JP4511517B2

JP4511517B2 - ＣｏＱ１０の微生物による生成

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Publication number: JP4511517B2
Application number: JP2006501840A
Authority: JP
Inventors: ハウムベリン，マークス; ロペズ−ウリバーリ，ルアル; パーキンス，ジョン，ビー．; シュインス，グヒスライン
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2010-07-28
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Also published as: US7435571B2; US20060088920A1; KR20050108359A; JP2006517794A; BRPI0407691A; WO2004074487A1; EP1594967A1; CN1751124A; CN1751124B

Description

本発明は、補酵素Ｑ−１０の合成に関与する酵素、前記酵素をコードする単離ＤＮＡ、および補酵素Ｑ−１０の微生物による生成に関する。

補酵素Ｑ−１０は、動物だけでなく、微生物および植物にも認められる。補酵素Ｑ−１０が人間の健康および疾患において重要な因子であるという証拠が確立され、増加している。補酵素Ｑ−１０は、化学合成、または微生物を用いた発酵により生成することができる。

酵素のデカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素および４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼは、補酵素Ｑ−１０（２，３−ジメトキシ−ジメチル−６−デカプレニル−１，４−ベンゾキノン）、別名ユビキノン−１０の生合成ステップを触媒する。ＤＰＰ合成酵素は、イソプレノイド中間体のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）分子を７回連続して結合することによりＤＰＰを形成する。次に、ＤＤＰは、すべてではないが、大部分の細菌のコリスミ酸から誘導される４−ヒドロキシベンゾエートと結合する。４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼによって触媒されるこのプレニル化の結果、３−デカプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート（３ＤＰ４ＨＰ）が生じる。３ＤＰ４ＨＰの芳香環は、さらに修飾されて、ユビキノンの還元型であるユビキノールを形成する。

イソプレノイド中間体のＩＰＰは、アセチル−ＣｏＡから始まる多段階の触媒経路によって合成される。ｐｈａＡによりコードされる酵素のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、ＩＰＰ合成の第１段階である２分子のアセチル−ＣｏＡの縮合を触媒して、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する。また、アセトアセチル−ＣｏＡは、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生合成のそれが関与する最初の段階を触媒するｐｈａＢ遺伝子産物のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの基質として働く。多くの細菌で、ＰＨＡ生合成に関わる遺伝子は、いくつかのオペロンに分かれる。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓでは、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼをそれぞれコードするｐｈａＡ遺伝子およびｐｈａＢ遺伝子は、あるオペロン上でクラスター形成するが、ＰＨＡ合成経路の最後の酵素をコードするｐｈａＣ遺伝子はこのオペロンの一部ではない。

本発明は、（１）デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素をコードするヌクレオチド配列、および（２）４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡであって、
ＤＰＰ合成酵素をコードするヌクレオチド配列は
（ａ）配列番号１６で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖、
（ｂ）（ａ）に定義のＤＮＡ配列またはその断片と標準的な条件下でハイブリッド形成し、ＤＰＰ合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｃ）配列番号１７で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、ＤＰＰ合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし、ＤＰＰ合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択され、
４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は
（ａ’）配列番号２３で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖、
（ｂ’）（ａ’）に定義のＤＮＡ配列またはその断片と標準的な条件下でハイブリッド形成し、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｃ’）配列番号２４で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｄ’）配列番号２４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択される
単離されたＤＮＡを対象とする。

本明細書で使用する「標準的な条件」下でハイブリッド形成するとは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（これらはいずれも、ここに参照によって組み込む）に記載されているような、ストリンジェントな条件でのハイブリッド形成を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存的であり、異なる状況では異なる。配列が長くなると、より高温でハイブリッド形成する。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨで、特定の配列の熱的融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い温度となるように選択される。Ｔｍは、平衡時において、標的に相補的な配列の５０％が標的配列にハイブリッド形成する温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）である（Ｔｍで、標的配列が過度に存在するとき、平衡時においてプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３では、塩濃度は、約１．０Ｍ未満ナトリウムイオン、特に０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩類）であり、温度は、短いハイブリダイゼーションプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いハイブリダイゼーションプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃である条件である。また、ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによってももたらされる可能性がある。この開示の目的では、そのようなハイブリッド形成に適したストリンジェントな条件は、３７℃の４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝液中でのハイブリッド形成、ならびに少なくとも約５０℃、通常約５５℃〜約６０℃で２０分間、０．２ＸＳＳＣで少なくとも１回洗浄することを含む条件、または同等の条件とする。バックグラウンドの少なくとも２倍を、陽性のハイブリッド形成とする。当業者であれば、同等のストリンジェンシーの条件を得るために、これに代わるハイブリッド形成および洗浄の条件が利用可能なことを容易に認めるであろう。

本明細書で使用する「断片」という用語は約１０以上のヌクレオチドの長さの核酸配列を指す。

本明細書で使用する２つの配列でヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列を、それぞれ後述のように最大限一致するように並べたとき、同じである場合に、２つの核酸配列またはポリペプチドは「同一」と呼ばれる。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列について、「同一」または「同一性」パーセントという用語は、比較ウィンドウ上で比較および最大一致度を見るために並べて、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズム、またはマニュアルのアラインメントおよび目視検査で測定したとき、同じか、または特定の割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性の割合がタンパク質またはペプチドに関して用いられるとき、同一でない残基位置は、しばしば保存的アミノ酸置換により異なることが認められており、この場合、アミノ酸残基は同等の化学的特性（例、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりをするので、分子の機能性特性は変わることはない。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性のパーセントは、置換の保存的性質を補正するため、上方修正される可能性がある。この補正方法は、当業者であれば、十分に承知している。特に、このとき、保存的置換は完全な不一致というよりむしろ部分的なものとして採点されることがあり、その結果、配列同一性の割合が高くなる。したがって、例えば、同一のアミノ酸のスコアを１とし、さらに非保存的置換のスコアを０としたとき、保存的置換のスコアは０〜１の間となる。保存的置換の採点は、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃＢｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、または例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で実施されるように算出される。おそらく、同一の配列の中には、ヌクレオチドが同一でないか、アミノ酸残基が同一でないという違いが見られることがある。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、マルチドメイン酵素の１つのドメインの生物活性が減少または変更する修飾により異なるが、酵素の第２のドメインにおいて第２の生物活性が保存されている場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。通常、ポリペプチドが配列番号１７または配列番号２４のような天然のＤＰＰ合成酵素または４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一の場合、本発明の範囲内であると考えられる。核酸配列が配列番号１６または配列番号２３のような天然のＤＰＰ合成酵素または４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードする核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％同一な場合、本発明の範囲内であると考えられる。

さらに、本発明は（１）配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１７の１つもしくは少数のアミノ酸の欠失、付加、もしくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、ＤＰＰ合成酵素の活性を有するポリペプチドと、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２４の１つもしくは少数のアミノ酸の欠失、付加、もしくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを含むポリペプチドを対象とする。

本明細書で使用する「１つまたは少数のアミノ酸の欠失、付加、または挿入」という用語は、１つまたは少数のアミノ酸の欠失、付加、または挿入により、それぞれのポリペプチド配列が突然変異していることを意味する。本出願では、「少しの」という用語は２以上を意味する。

さらに、本発明は、本発明の新しいヌクレオチド配列を含む構築体も提供し、また、本発明は制御配列も含み得る。

本明細書で使用する「構築体」は、ＤＮＡ挿入物を有する発現ベクターまたはプラスミドなどの、追加のＤＮＡを挿入または付加されたＤＮＡの断片または配列である。そのような「追加のＤＮＡ」は、天然ではこの位置に生じず、当技術分野で公知のクローニング法により挿入または付加されたＤＮＡである。また、この中には、当業者に公知の標準的なＤＮＡの形質転換、導入、または接合の方法により、微生物のゲノムへ挿入するＤＮＡ配列も含まれる。したがって、本発明の状況で用いられる構築体は、本書で開示されるような、当技術分野で公知の方法により、プラスミドもしくは発現ベクターへ挿入するＤＮＡ配列、または微生物のゲノムへ挿入するＤＮＡ配列を含む。適したプラスミドおよび発現ベクターは当業者に公知である。

「制御配列」という用語は、コーディングＤＮＡの転写を制御または媒介する配列を含む。そのような配列は、おそらくコーディングＤＮＡに隣接するか、おそらくコーディングＤＮＡの上流または下流に位置する。制御配列は、プロモーター、転写修飾因子、リボソーム結合部位、ターミネーター、ｍＲＮＡ安定化配列、および翻訳または転写エンハンサー要素を含むが、それらに限定されない。

本発明の１つの実施形態では、上記で特定されるＤＮＡを含む微生物が提供される。したがって、本発明は上記のような構築体を含む微生物を提供する。微生物は細菌または酵母菌が好ましいが、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｔｒｕｅｐｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、カンジダ属、シュードモナス属、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓなどの天然の補酵素Ｑ−１０産生株である細菌または酵母菌がより好ましい。最も好ましいのは、細菌種のＰａｒａｃｏｃｃｕｓｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓまたはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓである。

本発明は、
（ａ）ＤＰＰ合成酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子および／または４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させて、前記タンパク質の活性を高めるステップ、
（ｂ）補酵素Ｑ−１０が生成される培地および条件下で、微生物または宿主細胞を培養するステップ
を含む、微生物における補酵素Ｑ−１０の生成の方法またはプロセスを提供する。ＤＰＰ合成酵素をコードする遺伝子はｄｄｓＡとして知られ、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はｕｂｉＡとして知られている。一態様において、さらに本方法は、前記微生物のｃｒｔＥ遺伝子を突然変異させることにより、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素の活性を除去するステップを含む。

本発明の酵素の活性は、遺伝子のコピー数の増加、より強いプロモーターの使用、ｍＲＮＡの安定化、翻訳の増加、野生型に比べて活性を上昇および／もしくは安定性を向上させた酵素の突然変異型ならびに／または野生型に比べて阻害に対する耐性および／もしくは基質阻害もしくは生成物阻害に対する耐性を有する酵素の突然変異型の使用、またはその他の当業者に公知の手段を含む方法により増加することができるが、方法はそれらに限定されない。

補酵素Ｑ−１０生成のための培地および条件は当業者に公知であり、実施例１の培地および条件の部分で詳細に記述している。

「突然変異」または「突然変異する」という用語は、ここでは修飾と互換的に使用され、天然のヌクレオチド配列における変化を意味し、この結果、タンパク質のアミノ酸配列でも、これに応じた変化が引き起こされる。そのような変化は、タンパク質の機能または活性などに変化を引き起こす可能性がある。突然変異は、フレームシフト、置換、挿入および／または欠失の１つまたは複数を含む様々な方法で引き起こすことが可能であり、ナンセンス突然変異［アンバー（Ｔ／ＵＡＧ）、オーカー（Ｔ／ＵＡＡ）およびオパール（Ｔ／ＵＧＡ）］もこの１つである。欠失は、全遺伝子の欠失を含め、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失と考えられる。そのような突然変異を起こす方法は、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）またはＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）を使用する化学的突然変異生成、ならびに亜硝酸、ＵＶ（紫外線）照射、およびトランスポゾン、挿入要素、または細胞の突然変異率を制御する特定の遺伝子（例えば、ｍｕｔＳおよびｍｕｔＴ）のような生物剤を使用する突然変異生成を含むが、それらに限定されない。また、突然変異は、ＰＣＲにより作成された突然変異を含むＤＮＡ断片の調製物を使用したＤＮＡ組換え法、およびそのような突然変異を含むＤＮＡ断片を、当業者に公知の標準的なＤＮＡの形質転換法、導入法、または接合法により染色体へ導入する（天然の座位または別の染色体部位で）ことにより起こすことができる。

本発明の特別の実施形態は、
（ａ）配列番号１６で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖、
（ｂ）（ａ）に定義されるＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列またはその断片と標準的な条件下でハイブリット形成し、デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡと少なくとも８０％の程度まで同一であり、デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の程度まで同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択されるデカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡと、
（ａ’）配列番号２３で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖、
（ｂ’）（ａ’）に定義されるＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列またはその断片と標準的な条件下でハイブリット形成し、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｃ’）（ａ’）または（ｂ’）のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｄ’）配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡと少なくとも８０％の程度まで同一であり、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｅ’）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の程度まで同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択される４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含むＤＮＡ
から選択された単離ＤＮＡを提供することである。

別の実施形態では、本発明は、ｄｄｓＡおよびｕｂｉＡから選択される遺伝子の発現を高めて、ＤＰＰ合成酵素および４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼから選択される酵素の活性を高めること、ならびに補酵素Ｑ−１０が生成される培地および条件で細胞を培養することを含む微生物での補酵素Ｑ−１０の生成法を含む。

以下の実施例は、本発明の方法をさらに説明するために提供される。これらの実施例は、説明することに限り提供されるのであって、いずれの手法も本発明の範囲を制限することを意図していない。

実施例１：菌株、微生物学的方法、および解析手順

Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓなどの細菌では、イソプレノイド中間体ＦＰＰおよびＩＰＰからのゼアキサンチンの合成に、５段階の酵素反応が関与している。第一に、ｃｒｔＥによりコードされるＧＧＰＰ合成酵素によりゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が生成される。次に、２つのＧＧＰＰ分子が、ｃｒｔＢにコードされるフィトエン合成酵素により触媒されて結合し、フィトエンが生成される。次の酵素は、ｃｒｔＩによりコードされるリコペン合成酵素であり、４段階の不飽和化を実施することによりフィトエンをリコペンに変換する。ｃｒｔＹによりコードされるリコペンシクラーゼが、リコペンをβ−カロテンに変換し、次に、ｃｒｔＺによりコードされるβ−カロテン水酸化酵素により水酸化され、ゼアキサンチンが生じる。リコペン、β−カロテン、およびゼアキサンチンは赤またはオレンジであるが、その他の中間体は無色である。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ２１５８８は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，ＭａｎａｓｓａｓＶＡ２０１１０−２２０１，ＵＳＡ）より入手可能の天然型の海洋性ゼアキサンチン生成細菌（米国特許第３８９１５０４号）である。菌株Ｒ１５３４およびＲ１１４は、古典的突然変異誘発およびスクリーニング法により、ＡＴＣＣ２１５８８から誘導されたゼアキサンチン生成変異体である。菌株Ｒ１５３４およびＲ１１４は、ブダペスト条約の取り決めに従って、以前にＡＴＣＣに寄託され、それぞれ、ＡＴＣＣ株番号ＰＴＡ−３３３６およびＰＴＡ−３３３５が割り当てられている。菌株Ｒ１５３４ｉｎｔＥ、ＵＶ９−４、およびＥＭＳ９−７の構築については、実施例２で詳述する。

培地および条件
大腸菌株は、３７℃でＬＢ培地（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国メリーランド州スパークス）で増殖させた。組換え菌株でのプラスミドの維持のために、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）および／またはカナマイシン（実験によって２５〜５０μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。寒天（最終濃度１．５％）を固形培地に添加した。液体培地は、２００ｒｐｍで、回転振盪機で増殖させた。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株は２８℃で増殖させた。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓに対して使用した培地の組成を以下に記載する（各実験で用いた正確な培地については後の実施例で詳述する）。フラスコで増殖させたＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓのすべての液体培養は、特記しない限り、回転振盪機において２００ｒｐｍで振盪した。寒天（最終濃度１．５％）を固形培地に添加した。培地を高圧蒸気滅菌により滅菌した場合、滅菌後にグルコースを添加して（濃縮原液）、所望の最終濃度を得た。

Ｆ−培地は、トリプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ３０ｇ、Ｄ−グルコース・Ｈ_２Ｏ１０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５ｇを含む（蒸留水１Ｌあたり）。ｐＨは濾過または高圧蒸気滅菌による滅菌前に７．０に調整した。

３６２Ｆ／２培地は、Ｄ−グルコース・Ｈ_２Ｏ３３ｇ、酵母エキス１０ｇ、トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２．５ｇを含む（蒸留水１Ｌあたり）。培地のｐＨは濾過または高圧蒸気滅菌による滅菌前に７．４に調整した。滅菌後、微量元素溶液、ＮＫＰ溶液、およびＣａＦｅ溶液を各２．５ｍＬ添加した。後の３つの溶液は、濾過により滅菌した。微量元素溶液は、（ＮＨ_４）_２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２・６Ｈ_２Ｏ８０ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ６ｇ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ２ｇ、ＮｉＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ０．２ｇ、ＥＤＴＡ６ｇを含む（蒸留水１Ｌあたり）。ＮＫＰ溶液はＫ_２ＨＰＯ_４２５０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＰＯ_４３００ｇを含む（蒸留水１Ｌあたり）。ＣａＦｅ溶液は、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ７５ｇ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ５ｇ、濃ＨＣｌ３．７５ｍＬを含む（蒸留水１Ｌあたり）。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株の流加培養
すべての培養は、凍結した細胞懸濁液（−８０℃で１５〜２０％グルセロース保存）から開始された。流加発酵の前培養は、２組のそれぞれ２００ｍＬの３６２Ｆ／２培地の入った２Ｌのバッフル付き振盪フラスコで調製した。各フラスコに対して解凍した細胞懸濁液１ｍＬを接種物として使用した。前培養の初期のｐＨは７．２であった。前培養は、６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_６６０）が１４〜２２吸光度（使用される菌株による）となったあと、２８℃、２５０ｒｐｍで、２８時間振盪培養した。この培養物は、ＢｉｏｓｔａｔＥＤバイオリアクター（Ｂ．ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ドイツメルスンゲン）で培養し、この中には以下の組成を有する培地を含んだ（蒸留水１Ｌあたり）：Ｄ−グルコース・Ｈ_２Ｏ２５ｇ、酵母エキス（Ｔａｓｔｏｎｅ９００）１７ｇ、ＮａＣｌ４．０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ６．２５ｇ、（ＮＨ_４）_２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２・６Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０３８ｇ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０．０１３ｇ、ＮｉＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．００１ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．４７ｇ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０６２ｇ、ナイアシン０．０１ｇ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ、泡止め剤０．１ｍＬ、ＫＰ溶液３．５ｍＬ。ＫＰ溶液の組成は、Ｋ_２ＨＰＯ_４２５０ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ２００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４１００ｇである（蒸留水１Ｌあたり）。カナマイシン（最終濃度５０ｍｇ／Ｌ）をプラスミド保有株の培地に添加した。すべての方法で使用した供給溶液は、Ｄ−グルコース・Ｈ_２Ｏ５５０ｇ、ＫＰ溶液１８．２５ｍＬの組成を有した（蒸留水１Ｌあたり）。バイオリアクターの初期体積（接種後）は８Ｌであった。前培養は、例えば、初期ＯＤ_６６０値を０．５にするためバイオリアクターに滅菌水５０ｍＬ加えるというように、必要に応じて希釈した。発酵条件は自動的に、２８℃、ｐＨ７．２（ｐＨは２８％ＮＨ_４ＯＨの添加で制御）、最低撹拌速度３００ｒｐｍ、および通気速度１ｖ．ｖ．ｍ．（最終体積に対して）に制御され、溶存酸素は最低相対値４０％に制御された（カスケードで撹拌しながら）。これらの条件下で、培養は約２０時間、供給溶液の添加なしに進めた（回分期）。これ以降、撹拌速度の減速、基礎的消費の急激な減少、ＣＯ_２生成の減少が見られ、このことは初期のグルコースが消費され、供給が開始されたことを示していた。標準的な供給プロフィールは（供給の開始時点から）、１７時間は５０ｇ／ｈから８０ｇ／ｈへ増加し、７時間は８０ｇ／ｈで持続し、次に、１１時間は５５ｇ／ｈへ減少し、残りの発酵期間は５５ｇ／ｈで維持すると定義した。本培養の最終体積は、約１０ｍＬであった。

補酵素Ｑ−１０の分析法

試料の調製および抽出。培養物２０ｍＬを使い捨ての５０ｍＬのポリプロピレン遠心管へ移し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みは除去して廃棄した。ペレットはアセトン１０ｍＬで再懸濁し、試料は２０秒間、音波処理した。この遠心管に栓をし、本試料をＩＫＡＶｉｂｒａｘ振盪機を用いて２０分間混合した。次に、本試料を４０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上澄みはきれいな５０ｍＬのポリプロピレン遠心管に移した。アセトン１０ｍＬおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）１０ｍＬをペレットに加えて、２回目の抽出を行った。１回目の抽出のように、音波処理、混合、および遠心分離のステップを繰り返した。２回目の抽出物から上澄みを除去し、１回目の抽出の上澄みと混合した。脱水を促進するため、エタノール５ｍＬを混合した抽出物に添加した。試料の混合後、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発器を用いて溶媒を除去した（外界温度）。残渣はＴＢＭＥ１ｍＬ＋エタノール１ｍＬで再び可溶化した。次に、溶解を促進するために超音波槽の中で試料に５分間音波処理を行った。最後に、試料を遠心分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析のために上澄みをこはく色のガラスバイアルに移した。

ＨＰＬＣ。逆相ＨＰＬＣ法は、ユビキノンおよびこれに対応するヒドロキノンを同時に判定するために開発された。本法により、補酵素Ｑ−１０からカロテノイドであるフィトエン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、およびゼアキサンチンを明確に分離することができる。クロマトグラフィーは、サーモスタット調節の自動サンプル採取装置とダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。本法のパラメータは次の通りであった。

カラム：ＹＭＣカロテノイドＣ３０カラム；５μ、スチール、２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＹＭＣ、特許番号ＣＴ９９Ｓ０５２５４６ＷＴ）
ガードカラム：ＰｅｌｌｉｇｕａｒｄＬＣ−１８カートリッジ、２０ｍｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ、特許番号５９６５４）
移動相：アセトニトリル、メタノール、ＴＢＭＥの混合液（比率５８％、１０％、３２％）、均一濃度溶離
実行時間：２５分
通常カラム圧：開始時４８ｂａｒ
流速：１．０ｍＬ／分
検出：紫外部２８０ｎｍ
注入量：２０μＬ
カラム温度：１５℃

試薬。アセトニトリルおよびＴＢＭＥはＨＰＬＣグレードのものをＦｌｕｋａより購入した。エタノール（ｐ．ａ．）およびメタノール（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｌｖ）は、Ｍｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入した。アセトン（ｐｕｒｉｓｓ、ｐ．ａ．）および補酵素Ｑ−１０はＦｌｕｋａから購入した。

計算。定量分析は外部標準を用いて２段階の較正により実施した。算出はピーク面積を基に行った。

選択性。本法の選択性は、関連する参照化合物の標準液を注入することにより検証した。標的化合物（補酵素Ｑ−１０およびユビキノール−１０）は完全に分離し、干渉は見られなかった。選択した化合物の保持時間は、全トランス型ゼアキサンチン８．０分、１５Ｚ−フィトエン１０．４分、補酵素Ｑ−９１１．０分、β−クリプトキサンチン１２．３分、ユビキノール−１０１３．８分、補酵素Ｑ−１０１４．８分、β−カロテン１９．０分である。

直線性。ＴＢＭＥ／エタノール（１：１）で補酵素Ｑ−１０の希釈系列を作成し（最終濃度３００、１００、３０、３μｇ／ｍＬ）、前述のＨＰＬＣ法により分析した。３μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲で直線であることが分かった。相関係数は０．９９９９であった。

検出限界。ＨＰＬＣ法による補酵素Ｑ−１０の検出下限は１μｇ／ｍＬと判定された。

実施例２：Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓのｃｒｔＥ変異体の構築

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４におけるｃｒｔＥ遺伝子の挿入不活化。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４由来のｃｒｔＥ遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定は、Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓらにより報告されている［Ｇｅｎｅ１８５：３７〜４１（１９９７）］。５’末端および３’末端にＰｓｔＩ制限酵素認識部位を有するｃｒｔＥ特異的ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＲＳＦ１０１０−Ａｍｐｒ−ｃｒｔ２（米国特許第６２９１２０４号）をテンプレートとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作成した。使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ配列番号１および配列番号２で示すような配列を有した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分（１サイクル）、９４℃で１分、そして７２℃で１．５分（３０サイクル）、７２℃で７分（１サイクル）であった。ＰＣＲ反応により生成された４６０塩基対（ｂｐ）からなるＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩにより分解し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を用いてアガロースゲルより精製した。単離した断片は、あらかじめＰｓｔＩにより分解した「自殺」プラスミドベクターｐＳＵＰ２０２［Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：７８４〜７９１（１９８３）］と結合させた。結合混合物を標準的方法により大腸菌Ｓ−１７細胞の変換に使用した。形質転換体のスクリーニングにより、ｃｒｔＥの内部断片を含む所望のプラスミドの構築が認められた（プラスミドｐＳＵＰｃｒｔＥと命名）。プラスミドｐＳＵＰｃｒｔＥは、米国特許第６２９１２０４号で開示される接合法を用いて、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４へ移入した。接合完了体は、リファンピシン１００μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン３μｇ／ｍＬを含むＦ−寒天培地上で選択された。この結果、約１０^３のコロニーを得た。これらコロニーの大部分では、菌株Ｒ１５３４（ゼアキサンチン生成のため黄色）と比較して色の変化が認められ（白化）、これはｃｒｔＥ遺伝子の挿入不活化によるゼアキサンチン生成の減少と一致していた。

１０の代表的な推定上のｃｒｔＥ組込み体を、以下のようにコロニーＰＣＲによる分析のために選択した。コロニーを１．５ｍＬのミクロチューブに移した。試料は電子レンジで加熱したあと（９００ワットで１分間）、氷冷した。次に、ＰＣＲ緩衝液、１５％グリセロール、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーを含むＰＣＲミックスを加えた。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分のあと、５７℃で３０秒および７２℃で１分（合計２５サイクル）、次に７２℃で７分（１サイクル）であった。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＳＵＰｃｒｔＥプラスミドの所望の組込みがＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４染色体のｃｒｔＥ座で生じる場合だけ、ＰＣＲ生成物が得られるように設計された。フォワードプライマーｐＣｒｔＥａｍｐＦ（配列番号３）はｃｒｔＥ特異的であり、一方、リバースプライマーｐＣｒｔＥａｍｐＲ（配列番号４）はｂｌａ（アンピシリン耐性遺伝子）特異的であった。このコロニーＰＣＲ法により、検査した１０コロニーのうちの１０コロニーでｃｒｔＥ座に自殺ベクターｐＳＵＰｃｒｔＥの組込みを有することが発見された（すべてで予測された大きさのＰＣＲ生成物が得られた）。さらに、ベクターｐＳＵＰ２０２のｂｌａ遺伝子における、特定の断片に対応するように特別に設計されたＰＣＲプライマーにより、ｃｒｔＥ組込み体の１０のうちの８で頭尾方向にｐＳＵＰｃｒｔＥの多数の複製を含むことが検出された。

ｃｒｔＥ組込み体のうちの３つ（および対照としてＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＲ１５３４）を、さらにサザンブロット法により分析した。本菌株を液体Ｆ−培地内で増殖させ、染色体ＤＮＡを標準的方法を用いて細胞から抽出した。染色体ＤＮＡ試料を、制限酵素のＡｌｗＮＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＢｇｌＩＩ＋ＰｖｕＩＩにより分解し、アガロースゲル電気泳動を実施した。膜への断片の移入およびプローブによるハイブリッド形成を標準的方法により実施した。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＲ１５３４由来のｃｒｔＥ遺伝子を^３２Ｐで標識し、プローブとして使用した。対照の菌株Ｒ１５３４から分解された染色体ＤＮＡによるすべてのハイブリッド形成において、ｃｒｔＥプローブとハイブリッド形成させた断片の数量および大きさは、予想したようにＲ１５３４の染色体から単離したｃｒｔＥ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいていた。３つのｃｒｔＥ組込み体から分解されたＤＮＡによるハイブリッド形成の結果は、対照のＲ１５３４の結果と著明に異なり、（コロニーＰＣＲ分析の場合のように）染色体のｃｒｔＥ座における、ｐＳＵＰｃｒｔＥの多くの複製の組込みと一致していた。Ｒ１５３４ｉｎｔＥ（表１に記載）と命名された１つの組込み体は、以降の実験のために保存された（実施例４で記述）。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のｃｒｔＥ変異体の作成。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４に対して、標準的方法（紫外線［ＵＶ］照射またはエチルメタンスルホン酸［ＥＭＳ］による処置）を用いて突然変異を誘発した。簡単に述べると、菌株Ｒ１１４の一晩培養物（Ｆ−培地で増殖）は、ＯＤ_６６０が０．１になるまで継代培養し、３時間振盪培養した。培養物の一定分量を遠心分離し、得られた細胞のペレットを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で再懸濁することにより洗浄し、細胞を集めるために、再度、懸濁液を遠心分離した。次いで、洗浄した細胞ペレットをＯＤ_６６０が０．１となるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁させた。ＵＶによる突然変異誘発のために、細胞懸濁液の一定分量１０ｍＬを、１００ｍＬガラスビーカーに移した。懸濁液は、マグネチックスターラ上で、連続的に、静かに混合した（クリップはビーカー内に置かれた）。混合細胞懸濁液を１４５０μＷ／ｃｍ^２の放射束の紫外線で所定時間照射した。ＥＭＳによる突然変異誘発のために、ＥＭＳ０．１ｍＬを洗浄した細胞懸濁液の一定分量１０ｍＬへ添加し、混合液を回転振盪機で最高９０分間振盪した。次に、細胞を遠心分離により集め、突然変異誘発物質を除去するために２回洗浄した。

平板培養などで、生存率、希釈率に関する突然変異誘発処置を最適化するために、いくつかの予備実験を実施した。一旦これらの条件が確立されたあと、ＵＶまたはＥＭＳにより突然変異を誘発されたＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ菌株Ｒ１１４細胞を３６２Ｆ／２寒天板で平板培養し、白色（非ゼアキサンチン生成）コロニーを単離した。多くの上記の変異体を得て、さらに、単コロニー分離のためと、復帰突然変異の頻度が低いか、ないことを確認するために、３６２Ｆ／２寒天板の上で再びストリークした。以下の章で記述したように、合計４３の安定な変異体についてさらに評価を行った。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓのｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、またはｃｒｔＩ遺伝子の突然変異は、リコペンが可視色を発するゼアキサンチン経路での最初の中間体であるので、白色のコロニーが生じることが予想される。菌株Ｒ１１４の４３の白色非ゼアキサンチン生成変異体の中から、ｃｒｔＥ変異体を同定するために、２段階のスクリーニング方法を採用した。最初に、ｃｒｔＩ遺伝子産物のリコペンシクラーゼの活性減少を示すフィトエン蓄積について、変異体のスクリーニングを行った。フィトエン生成は、ｃｒｔＥで遮断される変異体では不可能なので、フィトエンを蓄積するいかなる変異体もｃｒｔＥ変異体として除外することが可能であり、したがって、以降の考察から除外した。２番目に、遺伝的相補性を試験するために、第１段階で同定された非フィトエン蓄積白色変異体を、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４由来のクローンｃｒｔＥ遺伝子を有するプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ_Ｒ１１４により形質転換した。クローンｃｒｔＥ遺伝子を導入した場合に、ゼアキサンチン生成が回復することは（すなわち、黄色のコロニー）、白色コロニー表現型の基になるのは、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素を不活化するｃｒｔＥの突然変異であることを強く示している。

振盪フラスコ培養で、フィトエン蓄積に関して変異体を検査した。白色変異体（＋親対照株Ｒ１１４）を５００ｍＬバッフル付きフラスコ内の１１０ｍＬの３６２Ｆ／２培地で増殖させた。培養物の初期ＯＤ_６６０は０．１６であった。２４、４８、７２時間後、細胞を集めるために、試料３０ｍＬを取り出し、５０ｍＬポリプロピレン管に入れて遠心分離した。細胞のペレットを水で洗浄し、再び遠心分離した。最終の細胞ペレットを、補酵素Ｑ−１０分析のために実施例１で記述した方法と同様のＨＰＬＣによりフィトエン蓄積に関して分析した。フィトエンに関する標準は得られなかったので、フィトエンに対応するクロマトグラムのピークはフィトエンのＵＶスペクトルと、質量分析で定量された化合物の質量により特定した。フィトエン濃度は、フィトエンおよび補酵素Ｑ−１０の特定の吸収係数の比率に基づいて算定した。この方法により、振盪フラスコ培養において、フィトエンを蓄積した、それら変異体を明白に識別することができた。さらに、フィトエンを蓄積しなかった６つの変異体（ＵＶ６−１、ＵＶ７−６、ＵＶ９−４、ＥＭＳ３−６、ＥＭＳ３−１５、ＥＭＳ９−７）について、次の段階の試験を実施した。

クローンｃｒｔＥ遺伝子による６つの白色非フィトエン蓄積変異体（ＵＶ６−１、ＵＶ７−６、ＵＶ９−４、ＥＭＳ３−６、ＥＭＳ３−１５、ＥＭＳ９−７）の遺伝的相補性に関する試験は以下の通り実施した。変異体ごとに、定常期の培養物１．５ｍＬを使用して、Ｆ−培地１００ｍＬに接種した。ＯＤ_６６０が０．５に達するまで、培養物を２８℃、２００ｒｐｍで増殖させた。次に、細胞を４℃、７，０００ｘｇで、１５分間遠心分離して集めて、氷冷１ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬで２回洗浄した。最終ペレットは、氷冷１ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍＬで再懸濁し、この電気反応性細胞は、電気穿孔法を行うために直ちに使用したか、グリセロールを最濃終度が１５％になるまで加え、細胞を−７０℃で一定分量５０μＬ中に保存した。形質転換のため、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ_Ｒ１１４１〜５μＬ（無塩溶液）を電気反応性細胞０．１ｍＬに加え、電気穿孔法を実施した（条件：氷冷１ｍｍキュベットで１８ｋＶ／ｃｍおよび１２９オーム、パルス長は一般に４〜５ミリ秒）。次に、Ｆ−培地１ｍＬを加えて、細胞懸濁液を２８℃で１時間振盪培養した。懸濁液の希釈液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＦ−寒天板上に広げ、寒天板を２８℃で培養した。

変異体ＵＶ６−１、ＵＶ９−４、ＥＭＳ３−６、およびＥＭＳ９−７のすべてのカナマイシン耐性コロニー（すなわち形質転換体）は濃黄色であったが、変異体ＵＶ７−６およびＥＭＳ３−１５の形質転換体は白色のままであった。本遺伝的相補性試験は、変異体ＵＶ６−１、ＵＶ９−４、ＥＭＳ３−６、およびＥＭＳ９−７が、ＧＧＰＰ合成酵素を不活化するｃｒｔＥに突然変異を含むことを示している。変異体ＵＶ９−４およびＥＭＳ９−７は、補酵素Ｑ−１０生成を評価するために以降の実験で使用した。

実施例３：Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４およびＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定

方法

ゲノムＤＮＡの単離。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４（Ｆ−培地で増殖）の培養物６００ｍＬを、４℃、１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、ペレットは溶解緩衝液（０．１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）２００ｍＬで１回洗浄し、溶解緩衝液１００ｍＬで１回洗浄した。最終ペレットは、リゾチーム５０ｍｇとリボヌクレアーゼＡ（デオキシリボヌクレアーゼ無含有）１ｍｇを含む溶解緩衝液２０ｍＬで再懸濁した。３７℃で１５分間の培養後、２０％Ｎ−ラウロイルサルコシルＮａ１．５ｍＬおよびプロテイナーゼＫ２．２５ｍｇを添加した。５０℃で３０〜６０分間の培養後、ゆっくりと、しかし十分に混合された１体積のバッファーを飽和させたフェノール（ｐＨ７．５〜７．８）により、ライセートを抽出した。乳濁液は３０，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、水相をフェノールで再抽出した。相は前回と同様に分離し、水相を１体積のフェノール：クロロホルム（１：１）で２回抽出した。このステップで、スイング型ローターにおいて、３，２００ｘｇで２０分間の遠心分離により、十分に満足な相分離を得た。１体積のクロロホルムによる最終の抽出後、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加し、溶液を２体積の氷冷エタノールで覆った。沈降したＤＮＡはガラス棒に巻き付け、７０％エタノールに５分間浸漬し、クロロホルムで洗浄し、５〜１０分間風乾した。ＤＮＡはＴＥ緩衝液５ｍＬ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）に一晩再懸濁した。この溶液は微量のゼアキサンチンのため黄色なので、上記のように有機抽出と巻き付けを繰り返して、清澄な調製物を得た。

λ−ライブラリー。ラムダＦＩＸ（登録商標）ＩＩのＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分分解したカスタムメードのライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国カリフォルニア州ラホーヤ）から購入した。

ＰＣＲ。ＰＣＲは、製造業者の指示通りに、ＧＣ含量の高いＰＣＲシステム（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ、マンハイム）を用いたＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスター）で実施した。一般的には、使用したＭｇＣｌ_２濃度は１．５ｍＭであり、最終濃度が１Ｍになるまで分割して溶液を加えた。

ＤＮＡの標識および検出。ＰＣＲＤＩＧプローブ合成キットおよびＤＩＧ発光検出キットを、それぞれＤＮＡの標識と検出のために使用した（２つともＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ、マンハイムより購入）。

λ−ＤＮＡの単離。製造業者の指示通りに、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ラムダキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を使用した。

ＤＮＡ塩基配列決定。塩基配列決定反応は、製造業者の指示通りに、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ＤＮＡ塩基配列決定キット（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスター）を用いて実施した。塩基配列決定反応生成物はＤｙｅＥｘ（商標）スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）で精製し、断片の分離および検出はＡＢＩＰｒｉｓｍ（商標）３１０遺伝子分析器（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスター）により実施した。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４由来のｄｄｓＡ遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のｄｄｓＡ遺伝子（ＤＰＰ合成酵素をコードする）は、最初、ｐｈａＡＢ遺伝子クラスターのクローニングおよび塩基配列決定の間に偶然に同定された。Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｐｈａＡおよびｐｈａＣの遺伝子配列を基にしたプライマーを使用して、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４由来のｐｈａＡの一部、およびＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４由来のｐｈａＣの一部を含むＰＣＲ断片を得た。次に、ＰＣＲ断片を使用して、ｐｈａＡおよびｐｈａＣ遺伝子について、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４λ−ライブラリーをスクリーニングした。本ライブラリーより、本プローブに対してハイブリット形成するＤＮＡ断片を同定し、クローンを作成した。塩基配列決定により、ｐｈａＡ遺伝子およびｐｈａＣ遺伝子が、確かにクローンの断片上に位置していることが認められた。さらに、ｐｈａＢ遺伝子がｐｈａＡ遺伝子の下流に位置することがわかった。したがって、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの場合のように、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓでは、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子はクラスターを形成し、一方、ｐｈａＣ遺伝子はゲノムの他の場所に位置している。ｐｈａＡＢの下流部位の塩基配列決定により、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のｄｄｓＡ遺伝子と類似した配列に基づいて、ｄｄｓＡ遺伝子と同定されたオープンリーディングフレームが明らかになった。２００２年２月２１日、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のｄｄｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）と、これに対応し、（配列番号６）をコードするＤＰＰ合成酵素のアミノ酸配列はＥＭＢＬに寄託されて、２００２年５月２日より登録番号ＡＪ４３１６９５で公的に利用できるようになった。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子の塩基配列決定。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ２１５８８由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、フォワードプライマー７Ｒ−０１（配列番号７）およびリバースプライマーｄｄｓ−３（配列番号８）により、ｄｄｓＡ遺伝子を増幅し、得られたＰＣＲ生成物を配列決定した。野生株ＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ配列とＡＴＣＣ２１５８８から古典的に誘導された変異体Ｒ１１４との比較により、Ｒ１１４のｄｄｓＡ遺伝子は、コード領域内のヌクレオチド６９８にＧからＡへの突然変異を含むことが明らかになった。このことにより、コドン２３３の中央のヌクレオチド（下線部分）はＧＧＣからＧＡＣに変わり、この結果、アミノ酸２３３は（ＡＴＣＣ２１５８８の）グリシンから（Ｒ１１４の）アスパラギン酸に変わった。

実施例４：Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓにおける補酵素Ｑ−１０生成に対する、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓｄｄｓＡ遺伝子の過剰発現の影響

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓの過剰発現に関するＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ由来のｄｄｓＡ遺伝子のクローニング。プライマーｄｄｓＡ／ＮｄｅＩ／ｆｏｒ（配列番号９）およびプライマーｄｄｓＡ／ＢａｍＨＩ／ｒｅｖ（配列番号１０）を用いたＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のＰＣＲにより、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のｄｄｓＡ遺伝子のコード領域を増幅した。プライマーｄｄｓＡ／ＮｄｅＩ／ｆｏｒは、Ｎｄｅｌ（ＣＡＴＡＴＧ）制限酵素認識部位を含み、この後部半分はｄｄｓＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧと一致するように位置している。プライマーｄｄｓＡ／ＢａｍＨＩ／ｒｅｖは終止コドン直後にＢａｍＨＩ部位を含む。ＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＸＩ１２のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ切断骨格と結合させ（Ｈｕｍｂｅｌｉｎら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１〜７，１９９９）、プラスミドｐＴＨ３６を得た。次に、ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３７５１）をＢｓｔＸＩおよびＢｓｕ３６Ｉで切断し、このうち大きな断片を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＭＣＳ−２上方（配列番号１１）およびＭＣＳ−２下方（配列番号１２）と結合させて、ベクターｐＢＢＲ−Ｋ−Ｎｄｅを得た。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のリボソームＲＮＡオペロンのｒｒｎＢプロモーターを含む、配列番号１３の配列を有するＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ切断断片を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ＮｄｅのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ切断骨格に挿入し、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢを得た。最後に、Ｒ１１４株由来のｄｄｓＡ遺伝子をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでｐＴＨ３６から切り取り、ベクターｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ切断骨格と結合させ、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４を得た。

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓにおいてＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ２１５８８由来の野生型ｄｄｓＡ遺伝子を過剰発現するベクターを作成するため、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーのｄｄｓ−ｗｔ−１（配列番号１４）とｄｄｓ−ｗｔ−２（配列番号１５）を用いて突然変異を誘発した。得られたプラスミドのｄｄｓＡ遺伝子（ｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢ−ｄｄｓＡ_ｗｔと命名）は完全に配列決定され、所望の変化が検証された。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子の全ヌクレオチド配列を配列番号１６に示し、これに対応するアミノ酸配列を配列番号１７に示す。組換えＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株において補酵素Ｑ−１０生成を評価した予備実験では、ｒｒｎＢプロモーターをプラスミドのｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４とｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｒｒｎＢ−ｄｄｓＡ_ｗｔで用いた場合、結果に不一致が生じることを示していた。したがって、ｒｒｎＢプロモーターは、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ染色体のｃｒｔＥ遺伝子の上流に位置するＤＮＡ配列と置き換えられた。本配列はｃｒｔＥプロモーターを含む。したがって、ｄｄｓＡ遺伝子の上流に配列番号１８（配列番号１３の代わりに）の配列を有するＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片を保有するプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡ_ｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４を得た。

ｄｄｓＡ遺伝子を過剰発現するＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株での補酵素Ｑ−１０生成。プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡ_ｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４を、電気穿孔法によりＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株のＲ１１４、ＵＶ９−４、ＥＭＳ９−７およびＲ１５３４ｉｎｔＥに導入した。得られた組換え菌株とそれぞれの親（対照）株を、振盪フラスコ培養（３６２Ｆ／２培地）で増殖（２組）し、補酵素Ｑ−１０の生成を測定した。初期の結果は、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ２１５８８（配列番号１６）の野生型ｄｄｓＡ遺伝子がＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４由来の変異体ｄｄｓＡ遺伝子に比べて、より高い活性を有するＤＰＰ合成酵素をコードしていることを示していた。したがって、以降は野生型ｄｄｓＡ遺伝子を過剰発現する菌株だけを検討した。表１のデータは、野生型ｄｄｓＡ遺伝子の発現が（多コピープラスミドのクローニングを通して）増加することによって、すべてのＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株において補酵素Ｑ−１０の生成が著明に増加したことを明らかに示している。補酵素Ｑ−１０に特定した生成の増加は、それぞれの検査した菌株で２〜８倍の範囲だった。

実施例５：Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４およびＡＴＣＣ２１５８８由来のｕｂｉＡ遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４のｕｂｉＡ遺伝子（４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードする）を、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４ゲノム配列と既知の細菌性４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの配列との比較により同定した。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４（配列番号１９）のｕｂｉＡ遺伝子のヌクレオチド配列を用いて、フォワードプライマーｕｂｉＡ−Ｎｄｅ（配列番号２１）およびリバースプライマーｕｂｉＡ−Ｂａｍ（配列番号２２）を設計した。プライマーｕｂｉＡ−Ｎｄｅは、後部半分がｕｂｉＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧと一致するように位置するＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）制限酵素認識部位を含む。プライマーｕｂｉＡ−ＢａｍＨＩは終止コドン直後にＢａｍＨＩ部位を含む。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１１４またはＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ２１５８８由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、両方のプライマーによりｕｂｉＡ遺伝子を増幅した（ゲノムＤＮＡの単離、ＰＣＲ、およびＤＮＡ塩基配列決定の方法は実施例３で記述）。ＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、両方のＰＣＲ断片をベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ内にクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｂｉＡ_ｗｔ（野性株ＡＴＣＣ２１５８８由来のｕｂｉＡ遺伝子を含む）およびプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｂｉＡ_Ｒ１１４（変異株Ｒ１１４由来のｕｂｉＡ遺伝子を含む）を得た。各プラスミドのクローン挿入物を配列決定した。菌株ＡＴＣＣ２１５８８（配列番号２３）由来のｕｂｉＡ遺伝子のヌクレオチド配列と菌株Ｒ１１４（配列番号１９）由来のｕｂｉＡ遺伝子のヌクレオチド配列の比較から、コドン２２０が変わる１つのヌクレオチドの相違が明らかになった。この相違について、両菌株由来のゲノムＤＮＡから増幅した非クローンＰＣＲ断片の関連部位の塩基配列決定により確認し、このことにより、ＰＣＲアーティファクトの可能性は除外された。ＡＴＣＣ２１５８８株由来の野生型ｕｂｉＡ遺伝子では、コドン２２０はＡＣＣ（スレオニンをコードする）であるが、Ｒ１１４株由来の変異体ｕｂｉＡ遺伝子では、コドン２２０はＡＴＣ（イソロイシンをコードする）である。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＲ１１４株およびＡＴＣＣ２１５８８株由来の４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼの対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０および配列番号２４に示す。

実施例６：Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓにおける補酵素Ｑ−１０生成に対するＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ由来ｕｂｉＡ遺伝子の過剰発現の影響

Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓでの過剰発現に関するＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ由来ｕｂｉＡ遺伝子のクローニング。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ２１５８８由来およびＲ１１４由来のｕｂｉＡ遺伝子を、それぞれ制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｂｉＡ_ｗｔおよびｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｂｉＡ_Ｒ１１４から切り取り（実施例５参照）、発現プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥからＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより切断されたベクター骨格と結合させた。このことによりｕｂｉＡ遺伝子はｃｒｔＥプロモーターの制御下におかれ、実施例４で記述した発現プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡ_Ｒ１１４に類似したプラスミドが作成された。この新しいプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｕｂｉＡ_ｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｕｂｉＡ_Ｒ１１４を用いて、電気穿孔法によりＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４を形質転換した。Ｒ１５３４株は、ｄｄｓＡ遺伝子の野生型染色体を含むために選択した。

ｕｂｉＡ遺伝子を過剰発現するＰ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４における補酵素Ｑ−１０生成。Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１５３４（対照株）、Ｒ１５３４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｕｂｉＡ_ｗｔ、およびＲ１５３４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｕｂｉＡ_Ｒ１１４をバイオリアクターで培養し（実施例１に記述した２重の条件で）、補酵素Ｑ−１０の生成を比較した。表２の結果は、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓＲ１１４またはＡＴＣＣ２１５８８由来のいずれのｕｂｉＡ遺伝子の過剰発現も、Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓにおける補酵素Ｑ−１０の生成を増加したことを示している。

Claims

（１）デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）合成酵素をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１６で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖と、
（２）４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２３で特定されるＤＮＡ配列またはその相補鎖と、
を含む単離されたＤＮＡ。
請求項１に記載のＤＮＡが挿入された発現ベクターまたはプラスミドを含む微生物。