한 손실을 나타낸다.
도 3. 대조군과 비교되는 KO 마우스의 사료 섭취.
도 4A - 4D. 도 4A) CLEC16A 발현을 나타내는 대표적인 면역블롯. 도 4B) 대조군 및 KO gWAT에서의 ER 스트레스 마커의 mRNA 수준. 도 4C) KO gWAT에서의 ER 스트레스를 나타내는 대표적인 면역블롯. 도 4) 장기 무게 비율.
도 5. 대조군 및 KO 마우스에서의 호르몬 민감성 리파제 (HSL) 인산화.
도 6A - 6C. 도 6A) 대조군 및 KO 마우스의 gWAT로부터의 지질 이화작용 유전자 (Cpt1b, Ppara), 지방생성 유전자 (Pparg 및 Adipoq) 및 열 발생 유전자 (Ucp1 및 Cidea)의 mRNA 발현 및 면역블롯 (도 6B 및 6C).
도 7. Clec16a KO 대비 대조군 마우스 혈청으로부터의 지질 분석 (콜레스테롤, 트라이글리세라이드, 및 유리 지방산).
도 8A - 8D. 도 8A) Clec16a KO 마우스는 대조군에 비교하여 감소된 아디포넥틴, 렙틴, 및 LDL-R을 나타낸다. 도 8B) Clec16a KO 마우스는 대조군 지방과 비교하여 증가된 사이토카인, 케모카인, 성장 인자를 나타낸다. 도 8C) Clec16a KO 마우스는 대조군 지방과 비교하여 증가된 사이토카인, 케모카인, 성장 인자를 나타낸다. 억제제 U0126은 상향 조절을 반전시킨다. 도 8D) Clec16a KO 비장세포에서 IL-16 전구체의 높은 구성성 발현 및 활성 카스파제-3에 의한 생체활성 IL-16의 방출.
도 9. Clec16a KO 비장세포에서의 SOCS1 및 SOCS3의 감소된 발현.
도 10A - 10I. 토파시티닙, pan JAK/STAT 억제제는 지방이영양성 표현형을 부분적으로 구제하고 UBC-Cre-Clec16aloxP KO 마우스의 생존율을 개선시킨다. 대조군, KO ± 토파시티닙 마우스에서의 RT-PCR에 의한 SOCS1 (도 10G) 및 SOCS3 (도 10H) 발현. (도 10I) Clec16a KO에서 우세한 Th-1 사이토카인/케모카인 및 토파시티닙으로의 구제. 대표적인 그래프는 마우스 사이토카인 어레이 패널을 사용하는, 대조군 (비히클), KO 및 KO+토파시티닙 억제제 처리된 마우스의 혈장으로부터의 사이토카인 및 케모카인의 정량화 그래프이다.
도 11. 라파마이신은 지방이영양성 표현형을 약화시키고 KO 마우스 생존율을 개선시킨다.
도 12. ANA-9 라인 면역블롯 검정. 레인 1 양성 대조군은 모든 항원을 보여준다. 레인 2 및 3은 대조군 마우스로부터의 혈청으로 프로빙된다; 레인 4-8은 Clec16a KO 마우스의 혈청으로 프로빙된다.
도 13. 혈청 면역글로불린 아이소타이핑. 대조군 및 KO 마우스 혈청 (n=10)으로 혈청 면역글로불린 아이소타입, 아이소타입 및 IgG 하위부류에서의 변화를 평가하기 위해 ELISA가 수행되었다.
도 14. Clec16a 녹아웃은 마우스에서의 무능력을 유도한다. KO 마우스는 조절에 장애가 있는 미토파지로 인해 등근 신경절에서 비정상적인 뉴런을 나타낸다. 척수 후색의 염증 및 소뇌 푸르키네 세포(Purkinje cell)의 손실이 있는 활성화된 미세아교세포가 분명히 나타난다.
도 15. Clec16a KO DRG, TG는 RT-PCR 및 면역블롯 분석에 의해 나타낸 조절에 장애가 있는 ER 스트레스 및 OXPHOS 신호전달을 나타낸다.
도 16A - 16E. (도 16A) CLEC16A 면역침전 풀 다운 및 블롯. (도 16B) MSMS에 대한 겔 이미지. (도 16C) Clec16a와 상호작용하는 상위 10개의 예측된 후보 파트너. (도 16D) 신경계 조직에서 구성적으로 상승된 ISG15를 나타내는 면역블롯 블롯. (도 16E) ISGlyation으로서 언급된 ISG15를 통한 단백질의 변형을 나타내는 모델. USP43이 반전을 매개한다.
도 17A - 17B. (도 17A) 대조군 및 CLEC16A KO 마우스에서의 적색 및 백색 펄프 비율의 비교. (도 17B) KO 및 야생형 마우스의 비장의 변화를 정량화하는 그래프.
도 18A - 18B. (도 18A) 대조군 및 CLEC16A KO 마우스에서의 피질 및 수질 비율의 비교. (도 18B) KO 및 야생형 마우스의 흉선의 변화를 정량화하는 그래프.
도 19. 야생형 및 CLEC16A KO 마우스에서의 면역 세포 침윤 및 선방 세포 변성의 변화를 보여주는 면역조직화학.
도 20. Clec16a KO의 유도 후 23일 째에 대조군 마우스와 KO 마우스 사이의 다양한 세포 마커의 상대적인 배수 변화를 보여주는 그래프.
도 21. 흉선에서 CD163의 상당한 상향 조절 및 비장에서 CD163 및 CD68의 상향 조절을 보여주는 그래프.
도 22는 인큐베이션 과정 중에 흉선에서의 Bcl-2는 상향 조절되는 한편 18일 째에 Bcl-2는 상승되는 것을 나타낸 그래프도.
도 23은 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 CD40의 발현 변화를 정량화한 그래프를 도시한다.
도 24는 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 Pax5, 및 CD19의 발현 변화를 정량화한 그래프를 도시한다.
도 25는 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 Icam1, 및 Vcam1의 발현 변화를 정량화한 그래프를 도시한다.
도 26은 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 CD3의 발현 변화를 정량화한 그래프를 도시한다.
도 27은 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 CD8, 및 GzmB의 발현 변화를 정량화한 그래프를 도시한다.
도 28은 KO 유도 중에 흉선 및 비장에서 FoxP3의 발현 변화를 정량화한 그래프이다.
최근의 연구는 CLEC16A가 자가포식/미토파지의 중요한 조절자인 것을 드러냈다. 그것과 여러 자가면역 장애와의 연관성을 감안하여, 본 발명자들은 유도성 전체 녹아웃 (KO), Clec16a DUBC 마우스를 생성하여 그것의 자가면역에서의 역할을 조사하였다. KO 마우스는 면역 기능장애, 지방분해를 통한 심각한 체중 손실, 및 시간 경과에 따라 사망률로 이어지는 중증도가 증가하는 뉴론성 표현형을 나타냈다. 이전에 관찰된 것과 같이, CLED16A의 약화는 자가포식, 미토파지를 파괴하고 신경변성을 유발하였다. 대조군 마우스와 비교하여 KO 마우스에서 소뇌, 피질, 삼차 신경절, 등근 신경절, 및 척수에서의 가속화된 미토파지가 관찰되었다.
ER 스트레스 및 미토콘드리아 기능장애는 증가된 산화성 스트레스 및 다중 전염증 매개체의 생성을 초래한다. 조절에 장애가 있는 OXPHOS 신호전달은 Clec16a DUBC KO 마우스의 DRG 및 비장세포 용해물에서 관찰되었다. KO 마우스는 또한 염증성 사이토카인/케모카인 프로파일을 나타냈다. KO는 혈청에서 IgM, IgA, Ig2b, IgG3 및 자가항체를 포함한, 상승된 항체 수준을 나타냈다.
JAK/STAT 억제제 (토파시티닙)로의 치료가 지방이영양성 표현형을 부분적으로 구제하고 생존율을 개선시킨 한편, 그것은 뉴런 조직에서 자가포식만을 구제하였고 뉴런성 표현형을 변경시키지 않았다. 뉴런 조직의 STAT 단백질은 미처리 Clec16a DUBC KO 마우스와 비교하여 토파시티닙-치료로 유의한 변화를 보이지 않았다. 이것은 JAK/STAT/SOC1 신호전달과 관련된 음성 피드백 루프에 기인한 것일 수 있다.
본 발명자들의 데이터는 감소된 CLEC16A 수준과 관련된 CLEC16A의 기능 변이체의 손실이 상승된 ER 스트레스를 통해 자가면역에 기여할 수 있어서 조절에 장애가 있는 미토파지 및 자가포식을 초래하고, 그것은 지방 지방분해 및 염증 매개체의 생성에 기여하는 것을 나타낸다. ER 스트레스, 미토파지/ 자가포식 또는 JAK/STAT 경로를 조절하는 약물이 과정을 부분적으로 반전시키고 위험 관련 CLEC16A 변이체를 가진 개체에서 자가면역 장애의 증상을 치료하고 예방하는 데 효과적일 수 있다. 그러한 약물의 조합이 이것에 최적일 수 있다.
Clec16a KO 마우스는 증가된 사료 소비 및 고혈당의 증거 없이, 지방 조직의 손실, 심각한 체중 손실, 상승된 면역글로불린 및 상당히 감소된 순환 인슐린 수준을 나타냈다. 대사 분석은 지질 프로파일 측정의 방해를 드러냈다. 백색 지방 조직은 증강된 염증 반응 및 에너지 소비와 동시에 감소하였다. CLEC16A의 손실은 자가포식성 손상 및 소포체 (ER) 스트레스의 악순환으로 이어져서, 과도한 지방분해 및 지방독성에 기여하여 손상된 미토파지 환경 하에서 JAK/STAT, mTOR, P38 및 JNK의 활성화 및 다중 전염증 매개체의 방출을 유발한다. ER 스트레스는 지방분해 캐스케이드를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 비정상적인 또는 과도한 사이토카인 생성은 자가면역 및 자가염증성 장애를 구동시키는 데 핵심 역할을 한다. 종합적으로, 본 발명자들의 데이터는 CLEC16A의 손실이 ER 스트레스, 조절에 장애가 있는 자가포식 및 미토파지를 유도하여, 결국 지방분해 캐스케이드를 활성화하여 지질 매개체를 생성하고 JNK/NF-kB 신호전달 경로의 활성화를 통하여 염증을 촉발시키는 과도한 지방세포 지방분해를 초래하는 것을 나타낸다.
그러므로, CLEC16A는 ER 스트레스의 조절, SOCS 발현 및 사이토카인 신호전달의 조절을 통해 광범위한 면역 세포에 그것의 효과를 발휘하며, 이것은 CLEC16A, ER 스트레스, 미토파지, 지방포식, 및 SOCS1 사이의 분자 연결의 작은 변화가 염증성 및 자가면역 장애의 기저를 이룰 수 있음을 시사한다. CLEC16A 기능저하를 초래하는 변이체를 지닌, 자가면역 질환을 가진 환자에서, ER 스트레스/미토파지/자가포식/SOCS1-JAK-STAT 신호전달에 미치는 조절 효과를 가진 약물은 약화된 CLEC16A 활성을 상쇄할 수 있고 표적 개입을 위해 개발될 수 있을 것이다. 본 발명자들의 Clec16a KO는 중량 조절, 뿐만 아니라 돌연변이-매개 병태생리학을 포함한, 정상적인 생리에서 Clec16a의 다면적인 역할을 강조한다.
정의
본 발명의 목적에 대해, 단수의 실체는 하나 이상의 그 실체를 나타낸다; 예를 들어, "cDNA"는 하나 이상의 cDNA 또는 적어도 하나의 cDNA를 나타낸다. 그와 같이, "하나"를 지칭하거나, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 용어 "포함하는", "포함한", 및 "가지는"은 상호교환적으로 사용될 수 있는 것이 주지된다. 나아가, "으로 이루어지는 군으로부터 선택된" 화합물은 둘 이상의 화합물의 혼합물 (즉 조합)을 포함하여, 뒤따르는 목록에서 하나 이상의 화합물을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 분리된, 또는 생물학적으로 순수한 분자는 그것의 자연적인 환경으로부터 제거된 화합물이다. 그와 같이, "분리된" 및 "생물학적으로 순수한"은 반드시 화합물이 정제된 정도를 반영하지는 않는다. 본 발명의 분리된 화합물은 그것의 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있거나, 실험실 합성 기법을 사용하여 제조될 수 있거나 또는 임의의 그러한 화학적 합성 경로에 의해 제조될 수 있다.
"특정 결합쌍"은 서로에 대해 특정 특이성을 가지며 정상적인 조건에서 다른 분자보다 우선적으로 서로에 결합하는 특정 결합 구성원 (sbm) 및 결합 파트너 (bp)를 포함한다. 특정 결합쌍의 예는 항원과 항체, 리간드와 수용체 및 상보적인 뉴클레오타이드 서열이다. 숙련된 사람은 많은 다른 예를 알고 있다. 추가로, 용어 "특정 결합쌍"은 또한 특정 결합 구성원과 결합 파트너의 어느 한 쪽 또는 양쪽이 모두 큰 분자의 일부를 포함하는 경우에도 적용할 수 있다. 특정 결합쌍이 핵산 서열을 포함하는 구체예에서, 그것들은 검정 조건 하에서 서로에게 혼성화하는 길이, 바람직하게 10개 뉴클레오타이드 길이보다 큰, 보다 바람직하게 15 또는 20개 뉴클레오타이드 길이보다 큰 길이를 가질 것이다.
"CLEC16A 관련된 면역 장애로는, 제한 없이, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 원발성 부신 기능부전, 크론병, 원발성 담즙성 간경변증, 청소년 특발성 관절염, 류머티스양 관절염, 및 원형 탈모증, 포도막염, 및 루푸스를 들 수 있다.
"샘플" 또는 "환자 샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 일반적으로 특정 분자, 바람직하게 ADHD 특이적 마커 분자, 예컨대 하기에서 기술되는 마커에 대해 테스트될 수 있는 샘플을 나타낸다. 샘플은 한정하는 것은 아니지만, 세포, 체액, 이를테면 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 소변, 타액, 눈물, 흉강액 등을 들 수 있다.
용어 "작용제" 및 "화합물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 박테리아, 식물, 진균, 또는 동물 (특히 포유류) 세포 또는 조직과 같은 생물학적 재료로부터 만들어진 추출물을 나타낸다. 생물학적 거대분자는 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 펩타이드/DNA 복합체, 및 본원에 기술된 CNV 또는 SNP-함유 핵산의 활성을 조절하는 능력을 나타내는 임의의 핵산 기반 분자 또는 그것들의 암호화된 단백질을 포함한다. 작용제 및 화합물은 또한 하기에서 본원에 기술된 스크리닝 검정에 포함됨으로써 잠재적 생물학적 활성에 대해 평가될 수 있는 "테스트 작용제" 또는 "테스트 화합물"로도 언급될 수 있다.
JAK 경로의 억제제가 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 이것들로는 제한 없이 하기에서 제시된 것들을 들 수 있다.
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본원에서 사용되는 용어 "조절하는"은 본원에 기술된 CLEC16A 분자의 정상적인 활성과 관련된 특정 세포, 생물학적 또는 신호전달 기능을 증가/촉진 또는 감소/억제하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 용어 조절하는은 신호전달 또는 활성을 간섭하거나, 본 발명의 유전자 또는 단백질의 활성을 촉진하는 테스트 화합물 또는 테스트 작용제의 능력을 나타낸다.
V. 제약학적 및 펩타이드 치료법
염증성 신호전달에서 본원에 기술된 CLEC16A에 의해 나타난 역할의 설명은 비정상적인 CLEC16A 기능과 관련된 자가면역 장애의 치료 및 진단에 유용한 제약학적 조성물의 개발을 촉진시킨다. 이들 조성물은, 상기 물질 중 하나 외에, 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 기타 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 본질은 투여 경로, 예컨대 경구, 정맥내, 피부의 또는 피하, 비강, 근육내, 복강내 경로에 따라 달라질 수 있다.
개체에게 투여되어야 할 것이 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 항체, 펩타이드, 핵산 분자, 소분자 또는 기타 제약학적으로 유용한 화합물이거나 간에, 투여는 바람직하게 "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량" (경우에 따라, 예방이 치료법으로 간주될 수 있음)이고, 이것은 개체에게 유익을 나타내기에 충분하다.
상기 논의된 것과 같이 비정상적인 CLEC16A 기능과 관련된 적어도 하나의 자가면역 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 조합은 미토파지 억제자/조절자, ER 억제자, JAK2 억제제 및 SOCS1 억제제 중 적어도 2가지를 포함한다. JAK-Stat 경로의 억제제가 또한 본 발명에서 사용될 것이다. 그러한 억제제는 기술분야에 알려져 있고 siRNA 분자, 펩타이드 모방체 및 상기에서 열거된 것과 같은 소분자를 포함한다.
다음의 실시예는 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해 제공된다. 그것들은 어떠한 방식으로든 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 I
UBC-Cre- Clec16a loxP 표현형 마우스를 통해 모델화된 자가면역에서 치료제로서 CLEC16A 및 SOCS1의 역할
본 발명자들의 Clec16a KO 마우스 모델은 미토콘드리아 결함 및 건강하지 못한 미토콘드리아의 축적을 보인다. 본 발명자들의 실험실 및 다른 실험실은 면역학적 및 신경 세포에서 Clec16a와 자가포식 사이의 관련성을 보였다 (Redmann et al., 2016; Soleimanpour et al., 2014; Tam et al., 2017). 정규 차우 식단이 공급된 대조군 및 Clec16a KO 마우스에서 본 발명자들이 이룬 첫 번째 가시적인 관찰은 체중의 차이였다. Clec16a 녹아웃 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 타목시펜(tamoxifen) 치료를 시작한 후 1주 후부터 시작하여 상당한 체중 손실 및 지방 위축을 나타낸다 (도 1, 2). KO 마우스에서 증가된 사료 섭취는 체중 손실 및 지방 조직 위축을 구제하지 못한 것으로 관찰되었다 (도 3). 본 발명자들의 실험실에서 연장된 작업은 CLEC16A의 감소된 발현이 지방에서 ER 항상성의 조절장애로 이어지고 자가포식의 억제에 대한 반응으로 지방분해 캐스케이드를 유도하는 것을 보여준다 (도 4). 본 발명자들은 Clec16a KO 마우스에서 관찰된 극심한 체중 손실이 웨스턴 블롯에서 지방의 완전한 손실 및 호르몬 민감성 리파제 (HSL) 단백질의 증가된 인산화에 의해 관찰된 지방분해 (지방포식)로 인한 것임을 보여준다 (도 5). mRNA 발현 및 면역블롯 분석은 지방 조직에서 HSL-매개된 지방분해를 촉진하는 하류 지방생성 유전자의 하향 조절과 함께 이화작용 및 열발생 유전자의 상향 조절을 드러냈다 (도 6). 혈청 지질 분석은 콜레스테롤, 트라이글리세라이드 및 유리 지방산의 상당한 감소 (도 7) 및 지방 조직에서 감소된 아디포넥틴, 렙틴 및 상향 조절된 LDL-수용체 (도 8A)를 나타냈다. 정상적인 지방 조직 성장 및 기능은 대사 항상성을 유지하는 데 중요하고 그것의 과잉 (예컨대 비만) 또는 부재 (예컨대 지방이영양증)는 심각한 대사성 질환과 관련된다. 더불어, 단백체 프로파일러 마우스 XL 사이토카인 어레이에 의해 측정되는 바 상승된 사이토카인 수준은 지방분해와 동시에 관찰되었고 마우스에서 관찰된 추가의 소모 및 척수소뇌 운동실조와 닮은 점진적인 신경퇴행에 기여할 수 있었다 (도 8). SOCS 단백질 및 JAK/STAT 경로 (도 9,10)와 자가면역 염증성 표현형 (도 12,13) 및 척수소뇌 운동실조 (도 14), 신경 조직에서 상승된 ER 스트레스 (도 15), OXPHOS 신호전달 조절 장애 (도 15)와의 연결에 대한 증거가 각각 제시된다. Clec16a는 특정 경우에 Clec16a 과다발현 NK 세포주를 사용하여 MSMS에 의해 확인된 ISG15를 통하여 병원성 효과를 매개한다 (도 16). 그러므로 본 발명자들의 전신 유도성 Clec16a KO 마우스는 건강한 형태의 체중 손실, 자가면역-염증성 표현형 및 척수소뇌 변성에 연루된 메커니즘 및 약물 표적의 향후 설명에 사용하기 위한 포괄적인 쥐과 모델을 제공한다.
Clec16a KO 마우스는 심각한 체중 손실을 나타낸다.
본 발명자들은 자가면역에서 CELC16A의 역할을 연구하기 위해 유도성 KO 모델인 UBC-Cre- Clec16aloxP 마우스를 사용하였다. 본 발명자들은 성체 마우스에서 가능한 태아 치사율을 피하고 CLEC16A 손실의 효과를 측정하기 이하여 이 모델을 선택하였다. 정규 차우 식단이 공급된 대조군 및 Clec16a KO 마우스에서 본 발명자들이 이룬 첫 번째 가시적인 관찰은 체중의 차이였다. Clec16a 녹아웃 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 타목시펜 치료를 시작한 후 1주 후부터 시작하여 심각한 체중 손실을 나타낸다. 동일한 기간 중에 대조군 마우스는 Clec16a KO와 비교하여 연구 전반에 겅쳐 건강한 외관을 보였고 그들의 체중을 유지하였다 (도 1).
Clec16a KO 마우스는 지방 조직 위축을 나타낸다.
모든 Clec16a KO는 연구 기간 동안 신경계 증상의 중증도가 증가되면서 악화된 상당한 체중 감소, 및 증가된 이환율을 나타냈다 (도 1). 문헌에 따르면 T1D 발병, MS 및 기타 자가면역 장애의 경우 성별 차이가 존재하지 않는다. 질환 발생률은 여성에서 약 60-80%이고 남성에서 20-30%이다. 건강한 검사를 목적으로, 그리고 체중 손실의 원인을 측정하기 위하여, Clec16a KO 및 대조군 마우스를 해부하였다. 대조군 마우스와 비교하여, 수컷 및 암컷 Clec16a KO 마우스는 둘 다 전형적인 생식선 지방 조직의 거의 완전한 부재로 묘사되었다 (도 2). 추가의 검사는 생식선, 서혜부, 장간막, 후복막, 회음부, 및 심낭을 포함한, 모든 WAT 데포가 Clec16a KO 마우스에서 현저하게 감소되었거나 없는 것을 나타냈다 (도 2). 그러므로, Clec16a 손실은 체중 감소 및 지방이영양증을 가진 포유류 모델에서 관찰되고 성체 마우스에서 WAT 침착에 뚜렷한 효과를 나타낸 것과 유사한 표현형인, 지방 조직의 지방이영양증으로 이어지는 지방 손실을 촉진한다. 이들 결과는 Clec16a KO가 지질 대사를 조절하고 아마도 지방분해 (지방포식)에 의해 매개된 비정상적인 지방 손실을 촉발시키는 것을 시사한다.
UBC-Cre-Clec16aloxP KO 마우스는 증가된 사료 섭취를 나타낸다.
본 발명자들은 중증 체중 손실 배후의 가능한 이유로서 소비된 사료의 양을 배제하기 위하여 사료 섭취 연구를 수행하였다. Clec16a KO 마우스는 대조군 마우스에 비교하여 훨씬 더 또는 더 많은 사료를 소비하였다. 그러므로, 더 적은 사료 소비는 Clec16a KO 마우스의 체중 손실 배후의 이유가 아니다 (도 3). 증가된 사료 소비에도 불구하고 Clec16a KO 마우스는 계속해서 빠르게 체중이 감소하였다. 이들 결과는 CLEC16A가 보관 중에 감소된 효율 또는 증가된 에너지 소비에 의해, 또는 CLEC16A KO 마우스에서 둘 다에 의해 지방 손실을 조절하는 것을 시사한다.
ER 스트레스는 CLEC16A 녹아웃 마우스에서 지방 조직 위축에 기여한다.
본 발명자들은 웨스턴 블롯에 의해 TAM 처리된 (KO) 마우스로부터의 생식선 백색 지방 조직 gWAT, 비장세포, 흉선 및 췌장에서 CLEC16A 단백질의 감소된 발현을 확인하였다 (도 4A). 본 발명자들은 CLEC16A의 감소된 발현이 지방 조직에서 ER 항상성의 조절장애로 이어지고 자가포식의 억제에 대한 반응으로 지방분해 캐스케이드를 유도한다고 가설을 세웠다. CLEC16A KO가 ER 스트레스를 유도했는지를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 RT-PCR (도 4B) 및 면역블롯 분석 (도 4C)에 의해 ER 스트레스에 대한 gWAT를 조사하였다. 예상했던 것과 같이, ER 스트레스 마커 유전자 (GRP78, ATF6, IRE1a, XBP1 및 CHOP)는 KO 마우스에서 mRNA 수준에서 상당한 상향 조절을 보였다 (도 4B). 면역블롯 분석은 추가로 상기 발견을 확인시켜주었다. KO 마우스의 gWAT 용해물은 거의 검출 가능하지 않은 포스포-IRE1a로 상당한 상향 조절 GRP78, ATF6, XBP1 및 CHOP를 보였다 (도 4C). 본 발명자들은 또한 gWAT 용해물에서 자가포식소체 마커 LC3-I/II 및 P62의 발현을 조사하였다. Clec16a KO gWAT는 대조군과 비교하여 P62의 상당한 증가 및 축적 및 LC3-11 발현의 적당한 증가를 보였다. 본 발명자들의 결과는 지방 손실이 대조군 및 KO 마우스에서 장기의 중량에 불리한 영향을 나타내지 않는 것을 보여준다 (도 4D). 그러므로, 지방에서 Clec16a 손실은 결함이 있는 자가포식 플럭스에 대한 반응으로 ER 스트레스를 촉진한다. ER 스트레스는 지방분해 캐스케이드 하류를 활성화하여 지방 조직 염증을 통해 체중 감소를 초래하여 심각한 일반화된 지방이영양증 및 모든 WAT 침착에 대한 현저한 영향으로 이어질 가능성이 있다.
Clec16a KO는 가속화된 HSL 매개 지방분해에 의해 비정상적인 지방 손실을 유발한다.
CLEC16A KO에서 근본적인 지방 손실을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 면역블롯 분석을 사용하여 지방분해 (지방포식)를 유도하는 데 CLEC16A의 역할을 평가하였다. HSL (호르몬-민감성 리파제)은 비-지방세포뿐만 아니라 지방세포에서 지방산을 동원하는 핵심 효소이다. 트라이아실글리세롤은 지질 방울에 일차 에너지 비축으로서 저장된다. 지방분해 중에, 지방세포에서 트라이아실글리세롤은 유리 지방산 및 글리세롤로 가수분해된다. Ser563, Ser659, 및 Ser660에서 PKA에 의한 HSL의 인산화는 HSL 활성을 자극하고, 결국 트라이아실글리세롤의 가수분해를 촉매한다. 본 발명자들은 베타-3-아드레날린 수용체 (β3-AR)를 나타내는 HSL의 증가된 인산화가 지방분해를 유도한 것을 발견하였다 (도 5). 본 발명자들의 결과는 CLEC16A가 지방 조직에서 지방분해를 제한하는 기능을 하고 CLEC16A의 손실이 지방분해를 촉발시키는 것을 나타낸다.
CLEC16A가 에너지 소비에 미치는 그것의 효과를 매개하여 심각한 지방 및 체중 손실을 유도하게 되는 메커니즘(들)에 대한 통찰력을 얻기 위하여, 본 발명자들은 RT-PCR에 의하여 Clec16a KO 마우스의 gWAT의 지질 대사를 조절하는 (≤10% 체중 손실) 핵신 유전자의 발현을 측정하였다. 실제로 ≥20% 체중 손실을 나타내는 마우스에서는 분석할 지방이 남아 있지 않았다. 본 발명자들은 지방 조직 지방산 산화에 필수적인 유전자인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 1b (Cpt1b)가 상류 전사 인자인 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 알파 (Pparα)와 함께 CLEC16A KO gWAT에서 상당히 상향 조절된 것을 발견하였다. 추가로, 지방생성 유전자, Ppar-α 및 그것의 하류 표적인 아디포넥틴 전구체 (Adipoq)의 발현은 Clec16a KO gWAT에서 상당히 감소하였다. 터모제닌 (Ucp1)을 포함한 열발생 유전자, 및 세포 사멸-유도 DFFA-유사 이펙터 A (Cidea) 유전자가 Clec16a KO 마우스의 WAT에서 상당히 상향 조절되었다 (도 6A). 중요하게, 단백질 발현은 또한 Clec16a KO 마우스의 gWAT에서 상향 조절된 mRNA 발현과 상관이 있었다. 면역블롯 분석은 CPTB1, PPAR-α, UCP- 1, CIDEA의 발현에서 상당한 상향 조절을 나타냈고 PPAR-γ 및 ADIPOQ의 발현에서 상당한 하향 조절을 나타냈다 (도 6B, C). 그러므로, Clec16a KO 마우스에서 지방 손실은 HSL-매개 지방분해를 촉진하는 지방생성 유전자의 하향 조절과 함께 이화작용 및 열발생 유전자의 상향 조절을 통해 매개된다. KO 마우스에서 증가된 사료 섭취는 백색 지방 위축을 구제하지 못한다.
지방분해는 세포 지질 방울에 저장된 트라이아실글리세롤의 이화작용으로서 정의된다. 지방분해 생성물 및 중간체가 세포의 신호전달 과정에 참여하고 특히 많은 비-지방 조직에 중요하다는 새로운 발견은 인간 질환에 관련이 있을 수 있을, 지방분해의 이전에 저평가된 측면의 진상을 밝혀준다. 정상적인 지방 조직 성장 및 기능은 대사 항상성을 유지하는 데 중요하고 그것의 과잉 (예컨대 비만) 또는 부재 (예컨대 지방이영양증)는 심각한 대사성 질환과 관련이 있다. 감소된 트라이글리세라이드 저장은 지방세포 지방독성, 미토콘드리아 기능부전 및 증가된 산화 스트레스로 이어진다. 이것은 손상된 인슐린 민감성 및 조기 합병증으로 이어지는 언급된 간, 근육 및 심장 기능에 기여한다.
Clec16a KO 및 대조군 마우스의 혈청 지질 분석.
비교를 위해, 본 발명자들은 KO 마우스를 두 그룹, ≤10% 체중 손실의 Clec16a KO 마우스 및 ≥20% 체중 손실의 Clec16a KO 마우스으로 나누었는데, 후자의 그룹에서는 마우스에 실제로 지방이 남아 있지 않았기 때문이다. 본 발명자들은 대조군 및 Clec16a KO 마우스의 혈청에 대해 지질 분석을 수행하였다. 대조군과 비교하여 Clec16a KO 마우스의 혈청에서 콜레스테롤, 트라이글리세라이드 및 유리 지방산의 상당한 감소가 관찰되었다 (도 6). 이들 결과는 제어된 Clec16a 발현이 보다 건강한 형태의 체중 손실을 촉진하는 데 치료적으로 잠재력이 있을 수 있음을 시사한다.
KO 마우스는 지방 조직 및 혈장에서 증가된 사이토카인 수준을 나타낸다.
Clec16a KO, 체중 손실 및 지방분해가 어떻게 쥐과 지방 조직에서 동적 면역 반응을 촉진하고 질환 발병에 기여할 수 있는지에 대한 통찰력을 얻기 위하여, 본 발명자들은 단백체 프로파일러 마우스 XL 사이토카인 어레이에서 대조군 및 Clec16a KO 마우스의 지방 조직 및 혈장을 평가하였다. 단백체 프로파일러 마우스 XL 사이토카인 어레이 키트는 막-기반 샌드위치 면역검정으로 선택된 마우스 사이토카인 및 케모카인의 상대적인 수준의 측정을 가능하게 한다. 지방 조직으로부터의 아디포넥틴 및 렙틴은 에너지 항상성 및 대사에서 핵심 역할을 한다. Clec16a KO 마우스는 대조군에 비교하여 감소된 아디포넥틴, 렙틴 및 LDL-R을 나타낸다 (도 8A). 더불어, 본 발명자들은 여러 자가면역 장애와 관련된 Clec16a KO 마우스의 지방 조직에서 여러 사이토카인, 케모카인 및 염증성 마커의 상향 조절을 보았다 (도 8B, C). 본 발명자들의 결과는 신호가 조절에 장애가 있는 지방분해 (지방 조직)로부터 기원하고 소비를 촉진하는 것을 나타낸다.
다양한 자가면역 질환의 발생, 진전 및 발병에 관여하는 염증성 메커니즘에서 통찰력을 얻기 위하여, 본 발명자들은 마우스 사이토카인 어레이 패널을 사용하여 사이토카인 및 케모카인에 대해 대조군, KO 및 U0126-처리된 KO 마우스로부터 혈장을 프로파일링하였다. Clec16a KO 마우스로부터의 혈장은 대조군과 비교하여 저수준의 Th2 (IL-10 & IL-13) 및 상승된 수준의 핵심 케모카인 GM-CSF, KC (CXCL1) JE (MCP-1), MCP-5, MIG (CXCL9), MIP-1b (CCL4) 대비 Th1 사이토카인 (TNF-α, IL-1, & IL-16)의 상향 조절을 나타냈다 (도 8D).
U0126 억제제 치료는 모든 상향 조절된 사이토카인 및 케모카인을 반전시켰고, 이것은 자가면역 위험이 포함된 염증 메커니즘이 조절에 장애가 있는 미토파지에 의해 매개되고 미토파지 억제제에 의해 교정될 수 있음을 시사한다 (도 8C). 본 발명자들의 결과는 조절에 장애가 있는 지방분해의 역할을 지지하는 중요한 결과를 제공하고 Clec16a 손실은 그래프에 도시된 것과 같이 자가면역의 진행으로 이어진다 (도 8B-C). 혈장 사이토카인 수준의 IL-16의 증가는 Clec16a KO 마우스에서 볼 수 있는 신경학적 변성에 기여할 수 있다 (도 8C). 본 발명자들의 면역블롯 분석은 Clec16a KO 비장세포에서 IL-16 전구체 및 생체활성 IL-16의 구성적으로 높은 발현이 추가로 사이토카인 매개된 신경변성의 역할을 지지하는 것을 나타낸다 (도 8D). 사이토카인 IL-16은 CD4+ Th1 세포를 향해 편향된 CD4+T 세포-특이적 화학유인물질이다. IL-16 전구체는 림프구에서 및 CD4+ T 세포 활성화 중에 구성적으로 발현되고; 활성 카스파제-3은 C-말단 생체활성 IL-16을 절단하고 방출한다. 증가된 사이토카인과 신경변성 사이의 연관성은 알려져 있다 (Khaibullin et al., 2017). 또한 CLEC16A MS 위험 대립유전자의 존재는 조절 요소를 통해 흉선에서 감소된 SOCS1 및 DE DEXI 발현과 상관이 있는 것으로 알려져 있다 (Leikfoss et al., 2013).
SOCS 단백질 발현은 UBC-Cre-Clec16aloxP KO 마우스에서 감소된다.
관찰된 내장 및 피하 지방의 손실, 및 사료 섭취 연구를 토대로, 본 발명자들의 편재성 Clec16a KO 마우스는 지방이영양증에서 관찰된 것과 유사한 표현형을 나타낸다. 조절에 장애가 있는 지방분해는 지방독성, 미토콘드리아 기능장애 및 증가된 산화 스트레스에 기여하여 염증 매개체의 생성을 초래한다. 사이토카인 신호전달의 억제자 1 (SOCS1) 유전자 옆의 CLEC16의 게놈 위치 및 여러 자가면역 장애의 발병에 중추적인 수지상 세포, B 및 T-림프구 및 천연 살해 (NK) 세포를 포함한 면역 세포에서의 발현 특이성으로 인해, 본 발명자들은 CLEC16A가 SOCS 발현을 조절하고 JAK-STAT 매개 사이토카인 신호전달을 조절하는 것을 통해 광범위한 면역 세포에 그것의 영향력을 발휘한다고 가설을 세웠다. SOCS (사이토카인 신호전달의 억제자) 패밀리 구성원은 Jak/Stat 경로를 억제하는 사이토카인 신호 변환의 음성 조절자이다. 이들 단백질은 사이토카인 신호전달, 증식, 분화, 및 면역 반응의 중요한 조절자이고 인터류킨, 성장 호르몬 (GH), 인터페론, 렙틴, 및 백혈병 억제 인자를 포함한, 30개를 넘는 사이토카인을 조절하는 데 관여한다. SOCS1은 SOCS3과 가장 큰 상동성을 공유하며 사이토카인에 의해 고도로 유도된다. SOCS1 및 SOCS3은 둘 다 Jak 활성을 직접적으로 억제한다. Jak (야누스 키나제) 및 Stat (신호 변환자 및 전사 활성자) 단백질은 염증성 면역 반응에 중요한 역할을 하고 (Fenner et al., 2006), 따라서, Jak/Stat 신호전달의 조절은 질환 진행으로 이어질 수 있는 비정상적인 신호전달을 방지하는 데 결정적이다.
염증성 사이토카인 폭풍에 포함된 메커니즘을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 SOCS1 및 SOCS3 발현 수준을 면역블롯 분석으로 조사하였다. Clec16a KO로부터의 비장세포는 대조군과 비교하여 감소된 SOCS1 및 SOCS3 발현을 나타낸다 (도 9). 감소된 SOCS 단백질 수준으로, 사이토카인 생성은 억제되지 않아 Clec16a KO 마우스에서 관찰된 염증, 부수적인 지방분해 및 신경변성에 기여하는 증가된 사이토카인 수준을 초래한다. 본 발명자들의 데이터에 비춰볼 때, 그리고 Clec16a와 여러 자가면역 장애와의 연관성을 감안하여, 본 발명자들은 CLEC16A, 지방포식, 및 SOCS 사이의 분자상의 관련이 비정상적이어서 자가면역 장애로 이어진다고 가설을 세웠다.
pan JAK 억제제 토파시티닙은 SOCS1-JAK-STAT 매개 사이토카인 신호전달을 억제하고 Clec16a KO 마우스의 생존력을 개선한다.
상기 발견 및 CLEC16A와 여러 자가면역 장애와의 확립된 관련성에 비추어, 본 발명자들은 Clec16a KO 마우스에서 관찰된 상향 조절된 JAK/STAT 신호전달이 JAK/STAT 억제제를 사용하여 구제될 수 있을 것으로 가설을 세웠다. 최근의 발견은 자가염증성 질환이 숙주 방어에서 정상적으로 기능하는 스트레스 감지 경로의 병리적 교란으로 인한 것일 수 있다는 부상하는 견해를 지지한다. 소포체 (ER)/비접힘 단백질 반응 (UPR)은 위험을 감지하기에 좋게 위치하여 면역 반응에 기여한다. 사이토카인은 결정적으로 병원체에 대한 숙주 반응을 매개하지만, 비정상적으로 생성될 때에는 또한 병원성 염증을 유도할 수 있다. 본 발명자들은 Clec16a KO 마우스를 토파시티닙으로 처리하여 앞으로의 인간 연구에서 신규한 임상 적응증에 대한 FDA 승인 약물을 용도 변경하였다. SOCS1 유전자 옆의 CLEC16의 게놈 위치, 및 CLEC16의 면역 세포에서의 발현 특이성으로 인해 그것은 Clec16a 관련 병리에서 잠재적 약용 표적(druggable target)으로서 탐색될 이상적 후보가 된다. 예상했던 바와 같이, 토파시티닙 처리는 지방 및 체중 손실을 상당히 약화시켰고 Clec16a KO 마우스의 생존력을 개선시켰다 (도 10-A 및 B). 토파시티닙-처리된 대조군 마우스는 연구기간 내내 건강하게 유지되었고 그들의 체중을 유지하였다.
토파시티닙 효과 뒤의 근본적인 메커니즘을 다루기 위하여, 본 발명자들은 먼저 SOCS1 및 SOCS3 발현에 대한 RT-PCR 및 대조군, Clec16a KO 및 Clec16a KO 토파시티닙-처리 마우스로부터 분리된 gWAT에 대한 면역블롯 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 p-HSL, p-STAT1, p-STAT3, SOCS-1, AMPK, mTOR, P62 및 LC3I/II 및 ER 스트레스를 평가하였다 (도 10 C-F). 토파시티닙-처리 마우스로부터의 SOCS1 mRNA 발현은 Clec16a KO 마우스와 비교하여 상당한 반전을 보인다 (도 10G). SOCS3 발현은 그룹간에 상당한 차이를 보이지 않았다 (도 10H).
면역블롯 분석은 Clec16a KO에서 포스포-HSL의 상당한 상향 조절 및 토파시티닙-처리 Cle16a KO 마우스에서의 감소를 나타냈다.Clec16a KO 마우스의 지방 조직의 조사는 p-STAT1 및 p-STAT3의 상향 조절을 입증하였다. 토파시티닙은 p-STAT1 및 p-STAT3 둘 다를 대조군 수준으로 하향 조절함으로써 염증성 표현형을 구제하였다. 본 발명자들은 또한 AMPK의 인산화에서 상당한 증가를 관찰하였다. 그러나, 그것의 표적인 ACC는 Clec16a KO 마우스에서 감소된 인산화를 나타냈다. 토파시티닙 처리는 p-AMPK를 상당히 감소시켰고 ACC의 인산화를 촉진하였다. AMPK의 또 다른 하류 이펙터는 자가포식을 포함한 많은 기능을 조절하는 mTOR 신호전달이다. mTOR의 과잉 활성화는 Clec16a KO 마우스의 gWAT에서 P62의 상당한 축적에 의해 증명되는 바 자가포식/지방포식의 억제를 촉진한다. 본 발명자들은 mTOR의 인산화에서 상당한 증가 및 토파시티닙 처리 Clec16a KO 마우스에서의 반전을 관찰하였고, 자가포식 결함을 수정하였다 (도 10-C, D). 본 발명자들은 또한 토파시티닙-처리 KO 마우스에서 지방분해 및 ER 스트레스 구제에 대해 평가하였다 (도 10-E, F). 예상했던 바와 같이, 토파시티닙-처리 KO 마우스는 p-HSL, 및 ER 스트레스 단백질 (GRP78, ATF6, p-IRE1α, XBP1 및 CHOP)에서 상당한 하향 조절을 나타냈다. 토파시티닙 처리는 또한 COX-2 및 p-IkBα의 발현을 상당히 감소시켰다.
증가된 사이토카인/케모카인 수준은 다양한 자가면역/염증성 질환의 발생, 진행 및 발병 중에 활용된 염증 메커니즘을 반영한다. 본 발명자들의 결과는 Clec16a 녹아웃 염증성 표현형이 토파시티닙에 의해 약화되는 것을 나타낸다. Clec16a KO 혈장에서 사이토카인 및 케모카인의 정량화는 대조군과 비교하여 IFN-γ, IL-1a, IL-3, IL-6, IL-13, IL-16, TNF-α, 여러 단핵구/대식세포 화학유인물질 단백질 및 IL-17의 강력한 상향 조절을 보였다. 본 발명자들은 Clec16a KO 단독과 비교하여 토파시티닙-처리 마우스에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 거의 완전한 반전을 관찰하였다 (도 10-1).
함께 고려하면, 토파시티닙은 HSL 매개 지방분해, AMPK, mTOR, JAK-STATs, 및 자가포식/지방포식 및 ER 스트레스 신호전달에 대해 그것의 다면적 효과를 발휘하고, 생존력을 개선하며, Clec16a KO 마우스에 의해 나타난 염증성 지방이영양성 표현형을 약화시킨다. mTOR 및 AMPK는 세포 항상성의 핵심 에너지 센서 및 마스터 조절자이다. 라파마이신은 AMPK 및 ULK1 활성화를 통해 미토파지/자가포식을 자극하는 mTOR 신호전달을 억제한다. Clec16a KO 마우스의 지방 조직에서 상승된 ER 스트레스 및 조절에 장애가 있는 자가포식에 비추어, 본 발명자들은 라파마이신으로 Clec16a KO의 표현형 구제를 평가하였다. 예상했던 바와 같이, 라파마이신 처리는 심각한 체중 손실을 상당히 감소시켰고 아마도 자가포식, ER 스트레스 및 지방분해 캐스케이드의 하류 활성자를 조절함으로써 토파시티닙과 유사하게 Clec16a KO 마우스의 생존력을 개선하였다 (도 11).
Clec16a KO는 마우스에서 자가면역에 대한 민감성을 유도한다.
본 발명자들은 변경된 Clec16a 발현이 자가면역 표현형을 자발적으로 발현하지 못하는 유전적 배경 (Hudson et al., 2003)에서 자가면역 반응을 유도할 수 있다는 가설을 테스트하기 위하여 본 발명자들의 유도성 KO 스트레인을 사용하였다. 이 모델은 그러므로 자가면역 반응의 가설을 추적하기 위해서뿐만 아니라, Clec16a KO가 어떻게 변형된 면역 조절을 통해 자가면역 반응을 촉발할 수 있을지를 탐구하기 위해 사용될 수 있다.
Clec16a KO-유도된 자가항체.
대조군 및 Clec16a KO 마우스로부터의 혈청 샘플을 라인 검정 웨스턴 블롯을 사용하여 다양한 핵 항원에 대한 항체에 대해 검정하였다 (도 12). ANA-9-라인 면역블롯 검정은 혈청 또는 혈장 중의 추출 가능한 핵 항원 SS-A 52, SS-A 60, SS-B, RNP/Sm, Sm, 동원체 B, Jo-1, Scl-70 및 리보솜 P 단백질에 대한 IgG 부류 자가항체의 반-정량적 측정을 위한 막-기반 효소 면역검정이다. 이들 결과는 Clec16a KO가 전신성 자가면역 질환을 나타내는 항핵 항체의 생성을 유발하였음을 보여준다.
Clec16a KO 마우스로부터의 혈청에서 본 발명자들이 발견한 상향 조절된 특이적 항체의 발견은 이들 항체가 또한 SLE 및 다른 전신성 자가면역 질환에서도 발견되기 때분에 가치있는 것이다. 이 모델에서 특정 표적 자가항체는, 이것이 자체 항원에 대한 잃어버린 내성의 메커니즘과 관련된 단서를 제공할 수 있기 때문에 추가의 특성확인이 필요하다.
혈청 면역글로불린 아이소타이핑.
다음으로, 본 발명자들은 Clec16a가 혈청 면역글로불린 (Ig) 아이소타입에 변화를 초래했는지를 측정하였다. 상응하는 IgG 하위부류를 또한 Clec16a KO 마우스 및 대조군 마우스 혈청에서 모두 측정하였다. 본 발명자들은 대조군에 대해 ≤10% 및 ≥20% 체중 손실이 있는 KO 마우스를 비교하였다 (도 13). ≤10% 체중 손실이 있는 Clec16a KO 마우스는 IgM, IgA 및 IgG 하위부류 IgG1 및 IgG2c 수준에서 상당한 변화를 보인 반면 (상부), ≥20% 체중 손실이 있는 Clec16a KO 마우스는 IgM, IgA, IgG2b 및 IgG3 IgG 하위부류에서 상당한 상향 조절을 보였다 (하부).
IgG1 및 IgG2c는 체중 손실의 초기 단계의 마우스에서 상당한 증가를 보였고 약 20%의 체중 손실이 있는 Clec16a KO 마우스에서는 유의할만하지 않았다. IgM 및 IgA는 두 체중 손실 범주에 대해 모두 상당한 상향 조절을 보였다 (도 13). 이들 상향 조절된 혈청 IgG 아이소타이핑 결과는 KO 마우스에서의 과도한 염증성 반응을 나타내며 자가면역에서 CLEC16A에 대한 역할을 가리킨다.
마우스에서 Clec16a의 편재성 유도성 녹아웃은 척수소뇌 운동실조를 닮은 진행성 신경변성을 초래한다.
본 발명자들의 전신 유도성 Clec16a KO 마우스는 떨림, 보행 장애, 및 시간이 갈수록 악화되는 근긴장성 이상자세를 포함한 신경 표현형을 나타낸다 (도 14). 병리적 분석은 축퇴하는 감각 축삭, 및 소뇌에서 푸르키네 세포 손실이 이 표현형을 설명해주는 것을 드러냈다. 활성화된 미세아교세포 및 성상세포가 CNS의 영향을 받은 영역에서 발견되었다. CNS와 PNS의 영향을 받은 영역과 영향을 받지 않은 영역은 미토파지 및 자가포식과 관련된 단백질의 증가된 수준을 보였다. 이들 발견은 미토파지 및/또는 자가포식이 일부 종류의 척수소뇌 변성에서 역할을 담당했을 것임을 시사한다. 소뇌 및 일차 감각 뉴런의 선택적 관여는 다양한 유전적 소인을 가진, 척수소뇌 운동실조로서 알려져 있는 인간 질환을 모델로 한다 (Huang and Verbeek, 2018).
Clec16a KO DRG 및 TG에서 ER 스트레스 및 조절에 장애가 있는 OXPHOS 신호전달.
KO 마우스에서 10일 및 22일째에 DG (A) 및 TG (B)에서의 상향 조절된 ER 스트레스 마커를 나타내는 RT-PCR. (C) 22일째에 DRG 및 TG 용해물에서의 CHOP의 발현을 나타내는 대표적인 면역블롯. (D) DRG 및 TG에서 CHOP의 발현 수준의 배수 변화를 나타내는 정량화 그래프. (E) 대조군과 비교한 KO의 DRG 및 TG 용해물에서의 미토콘드리아 OXPHOS 호흡기 복합체 단백질 수준을 나타내는 대표적인 면역블롯. 다음의 호흡기 복합체 단백질 하위유닛을 포함하는 칵테일 항체를 사용한다: NADH 탈수소효소 (유비퀴논) 1 베타 하위복합체 8 (NDUFB8; 복합체 I), 석시네이트 탈수소효소 복합체, 하위유닛 B, 철 황 (SDHB/Ip; 복합체 II), 유비퀴놀-사이토크롬 c 환원효소 코어 단백질 II (UQCR2; 복합체 III), 사이토크롬 산화효소 하위유닛 2 (COXII; 복합체 IV) 및 ATP 합성효소 5A (ATP 5A, 복합체 V). 상기 언급된 하위유닛의 각각의 수준의 정량화를 각각 나타냈다. 데이터를 포린 수준에 대해 표준화된 단백질의 %로서 표시하였다. (F) DRG 및 TG에서의 OXPHOS 신호전달 하위유닛의 발현 수준의 배수 변화를 나타내는 정량화 그래프. 막을 스트리핑하고 로딩 대조군으로서 β-액틴에 대해 다시 프로빙하였다. 데이터를 3회의 독립적인 반복의 평균 ± SE로서 표시하였다. *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001, #P<0.0001 (대조군 대비 KO).
Clec16a는 그것의 병원성 영향력을 ISG15를 통해 매개한다.
이들 병원성 영향력을 매개하는, 관심의 후보 단백질의 연구에서, 본 발명자들은 Clec16a 과다발현 시스템에서 vMALDI-MS (Mass Spec) 분석을 사용하여 CLEC16A 면역침전을 수행하였다. 상위 10개의 후보 중에서, E3 유비퀴틴 리가제/인터페론-자극된 유전자 15 (ISG15)가 잠재적으로 관심 있는 후보 파트너로서 나타났다. Clec16a 과다발현 YTS NK 세포는 ISG15의 하향 조절을 보였다. 본 발명자들은 ISG15가 진정한 후보 단백질 파트너라면 KO 마우스에서 상향 조절되어야 한다고 예상하였다. ISG15는 그것의 발현 및 표적에 대한 콘쥬게이션 (ISGlyation)이 감염, 인터페론-α 및 -γ, 허혈, DNA 손상, 세포 스트레스 및 노화에 의해 유도되는 유비퀴틴 유사 단백질이다. 인터페론은 인간 면역 체계의 가장 중요한 경고 분자 중 하나이며 그것은 세포 방어 메커니즘을 유도한다. ISG15는 또한 자가포식에 중요한 역할을 한다. 관찰은 단백질의 ISGylation가 ISG15와 P62 및 HDA6 (히스톤 탈아세틸화제)의 상호작용을 통해 선택적 자가포식에 의해 응집 및 분해를 촉진하는 것을 시사한다. 더불어, ISG15는 모세혈관확장성 운동실조 세포에서 상향 조절되며, 아마도 ISG15의 구성적 활성화에 의해 유발된 손상된 프로테오솜 기능을 보상하기 위하여 그것의 자가포식 플럭스를 향상시킨다.
그러므로 본 발명자들은 스트레스 상황에서 활성화되는 ISGlyation이 번역을 억제하고 p53을 향상시킴으로써 세포 기능을 정지시키는 세포 반응을 조정하고, 자가포식 및 리소솜에 의해 엔도솜성 및 새롭게 합성된 단백질의 분해를 촉발하며, 경고 상태의 신호를 전달하여 면역 체계에 의한 반응을 유도한다고 가설을 세웠다. ISG15 콘쥬게이션이 일시적이고 특정 프로테아제에 의해 반전될 수 있음을 감안하면, 이런 변형은 스트레스가 중단된 후 항상성 상태의 회복을 허용할 수 있다. 예상했던 바와 같이 대조군 및 KO 마우스의 신경 조직에서의 웨스턴 블롯 분석 (점수-1 및 4 장애 포함)은 ISG15의 상당한 상향 조절을 보였다. ISG15는 대조군 신경 조직에서 검출 가능하지 않았다.
유비퀴틴 경로의 세포 길항물질인 ISG15에 대한 다른 그룹으로부터의 최근 연구는 미토파지가 Clec16a가 손실된 유비퀴틴 경로의 구성적으로 상승된 ISG15-매개된 손상으로 인해 결핍될 수 있다는 개념을 지지한다. 이들 발견은 Clec16a의 기능의 손실이 아마도 KO 마우스에서 ISG15를 통해 신경-변성성 표현형에 기여하는 것을 추가로 확인시켜준다.
그러므로, 본 발명자들의 전신 유도성 Clec16a KO 모델은 CLEC16A 위험-관련 변이체가 자가면역/염증성, 지방이영양성, 신경변성성 및 척수소뇌성 운동실조 표현형으로 이어질 수 있는 메커니즘을 설명하기 위한 우수한 도구를 제공한다. JAK pan-억제제-(토파시티닙) 및 선택적 자가포식 유도자인 라파마이신으로부터의 본 발명자들의 결과는 CLEC16A 기능저하를 초래하는 변이체를 가지고 있는 환자에서 ER 스트레스, 미토파지/자가포식/SOCS1-JAK-STAT 신호전달에 대한 조절 효과를 가진 약물이 약화된 CLEC16A 활성을 보상할 수 있고 표적화된 개입을 위한 강력한 후보를 제시할 수 있을 것임을 지지한다.
실시예 II
이전의 실시예에서, 본 발명자들은 CLEC16A의 손실이 비정상적인 미토파지, 세포 사멸 및 면역 기능장애로 이어지는 것을 보인다. 이들 관찰을 확장시키기 위하여 본 발명자들은 Clec16a KO 및 대조군 마우스로부터의 14개의 포르말린-고정 파라핀-삽입 (FFPE) 장기 및 조직을 포함한 면역조직화학 (IHC) 연구를 수행하여 결함 미토파지에 대한 반응으로 임의의 시각적 구조적 결함을 드러냈다. 구체적으로, 본 발명자들은 횡경막, 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 비장, 피부, 흉선, 대퇴 사두근, 침샘, 삼두근, 발 관절 및 늑간근을 수득하고 연구하였다 (그룹당 N=4). 본 발명자들은 비장, 흉선 및 췌장에서 극적인 병리적 차이를 보였다. 구체적으로, 대조군 마우스에 대비하여 Clec16a KO에서 상당한 흉선 및 비장 위축뿐만 아니라 변성 및 췌장의 면역 세포 침윤이 있었다.
비장에 대한 대표적인 이미지 및 정량화 분석을 도 17A 및 17B에 도시한다. IHC는 비장 아키텍처에서 극적인 변화를 나타냈다; 적색 및 백색 펄프는 KO에서 잘 규정되지 않는다; 백색 펄프는 대조군에서 23% 대비 KO에서 43%로 우세하다 (백색:적색 펄프 비율은 대조군 및 KO에서 각각 0.52 및 0.75임). Clec16a KO 마우스 비장이 위축을 나타내는 것이 분명하다. KO 마우스 비장은 대조군과 비교하여 우세한 적색 펄프 면적을 가진 크기가 감소되었다.
흉선에 대한 대표적인 이미지 및 정량화 분석을 도 18A 및 18B에 도시한다. IHC는 흉선 아키텍처에서의 극적인 변화를 나타냈고; 흉선 수질 및 피질 영역은 KO 마우스에서 잘 규정되지 않으며; 수질 영역은 대조군과 비교할 때 KO에서 30%나 증가된다 (수질:피질 비율은 대조군과 KO에서 각각 0.23 및 0.33임). 비장에서 관찰된 위축과 유사하게, Clec16a KO 마우스 흉선은 위축을 나타낸다. KO 마우스 흉선 엽은 일반적으로 크기가 더 작으며 수질 영역이 우세하다. 도 19는 모든 Clec16a KO 마우스의 췌장이 대조군 마우스의 췌장에서는 관찰되지 않은 상당한 변성 및 면역 세포 침윤을 가진 것을 도시한다.
췌장을 침윤하는 면역 세포의 우세한 유형(들) 및 그것의 활성화를 측정하기 위하여 본 발명자들은 Clec16a KO의 유도 후 23일째에 훼장에서의 16개의 면역 마커의 면역표현형 분류를 수행하였다. 도 20 참고. 이 시점에서, 본 발명자들은 CD163의 상당한 상향 조절만을 관찰하였다. 헤모글로빈 (Hb) 스캐빈저 수용체인 CD163은 대식세포-특이적 단백질이다. 대식세포에서 높은 CD163 발현은 증가된 대식세포 활성과 관련된 많은 질환 (및 특히, 염증성 질환)에서 염증에 대해 반응하는 조직의 특징이다.
본 발명자들의 발견은 CLEC16A가 충분히 입증된 제1형 당뇨병 (T1D) 민감성 유전자인 것을 따르며 조절 췌장 면역 세포 프로파일에서 CLEC16A가 직접적으로 관여하는 데 대한 추가의 지지를 제공한다.
더불어, Clec16a KO 유도 후에 빠르게 전개되는 증상을 고려하여 본 발명자들은 상기에서 설명된 것과 같이, 비장 및 흉선에서 16개의 면역 마커의 시간 경과 발현 연구를 수행하였고 대조군과 비교했을 때 Clec16a KO 마우스에서 발현 프로파일의 광범위한 조절장애를 입증하였다. 발현 프로파일에 미치는 타목시펜 (Tam)의 영향을 배제하기 위하여 본 발명자들은 2개의 대조군 그룹 (Cntrl-Veh 및 Cntrl-Tam)을 가졌다. 두 대조군 그룹 사이에 유의한 차이는 없었다. 동시에, 본 발명자들은 비장과 흉선 사이에서 면역 마커 발현에서의 상당한 차이를 관찰하였다. 상당한 조절장애를 보인 모든 마커를 아래에서 제시한다.
CD163의 상당한 상향 조절을 모든 연구 시점에서 흉선에서 관찰하였고 안정적으로 유지되었으며 비장에서는 일시적으로 증가하여 18일째에 가장 높았다. 더불어, 비장은 CD68에 대해 한계값 증가를 나타냈다. 그러므로, 본 발명자들은 대식세포 계통의 두 마커의 증가를 보았다. 도 21 참고.
Bcl-2의 상당한 상향 조절을 모든 연구 시점에서 흉선에서 관찰하였고 안정적으로 유지되었으며 비장에서는 18일째에 매우 상당한 증가에 도달하여 연구가 종료될 때까지 유지되었다 (도 22). BCL2는 미토콘드리아의 외막에 위치하여, 그곳에서 세포 생존을 촉진하고 친-세포자멸성 단백질의 작용을 억제하는 데 중요한 역할을 한다. 세포자멸사는 면역 체계를 조절하는 데 능동적인 역할을 하며 결핍된 세포자멸사는 자가면역 질환의 병인학적 측면에 기여할 수 있다. 더불어, BCL2는 미토콘드리아 역학을 조절하는 것으로 알려져 있고, 미토콘드리아 융합 및 분열의 조절에 관여한다.
CD40은 Clec16a KO의 비장에서 상당히 상향 조절된다. CD40은 항원-제공 세포 상에서 발견되는 동시자극 단백질이며 그것의 활성화에 필요하다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질 수용체는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이 수용체는 T 세포-의존성 면역글로불린 부류 스위칭 및 메모리 B 세포 발달을 포함한 광범위한 다양한 면역 및 염증 반응을 매개하는 데 필수적이다.
본 발명자들은 Clec16a KO 마우스로부터의 비장 및 흉선 둘 다에서 B 세포 계통 마커의 상향 조절을 입증하였다. 도 23 및 24 참고. CD19는 모든 B 계통 세포에서 발현된다. PAX5 유전자는 전사 인자의 쌍을 이룬 박스 (PAX) 패밀리의 구성원이다. PAX5 유전자는 초기에 발현되지만, B 세포 분화의 후기 단계에서는 발현되지 않는 B 세포 계통 특이적 활성자 단백질 (BSAP)을 암호화한다. 그것의 발현은 또한 발달 중인 CNS 및 고환에서 검출되었고, 그러므로, PAX5 유전자 생성물은 B 세포 분화뿐만 아니라, 신경 발달 및 정자 생성에서도 중요한 역할을 할 수 있다.
본 발명자들은 흉선에서만 Ical1의 상당한 하향 조절을 발견하였다 (도 25). ICAM1은 항체 및 T 세포 수용체를 포함한 단백질의 슈퍼패밀리인 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CD54로도 알려져 있는 ICAM1 (세포간 부착 분자 1)은 또한 ICAM1 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. ICAM1은 세포-세포 상호작용을 안정화하고 백혈구 내피 이동을 용이하게 하는데 있어 그것의 중요성에 대해 알려져 있는 내피세포- 및 백혈구-관련 경막 단백질이다. ICAM1 결찰은 많은 키나제를 포함하는 캐스케이드를 통한 신호전달에 의한 염증성 백혈구 모집과 같은 전염증 효과를 유발하며, 그러므로 ICAM1의 감소는 염증을 증가시키고 신호 변환을 변형시킬 수 있다.
Vcam1의 상당한 상향 조절을 모든 연구 시점에서 흉선에서 관찰하였고 안정적으로 유지되었으며 (가장 높고 가장 중요한 상향 조절은 9일째에 기록됨) 비장에서는 일시적으로 증가하여 18일째에 가장 높았다. 혈관 세포 부탁 분자 1 (VCAM-1) 또는 CD106은 VCAM1 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. VCAM1은 세포 부착 분자로서 기능한다. 유전자 생성물은 Ig 슈퍼패밀리의 구성원인 제1형 막 단백질인 세포 표면 시알로당단백질이다. VCAM1 단백질은 림프구, 단핵세포, 호산성 세포, 및 호염기성 세포의 혈관 내피에의 부착을 매개한다. 그것은 또한 백혈구-내피 세포 신호 변환에서 기능하며, 죽상 동맥경화증 및 류머티스양 관절염의 발생에서 중요한 역할을 할 수 있다. 사이토카인에 의한 내피 세포에서의 VCAM-1의 상향 조절은 증가된 유전자 전사의 결과로서 발생한다.
발현의 가장 광범위한 조절 장애는 T 세포 면역 마커에 대해 관찰되었다.
CD3의 발현은 흉선 및 비장에서 모두 상당히 조절에 장애가 있었고, 반대 효과를 나타냈다. CD3은 단백질 복합체 및 세포독성 T 세포 (CD8+ 나이브 T 세포) 및 T 헬퍼 세포 (CD4+ 나이브 T 세포) 둘 다를 활성화하는 데 관여하는 T 세포 공동 수용체이다. 도 26 참고. CD4는 흉선에서 상당히 하향 조절되었으며, 비장에서는 18일째에 상향 조절되는 경향을 보였지만, 유의성에는 도달하지 않았다 (18일째 및 23일째에 각각 p=0.06 및 p=0.09).
CD8은 흉선에서만 상당히 하향 조절되었다. 도 27 참고. CD8은 T 세포 수용체 (TCR)에 대한 보조 수용체로서 작용하는 경막 당단백질이다. CD8은 세포독성 T 세포의 표면에서 우세하게 발현되지만, 또한 천연 살해 세포, 피질 흉선 세포, 및 수지상 세포 상에서도 발견될 수 있다. TCR과 함께, CD8은 T 세포 신호전달에서 역할을 하며 세포독성 T 세포 항원 상호작용을 보조한다.
그랜자임 B는 GZMB 유전자에 의해 암호화되며 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 천연 살해 (NK) 세포에 의해 발현되는 세린 프로테아제이다. 이 단백질은 세포 매개 면역 반응에서 CTL에 의한 표적 세포 세포자멸사의 신속한 유도에 중요하다.
FoxP3은 의 흉선에서 일시적으로 상향 조절되었다. FOXP3 (포크헤드 박스 P3)은 면역 체계 반응에 관여하는 단백질이다. FOXP3은 조절 T 세포 (Treg)의 발달 및 기능에서 조절 경로의 마스터 조절자이다. Treg는 일반적으로 면역 반응을 감소시킨다. FoxP3의 하향 조절은 23일째에는 실패하는 초기 보상 메커니즘일 수 있다.
결론
본 발명자들의 결과는 면역 세포에서 CLEC16A 작용의 중요한 역할을 강조하며 CLEC16A 활성의 섬세한 균형이 세포 항상성에 필요한 것으로 여겨지는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 8-10주령 마우스에서 Clec16a를 끄는 것(turning off)이 강력한 염증 반응, 척수소뇌 운동실조를 닮은 점진적인 신경퇴행을 포함한 운동실조 및 상당한 체중 손실을 포함한 중증의 신경 증상의 발생으로 이어진 것을 발견하였다. CLEC16A 기능부전을 초래하는 변이체를 가지고 있는 환자 집단에서, 미토파지/자가포식/SOCS1/ISG15 신호전달에 조절 효과를 미치는 약물이 약화된 CLEC16A 활성을 보상하고 자가면역 및 자가염증성 질환에서 표적화된 개입을 위한 강력한 후보를 제시할 수 있을 것이다. 본 발명자들의 결과는 췌장, 비장 및 흉선 기능의 조절에서 CLEC16A의 직접적인 관여에 대한 추가적인 지지를 제공한다.
이들 조절 장애가 있는 유전자 표적 및 세포 하위집단의 확인으로 인해 본 발명자들은 위험 관련 CLEC16A 변이체를 가진 개체에서 T1D와 같이 자가면역 장애의 증상을 치료 및 예방하는 효능을 가져야 하는, Clec16a KO 마우스에서 비정상적인 과정을 반전시키는 약물을 선택할 수 있다.
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본 발명의 특정한 바람직한 구체예가 기술되었고 상기에서 구체적으로 예시된 한편, 발명은 그러한 구체예에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 다양한 변형이 하기 청구범위에 제시된 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대해 만들어질 수 있다.

Claims (7)

  1. 그것을 필요로 하는 대상체에서 CLEC16A-관련 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 미토파지 억제자/조절자, ER 억제자, JAK2 억제제 및 SOCS1 억제제로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 유효량의 투여를 포함하는, 방법.
  2. 흉선의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법으로서, CD163, Bcl-2, Pax-5, V-cam1, CD8 및 FoxP3 중 하나 이상의 발현을 조절하는 작용제를 투여하고, 그로써 흉선의 수질 피질 비율을 변경시키며 흉선의 변성과 관련된 증상을 개선시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 비장의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법으로서, CD163, CD68, Bcl-2, CD40, Pax5, Vcam1, CD3, 및 GzmB 중 하나 이상을 조절하는 작용제를 투여하고, 그로써 비장의 백색 적색 펄프 비율을 변경시키며 비장의 변성과 관련된 증상을 개선시키는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 췌장의 CLEC16A-관련 변성을 치료하는 방법으로서, CD163 발현 및/또는 면역 세포 침윤 및/또는 췌장의 선방 세포 변성을 조절하는 작용제를 투여하고, 그로써 자가면역 증상을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLEC16A 관련 자가면역 장애는 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 원발성 부신 기능부전, 크론병, 원발성 담즙성 간경변증, 청소년 특발성 관절염, 류머티스양 관절염, 및 원형 탈모증, 포도막염, 신경변성 및 루푸스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 라파마이신 및 토파시티닙인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 핵산은 먼저 CLEC16a 암호화 핵산의 변경에 대해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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