JP4514607B2 - 生物学的エフェクターの細胞内送達 - Google Patents

Description

（発明の技術分野）
本発明は分子生物学の分野に関する。

（発明の背景）
対象物質を外部培地から細胞内、特に細胞核へ効率的に移入することを可能にする技術は、バイオテクノロジーの分野において極めて重要である。このような技術は、タンパク質もしくはペプチド産生、遺伝子発現の調節、細胞内シグナル伝達チャネルの解析、および細胞（もしくは細胞核）内への種々多様な物質の移送効果の解析に有用であり得る。現在利用できる技術は、移入用ベクターに対し、生物活性のある物質を宿主細胞の細胞質（もしくは核）内に移入させて、宿主ゲノムに影響を与えずに、またはこの活性物質の生物学的性質を変えずに処理することができないことにより制約を受ける場合が多い。

以前は、高分子活性物質の細胞内への導入は、この移送すべき物質のサイズおよび生化学的性質によって制約されていた。しかしながら、最近、トランスポーターペプチドもしくはタンパク質を用いることにより、この分野に進歩がもたらされた。例えば、Ｓｃｈｗａｒｚｅとその共同研究者は、複合ペプチドもしくはタンパク質を組織の細胞内へ、および血液−脳関門を通過させて移送させることができるＨＩＶ、ＴＡＴ_{４８−５７}由来１０マーのペプチドについて報告している。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５７３（１９９９）参照。この複合ペプチドもしくはタンパク質は、エンドサイトーシスを伴わないタンパク質導入プロセスにより細胞に吸収されるものと考えられている。この発見により、生物医学研究および患者体内への薬物の直接的な送達に新しい方法論の突破口が開かれた。しかしながら、この方法の１つの重要な制限は、これらのタイプのトランスポーターに細胞特異性がないことである。従って、標的としない正常な組織との相互作用により有害な副作用が生じるため、こうした非特異的トランスポーターペプチドの多くは、有用性に制限がある。このような制限は、糖尿病などの慢性疾患の処置において特に問題となる。

薬物および治療剤をペプチド移送を介して細胞内に送達するための、種々の細胞型を特異的に標的とするための効率的で安全な組成物および方法は、当該分野でなお求められている。

（発明の要旨）
本発明は、生体膜を通過して移行することができるトランスポーターペプチドを提供する。また、本発明は、エフェクターに対し生体膜を通過させて移行させるこのようなトランスポーターペプチドを使用する方法に関する。このトランスポーターペプチドは単体もしくは多量体であり得る。

一局面として、本発明は、（Ｘ_ｍＲＸ_ｏＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＸＲＸ_ｎ）および（Ｘ_ｍＲＸＲＲＸ_ｎ）から選ばれ、Ｘが非塩基性アミノ酸であり、ｍが０〜１４の整数であり、ｎがｍとは独立に０と１４との間の整数であり、ｏがｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数である少なくとも１種のアミノ酸を有するトランスポーターペプチドであって、生体膜を通過して移行することができるトランスポーターペプチドを含む。

一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有するトランスポーターペプチドを提供する。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有するトランスポーターペプチドを提供する。種々の別の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来のものである。さらに他の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素の切断部位から得られるものである。

別の局面として、本発明は、各単量体トランスポーターペプチドが（Ｘ_ｍＲＸ_ｏＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＸＲＸ_ｎ）および（Ｘ_ｍＲＸＲＲＸ_ｎ）から選ばれ、Ｘが非塩基性アミノ酸であり、ｍが０〜１４の整数であり、ｎがｍとは独立に０と１４との間の整数であり、ｏがｍおよびｎとは独立に０と５との間の整数であり、生体膜を通過して移行することができる２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくはそれ以上の単量体トランスポーターペプチドを含む多量体トランスポーターペプチドを含む。多量体トランスポーターペプチド内の個々の単量体トランスポーターペプチドは同一もしくは異なるものであり得る。

別の実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する多量体トランスポーターペプチドを提供する。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有する多量体トランスポーターペプチドを提供する。種々の他の実施形態として、この多量体トランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来のものである。さらに別の実施形態として、この多量体トランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素の切断部位から得られるものである。

一部の実施形態として、この多量体トランスポーターペプチドは、スペーサー部分およびリンカー部分を含む。好ましくは、このスペーサー部分およびリンカー部分は、可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタンパク質分解酵素に対し非感受性である。このリンカーは、例えば、ポリエチレングリコールであり得る。

他の実施形態として、この単量体もしくは重合体トランスポーターペプチドは、レポーター基を含むことができる。本明細書に用いている「レポーター基」とは、検出可能な任意の基である。非限定的な例としては、放射性同位体、蛍光性部分、リン光性部分、化学発光性部分、および量子ドットが挙げられる。その他のレポーター基としては、ビオチン、シンテイン、ヒスチジン、赤血球凝集素、ｍｙｃもしくはフラッグ・タグが挙げられる。

一部の実施形態として、本発明のトランスポーターペプチドは、式Ｉ：
［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ （Ｉ）
によって表され、式中、Ｐは前述のコンセンサスモチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ）（Ｘ_ｍＲＸ_ｏＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＸＲＸ_ｎ）および（Ｘ_ｍＲＸＲＲＸ_ｎ）に包含されるペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４を含むことができ、式中、Ｘ_１およびＸ_４はＲもしくはＫであり得、Ｘ_１およびＸ_４は任意のアミノ酸であり得る。一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。他の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。種々の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来のものである。さらに他の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素の切断部位から得られるものである。ｖによって表される所与のトランスポーター内のペプチド数は、整数とする。単量体トランスポーターでは、ｖは１である。多量体トランスポーターでは、ｖは２〜８以上の整数とする。任意の所与の多量体結合体において、それぞれのペプチドは互いに同じであっても異なっていてもよい。

単量体のトランスポーター構築物では、コアは存在していてもしていなくてもよいものとする。

ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘは０または１である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタンパク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ＰＥＧ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

本明細書に用いている「コア」とは、リンカー、スペーサーおよびレポーター基の接続ポイントとなる構造体である。また、コアは多量体トランスポーター内のペプチド間を結合する役割を果たす。一部の実施形態として、このコアを分枝型とすることによって多くのペプチドを同一トランスポーターユニット内で結合させることができる。通常、コアに対し結合に利用可能な多くの官能性を持たせることによって、この多量体構築物の種々の異なる部分（ペプチド、ならびに存在する場合にはスペーサー、リンカーおよびレポーター）をこのコアと融合させて１つの分子を形成させることができる。企図しているコア部分としては、以下に詳細を説明するポリリジン（Ｋ）が挙げられ、また、リンカーの組み込まれた構造のものも挙げられる。コアを選択することにより、所与の結合体内に存在するペプチドの数が決まる。代表的なコアとしては、Ｃ_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］_３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_８−Ｋ_４Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドが挙げられる。

多量体のトランスポーター構築物では、リンカーおよびレポーター基は存在していてもしていなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式Ｉにおいて独立に１もしくは０である。

本明細書に用いている「トランスポーターペプチド」とは、物質が生体膜を通過して移行するのを容易にするペプチドである。特に明記しない限り、または用いる文脈において不正確でない限り、トランスポーターペプチドを意味するものは単量体もしくは多量体のトランスポーターペプチドを包含する。

一部の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、１つ以上のエフェクターと融合させる。「エフェクター」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、または薬学的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断片、免疫調節剤、酵素もしくは治療剤などを含む任意の適切な分子であり得る。２つ以上のエフェクターが存在する場合、これらのエフェクターは同一もしくは異なるものであり得る。

「融合」もしくは「融合した」という用語は、何らかの第３の分子よりも互いを好む２種以上の分子をもたらすような特定の相互作用全てを含むものである。これには、共有結合、イオン結合、疎水性結合、水素結合などの作用が含まれるが、溶媒選択性などの非特異的結合は含まれない。

本発明の多量体結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ）・Ｅ （ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた結合体では、化学の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこれらの両方に結合させることができる。

本明細書に用いている「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」もしくは「結合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」とは、エフェクターと単量体もしくは多量体トランスポーターペプチドとの間の物理的な結合を可能にするあらゆるタイプの相互作用のことを意味する。この結合の性質は、共有もしくは非共有結合であり得るが、その結合は、細胞移行の前もしくは移行中に結合体が解離しないように十分強力なものである必要がある。結合体化は、当業者に公知の任意の化学的、生化学的、酵素的もしくは遺伝子的カップリング法を用いて達成することができる。目的のエフェクターは、トランスポーターペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングまたは融合させることができる。一部の実施形態として、このエフェクターは、リンカー基に、もしくは直接コアに、またはレポーター基にカップリングあるいは融合させる。

種々の実施形態として、単量体および／または多量体トランスポーターペプチドは、長さをアミノ酸長として５０個未満、２５個未満もしくは１５個未満であり得る。

さらなる実施形態として、移行は膵Ｂ細胞、肝細胞、大腸細胞、筋肉細胞および／または肺細胞内で行われる。

別の実施形態として、本発明は、トランスポーターペプチドを生体膜を通過させて移行させる方法を含む。例えば、配列番号１−６の配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは膵Ｂ細胞の膜を通過させて移行させることができ、配列番号７−１０の配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは肝細胞の膜を通過させて移行させることができ、配列番号１１のペプチドうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは大腸細胞の膜を通過させて移行させることができ、配列番号１２−２０の配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは筋肉細胞の膜を通過させて移行させることができ、および配列番号２１−３４の配列のうちの１種以上を含む単量体もしくは多量体ペプチドは肺細胞の膜を通過させて移行させることができる。

なおさらなる実施形態として、本発明は、１種以上のエフェクターに結合させた単量体もしくは多量体トランスポーターペプチドであるトランスポーターユニットを含む。種々の他の実施形態として、このエフェクターは核酸、ペプチドもしくは薬学的に活性な薬剤であり得る。

さらに別の実施形態として、本発明は、トランスポーターペプチドと１種以上のエフェクターとの間で移行可能な単量体もしくは多量体結合体を作製し、従ってトランスポーターペプチド−エフェクター結合体を形成する方法を含む。

別の実施形態として、本発明は、エフェクターを単量体もしくは多量体トランスポーターペプチドに結合させて真核細胞内に導入することによる、真核細胞の細胞質および／または核内に１種以上のエフェクターを移行させる方法を含む。例えば、このトランスポーターペプチド−エフェクター結合体は、この結合体の存在下で培養細胞をインキュベートすることにより、またはこの結合体を細胞内に注入することにより細胞内に導入することができる。

種々の他の実施形態として、本発明は、エフェクターを単量体もしくは多量体のトランスポーターペプチドに結合させ、細胞の活性状態の代謝を亢進させる条件の下、この細胞の存在下にインキュベートすることによる、真核細胞におけるエフェクターの細胞内濃度を上昇させる方法を含む。本発明の好ましい実施形態は、この真核細胞としてヒト細胞を使用することを含む。

さらなる実施形態として、本発明は、治療的もしくは予防的に有効な量の単量体もしくは多量体トランスポーターユニット、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的組成物を含む。

好ましい「薬学的組成物」としては、ａ）希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；また、錠剤用としてｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウム・アルミニウム、でんぷん糊、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊剤、例えば、でんぷん、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩もしくは発泡性混合物；ならびに／あるいはｅ）吸収剤、着色剤、矯味矯臭剤および甘味剤とともに有効成分を含む錠剤およびゼラチンカプセル剤が挙げられる。注射用組成物は、好ましくは等張水溶液もしくは懸濁液であり、坐剤は脂肪性乳濁液もしくは懸濁液から調製するのが有利である。これらの組成物は、滅菌することができ、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、溶解促進剤、浸透圧調節塩および／または緩衝液を含むことができる。また、さらに、これらは他の治療上有用な物質を含むこともできる。これらの組成物は、それぞれ、従来の混和、顆粒化またはコーティング法によって調製され、有効成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％含有する。

なおさらなる実施形態として、本発明は、１個以上の容器が本発明の薬学的組成物を治療的もしくは予防的有効量で含有するキットを含む。

本発明の別の実施形態は、疾患の処置もしくは予防を必要とする被験体に対し、疾患を処置もしくは予防するのに十分な量の薬学的組成物を投与することにより、その疾患を処置もしくは予防する方法を含む。処置対象の疾患としては、例えば、糖尿病、大腸癌、呼吸器疾患、神経変性障害、心臓麻痺、および／またはウイルス感染症が挙げられ得る。

別の局面として、本発明は、特定の細胞型に対してファージ・ライブラリをスクリーニングした後、どの細胞がファージを取り込んだかを評価する、トランスポーターペプチド用ファージ・ライブラリのスクリーニング方法を含む。

別の実施形態として、この方法は、取り込まれたファージのＤＮＡを同定し、これから発現されるペプチドを推定することを含む。

なおさらなる実施形態として、この方法は、ファージ・ライブラリを少なくとも３サイクルにわたって選択するスクリーニング工程を含む。

さらに別の実施形態として、本発明は、ペプチドの多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ディスプレイを有するファージを含む。

（発明の詳細な説明）
本発明は、薬物および治療剤を細胞内へ送達するための、種々の細胞型を特異的に標的とするペプチドトランスポーターならびにペプチド移送システムを提供する。当該分野で公知の既存の移送システムには、これらが非効率的で、宿主ゲノムに影響を与え、活性物質（例えば、エフェクタ）の生物学的性質を変え、標的細胞を殺傷し、あるいは（例えば、ウイルス性結合体を使用することにより）極めて高いリスクを生じるためヒト対象には使用できないので、制約がある場合が多い。本発明のペプチド移送システムでは、治療剤となり得るものを細胞内へ送達するためにプロタンパク質転換酵素およびその特異的なリガンドを用いることによって当該分野で公知のトランスポーターシステムの限界を克服している。本発明のシステムでは、宿主のゲノムに影響を与えず、その他の点でも、非侵襲性である、変化を受けていない生物活性物質が効率的に送達される。

受容体媒介性のエンドサイトーシスは、細胞内への治療剤の送達を狙った実験系において広く利用されてきた。ＫａｔｏおよびＳｕｇｉｙａｍａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：２８７（１９９７）。従って、細胞特異的なエンドサイトーシス受容体を首尾良く標的にすることによって、ペプチドを細胞型特異的に送達することができる。プロタンパク質転換酵素は、受容体媒介性エンドサイトーシスにより取り込まれる細胞表面受容体の一例である。こうしたタンパク質は、ペプチドホルモン、神経ペプチドその他の多くのタンパク質の前駆体をその生物活性のある形に転換する役割を果たしていることが明らかにされている。プロタンパク質転換酵素ファミリーの切断部位にはコンセンサス配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒが含まれている。発現および局在性に関する情報は、プロタンパク質転換酵素は細胞外のリガンドを細胞内空間に移送することを示す。

例えば、哺乳類のプロタンパク質転換酵素は、その組織分布に基づいて３グループに分類することができる。１つのクラスのフューリン（Ｆｕｒｉｎ）、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６およびＬＰＣＩＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７は広範囲の組織および細胞株において発現される。第２のクラスの神経内分泌特異的転換酵素ＰＣ２およびＰＣ１／ＰＣ３の発現は、膵島、下垂体、副腎髄質および多くの脳領域などの内分泌組織に限定されている。さらに、第３のクラスのＰＣ４の発現は、精巣の精子形成細胞に高度に制限されている。神経内分泌特異的転換酵素は、主として分泌顆粒内に局在している。また、ＰＣ５／ＰＣ６Ａも、分泌顆粒に局在していると報告されている。さらに、間接的な証拠ではあるが、一部のプロタンパク質転換酵素分子は細胞表面に存在することが示唆されており、フューリンはＴＧＮと細胞表面との間を循環することが明らかにされている。Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ、ＢＭＪ．３１６：１２２１（１９９８）を参照されたい。

天然リガンドの働きをするように見えるペプチドリガンドは、ファージ・ディスプレイ法によって同定される場合が多い。効率的な受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導するペプチド配列の単離は、ファージ・ディスプレイ法を用いることによって向上する。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４４８：４５０、ｐ４６３（１９９９）を参照されたい。ファージ・ディスプレイ・ライブラリは、細胞受容体に対する天然リガンドの修飾体を含む変異体分子（Ｃａｂｉｂｂｏら、Ｇｅｎｅ １６７：４１（１９９５））および短鎖ペプチド（Ｚｗｉｃｋら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７（１９９８））の膨大な供給源となる極めて強力なツールである。また、ライブラリを直接注射したマウスにおいて、脳および腎臓に１３倍の選択性を示すペプチド配列が首尾良く単離されている。ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４（１９９６）ならびにＰａｓｑｕａｌｉｎｉ、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １：４２３（１９９６）を参照されたい。

時として、この方法により得られたリガンドは、短鎖ペプチド分子内の立体構造の自由度が高く接触残基数が少ないため、低親和性（マイクロモル程度）となることがある。ペプチドリガンドの結合親和性を改善する１つの方法は、低親和性ペプチドのいくつかのコピーを単一の多量体分子の形に結合させることである。この多量体リガンドの親和力（および生物活性）は、単量体リガンドに対して大きく向上させることができる。一部の実施形態として、多量体構築物は、オキシム化学を用いて、構築ブロックとしての細胞を標的とするペプチドから作製する。例えば、このペプチドは、特定の細胞（例えば、膵β細胞）に特異的に結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してこの細胞による取り込みを誘発させることができるペプチドリガンドを選択するファージ・ディスプレイ実験から得ることができる。

例えば、単量体としてのＩｇＭは低親和性タンパク質であるが、５量体の形をとると、細菌もしくはウイルスの表面に存在する反復性抗原決定基に対する親和力が大きく向上する。Ｒｏｉｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ），ｐ６５−８４（１９９１）を参照されたい。

同様に、組換えＤＮＡ技術により作製されるタンパク質であるこのペンタボディでは、１０^５倍の向上がみられる。Ａｌｅｘｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１６６３−１６６８（１９９７）。ファージ・ライブラリから得られるポリペプチドの低親和性はペンタボディの５量体構造によって補われ、その標的に対する高い親和力が得られる。

また、最近、Ｒｏｓｅは同様な分子を「ケモボディ（ｃｈｅｍｏｂｏｄｙ）」と名付けた。ＲｏｓｅおよびＶｉｚｚａｖｏｎａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：７０３４−７０３８（１９９９）を参照されたい。このケモボディは、相補性構造に非共有結合することにより抗体分子の働きを模倣することができるペプチドサブユニットの複数のコピーを提示する合成分子である。その結合ペプチドのアミノ酸配列は、ファージ・ライブラリ法により同定され、サブユニット自体そのものは、オキシム化学によって構築された。また、同時に２つ以上のペプチドサブユニットによって標的に結合することができるように、適切なスペーサーおよびリンカーもこのケモボディに導入された。Ｒｏｓｅは、可動性リンカーを有するインフルエンザ・ウイルスのファージ由来ペプチドのコピーを４個有するモデルケモボディを作製した。

特定の細胞型を選択的に標的とする低分子トランスポーターペプチドは、大きなファージ・ディスプレイ・ライブラリから得て、単量体もしくは多量体トランスポーター分子として用いることができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて得られるような低分子ペプチド担体の有利な点としては、高品質、高純度、低免疫原性であり、生体の全ての細胞に極めて効率的に送達することを可能にすることが挙げられる。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５７３（１９９９）。従って、ペプチド担体では、種々の高分子を効率的に送達するためのリポソーム、ウイルスなどの従来のトランスポーターを改良することができる可能性がある。例えば、Ｍａｈａｔｏら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．４：３３７（１９９７）、およびＭａｈａｔｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：１３３ ４：３３７（１９９７）を参照されたい。

本明細書に記載したトランスポーターペプチドは、種々の疾患の治療に用いられ、このような疾患としては、糖尿病が挙げられるが、これに限定されるものではない。正常な生物体（では、インスリン分泌により正常血糖が維持されるようにβ細胞集団は厳格に制御されている。β細胞集団は、乳児もしくは成熟生物体の要求に反応して、特に、特定の生理的および生理病理学的状態への反応として調節されている。β細胞集団の適切性は、基本的にβ細胞の死と再生との動的バランスによって達成されている。このバランスは、未熟β細胞の分化および既存のインスリン分泌細胞の増殖によって達成されている。ＳｃｈａｒｆｍａｎｎおよびＣｚｅｒｎｉｃｈｏｗ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．２２：２２３（１９９６）ならびにＢｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．４９：９１（１９９４）を参照されたい。Ｉ型糖尿病におけるβ細胞集団の障害されたバランスは、膵β細胞を標的にする免疫系の特異的攻撃により惹起される過程であるβ細胞破壊の促進によって生じる。従って、β細胞破壊の速度を抑制もしくは低下させると、糖尿病が安定化されるばかりではなく、島が再生されてβ細胞集団の機能不全を是正することも可能となる。

Ｉ型糖尿病の実験モデルにおいてβ細胞の喪失速度を低下させるのに用いられる効力のあるツールとして数種の化合物を確立した。これらのペプチドの多くは本質的にペプチジルであり、従ってペプチド担体に容易に結合する。本明細書に記載したこれらのペプチドは、治療用「積み荷（ｃａｒｇｏ）」のデザイン、即ち、治療剤（「エフェクタ」）を担体（単量体もしくは多量体「トランスポーターペプチド」）とカップリングさせるための基剤となる。

本発明の移送システムの１つの実施形態は、Ｉ型糖尿病の治療のためにβ細胞の細胞内メカニズムを標的にしたものである。Ｉ型糖尿病の症状は、免疫系の分泌による膵β細胞の破壊に続発するものである。Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，ＢＭＪ ３１６：１２２１（１９９８）を参照されたい。ヒトおよび齧歯類における結論的なデータは、サイトカインのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、マクロファージおよびＴ細胞により分泌されるＴＮＦαおよびＩＮＦγと共に、β細胞の機能不全および破壊ならびにＩ型糖尿病をもたらす最終的な転帰の原因となる主要な成分であることを示す。Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３９：１００５（１９９６）、Ｎｅｒｕｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １１ Ｓｕｐｐｌ １：１６（１９８８）、ならびにＭａｕｒｉｃｉｏおよびＭａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：１５３７（１９９８）を参照されたい。これらの分泌サイトカインは、膵β細胞においてシグナル伝達およびエフェクター分子の高度に複雑なネットワークに関与している。このシグナル伝達は、細胞の挙動を改変し、細胞の運命に決定的な影響力を与える。これまでに蓄積された証拠から、この調節性細胞内ネットワークは新規な治療方法の開発のための有望な標的となることが分かる。Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：４５（１９９８）、Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．５：４６１（１９９８）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１０：２９３（１９９７）、Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：１２２３（１９９９）、Ｂｌｅｉｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１４３１（１９９９）、Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５：１６９（１９９９）、およびＣｈｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：５６２（２０００）を参照されたい。細胞内サイトカイン・シグナル伝達の処理および形成に関与するこれらの分子はそれぞれ、トランスポーター−薬物設計の標的とすることができる。

β細胞内でＩＬ−１βによって動員される最も重要なシグナル伝達分子としては、セラミド、プロスタグランジン、熱ショックタンパク質、誘導性ＮＯシンターゼ酵素（ｉＮＯＳ）、転写因子ＮＦ−κＢ（Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６０８４（１９９８）参照）、ならびに３種のＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２、ｐ３８およびＪＮＫがある。これらの分子の多くは、β細胞の生残および機能の改善をもたらした既存の阻害剤によるブロックの標的である。ｉＮＯＳノックアウト（ＫＯ）マウスはＩＬ−１βの細胞毒性に対して抵抗性であり（Ｆｌｏｄｓｔｒｏｍら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：７０６（１９９９）参照）、ｉＮＯＳ作用のブロッカーはＮＯの細胞毒性の種々の側面を抑制する（Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．５：４６１（１９９８）に概説されている）。島および細胞株による研究は、Ｃａ^２＋チャネルのブロッカーおよびカスパーゼ阻害剤は齧歯類のβ細胞死を防止することを示す。Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：１２００（１９９９）、およびＹａｍａｄａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：４７８（１９９９）を参照されたい。ｐ３８阻害剤は、グルコース賦活性インスリン放出のＩＬ−１β媒介性阻害を減弱させる。Ｌａｒｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５２９４（１９９８）を参照されたい。アンチセンスＧＡＤトランスジェニックＮＯＤマウスにおいてＧＡＤの発現をβ細胞特異的に抑制すると、自己免疫性糖尿病が阻止された。Ｙｏｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１１８３（１９９９）を参照されたい。膵β細胞株においてｂｃｌ−２、ＩＬ−１ＲａおよびＪＢＤ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼＪＮＫの優性阻害因子）を発現させると、細胞はアポトーシスに抵抗性となった。Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：７７−８２（２０００）、Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３９：５３０（１９９６）、Ｄｕｐｒａｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１１６０（１９９９）、およびＧｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：１７３０（１９９９）を参照されたい。以上のデータを総合すると、特定の手段により細胞内事象を操作することはＩ型糖尿病の治療にかなり有望であることを示す。

疾病治療の１つの主要な課題は、生物学的に重要な分子をインビボで有効な細胞透過性の生物活性化合物に変換することである。Ｇｉｂｂｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１９６９（２０００）を参照されたい。例えば、β細胞の喪失を防止するための最も有望なツールは、多くの高分子タンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：１２２３（１９９９）参照）、ドミナントネガティブ型のＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ、ＦＡＤＤもしくはＩＲＡＫ（Ｂｕｒｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２２０３（１９９８）、およびＳｔｅｐｈｅｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：３２１９（１９９９）参照）などのサイトカイン・シグナル伝達の阻害因子、または現在インビボで組織および膵β細胞を含む細胞型に送達させることができないＪＮＫ阻害剤ＪＢＤ２８０（Ａｍｍｅｎｄｒｕｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１４６８−１４７６（２０００）参照）である。

最近の研究は、高分子タンパク質を、細胞および器官に容易に送達させることができる低分子生物活性化合物に変換する試みの前進を示す。Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：８９（１９９９）を参照されたい。これらの方法には基本的に２つの条件が必要とされる：即ち、１）細胞内に効率的に送達させたい分子に特定のトランスポーターもしくはその化学的修飾体を結合させること（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５７３（１９９９）、Ｂｒｕｇｉｄｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５（１９９５）、Ｏｅｈｌｋｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４１４：１２７（１９９８）およびＴｅｒｓｋｉｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１６６３（１９９７）に報告されている効率的な短鎖ペプチドトランスポーターを参照されたい）；２）トランスポーターに低分子ペプチド配列を結合させることができるように、タンパク質の活性部分を狭小化する必要があること。手短に言えば、概してこれらの条件では、元のタンパク質の不可欠な生物学的性質を保ちながら細胞内に入ることができる３〜３０アミノ酸長の二連（ｂｉ−ｐａｒｔｉｔｅ）ペプチドが設定される。癌研究の場合のように（Ｇｉｂｂｓ、Ｏｌｉｆｆ、Ｃｅｌｌ ７９：１９３（１９９４）参照）、β細胞には操作することによりサイトカイン誘発性アポトーシスからβ細胞を保護することができる多数の細胞内事象があり、こうした操作は薬剤設計の有望な標的となると考えられる。

受容体媒介性エンドサイトーシスは、細胞内への治療剤の送達を狙った実験系において広く利用されている。Ｋａｔｏ、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：２８７（１９９７）を参照されたい。エンドサイトーシス作用は、ＩｇＧ Ｆｃ、ソマトスタチン、インスリン、ＩＧＦ−ＩおよびＩＩ、トランスフェリン、ＥＧＦ、ＧＬＰ−１、ＶＬＤＬもしくはインテグリン受容体を含む多くの受容体について報告されている共通的性質である。Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ．１１１：６３（１９９９）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５３：Ｓ６３（１９８９）、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５７１３（１９９０）、ＳｍｉｔｈおよびＪａｒｅｔｔ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：６１３（１９８８）、Ｓｏｌｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：５９５（１９９０）、Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：２０３（１９９５）、Ｙｏｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１６４（１９９９）、およびＭｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７：７５９（１９９７）を参照されたい。エンドサイトーシスを媒介する細胞型特異的受容体についても報告されている。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４８：４６３（１９９９）を参照されたい。

強い実験的バックグラウンドは、膵β細胞を選択的に標的にするトランスポーターペプチドが大きなファージ・ディスプレイ・ライブラリから得られることも考えられることを示しているが、そのような試みについては報告されていない。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて得られるような低分子ペプチド担体の利点は数多くあり、例えば、化学合成による作製が容易であること、高品質、高純度、低免疫原性であること、および生物体の全ての細胞に極めて効率的に送達することが可能であることが挙げられる。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５７３（１９９９）を参照されたい。従って、本発明のペプチド担体には、多くの高分子の効率的な送達において、リポソームもしくはウイルスなどの従来のトランスポーターよりもうまく機能する可能性がある。例えば、Ｍａｈａｔｏら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ４：３３７（１９９７）およびＭａｈａｔｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｓｙｓｔ．１４：１３３（１９９７）を参照されたい。

ファージ・ペプチド・ライブラリは、従来より、線維状ファージＭ１３の誘導体として構築されている。ペプチド・ライブラリは、このペプチドモチーフの１〜５個のコピーを提示するキャプシドのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩに融合される。Ｚｗｉｃｋら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７（１９９８）を参照されたい。あるいは、メジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩを用いることによって高価（ｈｉｇｈ−ｖａｌｅｎｔ）提示（ｄｉｓｐｌａｙ）が達成される。しかしながら、これらのタイプのライブラリは、受容体媒介性エンドサイトーシスペプチド配列の単離のために最適化されていない。高い内部移行効率を有する担体を回収することに関連して考慮すべき事柄は以下の通りである：１）ペプチドの１価もしくは低価（ｌｏｗ−ｖａｌｅｎｔ）提示は、線維状ファージのような大きな構造体を効率的に取り込ませるには基本的に不十分であるが、多価提示では効率的取り込みが可能となること（Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４８：４５０（１９９９）参照）；および２）受容体結合リガンドが内部移行が、原形質膜の特定領域における細胞表面受容体の濃縮、続くクラスリン被覆小胞の形成に関連すること（Ｄａｍｋｅ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９：４８（１９９６））。

Ｍ１３誘導体のサイズは大きく（１〜１．５μｍ）（Ｚａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ ９：１２７（１９８０）参照）、古典的なクラスリン被覆ピットの通常サイズ（１５０ｎＭ）を上回る。クラスリン被覆ピットは、膜表面の約２％を占める原形質膜上の陥入構造体である。この特殊な構造は、インスリン、ＥＧＦなどの細胞外タンパク質もしくはペプチドを１０〜５０％／分という極めて速い速度で除去する高度に効率的な受容体媒介性内部移行プロセスを指向する。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７：７５９（１９９７）を参照されたい。従って、従来のＭ１３ファージでは、こうした特殊で高度に効率的な構造による受容体媒介性内部移行が行われるとは考えられない。

従って、報告されている試みでは、ペプチド担持ファージが高い内部移行率を示すペプチドは得られていない。これまで、こうした研究から、特定の細胞型に特異的なコンセンサス取り込みモチーフは出現していない。

一部の局面として、本明細書に開示した本発明は、ペプチド担持エフェクターの取り込みを促進するトランスポーターペプチドの同定に関する。一旦このペプチド配列が決まると、このペプチドをエフェクター分子に結合させることによりエフェクター分子を生体膜を通過させて移送させる。例えば、ファージ・ディスプレイ・パニングにより膵インスリン分泌β細胞を標的にする一連のペプチドを単離した。こうした細胞を標的にするペプチドを構築ブロックとする単量体もしくは多量体構築物を合成した。これらの構築物は、治療剤を特異的に送達して糖尿病をコントロールするように設計した新規化学物質である。

本発明のトランスポーターペプチドは式Ｉで表すことができる：
［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ （Ｉ）
式中、Ｐは前述のコンセンサス配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ）（Ｘ_ｍＲＸ_ｏＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＸＲＸ_ｎ）および（Ｘ_ｍＲＸＲＲＸ_ｎ）に包含されるペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４を含むことができ、式中、Ｘ_１およびＸ_４はＲもしくはＫとすることができ、Ｘ_１およびＸ_４は任意のアミノ酸とすることができる。一実施形態として、本発明は、アミノ酸配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。別の実施形態として、本発明は、配列番号１−３４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１種のペプチドを含む多量体トランスポーターを提供する。種々の別の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素のリガンド由来のものである。さらに別の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、タンパク質転換酵素の切断部位から得られるものである。ｖによって表される所与のトランスポーター内のペプチド数は、整数とする。単量体トランスポーターでは、ｖは１である。多量体トランスポーターでは、ｖは２〜８またはそれ以上の整数とする。任意の所与の多量体結合体において、それぞれのペプチドは互いに同じか、異なるものとすることができる。

ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘは１または０である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタンパク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ポリエチレングリコール（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

本明細書に用いている「コア」とは、多量体トランスポーターペプチド内のペプチド間を結合する役割を果たす構造体である。また、コアは、リンカー、スペーサーおよびレポーター基の接続ポイントとなる。通常、コアに対し結合に利用可能な多くの機能性を持たせることによって、この多量体構築物の種々の異なる部分（ペプチド、および存在する場合にはスペーサー、リンカーおよびレポーター）をこのコアと融合させて１つの分子を形成させることができる。企図しているコア部分としては、以下に詳細を説明するポリリジン（Ｋ）が挙げられ、また、リンカーの組み込まれた構造のものも挙げられる。コアを選択することにより、所与の結合体内に存在するペプチドの数が決まる。代表的なコアとしては、Ｃ_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］_３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_８−Ｋ_４Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドが挙げられる。単量体トランスポーターペプチドでは、コアは存在していてもしていなくてもよい。

このトランスポーター構築物では、リンカーおよびレポーター基は存在していてもしていなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式Ｉにおいて独立に１もしくは０である。

本明細書に用いている「トランスポーターペプチド」とは、物質が生体膜を通過して移行するのを促進するペプチドである。特に明記しない限り、または用いる文脈において不正確でない限り、トランスポーターペプチドを意味するものは単量体もしくは多量体のトランスポーターペプチドを包含する。

トランスポーターペプチドは、物質が細胞の生体膜を横切って、特にその細胞質もしくは核内へ通過または移行するのを容易にするペプチドである。移行の検出は、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／０２８４０号に記載されている細胞透過アッセイ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を含む種々の方法によって行うことができる。一般に、細胞透過アッセイは、ａ）培養細胞を、移行させるペプチドとインキュベートし、ｂ）この細胞を固定して透過処理し、およびｃ）細胞内のペプチドの有無を検出することによって実施する。検出工程は、固定、透過処理した細胞をこのペプチドに対する標識抗体とインキュベートした後、ペプチドと標識抗体との免疫反応を検出することによって行うことができる。あるいは、検出可能な標識ペプチドを用い、細胞コンパートメント内の標識の有無を直接検出することによっても、検出を行うことができる。この標識は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、色素、または検出可能な任意の標識とすることができる。例えば、ｄｅ Ｊｏｎｇら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：２０８１（１９９９）およびＢｒｅｅｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８１：６５８（１９９９）を参照されたい。

さらに、本発明は、トランスポーターペプチドをエフェクターにカップリングもしくは融合させた結合体である移送ユニット、もしくは結合体を含む。本明細書に用いている「カップリングさせた」とは、エフェクターと前記ペプチドとの物理的な結合を可能にする任意のタイプの相互作用のことを意味する。この結合の性質は、共有もしくは非共有結合とすることができるが、その結合は、細胞移行の前もしくは移行中にこのベクターが解離しないように十分強力なものである必要がある。カップリングは、当業者に既知の任意の化学的、生化学的、酵素的もしくは遺伝子的カップリング法を用いて達成することができる。対象とするエフェクターは、このペプチド・ベクターのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングさせることができる。

「融合した」もしくは「融合」または「結合する」あるいは「相互作用する」という用語は、２種以上の分子同士が何らかの第３の分子に対するよりも高い選択性を示すような特定の相互作用全てを含むものであり、これらには、共有結合、イオン結合、疎水性結合、水素結合などの作用が含まれるが、溶媒選択性などの非特異的結合は含まれない。

一部の実施形態として、このトランスポーターペプチドは、１つ以上のエフェクターとカップリングもしくは融合させる。このカップリングは、直接的なもの、もしくはコアを介したものとすることができる。「エフェクター」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、または薬学的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断片、免疫調節剤、酵素もしくは治療剤などを含む任意の適切な分子とすることができる。２つ以上のエフェクターが存在する場合、これらのエフェクターは同一もしくは異なるものとすることができる。エフェクターとは、例えば、生物学、医薬、診断、トレーシングもしくは食品加工の対象になる任意の分子または化合物のことを意味する。エフェクターは、種々の由来の核酸、特にヒト、ウイルス、動物、真核もしくは原核生物、植物または合成由来等の核酸（リボ核酸、デオキシリボ核酸）で構成することができる。対象とする核酸は、例えば、単純な微量ヌクレオチドからゲノム断片もしくはゲノム全体に至る種々のサイズのものとすることができる。同様に、これはウイルスゲノムもしくはプラスミドとすることができる。あるいは、対象とするエフェクターは、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパク質、成長因子、抗原、抗体などのタンパク質とすることもできる。さらに、このエフェクターは、例えば、毒素、治療剤、もしくは抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生生物剤などの抗病原体剤のような薬学的に活性な物質とすることができる。この対象とするエフェクターは、それ自体そのままで活性があるものとすることができ、またはインサイチュでペプチドもしくは別の物質または環境条件により活性化されるものとすることができる。

本発明のトランスポーターペプチド結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ）・Ｅ （ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた結合体では、化学の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこれらの両方に結合させることができる。単量体トランスポーターペプチド結合体（ｖ＝１）では、コアは存在してもしていなくてもよい。

本明細書に用いている「薬学的に活性な物質」とは、ヒトもしくは動物の生物体に投与したときに、検出可能な薬理学的および／または生理学的効果を誘起する化学物質もしくは化合物のことを意味する。本明細書に用いている「治療剤」とは、ヒトもしくは動物の生物体に投与したときに、目的とする薬理学的および／または生理学的効果を誘起する化学物質もしくは化合物のことを意味する。

本発明によるトランスポーターペプチドは、その透過能がこれにカップリングさせる対象物質（エフェクター）の性質とは事実上無関係であるという事実に特徴がある。

また、本発明は、対象物質を細胞もしくは細胞の核内に導入する方法を含む。この方法は、細胞内への効率的な透過を可能にするのに十分な量のトランスポーターペプチド−エフェクター結合体もしくはトランスポーターユニットと細胞とを接触させることを含む。一般に、本方法は、この結合体をインビボまたはインビトロで取り込ませるために用いることができる。例えば、この結合体は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで与えることができる。さらに、本発明によるトランスポーターペプチドは、カップリングさせた物質に生物活性を持たせることを可能にすることができる。従って、トランスポーターペプチドはカップリングさせたエフェクターの生物活性を増強させることができる。インビトロによる方法では、エフェクターをトランスポーターとカップリングさせ、得られた結合体を、細胞代謝の活性化を可能にする温度で細胞とインキュベートする。場合によっては、このトランスポーター−エフェクター結合体を特定の細胞に注入する。この結合体を細胞内に導入する他の任意の方法を用いることもできることは当業者によって認められよう。

また、以上のペプチド−エフェクター結合体のほかに、本発明は、薬学的に受容可能な塩基もしくは酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、プロドラッグ、代謝体、立体異性体もしくはこれらの混合物を提供する。また、本発明は、薬学的に受容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤と共に、ペプチド−エフェクター結合体を含む薬学的組成物を含む。

「薬学的に受容可能な塩」という用語に包含される塩とは、一般に、この遊離塩基と適切な有機もしくは無機酸とを反応させて本明細書に開示した化合物の「薬学的に受容可能な酸付加塩」を作製することにより調製する本発明の化合物の毒性のない塩のことを意味する。こうした化合物は、この遊離塩基の生物学的効果および性質を保持するものである。このような塩の代表例は、酢酸塩、アムソン酸塩（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゾネート、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラリエート（ｃｌａｖｕｌａｒｉａｔｅ）、二塩化水素化物、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル塩、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミン・アンモニウム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエート、エンボネート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリキュレート、スラメート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、および吉草酸塩などの水溶性ならびに非水溶性塩である。

本発明の方法によれば、ヒト患者に対し、薬理学的に有効な量のペプチドもしくは結合体を投与することができる。「薬理学的に有効な量」という用語は、研究者もしくは臨床家によって求められている組織、器官系、動物もしくはヒトの生物学的または医学的反応を誘起する薬物もしくは薬学的組成物（エフェクター）の量のことを意味する。

また、本発明は、対象エフェクターを細胞もしくは細胞核内に導入するのに適した薬学的組成物を含む。この組成物は、内服に適したものであることが好ましく、有効量の本発明の薬理学的に活性な化合物を単独、もしくは１種以上の薬学的に受容可能な担体との組合せで含む。この化合物は、毒性があるとしても極めて少ないという点で、特に有用である。

好ましい薬学的組成物は、ａ）希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；錠剤用としてｃ）カップリング剤、例えば、ケイ酸マグネシウム・アルミニウム、でんぷん糊、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊剤、例えば、でんぷん、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩もしくは発泡性混合物；および／またはｅ）吸収剤、着色剤、矯味矯臭剤および甘味剤とともに有効成分を含む錠剤ならびにゼラチンカプセル剤である。注射用組成物は、好ましくは等張水溶液もしくは懸濁液であり、坐剤は脂肪性乳濁液もしくは懸濁液から調製するのが有利である。これらの組成物は、滅菌することができ、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤などの佐剤、溶解促進剤、浸透圧調節塩および／または緩衝液を含むことができる。また、さらに、これらは別の治療上有用な物質を含むことができる。これらの組成物は、それぞれ、従来の混和、顆粒化またはコーティング法によって調製することができ、有効成分を約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％含有する。

本明細書に開示した活性化合物および塩の投与は、一般に認められている治療剤の投与方法のうちの任意の方法によることができる。これらの方法としては、経口、鼻腔内、非経口、経皮、皮下もしくは局所性投与様式などの全身性または局所投与が挙げられる。

目的とする投与様式に応じて、この組成物は、例えば、好ましくは単位投与量の注射用剤、錠剤、坐剤、丸剤、徐放性カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤などのような固体もしくは半固体または液状の投与形態とすることができる。この組成物は、有効量の活性化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩を含むことになり、また、さらに、薬学において通例用いられている任意の従来の薬学的賦形剤および他の治療薬もしくは薬学的組成物、担体、アジュバント、希釈剤なども含むことができる。

固体組成物の賦形剤としては、医薬用品質のマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、蔗糖、炭酸マグネシウムなどを用いることができる。また、上記の活性化合物は、例えば、プロピレングリコールなどのポリアルキレングリコールを担体とする坐剤として製剤化することができる。

液体、特に注射用組成物は、例えば、溶解、分散などにより調製することができる。活性化合物は、例えば、水、生理食塩液、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノールなどの医薬用純品溶媒に溶解もしくは混合することにより、注射用溶液もしくは懸濁液を作製する。

また、投与することになる薬学的組成物は、必要に応じて、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンのような他の物質などの毒性のない補助剤を少量含むことができる。

一般に、非経口注射用剤は、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射もしくは注入により投与する。注射用剤は、溶液もしくは懸濁液、または液に溶かした後、注射するのに適した固体形態のような通常の形態として調製することができる。

非経口投与の１つの方法として、本明細書に引用により組み込まれている米国特許第３，７１０，７９５号に記載の方法に従い、投与量の一定のレベルが維持されるのを確実なものにする徐放性もしくは持続放出性製剤の埋め込み法を用いる。

本発明の化合物は、錠剤、カプセル剤（各々が徐放性および持続放出性製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口剤形として投与することができる。また、同様に、この化合物は、医薬分野の当業者に周知の形態により静脈内（急速および点滴の両方）、腹腔内、皮下もしくは筋肉内形態で投与することができる。

この化合物の用法・用量は、患者の体型、種類、年齢、体重、性別および病状；治療対象の症状の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用する特定の化合物もしくはその塩を含む種々の要素に基づいて選択する。当該分野の医師もしくは獣医師であれば、症状の進行を防止し、遅らせ、または止めるのに必要とされる薬剤の有効量を容易に決定し、処方することができる。

本発明の経口用量は、適応となる効果に用いる場合、有効成分を０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０もしくは１０００．０ｍｇ含有する分割錠の形態で提供し得る。

本発明の化合物は、１日１回の用量として投与することができ、あるいは１日当たりの総投与量を１日２回もしくは３回または４回の分割用量として投与することができる。さらに、本発明に好ましい化合物は、適切な鼻腔内投与用器具（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｖｅｈｉｃｌｅ）の局所使用による鼻腔内投与、もしくは当業者に周知の形態の経皮投与用皮膚パッチ剤による経皮投与を行うことができる。経皮送達システムの形態で投与する場合には、勿論、適量投与（ｄｏｓａｇｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は用法・用量全体を通して間欠的ではなく連続的なものとなる。その他の好ましい局所用製剤としては、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾル・スプレー剤およびゲル剤が挙げられ、これらの場合、有効成分の濃度は０．１％〜１５％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲となろう。

本明細書に詳細に述べた化合物は、有効成分を構成することができ、通常、対象とする投与形態、即ち、経口用としての錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに対して適切に選ばれ、従来の調剤慣行に合った適切な薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（本明細書ではこれらを総称して「担体」物質と呼ぶ）と混合して投与する。

例えば、錠剤もしくはカプセル剤として経口投与する場合、有効薬物成分は、エタノール、グリセロール、水などの経口用で毒性がなく薬学的に受容可能な不活性担体と混合することができる。さらに、所望もしくは必要に応じて、この混合物に適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤を混和することもできる。好適な結合剤としては、でんぷん、ゼラチン、グルコースもしくはベータ乳糖のような天然糖、コーン甘味剤、アカシア、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろうなどが挙げられる。こうした剤形に用いる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、でんぷん、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタン・ガムなどが挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明の化合物は、小単層小胞、大単層小胞および多重層小胞などのリポソーム送達システムの形で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成することができる。一部の実施形態として、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されているようにして、脂質成分の膜を薬剤の水溶液で水和させて、薬剤を内包する脂質層を形成する。

また、本発明の化合物は、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせることもできる。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピラン・コポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、もしくはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリジンを挙げることができる。さらに、本発明の化合物は、薬剤の放出を制御するのに有用なクラスの生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーとカップリングさせることができる。

上記薬学的組成物はいずれも、活性化合物、特に有効成分としての式Ｉの化合物を０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％含有することができる。

（その他の実施形態）
本発明の１つ以上の実施形態についてその詳細を前記の添付明細書において説明した。本発明の特定の実施形態についての前記詳細な説明から、生体膜を通過させて移行させるための独自の方法および組成物が開示されたことが明瞭に理解されよう。本明細書では特定の実施形態についてその詳細を説明したが、これは単に例示を目的として例として説明したものであり、以下に添付した特許請求の範囲に対して限定しているものではない。特に、この特許請求の範囲に定義したような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対し、種々の置換、変更および変形を行うことができることは、本発明者により企図されている。例えば、特定のタイプの細胞、または移行させるべき特定のエフェクターの選択については、本明細書に開示した実施形態を知った当業者には日常的な事柄であると考えられる。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、文脈上明らかに別の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数の対象を含む。特に定義しない限り、本明細書に用いている科学技術用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有する。また、本明細書に引用されている全ての特許および刊行物は、引用により本明細書に組み込まれている。

以下に示した実施例は、本発明の好ましい実施形態についてさらに十分に説明するためのものである。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲により定義した本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。

（実施例１：内部移行ペプチドモチーフの特定）
ファージ・ペプチド・ライブラリは、古典的な方法では、線維状ファージＭ１３の誘導体として構築される。ペプチド・ライブラリを、ペプチドモチーフの１〜５個のコピーを提示するキャプシドのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩに融合する。Ｚｗｉｃｋら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４２７−４３６（１９９８）を参照されたい。あるいは、メジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩを用いることによって高価（ｈｉｇｈ ｖａｌｅｎｔ）提示が得られる。しかしながら、これらのタイプのライブラリは、受容体媒介性エンドサイトーシスの対象となるペプチド配列の単離のために最適化されていない。何故なら、ペプチドの１価もしくは低価提示は、線維状ファージのような巨大な構造体を効率的に取り込ませるには不十分であるからである。多価提示のみが効率的取り込みを可能にする。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４８：４５０−４６２（１９９９）を参照されたい。さらに、受容体結合リガンドの内部移行は、原形質膜の特定領域に細胞表面受容体が濃縮され、次いでクラスリン被覆小胞が形成される必要があり（Ｄａｍｋｅ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９：４８−５１（１９９６）参照）、従来のＭ１３ファージでは、こうした特殊で高度に効率的な構造による受容体媒介性内部移行が行われるとは考えられない。

Ｔ７ ４１５ファージ系およびＴ７ ４１３ｂファージ系のファージ・ディスプレイ・ライブラリを構築した。このファージでは、減少した容量内にこの提示ペプチドが４１５個のコピーとして生じる（キャプシドの直径は約５０ｎＭである）。従って、本発明に含まれるのは、以下の基準を満たす新規なファージ系のファージ・ディスプレイ・ライブラリである：４〜５０ｍｅｒペプチドの多価提示（＞４００個のコピー／ファージ）；サイズが小さい（５０ｎＭ）；内部移行したファージを効率的に回収できる；内部移行しなかった結合ファージを除去できる；および個別ペプチド配列の数が大である（＞１０^９個のヘプタペプチド配列を示す３×１０^８個の独立クローン）。

このライブラリを用いて、βＴＣ−３細胞モデル内への高分子の効率的、特異的な細胞内送達を誘導するペプチドモチーフの単離に成功した。さらに、このライブラリを５種の異なる（非−β）細胞株に対して用い、それぞれの場合で、各細胞型に特異的なペプチドモチーフの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）について観察した。この方法の概括的な全体像を以下に説明する。

（選択／濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法）
多くのインスリン分泌細胞株、齧歯類およびヒト単離島、およびＦＡＣＳにより精製したβ細胞に対するファージ・ディスプレイ・ライブラリをパニングし、最終的に、これを直接動物（マウス、ラット、ブタ）に注射した後、島を抽出して内部移行したファージを回収する。パニング方法は、ファージの添加、回収および増幅の少なくとも３サイクルからなる。あるいは、最も選択的なリガンドを単離するために、このライブラリを種々のインスリン非分泌細胞と共にインキュベートした後にβ細胞に対するライブラリを選択することにより、他の細胞型に結合するファージを除去する。記載されるように、クロロキンを用いてリソソームによる分解をブロックする実験を実施する。Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４８：４５０（１９９９）を参照されたい。

（ファージ特異性の測定）
選択したファージを単離し、多くの種々の細胞および器官と共にインキュベートする。例えば、一部の実験として、選択したファージをインスリン分泌およびインスリン非分泌細胞および器官とインキュベートする。取り込みについては、回収されたファージ数をカウントすることにより測定する。抗ファージ抗体を用いて免疫細胞化学的研究を実施する。

（ファージ由来（ｐｈａｒｇｅ−ｂｅａｒｄ）ペプチドの特徴付け）
単離ファージからのＤＮＡを配列決定し、発現されるペプチドを推定する。直接の内部移行を誘導するペプチド、およびこれらのペプチドの変異型を化学的に合成し、Ｎ末端をＦＩＴＣで標識し、もしくはヨウ素化する。標識ペプチドを種々の細胞型、齧歯類およびヒト単離島に加え、そして、マウスに直接注射する。取り込みの特異性、細胞内局在性、クリアランスおよび安定性について評価する。Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：２０３（１９９５）を参照されたい。

（生化学的アッセイ）
インスリン分泌細胞およびインスリン非分泌細胞を分析するため、特徴付けを行ったペプチドを３種の既知配列：ＹＶＡＤ（カスパーゼ阻害因子、配列番号３５；Ｒｏｕｑｕｅｔら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１１９２（１９９６））、ＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰ（ＮＦ−κＢ核内局在化阻害因子（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５（１９９５）、配列番号３６）もしくはＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＪＮＫ阻害因子、Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：７７−８２（２０００）、配列番号３７）に結合させる。これらのペプチドは、化学的に合成し、インスリン分泌細胞およびインスリン非分泌細胞に加える。カスパーゼ、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫは、一般的活性化剤エトポシド（Ｋｉｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０：４３９（２０００）参照）もしくはアニソマイシン（Ｕｓａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１８５（１９９８）参照）により活性化する。上記ペプチドによるカスパーゼ、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫの阻害についてはβ細胞および非β細胞を用いて検討する。以上の実験によって、これらのペプチド担体が薬剤となり得る物質を活性のある形態で特にβ細胞内に移送することができるかどうかが分かる。

（治療剤となり得る物質のＧＬＰ−１受容体による取り込み）
ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）の発現は、主として脳および膵臓に限定されている。Ｙａｍａｔｏら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２９：５６（１９９７）を参照されたい。この受容体は、アゴニストに結合した後、内部移行される。Ｗｉｄｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０：２０３（１９９５）を参照されたい。こうした性質があるため、ＧＬＰ−１Ｒは膵β細胞への治療剤の選択的送達を媒介する魅力的なツールとなる。この特性は、上に記載されるように評価される。ＧＬＰ−１Ｒを用いて集められた情報が、例えば、高められた選択性を有する二重特異的ダイマーの設計において、補助する。

（ＧＬＰ−１受容体に対する他の内部移行モチーフの特定）
ＧＬＰ−１Ｒを用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞は、上記のような選択実験の基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）となる。新規に特定したモチーフについてその特異性およびエンドサイトーシス誘導能を評価する。

（全−Ｄ−レトロ−インベルソ型（ａｌｌ−Ｄ−ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドの作製）
一部の実施形態として、上記ペプチドはレトロ−インベルソ型ペプチドとして合成することができる。安定性が高く、免疫原性の少ない全Ｄ−レトロ−インベルソ型ペプチド（Ｓｅｌａ、Ｚｉｓｍａｎ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１：４４９（１９９７）参照）について、前述の方法により、分析する。

進化によって、天然のタンパク質にはほぼＬ型アミノ酸のみが存在することになった。従って、事実上全てのタンパク質分解酵素は、隣接するＬ型アミノ酸間のペプチド結合を切断するので、Ｄ型アミノ酸からなる人工的なタンパク質もしくはペプチドは、タンパク質分解に対してかなり抵抗性である。この抵抗性は薬剤の設計者には魅力的であったが、Ｌ−アミノ酸からなるタンパク質の生体系が排他的であるため、このようなタンパク質は、鏡像異性タンパク質により形成される鏡像面と相互作用することができないということになる。従って、通常、全Ｄ（ａｌｌ−Ｄ）型アミノ酸タンパク質には生物効果もしくは活性がない。

線状の修飾レトロ−ペプチド構造については長い間研究されてきており（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：１−７（１９７９）参照）、「レトロ−アイソマー」という用語は、親ペプチドに対して配列の方向が逆であるアイソマーを含むとされた。「レトロ−インベルソ・アイソマー」とは、配列の方向が逆で、各アミノ酸残基の対掌性が逆であり、従って末端基相補性が生じ得ない線状ペプチドのアイソマーのことを意味する。

さらに最近、Ｊａｍｅｓｏｎらは、これら２つの性質、即ち、逆合成および対掌性の変化を組み合わせることにより、ＣＤ４受容体のヘアピンループのアナログを設計した。Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：７４４−７４６（１９９４）およびＢｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８：６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ−鏡像異性体と逆合成を組み合わせたことによる最終的な結果は、各アミド結合のカルボニル基とアミノ基とが交換されるが、各α炭素の側鎖基の位置は保存されたことである。Ｊａｍｅｓｏｎらは、従来の全−Ｌ鏡像異性体の限定的なインビボ活性（タンパク質分解を受けやすいことに起因する）とは対照的に、逆Ｄペプチドの生物活性が増大することを明らかにした。

ヒト・クラスＩ組織適合性分子ＨＬＡ−Ａ２の非天然リガンドとして使用することができる部分修飾したレトロ−インベルソ偽ペプチドが報告されている。Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０３０−２０３９（１９９６）を参照されたい。このような非天然リガンドでは、安定性およびＭＨＣ結合能が増大した。

レトロ−インベルソ・ペプチドを、以下のようにして配列が既知のペプチドに対して作製する。レトロ−インベルソ・ペプチドアナログをデザインし、合成するためのモデル・ペプチドとして、既知の配列を有するペプチド（例えば、腫瘍抗原ペプチド）を選択する。このアナログは、Ｄ−アミノ酸を用い、このレトロ−インベルソ・ペプチド内のアミノ酸の配列がモデルとして働く選択したペプチド内の配列と正確に逆になるように、Ｄ−アミノ酸を結合させてペプチド鎖とすることにより合成する。例えば、このペプチド・モデルがＡＢＣの配列を有するＬ−アミノ酸で形成されているペプチドである場合、Ｄ−アミノ酸で形成されるそのレトロ−インベルソ・ペプチドアナログはＣＢＡの配列を有することになる。Ｄ−アミノ酸の鎖を合成してレトロ−インベルソ・ペプチドを作製する方法は、当該分野で公知であり、前記文献において説明されている。

天然ペプチドの場合の固有の問題が天然のタンパク質分解酵素により分解されることにあるので、本発明のペプチドは、目的ペプチドの「レトロ−インベルソ・アイソマー」を含むように作製することができる。従って、天然性のタンパク質分解からペプチドを保護することにより、この特定のヘテロ２価（ｈｅｔｅｒｏｂｉｖａｌｅｎｔ）もしくはヘテロ多価（ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）化合物の有効性は増大するはずである。

レトロ−インベルソを含むペプチドでは、天然のタンパク質分解酵素による分解から保護されるため、レトロ−インベルソを含まないアナログと比べて、生物活性が増大すると予測される。

（修飾ペプチドの作製）
一部の実施形態として、このペプチドは、修飾ペプチドとして合成することができる。この修飾ペプチドは前述の方法により分析する。

アナログは、アミノ酸配列により、またはアミノ酸配列に影響を与えない修飾により、あるいはこれらの両者により天然のペプチドと異なるものとすることができる。好ましいアナログとしては、その配列が、単に保存的アミノ酸置換、好ましくは１、２もしくは３置換のみ、例えば、１つのアミノ酸の同様な特徴を有する別のアミノ酸による置換（例えば、グリシンをバリンに、リジンをアルギニンに置換など）によって、またはペプチドの生物活性を消失させない１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは挿入によって、その野性型配列（すなわち、天然に生じるペプチドの相同な部分の配列）と異なるペプチドが挙げられる。

（普通一次配列に影響を与えない）修飾としては、インビボもしくはインビトロにおけるペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化もしくはカルボキシル化が挙げられる。また、糖鎖形成の修飾、例えば、ペプチドの合成およびプロセッシング過程において、または、例えば、糖鎖形成に影響を与える酵素、例えば、哺乳類のグリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素をペプチドに作用させることによる別のプロセッシング工程において、ペプチドの糖鎖形成パターンを修飾することによるものも挙げることができる。また、リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンもしくはホスホスレオニンを有する配列を挙げることもできる。

本発明は、１つ以上のペプチド結合が、ペプチダーゼにより切断されにくい別のタイプの共有結合（「類似ペプチド結合」）に置換されたアナログを含む。対象に注射後のペプチドの蛋白性分解が問題となる場合、特定の切断されやすいペプチド結合を切断不能の類似ペプチド結合に置換すると、得られるペプチドは安定性が増し、治療剤としてより有用なものとなる。このような類似ペプチド結合およびこれをペプチドに組み込む方法は、当該分野では周知である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末端ブロック基も有用である。ペプチドの荷電アミノ−末端およびカルボキシ−末端をブロックすると、ペプチドが疎水性細胞膜を通過して細胞内へ入るのが促進されるという別のメリットがある。

（多量体ペプチドの作製）
多量体リガンドでは、内部移行速度の増大につながる最大数桁の結合力の向上がみられる。Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１６６３（１９９７）およびＹｏｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１６４（１９９９）を参照されたい。単一特異性ダイマーは、強い結合力を示し、二重特異性ダイマーでは、特異的に細胞を標的にする物質としての実用面の潜在能力を向上させることができる選択性が高まると考えられる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：５３７（１９９６）を参照されたい。単量体および多量体ペプチド（単一および多重特異性）は、ペプチドとして、あるいは例えば、柔軟性のあるペプチジルまたは糖ベースの主鎖を有するペプチド類似体として合成することができる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：５３７（１９９６）、Ｚｅｎｇら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２：６６（１９９６）およびＵｌｂｒｉｃｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６４．（１．−３．）：６３−７９．、６４：６３（２０００）を参照されたい。

（細胞内局在性）
単離した種々のペプチド配列は、種々の細胞コンパートメント（例えば、核、ミトコンドリア、細胞質ゾルなど）に局在し得る。これについては、標識（例えば、ヨウ素化もしくはＦＩＴＣ標識）ペプチドを用いて調べる。この局在性情報を利用して機能性研究をデザインする。例えば、細胞質ゾル内に蓄積するペプチドは、ＮＦ−κＢの核移行を阻害するのに好ましく、核内に移行するペプチドは、ＪＮＫを阻害するのに最も適している。一部の実施形態として、核局在化モチーフのような配列を結合体に加えて、担体を適切な細胞コンパートメントへ再誘導することができる。

（機能性研究）
カスパーゼ、ＮＦ−κＢもしくはＪＮＫ阻害剤に結合させた、β細胞を標的とするトランスポーターペプチド（例えば、単量体もしくは多量体のＬ型もしくはＤ型エナンチオマー）をβ細胞株、ＦＡＣＳ精製β細胞ならびに単離ヒトおよび齧歯類の島（ｉｓｌｅｔ）に加える。ＩＬ−β（ＴＮＦαおよびＩＦＮγを併用）によりアポトーシスを誘発させ、アポトーシスに対する抵抗性を調べる。

（インビボ糖尿病実験）
糖尿病発症前および発症後の状態のＮＯＤマウスにエフェクタ・ペプチド（カスパーゼ、ＮＦ−κＢもしくはＪＮＫ阻害剤に結合させたβ細胞を標的とするペプチド）を注射する。用量および注射頻度は、前述のようにして決定する。次いで、糖尿病の発生を測定する。

（免疫原性に関するアッセイ）
齧歯類およびウサギを用い、ペプチドの免疫原性の潜在性について評価する。

（クローニング）
特定の細胞による効率的な内部移行を誘導するペプチドモチーフについては実施例ＩＩＩおよびＩＶにおいて説明する。このペプチドを用いて、確立された手順により、例えば、ＩＮＳ−１、βＴＣ−３およびヒト島ｃＤＮＡライブラリからの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体のクローニングならびに特徴付けを行う。Ｔｈｏｒｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：８６４１（１９９２）およびＶｏｌｚら、ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ．３７３：２３（１９９５）を参照されたい。

（特徴付け）
上記のクローニングした受容体の組織分布について、インスリン分泌およびインスリン非分泌細胞および器官のノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより調べる。結合速度、クリアランスおよび内部移行の特異性についてはＣＯＳ−７細胞にこの受容体を一時的にトランスフェクションさせることにより調べる。対照ペプチドは、変異配列、および例えば、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、グルカゴン、セクレチンなどの既知ペプチドとする。これらの受容体に対する別の内部移行モチーフについては上記のトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞において前記ライブラリをパニングすることにより特徴付ける。

（実施例ＩＩ：トランスポーターペプチドのスクリーニング方法）
特に指定した場合を除き、溶媒および試薬は全てフルカ社（Ｆｌｕｋａ）、ブックス（Ｂｕｃｈｓ）、スイスから入手し、分析品質以上のものとし、さらに精製することなく使用した。アミノ酸は全てペプチド・インスティテュート社（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）（日本）から購入した。樹脂はアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国；ノバビオケム社（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、スイスもしくはバッヘム社（Ｂａｃｈｅｍ）、スイスから入手した。水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。バイオアッセイにはインスリン分泌細胞株βＴＣ−３を用いた。Ｅｆｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９０３７−９０４１を参照されたい。

（ファージの調製および濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法）
標準的な手順により（例えば、ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＴ７ ４１４ファージもしくはＴ７ ４１３ｂファージを用い）、キャブシドの表面にランダムな１５マーエピトープを提示する３×１０^８個の単独（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ファージのライブラリを作製した。ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８（１９９３）を参照されたい。（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｏｔｔの上記文献に）記載されるように、ファージを増幅させた後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により精製し、最終的に、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０：１ｍＭ、ＴＥ）中に１０^１０個感染性粒子／μｌの濃度で再懸濁した。培養培地中の細胞にファージ（１０^１２個）を１〜２４時間加えておいた。エンドサイトーシス小胞内でタンパク質分解を免れたファージの単離を容易にするには、インキュベーション時間をさらに長くすることが好ましかった。結合および内部移行を行わせた後、細胞を洗浄し、内部移行されなかったファージを、サブチリシン（３ｍｇ／ｍｌ）（４４）で消化させて破壊した。充分に洗った後、２％デオキシコール酸塩、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．０の緩衝液で細胞を溶解させることにより、内部移行されたファージを回収した。回収したファージは、最終的にＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ）を用いて増幅させ、前述のようにして精製した。次いで、この選択したファージの調製物を用いて第２ラウンドのパニングを行った。３〜５ラウンドを順次実施することにより特定のファージ保有ペプチド配列を濃縮した。

（免疫細胞化学および蛍光による検討）
上記の濃縮スキームによって単離した単一ファージを増幅させた後、培養培地中の細胞に２４時間加えておいた。次いで、培地を洗い流し、細胞を冷メタノール−アセトン（１：１）で５分間固定した。ファージ・キャプシドに対する抗体は、蛍光結合二次抗体と共に用いた。古典的な蛍光顕微鏡による検討および共焦点顕微鏡によるアッセイを実施した。組織は、処理の前にパラフィン包埋した。

（ペプチド）
Ｃ−末端アミド基を有し、必要に応じてＦＩＴＣ標識もしくはヨウ素化したペプチドを、古典的なＦ−ｍｏｃ化学（オースペップ社（Ａｕｓｐｅｐ）、オーストラリア）を用いて合成した。ペプチドは全てＨＰＬＣにより精製し、質量分析法によって分析した。

（生化学的検討）
種々の細胞株、例えばβＴＣ−３、ＩＮＳ−１、ＨｅＬａ、ＷｉＤｒ、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ−７などにおいて、ペプチド添加の１時間後からＪＮＫ、ＮＦ−κＢおよびカスパーゼをエトポシド（ＶＰ−１６，Ａｌｅｘｉｓ）により１時間賦活化する。細胞抽出物を処理して（ｃ−Ｊｕｎを基質として用いる固相ＪＮＫアッセイ（Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６４６６（２０００）参照）により）ＪＮＫ活性、（電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５（１９９５）参照）により）ＮＦ−κＢの核移行および（アップステート・バイオケミカルス社（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から市販のキットおよび抗体により）カスパーゼ活性を測定する。

（アポトーシスの測定）
アポトーシスは、以前に報告された方法に従い、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびヨウ化プロピジウムの組合せを用いて測定する。Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６４６６（２０００）、Ｈｏｏｒｅｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１５６８（１９９６）を参照されたい。

（島）
島は、Ｇｏｔｏｈらの方法（Ｇｏｔｏｈら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４３：７２５（１９８７）参照）により単離する。ヒト島は、例えば、「Ｉｎｓｅｌ Ｓｐｉｔａｌ」、ベルン（Ｂｅｒｎ）、スイスから入手することができる。

（マウス）
正確な投与量および注射の時間枠は、各ペプチドごとに最適化する。しかしながら、ＪＮＫＩを用いたこれまでの経験から、ペプチドの１ｍＭ ＰＢＳ溶液１００μｌを２日おきに注射するのが合理的な出発点であることが分かっている。

（λＺＡＰ発現ライブラリ）
λＺＡＰ発現原核／真核発現ベクター中のＩＮＳ−１ ｃＤＮＡライブラリを用いてＩＢ１ ｃＤＮＡおよびＩＢ２ ｃＤＮＡをクローン化した。Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８４３（１９９８）およびＮｅｇｒｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６４：３２４（２０００）参照。このライブラリは、真核ＣＭＶプロモータの制御下で、単純なヘルパー・ファージ切り出し（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって容易にプラスミド・ライブラリに変換される。

（実施例ＩＩＩ：ファージ・ディスプレイ・ライブラリのパニングおよび内部移行されたペプチドモチーフの特徴付け）
β細胞を特異的に標的にして薬剤を送達させることができれば、Ｉ型糖尿病の治療に極めて大きな影響を与えることになろう。基本的にβ細胞の機能（すなわち、インスリン分泌）を変えないβ細胞破壊のブロッカーはすでに存在する（例えば、ＪＢＤ、ｂｅｌ−２）。こうした分子の１つ（ＪＢＤ）を低分子ペプチドに変換しても全生物活性を保持させることができることが示されている。

膵β細胞株βＴＣ−３は、本明細書に記載したファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いてパニングした。下記の表１に示すように、選択の各サイクルにおいて、回収ファージ数の選択的な濃縮が認められた。βＴＣ−３細胞を用いるパニング実験を、濃縮手順の各工程で１０^９個のファージを用いて実施した。０℃（エンドサイトーシスはみられない）で回収されたファージ数は１００個未満であり、このことから、本明細書に記載した条件下では、内部移行されなかった細胞外の結合ファージのバックグラウンドは極めて低いことが分かる。

βＴＣ−３細胞株における３工程のパニング後のファージ回収率を表２に示す。

表３に示した時間βＴＣ−３細胞とインキュベートしたファージＰ１（配列番号１）を用い、滴定実験を実施した。また、投入／回収ファージの比率も示す。滴定実験から、最初の投入Ｐ１ファージの１０％も回収することができることが分かった。

取り込みの特異性についての測定は、５種の細胞株における回収ファージ数をタイトレートすることにより行った。ファージ（１０^８個）を、示した細胞株と１６時間インキュベートした後、表４に示したように、内部移行されたファージ数および回収されたファージ数を算定した。インテグリン内部移行モチーフを提示する対照ファージは、全ての細胞株に対して同様な回収ファージ数（１〜３×１０^６個）を示した。このことから、Ｐ１（配列番号１、表５参照）は、βＴＣ−３細胞によって、テストした他のどの細胞株より１０，０００〜１，０００，０００倍効率的に内部移行されることが分かる。

次いで、ファージＰ１の提示ペプチドの配列に基づいてペプチドを合成した。ＦＩＴＣで標識した１０アミノ酸ランダム配列にＰ１ ５マーペプチドの配列を結合させた。対照配列は、Ｐ１ ５マー配列を（Ａｌａ）_５で置き換えた以外は同一であった。細胞にペプチド（１０μＭ）を１時間加え、細胞を洗い、冷メタノール−アセトン（１：１）で固定した。βＴＣ−３細胞内のＦＩＴＣ標識Ｐ１ペプチドは可視化することができたが、他の細胞型ではできなかった。

最後のサイクルの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）時の２０個の回収ファージの配列解析結果を表５に示す。重要なことであるが、全ての配列は、５個のアミノ酸の同じ保存コンセンサス配列に厳密に従った。このことから、ファージの効率的な取り込みを誘導する保存モチーフが特異的に選択／濃縮されることが示唆される。こうして得られたペプチドモチーフの大部分は、プロタンパク質転換酵素のコンセンサスなＲ−Ｘ−Ｘ−Ｒに従う。この知見は、潜在的薬物および高分子を特定の細胞型の細胞内に送達するためのビヒクルとしてプロタンパク質転換酵素を使用する提案の根拠を成すものである。

（実施例ＩＶ：多量体結合体）
ファージ・ライブラリから得られるリガンド・ペプチドは低親和性（マイクロモル程度）とすることができる。その結合親和性もしくは結合力は、ペプチド分子のコピーを多量体化することにより、例えば、ペプタボディ（ｐｅｐｔａｂｏｄｙ）を形成させることにより向上させることができる。ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−９０（１９９０）、Ｒｅｎｓｃｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６２３−３６２７（１９９４）、およびＡｌｅｘｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１６６３−１６６８（１９９７）を参照されたい。ファージを用いた実験から、ファージ・ペプチドＲＲＴＫ（配列番号１、上記参照）は受容体媒介性エンドサイトーシスを介してβＴＣ−３細胞により特異的に取り込まれるが、その内部移行効率は低い（これはその低親和性結合（ほぼマイクロモルの程度）に起因し得る）ことが分かった。レポーター・タグ（ＦＩＴＣまたはビオチン）と共にこのペプチドの複数（４もしくは８個）のコピーを有する一連の多量体（図１および２）を構築した。

本発明の多量体トランスポーターペプチドは、式Ｉ：
［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ （Ｉ）
によって表すことができ、式中、Ｐは前述のコンセンサスモチーフ（Ｘ_ｍＲＸ_ｏＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＲＸ_ｎ）、（Ｘ_ｍＲＲＸＲＸ_ｎ）および（Ｘ_ｍＲＸＲＲＸ_ｎ）のトランスポーターペプチドである。例えば、このペプチドは、配列Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４を含むことができ、式中、Ｘ_１およびＸ_４はＲもしくはＫとすることができ、Ｘ_１およびＸ_４は任意のアミノ酸とすることができる。ｖによって表される所与のトランスポーターペプチド内のペプチド数は、２〜８以上の整数とする。任意の所与の多量体トランスポーターペプチドにおいて、それぞれのペプチドは互いに同じか、異なるものとすることができる。好ましいペプチドとしては、例えば、表５に挙げたものがある。

ペプチドとコアとの間のスペーサーは存在していてもしていなくてもよく、従って、ｘは１または０である。好ましいスペーサーは可動性、両親媒性、非免疫原性、およびタンパク質分解酵素に対し非感受性であり、例えば、スクシンイミジル−ＰＥＧ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

企図されるコア部分としては、表７に記載したポリリジン（Ｋ）コアが挙げられ、また、組み込まれたリンカーを有するものも挙げられる。選択されるコアにより、所与の結合体内に存在するペプチドの数が決まる。代表的なコアとしては、Ｃ_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、Ｃ−ＧＧＧ−［Ｋ（Ｃ）］_３−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ−Ｓ）−アミド、（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_４−Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ｓｕｃｃ−ｐｅｇ）−アミドおよび（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ）_８−Ｋ_４Ｋ_２Ｋ−Ｋ（ＧＧＧ）−アミドが挙げられる。リンカーおよびレポーター基は存在していてもしていなくてもよく、従って、ｙおよびｚは、式Ｉにおいて独立に１もしくは０である。

リンカーは存在していてもしていなくてもよい（即ち、ｙは１もしくは０である）。リンカーとしては、コアをレポーターに接続する部分が挙げられ、例えば、ｓｕｃｃ−ＰＥＧもしくはＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ−Ｌｙｓとすることができる。

レポーター基は存在していてもしていなくてもよい（ｚは１もしくは０である）。レポーター基は検出可能な任意の基である。例としては、放射性同位体、蛍光性部分、リン光性部分、化学発光性部分、および量子ドットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他のレポーター基としては、ビオチン、シンテイン、ヒスチジン、赤血球凝集素、ｍｙｃもしくはフラッグ・タグが挙げられる。本明細書において用いる代表的な蛍光レポーター基はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）である。

代表的な多量体トランスポーターペプチドは図１および図２に示した。

多量体トランスポーターペプチド・ユニットもしくは結合体においては、多量体トランスポーターペプチドを、１つ以上のエフェクターと融合させる。このエフェクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、または薬学的に活性な薬剤、例えば、毒素、抗生物質、抗病原体剤（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗原、抗体、抗体断片、免疫調節剤、酵素もしくは治療剤などを含む任意の適切な分子とすることができる。２つ以上のエフェクターが存在する場合、これらのエフェクターは同一もしくは異なるものとすることができる。

従って、本発明の多量体結合体は、式（ＩＩ）：
（［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ）・Ｅ （ＩＩ）
によって表すことができ、式中、Ｐ、コア、スペーサー、リンカー、レポーター、ｖ、ｘ、ｙおよびｚは前記の通りであり、Ｅはエフェクターである。共有結合により融合させた結合体では、化学結合の法則通りに、エフェクターはコア、もしくはリンカー、またはこれらの両方に結合させることができる。

（ペプチド合成）
ペプチド配列ＲＲＴＫ（Ｐ１、配列番号１）を、膵β細胞に結合させるためのペプチドコンセンサスモチーフＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４（ここで、Ｘ_１およびＸ_４はＲもしくはＫとすることができ、Ｘ_１およびＸ_４は任意のアミノ酸とすることができる）を明らかにするファージ・ディスプレイ実験から得た。表６に示されるように修飾したペプチドを、Ｂｏｃ化学により０．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＰＡＭ樹脂を用いて手動で合成した。イタリック体は、対応するタンパク質配列には存在しないリンカー残基およびスペースを示す。この実験に用いたいくつかのコア構造を表７に示す。合成を、Ｂｏｃ化学により０．５ｍｍｏｌのメチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）を用いて行った。

ペプチドは全て、（５％のｐ−クレゾールの存在下に０℃で１時間）ＨＦを作用させて樹脂から切断し、冷エーテルで沈殿させ、５０％アセトニトリルで抽出し、ろ過して凍結乾燥した。粗製ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩＭＳにより特性を決定した。

（フルオレセイン・リンカーの調製）
フルオレセイン・リンカーＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨを、オフォード（Ｏｆｆｏｒｄ）の方法により調製した。Ｏｆｆｏｒｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８７：３４８−６９（１９９７）を参照されたい。簡単に言えば、２ｍｍｏｌのＢｏｃ−アミノオキシアセチル（Ｂｏｃ−ＡＯＡ−ＯＳｕ）および１．２ｍｍｏｌのＮ^ε−（ＴＦＡ）−Ｌｙｓを３ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液に加え、Ｎ−エチルモルホリンをｐＨ値が８〜９となるまで加えた。室温で１５時間、次いで３７℃で１時間インキュベートした後、絶えず撹拌しながら氷酢酸を注意深く加えることによってｐＨ値を３．０に下げた。生成物［Ｂｏｃ−ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＯＨ］を、分取スケールのＨＰＬＣにより単離し、次いで乾燥した。この乾燥した化合物に４ｍｌの水、次いで０．４４ｍｌのピペリジン（最終濃度１Ｍ）を加え、これを室温で４時間インキュベートした後、氷上でｐＨを３．０に調整した。次に、この混合物を０．１％のＴＦＡ１０ｍｌで希釈した。分取ＨＰＬＣにより脱保護物質（Ｂｏｃ−ＡＯＡ−Ｌｙｓ−ＯＨ）を単離し、再度乾燥した。この乾燥物質を３００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、４０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を加え、得られた混合物をＮ−エチルモルホリンでｐＨ８．０に調整した。暗所で１５時間インキュベートした後、生成物を、メタノール／ＣＨ_３Ｃｌ（１：１、ｖ／ｖ）で平衡させたシリカ・カラム［Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（フルカ・ケミー社（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ）、ブックス（Ｂｕｃｈｓ）、スイス）、１．５×２０ｃｍ］を用いたクロマトグラフィーにより精製した。過剰のＦＩＴＣを貫流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分に溶出させ、予測される生成物を含む第二の黄色画分をメタノール／ＣＨ_３Ｃｌ（４：１、ｖ／ｖ）で溶出させた。回転式蒸発により溶媒を除去した後、この乾燥化合物Ｂｏｃ−ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨを（２０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度の）ＴＦＡ中で脱保護し、室温で４５分間置いておいた。次に、ＴＦＡの大部分を蒸発させ、凍結乾燥により乾燥を完了させた。最終生成物［ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨ］は、分取ＨＰＬＣにより単離し、ＥＳＩ−ＭＳにより特性を決定した。

（コアへのペプチドリガンドのアルキル化）
０．９μｍｏｌのＣｙｓ−コア・ペプチド（１．１９ｍｇ）を５０μｌのアセトニトリルおよび１００μｌの水に溶かした（ペプチドは完全には溶けない）。ブロモアセチル−ペプチドの新鮮溶液（ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液の３．６μｍｏｌ溶液）を調製した。次いで、２つの溶液を室温の暗所で混合することによりアルキル化を開始させた。４０分後に生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、そして特性を決定した。

（過ヨウ素酸酸化）
過ヨウ素酸酸化を行うため、０．３７５μｍｏｌのペプチド（表６のペプチド３もしくは４、または表８に挙げたアルキル化ペプチド）を４３３μｌアセトニトリルおよび１．２６ｍｌイミダゾール緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．９５、塩化物対イオン）に溶かした。メチオニン（１１３μｌ、２００ｍＭ）を加えた。次に、１７μｌのＮａＯ_４（０．１Ｍ水溶液）を加えて酸化を開始させた。５分後、４０μｌのエチレングリコール（５００ｍＭ水溶液）を加えることにより反応を停止させた。得られた生成物は分取ＨＰＬＣにより精製し、質量分析法により特性を決定した。

（オキシム化）
次に、過ヨウ素酸酸化により得られたアルデヒドをコア３もしくは４（各コアにＡＯＡ基を含む）、またはＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨと反応させてオキシムを形成した。図１および２に示したオキシム１〜６をこうして作製した。また、表９に予測および実測質量分析データを示した。図１に示されるように、オキシム１〜３については、コアの分枝Ｌｙｓ残基を、αアミノ基とεアミノ基との両方において、スペーサーありまたはなしで、ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのＮ末端でアシル化した。スペーサーと共に、レポータ・タグＦＩＴＣを各構築体のコアに導入した。図２のオキシム４〜６では、コアの分枝Ｌｙｓ残基を、αアミノ基とεアミノ基との両方において、スペーサーとともにＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのＮ末端でアシル化した。スペーサーと共に、レポータ・タグのビオチンを各構築体のコアに導入した。

ＡＯＡＬｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨでオキシム化するために、０．１２９μｍｏｌの酸化構築物を５μｌのアセトニトリルおよび２００μｌのＮａＯＡｃ緩衝液（酢酸０．５７ｍｌおよび水１００ｍｌの混合物と、酢酸ナトリウム０．８２ｇを水１００ｍｌに溶かした溶液とをｐＨ４．０となるように混合した溶液）に溶解させた。この混合物に０．５１６μｍｏｌのＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−ＯＨ（１００μｌのアセトニトリルおよび１００μｌのＮａＯＡｃ緩衝液に８．８ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かしたもの）を加えた後、酢酸を最終濃度が４％となるよう加えた。コア３もしくは４をオキシム化するために、酸化したペプチド３もしくは４の３．８μｍｏｌを１００μｌのアセトニトリルおよび２００μｌのＮａＯＡｃ緩衝液に溶解させた。この溶液に０．４７５μｍｏｌのコア３もしくは０．２３７μｍｏｌのコア４を加えた後、酢酸を最終濃度が４％となるよう加えた。室温で２４時間反応させた後、生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、質量分析により特性を決定した。

４本の分枝のそれぞれの末端にＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチド（ペプチド１）のコピーを有する円形のトリリジン・コア（コア１）にオキシム１（図１）を形成させた。各ペプチドのＮ末端を、ブロモアセチル基とチオール基との特異的な反応により生じるチオエーテル結合を介して結合させた。また、このトリリジン・コアにはスクシンイミジル−ＰＥＧスペーサー、および酸化を受けてアルデヒドを形成することができるセリンを含ませたので、レポーター基アミノオキシアセチル−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）を、オキシム形成を介してこのテトラマーに導入した。ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析により、目的生成物であることが示された：質量分析データ：Ｍｒ実測値４２８９．３１、Ｍｒ理論値４２８９．０４。オキシム１は酸性および中性ｐＨで２４時間安定であった。

オキシム２および３（図１）を、同様にして形成したが、オキシム３ではＲＲＴＫペプチド（配列番号１）とコアとの間に２ユニットのＰＥＧスペーサーを配置し、オキシム２ではＲＲＴＫペプチド（配列番号１）のＮ末端はコア１ではなくコア２と結合させた。質量分析データ：オキシム２：Ｍｒ実測値４４５９．４８、Ｍｒ理論値４４６０．１９；オキシム３：Ｍｒ実測値６７０８．２９、Ｍｒ理論値６７０８．００。

オキシム４（図２）を、オキシム３と同様にして合成したが、ＦＩＴＣ基をレポーターとするのではなく、ビオチン基をトリリジン・コアのアミド結合を介して直接結合させた。質量分析データ：Ｍｒ実測値６１６０．０、Ｍｒ理論値６１６０．３。オキシム５はオキシム４と同様であったが、ＲＲＴＫ（配列番号１）残基は全てＤ型であった。質量分析データ：Ｍｒ実測値６１５８．６、Ｍｒ理論値６１６０．３。

オキシム６を、オキシム４と同様に合成したが、ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのコピーを４個ではなく、８個含む。質量分析データ：Ｍｒ実測値１１６４６．１、Ｍｒ理論値１１６４３．６。

（免疫細胞化学および蛍光による検討）
前述の濃縮スキームによって単離した単一ファージを増幅させた。このファージ・ペプチドおよびオキシム１〜６のうちの１種を培養培地中の細胞に加え、２４時間インキュベートした。次に、培地を洗い流し、細胞を冷メタノール−アセトン（１：１）で５分間固定した。ファージ・キャプシドに対する抗体もしくはビオチン（ペプチド）に対する抗体を、フルオレセイン結合（ファージ）もしくはテキサス・レッド標識（ペプチド）二次抗体と共に用いた。古典的な蛍光顕微鏡による検討および共焦点顕微鏡によるアッセイを実施した。

まず、オキシム１〜３のβＴＣ−３細胞内への侵入について調べた。蛍光による検討では、構築ブロックとして２ユニットのＰＥＧスペースを有するＲＲＴＫペプチドの４つのコピーを用いるテトラオキシム（樹状形）のオキシム３は、βＴＣ−３細胞表面の受容体に明確に結合し、細胞内へ侵入可能であることが明らかになった。オキシム３が優れているのは、細胞表面の受容体への結合を増強するＰＥＧスペーサーの可動性に起因し得る。

次いで、オキシム３に類似のオキシム４〜６を合成し、結合親和力および侵入効率についてアッセイした。ＲＲＴＫ（配列番号１）ペプチドのコピー数を、オキシム６では８個まで増やし、Ｄ−ペプチドが高い安定性を有し、免疫原性がより低いことが実証されているので（Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４８：４５０（１９９９）を参照）、オキシム５では上記ペプチドをＤ−エナンチオマー型に変更した。顕微鏡による検査では、８個のペプチドコピーを有するオキシム６（オクタオキシム）は細胞内へ効率的に侵入することができることが明らかになった。ビオチンに対するテキサス・レッド標識二次抗体によって、このオクタオキシムは、「空胞状」構造体としての細胞の内側に、または細胞膜に局在することが明らかになった。従って、ペプチドコピー数を最大８個まで増加させた多量体は、結合ペプチドの向上した結合活性および移送効率を示す。

図１はオキシム１〜３の構造を示す。コアの分枝Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基は、ＲＲＴＫペプチドのＮ末端でアシル化（スペーサがあってもなくてもよい）されている。スペーサーと共に、レポータ・タグＦＩＴＣが各構築体のコアに導入されている。 図２はオキシム４〜６の構造を示す。コアの分枝Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基は、ＲＲＴＫペプチドのＮ末端でスペーサーを有してアシル化されている。スペーサーと共に、レポータ・タグのビオチンが各構築体のコアに導入されている。

Claims (28)

1. 式Ｉ、
   ［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ （Ｉ）
   による多量体トランスポーターペプチドであって：
   ここで、Ｐは少なくともアミノ酸配列ＲＲＴＫ（配列番号１）を含むトランスポーターペプチドであり、ここで、
   ｖは８であり、
   ｘは、０〜８であり、ｙおよびｚは独立に０または１であり、
   各Ｐは同じでも異なっていてもよく、該トランスポーターペプチドは生体膜を通過して移行し得、
   ここで、該コアは、
   

   

   であり、ここで、Ｇはグリシンであり、Ｋはリジンである、トランスポーターペプチド。
2. 請求項１に記載のトランスポーターペプチドであって、前記スペーサーがスクシンイミジル−ポリエチレングリコールである、トランスポーターペプチド。
3. エフェクターと結合体化されている請求項１に記載のトランスポーターペプチドを含む、トランスポーターユニット。
4. 式ＩＩ：
   （［Ｐ］_ｖ−［スペーサー］_ｘ−コア−［リンカー］_ｙ−［レポーター］_ｚ）・Ｅ （ＩＩ）
   のトランスポーターユニットであって：
   ここで、Ｅはエフェクターであり、
   Ｐは少なくともアミノ酸配列ＲＲＴＫ（配列番号１）を含むトランスポーターペプチドであり、ここで、
   ｖは８であり、
   ｘは、０〜８であり、ｙおよびｚは独立に０もしくは１であり、
   各Ｐは同じでも異なっていてもよいものとし、ならびに該トランスポーターペプチドは生体膜を通過して移行し得、
   ここで、該コアは、
   

   

   であり、ここで、Ｇはグリシンであり、Ｋはリジンである、トランスポーターユニット。
5. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが前記リンカーに共有結合により融合されている、トランスポーターユニット。
6. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが核酸、ペプチドおよび薬学的に活性な薬剤からなる群から選ばれる、トランスポーターユニット。
7. 請求項６に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが核酸である、トランスポーターユニット。
8. 請求項７に記載のトランスポーターユニットであって、前記核酸がＤＮＡである、トランスポーターユニット。
9. 請求項７に記載のトランスポーターユニットであって、前記核酸がＲＮＡである、トランスポーターユニット。
10. 請求項６に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターがペプチドである、トランスポーターユニット。
11. 請求項６に記載のトランスポーターユニットであって、前記エフェクターが薬学的に活性な薬剤である、トランスポーターユニット。
12. 請求項１１に記載のトランスポーターユニットであって、前記薬学的に活性な薬剤が、毒素、抗生物質、抗病原体剤、抗原、抗体断片、免疫調節剤、酵素および治療剤からなる群から選ばれる、トランスポーターユニット。
13. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、各トランスポーターペプチドが５０アミノ酸長未満である、トランスポーターユニット。
14. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、各トランスポーターペプチドが２５アミノ酸長未満である、トランスポーターユニット。
15. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、各トランスポーターペプチドが１５アミノ酸長未満である、トランスポーターユニット。
16. 請求項４に記載のトランスポーターユニットであって、移行が膵Ｂ細胞、肝細胞、結腸細胞、筋肉細胞および肺細胞からなる群から選ばれる組織内へ行われる、トランスポーターユニット。
17. 請求項４に記載のトランスポーターユニットを膵β細胞の膜を通過させて移行させるインビトロの方法。
18. 治療的もしくは予防的に有効な量の請求項４に記載のトランスポーターユニット、および薬学的受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
19. 請求項１に記載の前記トランスポーターペプチドとエフェクターとの間で移行可能な結合体を生成する方法であって、該エフェクターを該トランスポーターペプチドに結合させてトランスポーターペプチド−エフェクター結合体を形成することを含む方法。
20. エフェクターを真核細胞の細胞質および核の中へ移行させるインビトロの方法であって、
    該エフェクターを請求項１に記載のトランスポーターペプチドに結合させてトランスポーターペプチド−エフェクター結合体を形成する工程、および
    該トランスポーターペプチド−エフェクター結合体を該細胞に導入する工程
    を包含する、方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、前記導入工程が、前記トランスポーターペプチド−エフェクター結合体の存在下で細胞培養物をインキュベートすることにより、または前記トランスポーターペプチド−エフェクター結合体を前記細胞内に注入することにより達成される方法。
22. 請求項２０に記載の方法であって、前記真核細胞がヒト細胞である、方法。
23. 請求項２０に記載の方法であって、前記真核細胞がβ細胞である、方法。
24. 真核細胞内のエフェクターの細胞内濃度を増大させるインビトロの方法であって、
    該エフェクターを請求項１に記載のトランスポーターペプチドに結合させてトランスポーターペプチド−エフェクター結合体を形成する工程、および
    該真核細胞の活性な代謝を促進する条件の下、該トランスポーターペプチド−エフェクター結合体の存在下で該細胞をインキュベートする工程
    を包含する、方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、前記真核細胞がヒト細胞である、方法。
26. １つ以上の容器に請求項１８に記載の治療的もしくは予防的に有効な量の薬学的組成物を含む、キット。
27. 疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、被験体の該疾患を処置または予防するために十分な量の請求項１８に記載の薬学的組成物である、薬学的組成物。
28. 請求項２７に記載の薬学的組成物であって、該疾患が、糖尿病、結腸癌、呼吸器疾患、神経変性障害、心臓麻痺、およびウイルス感染症からなる群から選ばれる、薬学的組成物。

Images