JP4512751B2 - タンパク質の分析方法、装置およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法、装置およびプログラムに関する。

通常、タンパク質の構造を解析する場合には、そのタンパク質のモノアイソトピック質量を求めることが必要となる。ここで、モノアイソトピック質量とは、^１２Ｃ，^１Ｈ，^１４Ｎ，^１６Ｏ，^３２Ｓなど、天然界で存在比率の高い同位体の質量数で組成式を計算して得られる質量をいう。

ところで、タンパク質の質量（分子量）を分析する場合には、マススペクトルを用いて行うことが一般的である。即ち、目的とするタンパク質を単離してイオン化し、質量分析装置（ＭＳ）を用いてこれを分析することにより、その質量が求められる。

しかし、タンパク質を構成する元素には、各々同位体が存在し、自然界において一定割合でこれらの同位体が含まることが知られている。例えば、炭素について見てみると、安定な同位体は、おおよそ^１２Ｃ：^１３Ｃ＝０．９８９：０．０１１の割合で存在している。このため、目的タンパク質についてマススペクトルを求めた場合、たとえ単離された純粋なタンパク質であっても、モノアイソトピックピーク以外の複数の同位体ピークが分布したマススペクトルパターンが得られることとなる（図１参照）。

そして、タンパク質の質量が大きくなるに従い、得られる同位体ピークの数が増加し、ピーク１つ当たりの相対的な強度が弱くなり、マススペクトルパターンもブロードとなることが知られている（図２（Ａ）〜（Ｄ）参照）。さらに、タンパク質の質量が大きくなった場合には、モノアイソトピックピークが検出されず、同位体ピークのみが検出されることとなる（図３参照）。

したがって、得られた複数の同位体ピークから、目的タンパク質のモノアイソトピック質量を求めることはできず、このままでは目的タンパク質の構造解析が困難となる。

そこで、これらのモノアイソトピック質量を求める方法としては、各分子量のアベラジンについてそれぞれマススペクトルパターンを予め計算により求めておき、これを実際に測定した目的タンパク質のマススペクトルパターンと比較することにより、モノアイソトピック質量を求める方法が知られている（非特許文献１および２）。

ここで、アベラジンとは、平均的な組成のアミノ酸から構成される仮想的なタンパク質をいう。

そして、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法としては、より精度の高いものが必要とされている。
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００、１１、３２０−３３２ Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９５、６、２２９−２３３

本発明の課題は、より精度の高い、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法、装置およびプログラムを提供することにある。

即ち、本発明は、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法であって、
（ａ）目的タンパク質について第１の質量分析を行う工程、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択する工程、
（ｃ）前記（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて第２の質量分析を行い、マススペクトルパターン１を得る工程、
（ｄ）特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う工程、
（ｅ）前記（ｄ）工程で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択する工程、
（ｆ）前記（ｅ）工程で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る工程、
（ｇ）前記マススペクトルパターン１と前記複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を求める工程、
（ｈ）前記（ｇ）工程で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する工程、
（ｉ）前記（ｈ）工程で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を求める工程、
（ｊ）前記（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記（ｉ）工程で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する工程、
を含む、方法である。

また、本発明は、前記（ａ）〜（ｊ）工程を行った後、（ｃ）工程においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化して（ｃ）〜（ｊ）工程を複数回繰り返し、複数回の（ｊ）工程で出力されたモノアイソトピック質量のうち、最大多数を占める質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択することを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、前記（ｇ）工程の類似度を求める工程が、前記マススペクトルパターン１と前記マススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、前記（ｈ）工程において、コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、前記（ａ）工程における第１の質量分析を、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行うことを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、前記（ｃ）工程における断片化が、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、前記（ｃ）工程におえる第２の質量分析を、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行うことを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、目的タンパク質が、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、上記の方法である。

また、本発明は、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める装置であって、
目的タンパク質について行われた第１の質量分析で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択するタンパク質プレカーサーイオン選択手段、
前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて行われた、第２の質量分析で得られたマススペクトルパターン１を得るマススペクトルパターン１取得手段、
特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う仮想的第１質量分析手段、
前記仮想的第１質量分析手段で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択するアベラジンプレカーサーイオン選択手段、
前記アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る仮想的第２質量分析手段、
前記マススペクトルパターン１取得手段で得られたマススペクトルパターン１と、前記仮想的第２質量分析手段で得られた複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を算出する類似度算出手段、
前記類似度算出手段で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段、
前記類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を算出する質量差算出手段、および
前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記質量差算出手段で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する出力手段、
を備えることを特徴とする装置である。

また、本発明は、前記マススペクトルパターン１取得手段においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化することにより、複数のモノアイソトピック質量を出力させ、最大多数を占める前記質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択するモノアイソトピック質量選択手段、をさらに備えることを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、前記類似度算出手段にて類似度を算出するにあたり、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、前記コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、第１の質量分析は、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、タンパク質プレカーサーイオンの断片化は、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、第２の質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、目的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、上記の装置である。

また、本発明は、タンパク質のモノアイソトピック質量を求めるプログラムであって、コンピュータを、
目的タンパク質について行われた第１の質量分析で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択するタンパク質プレカーサーイオン選択手段、
前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて行われた、第２の質量分析で得られたマススペクトルパターン１を得るマススペクトルパターン１取得手段、
特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う仮想的第１質量分析手段、
前記仮想的第１質量分析手段で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択するアベラジンプレカーサーイオン選択手段、
前記アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る仮想的第２質量分析手段、
前記マススペクトルパターン１取得手段で得られたマススペクトルパターン１と、前記仮想的第２質量分析手段で得られた複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を算出する類似度算出手段、
前記類似度算出手段で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段、
前記類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を算出する質量差算出手段、および
前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記質量差算出手段で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する出力手段、
として機能させることを特徴とするプログラムである。

また、本発明は、前記マススペクトルパターン１取得手段においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化することにより、複数のモノアイソトピック質量を出力させ、最大多数を占める前記質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択するモノアイソトピック質量選択手段、としてさらに機能させることを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、前記類似度算出手段にて類似度を算出するにあたり、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、前記コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、第１の質量分析は、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、タンパク質プレカーサーイオンの断片化は、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、第２の質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、上記のプログラムである。

また、本発明は、目的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、上記のプログラムである。

本発明によれば、精度の高い、タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法、装置およびプログラムが得られる。

図１は、［Ｍ＋Ｈ^＋］１００００のタンパク質の同位体ピークの分布例を示す図である。 図２は、タンパク質の同位体ピークの分布例を示す図である。（Ａ）［Ｍ＋Ｈ^＋］１０００、（Ｂ）［Ｍ＋Ｈ^＋］５０００、（Ｃ）［Ｍ＋Ｈ^＋］１００００、（Ｄ）［Ｍ＋Ｈ^＋］２００００ 図３は、ウマミオグロビン［Ｍ＋Ｈ^＋］１６９４１．９７の同位体ピークの分布を示す図である。 図４は、ウマミオグロビンのプレカーサーイオンにおいてモノアイソトピックピークを選択した場合のフラグメントの例を示す図である。 図５は、ウマミオグロビンのプレカーサーイオンにおいて９番目のピークを選択した場合のフラグメントの例を示す図である。 図６は、ウマミオグロビンのプレカーサーイオンにおいて９番目のピークを選択した場合のｂ_７０プロダクトイオンのマススペクトル（マススペクトルパターン１）を示す図である。 図７は、ウマミオグロビンのｂ_７０プロダクトイオン（ｍ／ｚ７８５０．０８）において、プレカーサーイオンで選択された同位体ピークが６−１２番目であると仮定した場合のマススペクトルと比較した結果を示す図である。 実線：ｂ_７０のマススペクトル（マススペクトルパターン１） 点線：アベラジンを用いて計算された７９００Ｄａの仮想プロダクトイオン（マススペクトルパターン２） 図８は、ウマチトクロームＣ［Ｍ＋Ｈ^＋］１１６９５．１４の同位体ピークの分布を示す図である。 図９は、本発明の方法、装置およびプログラムの動作を示すフローチャートである。 図１０は、本発明の装置およびプログラムの実施形態を示す機能構成図である。

本発明に用いる目的タンパク質の分子量としては、特に制限はないが、１０ｋＤａ以上のタンパク質のモノアイソトピック質量を求める場合に、本発明の方法、装置およびプログラムが特に適している。

以下、本発明の方法について説明する。なお、図９に本発明の方法のフローチャートを示す。

本発明の（ａ）工程において、第１の質量分析を行う場合に、用いる質量分析装置としては、特に制限はないが、例えば飛行時間型質量分析計を挙げることができる。そして、（ｂ）工程で得られた複数の同位体ピークから１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択することを考慮すると、イオン選別の分解能が高い質量分析装置を用いることが好ましい。このような質量分析装置としては、例えば、特開２００４−２８１３５０号公報に記載されたような周回型飛行時間型質量分析装置を挙げることができる。

ここで、（ａ）工程において得られるマススペクトルパターンとしては、例えば、図３に示すものが考えられる。即ち、目的タンパク質について複数の同位体ピークが検出されることとなる。

そして、（ｂ）工程においては、上記（ａ）工程で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、任意の１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択する。ここで選択する同位体ピークとしては、もっとも大きいピークまたはその周辺のピークとすることが好ましい。以下便宜的に、ここで選択されたピークを、ｎ番目の同位体ピークということがある。

つぎに、（ｃ）工程において、（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化する方法としては、特に制限はないが、例えば、電子ビームを照射する方法（ＥＣＤ）や、赤外レーザービームを照射する方法（ＩＲＭＰＤ）、さらには、アルゴンやヘリウムなどの希ガス原子を衝突させる方法（ＣＩＤ）等を挙げることができる。

なお、ここでタンパク質プレカーサーイオンを断片化する部位を変化させ、異なる部位で断片化させて複数の断片について以下の工程を繰り返して行うことにより、より高い精度でモノアイソトピックピークを求めることができることとなる。

また、（ｃ）工程において、断片化されたタンパク質プレカーサーイオンについて第２の質量分析を行う場合に用いる質量分析装置としては、特に制限はないが、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置等を用いることができる。

そして、選択された同位体ピークがモノアイソトピックピークである場合には、このピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを断片化して得られるマススペクトルパターン１は、例えば、図４に示すものとなる。即ち、このタンパク質プレカーサーイオンには、質量数の大きな同位体元素は含まれておらず、これを断片化した場合にもモノアイソトピックピークのみが得られることとなる。

これに対して、選択された同位体ピークがモノアイソトピックピークでない場合には、このピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを断片化して得られるマススペクトルパターン１は、例えば、図５に示すものとなる。即ち、このタンパク質プレカーサーイオンには、質量数の大きな同位体元素が含まれているため、これを断片化して得られるマススペクトルパターン１には、モノアイソトピックピークの他に同位体ピークが現れることとなる。

そして、ここで得られるマススペクトルパターン１を、後述のアベラジンについての仮想的な質量分析により得られるマススペクトルパターン２と比較することにより、選択された同位体ピークが何番目の同位体ピークであるか（即ち、モノアイソトピック質量よりいくつ質量数が多いか）を求めることが可能となる。

より具体的には、マススペクトルパターン１から同位体ピークの強度比を求め、これとマススペクトルパターン２から得られる同位体ピークの強度比とを比較し、その類似度を求めることとなる。

次に、アベラジンを用いてマススペクトルパターン２を求める工程について説明する。

即ち、（ｄ）工程において、特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う。ここで用いる特定の分子量は、例えば、以下のようにして決定される。まず、（ｂ）工程において選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量を、アベラジン１残基当たりの質量で割って、アベラジンの残基数を求める。ここで、アベラジン１残基当たりの質量は１１１．１２５４であり、その組成はＣ_{４．９３８４}Ｈ_{７．７５８３}Ｎ_{１．３５７７}Ｏ_{１．４７７３}Ｓ_{０．０４１７}であることが知られている。そして、このアベラジン１残基当たりのＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓの各原子数に、求めたアベラジン残基数を掛けることにより、アベラジンについて特定の分子式を求めることができる。

次に、上で求めた特定の分子量のアベラジンについて、仮想的な質量分析を行う。上記の分子量を求める際に、アベラジン１残基当たりのＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓの各原子数に、アベラジン残基数を掛けているため、同時にアベラジンの原子組成が求まることとなる。そして、原子組成が分かれば、各原子の安定同位体の存在比を利用して、同位体ピーク強度比を計算することができることとなり、これにより特定の分子量のアベラジンについて仮想的な質量分析を行えることとなる。

なお、同位体ピーク強度比とは、質量分析によって得られたすべての同位体ピークの強度に対する、各同位体ピークの強度の比を意味する。

また、同位体ピーク強度比の計算方法としては特に制限はないが、例えば、各原子の安定同位体存在比の畳み込み積分を用いることができる。

次に、（ｅ）工程として、（ｄ）工程で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する。ここで選択する同位体ピークとしては、用いるアベラジンの質量に応じて適宜決定されるが、例えば、１０〜２０ｋＤａのアベラジンであれば、モノアイソトピックピーク（０番目のピーク）から２０番目の同位体ピークとすることができる。即ち、この程度の質量のアベラジンにおいては、０から２０番目までの２１の同位体ピークにより、全体の同位体ピーク強度比の９５％以上を占めるため、２１番目以降の同位体ピークは計算上無視できるためである。

そして、（ｆ）工程において、（ｅ）工程で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化して、仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る。アベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化する方法としては、例えば、１〜１００００Ｄａずつ、好ましくは５〜１０００Ｄａずつ、より好ましくは１０〜５００Ｄａずつ、さらに好ましくは５０〜２００Ｄａずつ、例えば１００Ｄａずつ断片化する部位を変化させて、ｂ系列およびｙ系列について、各々アベラジンプロダクトイオンを得ることが挙げられる。そして、断片化されたそれぞれのアベラジンプロダクトイオンについて、同位体ピーク強度比を計算できるため、その結果が仮想的な第２の質量分析となり、選択されたアベラジンプレカーサー同位体ピーク毎に、複数のマススペクトルパターン２を得ることができることとなる。

次に、（ｇ）工程として、マススペクトルパターン１と複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を求める。類似度を評価する方法には特に制限はないが、例えば、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２の各同位体ピーク強度比から求めたコサイン係数（マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２をベクトルとみなし、２つのベクトルの内積をそれぞれのノルムで割った値）を用いることができる。

ここで類似度を求めるマススペクトルパターン２としては、マススペクトルパターン１に対応するタンパク質プロダクトイオンの質量電荷比に最も近いアベラジンプロダクトイオンを選択し、これに対応するマススペクトルパターン２を用いることが好ましい。

そして、（ｅ）工程で選択されたアベラジンプレカーサー同位体ピーク毎に、複数のマススペクトルパターン２とマススペクトルパターン１との類似度を評価する。そして、コサイン係数を用いて類似度を評価する場合には、各プロダクトイオンにおけるモノアイソトピックピーク位置が不明であることを考慮して、マススペクトルパターン１、マススペクトルパターン２におけるそれぞれの最大ピークが一致するように平行移動させてコサイン係数を求めることが好ましい。なお、コサイン係数が基準値を下回る場合は、同定不能とすることが好ましい。この場合の基準値としては、用いるタンパク質等により適宜決定されるが、例えば、コサイン係数を用いる場合は０．７以下、好ましくは０．８以下、より好ましくは０．９以下とすることができる。

（ｈ）工程として、（ｇ）工程で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する。

次に、（ｉ）工程として、（ｈ）工程で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、特定の分子量のアベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を求める。これは、（ｈ）工程で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの同位体ピークが、モノアイソトピックピークから数えて何番目であるかを求めることと同義となる。なお、特定の分子量のアベラジンについては、各原子組成が分かっているため、モノアイソトピック質量を計算により求めることができる。

最後に、（ｊ）工程として、（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記（ｉ）工程で得られた質量差を差し引いた質量を、目的タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する。即ち、（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの同位体ピーク（ｎ番目の同位体ピーク）が、モノアイソトピックピークから数えて何番目の同位体ピークであるかを求めることと同義となる。

以上の工程により、目的タンパク質のモノアイソトピック質量が求められることとなる。

なお、（ａ）〜（ｊ）工程を行った後、（ｃ）工程においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化して（ｃ）〜（ｊ）工程を複数回繰り返し、複数回の（ｊ）工程で出力されたモノアイソトピック質量のうち、最大多数を占める質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択することにより、さらに高い精度で目的タンパク質のモノアイソトピック質量を求めることができる。

以下、図１０を参照して、本発明の装置について説明する。

図１０において、本発明の装置１０は、タンパク質プレカーサーイオン選択手段１１、タンパク質プレカーサーイオン選択手段１１に接続されたマススペクトルパターン１取得手段１２、および、仮想的第１質量分析手段１３、仮想的第１質量分析手段１３に接続されたアベラジンプレカーサーイオン選択手段１４、アベラジンプレカーサーイオン選択手段１４に接続された仮想的第２質量分析手段１５を備えている。そして、マススペクトルパターン１取得手段１２と仮想的第２質量分析手段１５は、ともに類似度算出手段１６に接続され、類似度算出手段１６は類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段１７に接続され、類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段１７は質量差算出手段１８に接続され、質量差算出手段１８は出力手段１９に接続され、出力手段１９はモノアイソトピック質量選択手段２０に接続されている。

本発明の装置は上記のように構成されており、以下その作用について説明する。

タンパク質プレカーサーイオン選択手段１１は、目的タンパク質について行われた第１の質量分析で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択する。そして、マススペクトルパターン１取得手段１２は、タンパク質プレカーサーイオン選択手段１１で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて行われた、第２の質量分析で得られたマススペクトルパターン１を得る。

一方、仮想的第１質量分析手段１３は、特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う。そして、アベラジンプレカーサーイオン選択手段１４は、仮想的第１質量分析手段１３で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択する。次に、仮想的第２質量分析手段１５は、アベラジンプレカーサーイオン選択手段１４で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る。

類似度算出手段１６は、マススペクトルパターン１取得手段１２で得られたマススペクトルパターン１と、前記仮想的第２質量分析手段１５で得られた複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を算出する。そして、類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段１７は、類似度算出手段１６で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する。次に、質量差算出手段１８は、類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段１７で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を算出する。そして、出力手段１９は、タンパク質プレカーサーイオン選択手段１１で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記質量差算出手段１８で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する。

以上により、目的とするタンパク質のモノアイソトピック質量が求められることとなる。

なお、モノアイソトピック質量選択手段２０は、マススペクトルパターン１取得手段１２においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化することにより、複数のモノアイソトピック質量を出力手段１９に出力させ、最大多数を占める前記質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択する。

これにより、より精度の高い、モノアイソトピック質量を求めることができる。

本発明のプログラムは、コンピュータを、上記の本発明の装置における各手段として機能させるものである。

シミュレーションによる実施として、ウマのミオグロビンを用いた計算による検証実験を行った。ウマミオグロビンは１５３のアミノ酸残基からなり、モノアイソトピック質量は１６９４１．９７Ｄａである。

まず、（ａ）工程で得られるウマミオグロビンのプレカーサーイオンのマススペクトルパターンを、同位体ピーク強度比を計算することより作成した（図３）。

（ｂ）工程としては、ウマミオグロビンプレカーサーイオンの６番目から１２番目の同位体ピークをそれぞれ選択した場合についての計算を行うものとした。

（ｃ）工程のシミュレーションとして、仮想的な断片化によりｂ系列としてｂ_１０、ｂ_２０、…、ｂ_１５０、ｙ系列としてｙ_３、ｙ_１３、…、ｙ_１４３のそれぞれ１５個ずつ、計３０個のプロダクトイオンを作成した。１価のチャージを持つｂ系列、ｙ系列の質量電荷比は、ウマミオグロビンのアミノ酸配列から計算することができ、その結果を表１に示す。ここで、それぞれのプロダクトイオンがプレカーサーイオンの６番目から１２番目の同位体ピークから生成された場合について同位体ピーク強度比の計算を行い、計３０×７＝２１０個のマススペクトルパターン１を得た。これらの計算は、ウマミオグロビンのアミノ酸配列からそれぞれのプロダクトイオンの原子組成を求めることにより行った。また、同位体ピーク強度比の計算には、分子内の各原子の存在量と安定同位体の存在比を用い、フーリエ変換を用いた畳み込み演算により求めた。

１例として、ウマミオグロビンプレカーサーイオンの９番目の同位体ピーク（１６９５０．９７Ｄａ）を選択して断片化して得たウマミオグロビンプロダクトイオンｂ_７０（７８５０．０８Ｄａ）のマススペクトルパターン１を図６に示す。なお、実際のタンパク質の質量測定においては、モノアイソトピックピークから何番目のピークであるかは不明であり、通常は最も大きいピークまたはその周辺のピークを選択し、ｎ番目のピークとして以下の評価を行うこととなる。

次に（ｄ）工程においては、１６９５０Ｄａのアベラジンを使用して仮想的な質量分析を行った。このときの原子組成はＣ_{７５３．７３８２７１}Ｈ_{１１８４．１３４０５７}Ｎ_{２０７．２２３０７８}Ｏ_{２２５．４７７３９１}Ｓ_{６．３６４５８９}となった。

（ｅ）工程としては、プレカーサーイオンのモノアイソトピックピーク（以下、０番目のピークと表記する）から２０番目までの同位体ピークをそれぞれ選択した場合についての計算を行うものとした。

（ｆ）工程のシミュレーションとして、１６９５０Ｄａのアベラジンを１００Ｄａから１６９００Ｄａまで、１００Ｄａおきに１６９個のアベラジンプロダクトイオンを仮想的に作成した。それぞれに対して０から２０番目までの２１の同位体ピークをアベラジンプレカーサーイオンとした場合における、各アベラジンプロダクトイオンの同位体ピーク強度比を計算した。これにより、１６９×２１＝３５４９個のマススペクトルパターン２を得た。

（ｇ）工程として、（ｃ）工程で得られたマススペクトルパターン１と、（ｆ）工程で得られたマススペクトルパターン２について、類似度の評価を行った。

例えば、図６に示したウマミオグロビンプレカーサーイオンの９番目の同位体ピークを断片化して得たウマミオグロビンプロダクトイオンｂ_７０（７８５０．０８Ｄａ）のマススペクトルパターン１についての類似度の評価は、以下のようにして行った。まず、（ｆ）工程で得られた１６９個のアベラジンプロダクトイオンのうち、７９００Ｄａのアベラジンプロダクトイオンを、ウマミオグロビンプロダクトイオンｂ_７０（７８５０．０８Ｄａ）に対して、最も近い質量電荷比を持つものとして選択した。次に、７９００Ｄａのアベラジンプロダクトイオンにおいて、アベラジンプレカーサーイオンの同位体ピークのうち０から２０番目までを各々選択した場合におけるピークパターンを用い、それぞれに対してマススペクトルパターン１の類似度を評価した。すなわち、０から２０番目までのアベラジンプリカーサーイオンの同位体ピークパターンのそれぞれを、類似度を評価すべきマススペクトルパターン２とした。なお、類似度の評価は、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２のコサイン係数を計算することにより行った。この場合に、実際のマススペクトルを用いる場合には各プロダクトイオンにおけるモノアイソトピックピーク位置が不明であることを考慮して、マススペクトルパターン１、マススペクトルパターン２におけるそれぞれの最大ピークが一致するように平行移動させ、これに対するコサイン係数を計算した。図７に、アベラジンプリカーサーイオンの同位体ピークのうち６〜１２番目の同位体ピークに対する類似度の評価結果を示す。この中で、（ｄ）アベラジンプレカーサーイオンの９番目の同位体ピークのアベラジンプロダクトイオンのマススペクトルパターン２と、マススペクトルパターン１との類似度が最も高いことがわかる（コサイン係数＝１．００）。なお、５番目以前、もしくは１３番目以降の同位体ピークについては、９番目から離れるにしたがって類似度が低くなるため、図は省略した。なお、コサイン係数が０．９以下の場合には、同定不能とした。

（ｈ）工程として、ウマミオグロビンプロダクトイオンｂ_７０を用いた場合には、ウマミオグロビンプレカーサーイオンの同位体ピークは、（ｇ）工程で類似度が最も高かった９番目であると評価された。

これは、ウマミオグロビンプロダクトイオンｂ_７０がウマミオグロビンプレカーサーイオンで９番目の同位体ピークを選択したものとしてシミュレーション生成したものであるため、上記評価結果が正しいものであることが検証された。

（ｉ）工程として、選択したウマミオグロビンプレカーサーイオン（１６９５０．９７Ｄａ）が、モノアイソトピックピークから９番目のピークであることより、ウマミオグロビンのモノアイソトピック質量は、１６９５０．９７−９＝１６９４１．９７Ｄａであることが求められた。

同様な評価手順を、（ｃ）工程で得られたｂ系列、ｙ系列のそれぞれ１５個ずつ、計３０個のプロダクトイオンについて全て行い、各プロダクトイオンにおいてウマミオグロビンプレカーサーイオンの同位体ピークを評価した。結果を表２にまとめる。

表２において、例えばウマミオグロビンプレカーサーイオンの９番目のピークについて見てみると、３０個のプロダクトイオンのうち２７個が正しく９番目のピークであると評価しており、正解率は９０％となっている。

そして、ｂ、ｙ系列の２１０個のプロダクトイオンの９１．４％にあたる１９２個において、プレカーサーイオンの同位体選択ピークを正しく評価することができた。このとき、コサイン係数が０．９以下となるものは見られなかった。また、各プロダクトイオンについてみると、８０〜９０％以上の確率で選択された同位体ピークと一致することが分かる。また、表２において下線で示した部分がプレカーサーイオンの同位体選択ピークを正しく評価されたプロダクトイオン数であるが、いずれにおいても正しく評価したものがもっとも多いことが分かる。よって、ウマウマミオグロビンを用いた場合において、各プロダクトイオンによって評価されたプレカーサーイオンの同位体選択ピークのうち、正しいものが最も多数を占めることが示された。

実施例１と同様のシミュレーションを、ウマチトクロームＣに対して行った。ウマチトクロームＣは１０４のアミノ酸残基からなり、モノアイソトピック質量は１１６９５．１４Ｄａである。

まず、（ａ）工程で得られるウマチトクロームＣのプレカーサーイオンのマススペクトルパターンを、同位体ピーク強度比を計算することより作成した（図８）。

（ｂ）工程としては、プレカーサーイオンの６番目から１２番目の同位体ピークをそれぞれ選択した場合についての計算を行うものとした。

（ｃ）工程のシミュレーションとして、仮想的な断片化によりｂ系列としてｂ_１０、ｂ_２０、…、ｂ_１００、ｙ系列としてｙ_４、ｙ_１４、…、ｙ_９４のそれぞれ１０個ずつ、計２０個のプロダクトイオンを作成した。１価のチャージを持つｂ系列、ｙ系列の質量電荷比は、ウマミオグロビンのアミノ酸配列から計算することができ、その結果を表３に示す。ここで、それぞれのプロダクトイオンがプレカーサーイオンの６番目から１２番目の同位体ピークから生成された場合について同位体ピーク強度比の計算を行い、計２０×７＝１４０個のマススペクトルパターン１を得た。これらの計算は、ウマチトクロームＣのアミノ酸配列からそれぞれのプロダクトイオンの原子組成を求めることにより行った。また、同位体ピーク強度比の計算には、分子内の各原子の存在量と安定同位体の存在比を用い、フーリエ変換を用いた畳み込み演算により求めた。

次に（ｄ）工程においては、１１７００Ｄａのアベラジンを使用して仮想的な質量分析を行った。このときの原子組成はＣ_{５２０．２７９５１４}Ｈ_{８１７．３６６８７１}Ｎ_{１４３．０３８９３９}Ｏ_{１５５．６３９２６１}Ｓ_{４．３９３２５６}となった。

（ｅ）工程としては、プレカーサーイオンのモノアイソトピックピークから２０番目までの同位体ピークをそれぞれ選択した場合についての計算を行うものとした。

（ｆ）工程のシミュレーションとして、１１７００Ｄａのアベラジンを１００Ｄａから１１７００Ｄａまで、１００Ｄａおきに１１７個のプロダクトイオンを仮想的に作成した。それぞれに対して０から２０番目までの２１の同位体ピークをプレカーサーイオンとした場合における、プロダクトイオンの同位体ピーク強度比を計算した。これにより、１１７×２１＝２４５７個のマススペクトルパターン２を得た。

（ｇ）工程として、（ｃ）工程で得られたマススペクトルパターン１と、（ｆ）工程で得られたマススペクトルパターン２について、類似度の評価を行った。

評価は実施例１と同様に行い、その結果を表４に示す。ｂ、ｙ系列の１４０個のプロダクトイオンの６６．４％にあたる９３個において、プレカーサーイオンの同位体選択ピークを正しく評価することができた。このとき、コサイン係数が０．９以下となるものは見られなかった。各プロダクトイオンは、ウマミオグロビンに比べてばらつきはあるものの、４０〜８０％以上の確率で選択された同位体ピークと一致することが分かる。また、表４において下線で示した部分がプレカーサーイオンの同位体選択ピークを正しく評価されたプロダクトイオン数であるが、いずれにおいても正しく評価したものがもっとも多いことが分かる。このようにして、ウマチトクロームＣの場合においても、各プロダクトイオンによって評価されたプレカーサーイオンの同位体選択ピークのうち、正しいものが最も多数を占めることが示された。

Claims (24)

1. タンパク質のモノアイソトピック質量を求める方法であって、
   （ａ）目的タンパク質について第１の質量分析を行う工程、
   （ｂ）前記（ａ）工程で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択する工程、
   （ｃ）前記（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて第２の質量分析を行い、マススペクトルパターン１を得る工程、
   （ｄ）特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う工程、
   （ｅ）前記（ｄ）工程で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択する工程、
   （ｆ）前記（ｅ）工程で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る工程、
   （ｇ）前記マススペクトルパターン１と前記複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を求める工程、
   （ｈ）前記（ｇ）工程で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する工程、
   （ｉ）前記（ｈ）工程で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を求める工程、
   （ｊ）前記（ｂ）工程で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記（ｉ）工程で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する工程、
   を含む、方法。
2. 前記（ａ）〜（ｊ）工程を行った後、（ｃ）工程においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化して（ｃ）〜（ｊ）工程を複数回繰り返し、複数回の（ｊ）工程で出力されたモノアイソトピック質量のうち、最大多数を占める質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記（ｇ）工程の類似度を求める工程が、前記マススペクトルパターン１と前記マススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記（ｈ）工程において、コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記（ａ）工程における第１の質量分析を、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記（ｃ）工程における断片化が、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記（ｃ）工程におえる第２の質量分析を、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 目的タンパク質が、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. タンパク質のモノアイソトピック質量を求める装置であって、
   目的タンパク質について行われた第１の質量分析で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択するタンパク質プレカーサーイオン選択手段、
   前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて行われた、第２の質量分析で得られたマススペクトルパターン１を得るマススペクトルパターン１取得手段、
   特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う仮想的第１質量分析手段、
   前記仮想的第１質量分析手段で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択するアベラジンプレカーサーイオン選択手段、
   前記アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る仮想的第２質量分析手段、
   前記マススペクトルパターン１取得手段で得られたマススペクトルパターン１と、前記仮想的第２質量分析手段で得られた複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を算出する類似度算出手段、
   前記類似度算出手段で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段、
   前記類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を算出する質量差算出手段、および
   前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記質量差算出手段で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する出力手段、
   を備えることを特徴とする装置。
10. 前記マススペクトルパターン１取得手段においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化することにより、複数のモノアイソトピック質量を出力させ、最大多数を占める前記質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択するモノアイソトピック質量選択手段、
    をさらに備えることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
11. 前記類似度算出手段にて類似度を算出するにあたり、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、請求項９または１０に記載の装置。
12. 前記コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
13. 第１の質量分析は、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載の装置。
14. タンパク質プレカーサーイオンの断片化は、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれかに記載の装置。
15. 第２の質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれかに記載の装置。
16. 目的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、請求項９〜１５のいずれかに記載の装置。
17. タンパク質のモノアイソトピック質量を求めるプログラムであって、コンピュータを、
    目的タンパク質について行われた第１の質量分析で得られたタンパク質イオンの複数の同位体ピークから、１つの同位体ピークに対応するタンパク質プレカーサーイオンを選択するタンパク質プレカーサーイオン選択手段、
    前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンを断片化したタンパク質プロダクトイオンについて行われた、第２の質量分析で得られたマススペクトルパターン１を得るマススペクトルパターン１取得手段、
    特定の分子量のアベラジンについて仮想的な第１の質量分析を行う仮想的第１質量分析手段、
    前記仮想的第１質量分析手段で得られたアベラジンイオンの複数の同位体ピークに対応するアベラジンプレカーサーイオンをそれぞれ選択するアベラジンプレカーサーイオン選択手段、
    前記アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択された複数のアベラジンプレカーサーイオンを仮想的に断片化したアベラジンプロダクトイオンについて仮想的な第２の質量分析を行い、複数のマススペクトルパターン２を得る仮想的第２質量分析手段、
    前記マススペクトルパターン１取得手段で得られたマススペクトルパターン１と、前記仮想的第２質量分析手段で得られた複数のマススペクトルパターン２それぞれとの類似度を算出する類似度算出手段、
    前記類似度算出手段で得られた類似度のうち、最も高い類似度を有するマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンを選択する類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段、
    前記類似アベラジンプレカーサーイオン選択手段で選択されたアベラジンプレカーサーイオンの質量から、前記アベラジンのモノアイソトピック質量を差し引いた質量差を算出する質量差算出手段、および
    前記タンパク質プレカーサーイオン選択手段で選択されたタンパク質プレカーサーイオンの質量から、前記質量差算出手段で得られた質量差を差し引いた質量を、前記タンパク質のモノアイソトピック質量として出力する出力手段、
    として機能させることを特徴とするプログラム。
18. 前記マススペクトルパターン１取得手段においてタンパク質プレカーサーイオンを異なる部位で断片化することにより、複数のモノアイソトピック質量を出力させ、最大多数を占める前記質量を前記タンパク質のモノアイソトピック質量として選択するモノアイソトピック質量選択手段、
    としてさらに機能させることを特徴とする、請求項１７に記載のプログラム。
19. 前記類似度算出手段にて類似度を算出するにあたり、マススペクトルパターン１とマススペクトルパターン２のコサイン係数を用いることを特徴とする、請求項１７または１８に記載のプログラム。
20. 前記コサイン係数が０．９を超えるマススペクトルパターン２に対応するアベラジンプレカーサーイオンのみを選択することを特徴とする、請求項１９に記載のプログラム。
21. 第１の質量分析は、周回型飛行時間型質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれかに記載のプログラム。
22. タンパク質プレカーサーイオンの断片化は、タンパク質プレカーサーイオンに電子ビームおよび／または赤外線レーザービームを照射すること、および／または、タンパク質プレカーサーイオンに希ガス原子を衝突させること、により行われることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれかに記載のプログラム。
23. 第２の質量分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置を用いて行われることを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれかに記載のプログラム。
24. 目的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする、請求項１７〜２３のいずれかに記載のプログラム。

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